Universidad De Las AméricasIngenieria en BiotecnologiaBiotecnología en Alimentos

Modificación genética de Musa paradisiaca, para retardar su tiempo de oxidación

Nombres: Humberto Serrano, Daniela Gutiérrez

1) Introducción:

El banano pertenece a la familia Musaceae del género musa, existen actualmente más de 700 variedades de las cuales solo 100 son cultivables. Su crecimiento se da en regiones tropicales y subtropicales. Los países con mayor exportación de banano son Colombia, Costa Rica, Ecuador, Panamá Filipinas entre otros. Los países de latinoamérica producen una mayor cantidad de bananos que son de exportación (Sánchez, 2004), esto se debe a que se tiene una gran cantidad de luz en todos los meses del año, se dan las condiciones ideales de clima y suelo para la producción bananera en el país. El Ecuador al ser un país diverso, posee una gran cantidad de especies tropicales gracias a sus suelos y climas en las diferentes zonas del país. El banano del Ecuador es conocido a nivel mundial por sabor y su gran calidad, siendo muy cotizado en mercados de Asia, Europa, y Norteamérica. Actualmente el Ecuador cuenta con un territorio cultivable extenso superando las 200.000 ha. (Pérez. E, et al. 1994). La producción de banano en el Ecuador se realiza en 20 provincias, en la costa 89%, oriente 1%, Sierra 10%. La mayor producción en la región de la costa (Imagen 1) se dan en las provincias del Guayas y Los Ríos (El Agro, 2013), esta producción ha llegado generar fuentes de empleo y de ingresos económicos hacia el estado, ya que el país cuenta con el 30% de la oferta mundial. De acuerdo al Magap el 10% de la superficie agrícola del Ecuador se encuentra con banano, (Grafico 1) aumentando su crecimiento anual con un 3% (MAGAP, 2013). En el año 2012 el Ecuador exportó 2,078,239.38 millones de dólares en divisas y 5,196,065.09 toneladas y la inversión es aproximadamente unos 4.000 millones de dólares

El plátano o Musa paradisiaca variedad hartón, es un cultivo perenne debido a que la planta produce retoños, las plantas de plátano siempre mueren luego de cosecha (Hernández, 2009). Muchas frutas incluyendo el banano sufren oscurecimiento enzimático , este factor afecta a los productos procesados ya que al cortarlos sufren oscurecimiento debido a que la ruptura de las células. Este cambio de color se debe a la polimerización y oxidación de los compuestos fenólicos en donde interviene la enzima polifenoloxidasa (Varoquaux et al, 1994).

El pardeamiento se da debido a que se realiza una oxidación que es catalizada por enzimas, que son derivadas del catecol para dar lugar a las o-quinonas. La principal enzima que interviene en este proceso es la polifenoloxidasa, esta se encuentra dentro de las oxidoreductasas, esta también se conoce como fenolasa, monofenol oxidasa cresolasa o tirosinasa. Una característica de la PPO, es que contiene un centro activo con dos átomos de cobre que se unen a histidinas, y alrededor de los átomos de cobre se encuentran los aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos unidos a sus sustratos.

Las o-quinonas atacan a los componentes celulares que dan lugar a la formación de polímeros, estos son los polímeros que son responsables de oscurecer los tejidos sobre todo en plátanos y papas (Hernández, 2009). Cuando la célula está intacta las enzimas se encuentran separadas en compartimentos como las vacuolas y cloroplastos, pero cuando el fruto envejece o tiene daños infecciosos o físicos esta reacción sucede debido a que las enzimas se unen con sus sustratos (Boyer, 2000). La polifenoloxidasa se encuentra unida a las membranas subcelulares, en los vegetales la mayoría se unen a la membrana de los tilacoides. La concentraciones de los iones de hidrógeno dan una señal para que las enzimas se activan, esto se debe a que el pH tiene un efecto en la estructura de los enlaces polipeptídicos. En muchos alimentos el pH puede tener variaciones de 2.5 a 7, es por esto que la inhibición de algunas reacciones y el crecimiento microbiano se puede dar a la variación del pH en el fruto (Hernández, 2009).

El manejo de cosecha y postcosecha del banano consta de una serie de pasos los cuales incluye el tiempo y la edad de cosecha, donde es importante cosechar en estado pre-maduración. El tamaño de cosecha de la fruta debe estar entre los 20 cm y un grosor de 5-6 cm. (Rosales, 2004).

El vector binario pBI121 tiene una secuencia de 14758 bp, es muy usado en transformación de plantas, en muchos experimentos se reemplaza la glucuronidasa (GUS) para la expresión del gen, el plásmido tiene enzimas de restricción HindIII y EcoRI, el promotor CaMV (35s) tiene una región de 835 bp, una región GUS 1812 bp y un terminador NOS (235 bp). (Po-yen, 2002).

2) Planteamiento del problema y justificación

Unos de los grandes problemas al comercializar el plátano (Musa paradisiaca) es su corto tiempo de vida, ya que da un mecanismo de pardeamiento enzimático, en el cual actúan las enzimas peroxidasa y polifenoloxidasa, las cuales coloreando la fruta con un color café o negro. Esto genera pérdidas ya que cuando el fruto se encuentra así el consumidor lo rechaza, estas son unas de las principales causas de pérdida del producto. Este es un factor limitante ya que su vida útil en percha no es muy larga.Uno de los puntos claves del proceso de producción de banano es el método de postcosecha empleado. Los agricultores emplean un tiempo de vida del banano antes de ser cultivado por lo que es importante cosechar en estado de fruta verde, con ésto se evita la oxidación temprana y desprendimiento de reguladores de crecimiento como etileno, por éste motivo el fruto verde permanece más tiempo para su transporte y comercialización. En la exportación de frutas tropicales, es importante el estado de transporte de envío y recepción por lo que el banano al ser un producto de mayor exportación generando grandes ingresos al agricultor y el país. Como se mencionó anteriormente, los factores determinantes del valor y estado de la fruta viene dado por el estado visual causado por enzimas causantes de la oxidación del producto. Otros problemas asociados con el problema de comercialización es causado por manchas de látex que a diferencia de la oxidación frutal se soluciona con un lavados específicos. Para solucionar estos defectos en la exportacion y comercializacion local del banano nos hemos planteado la creación de un modelo de producción de banano transgénico con propiedades antioxidativas mediante la adición de genes que expresan ciertas proteínas que inhiben el proceso de oxidación en la fruta. Los genes pertenecen a un grupo llamado

PPOs. Estos genes tienen el propósito de inducir proteínas o enzimas capaces de inhibir la acción de otras enzimas causantes de la oxidación del fruto por diversas reacciones, con lo que garantizamos un producto de mejor aceptación y mejor calidad sin afectar sus propiedades nutricionales del mismo. Éste producto será de interés para grandes productores de banano y exportadores por lo que en primera instancia se realizará la investigación y desarrollo del producto en escala de laboratorio para posteriormente implementarlo en el campo. Al ser el banano un producto de consumo masivo y consumido por una población mundial extensa, la modificación del fruto en cuanto a calidad aumentará de forma significativa el consumo del producto. El proyecto de investigación será de gran inversión por lo que está diseñado para trabajar conjuntamente con instituciones como la Universidad de las Américas y el Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador (CIBE). Éstas dos instituciones contribuirán con el implemento y capital necesario para la elaboración del proyecto.

3) Metodología

- Método de transcripción reversa:

Se realizará una (RT-PCR) de tejidos del plátano Musa paradisiaca, mediante el método CTAB, luego se construirá una biblioteca de cDNA. Se utilizarán los siguientes primers 5′-AAG CTG GGA GTT GCT CAC GCA ACT GT-3′ (sentido) y 5′-TTA AGA AGC AAA CTC AAT CTT GAT ACC ACC-3′ (antisentido). Las reacciones se realizarán en las siguientes condiciones, desnaturalización a 94 °C, luego 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 45 segundos a 62°C , un minuto a 72°C, con una extensión final a 72°C por 10 minutos. El cDNA amplificado se clonara con un vector pGEM-T y se utilizará el primer T7 (Guiquin, et al 2011).

- Vector de expresión:

El DNA del banano con PPO el cual contiene en ambos extremos un sitio BamHI como se muestra en la Fig 3, luego de que el fragmento se digiera con BamHI, procederemos a ligar en el plásmido pBI121 (Ver fig. 2) y por consiguiente se introducirá en la cepa de E. coli HB101. El fragmento se insertará corriente abajo del promotor de RNA 35S obtenido del virus del mosaico de la coliflor (Ver fig. 2). Esta construcción contiene al gen nptII el cual nos permitirá seleccionar aquellas plantas transgénicas resistentes a la Kanamicina. Los diferentes plásmidos se obtendrán de análisis a partir de colonias de cepas de E. coli resistentes al antibiótico, y para obtener una correcta inserción se utilizara el método de corte con HindIII. El plásmido que se obtendrá a partir de la construcción con el PPO DNA antisentido se llamará pBI121-AsPPO. La cepa que se utilizará para la transformación con Agrobacterium tumefaciens será EHA 105 (Murata,2000).

- Introducción del vector en Agrobacterium tumefaciens:

Para la introducción del plásmido vector pBI121-AsPPO en Agrobacterium tumefaciens EHA 105 se utilizará el método de apareamiento triparental con ayuda de un plásmido secundario. La cepa de E.coli específica mencionada anteriormente se encubará en un medio de cultivo LB con antibiótico previamente (50 ug-ml) a una temperatura de 37 °C. adicionalmente Agrobacterium tumefaciens se encubará durante 12 horas en medio LB añadido 0.3 mg - ml de estreptomicina y 0.1 mg-ml de rifampicilina, éste proceso será a 27 °C. Éstas tres tipos de cepas se mezclarán en medio agar LB y permanecerán en proceso de incubación durante 12 horas. Luego de los pasos mencionados, se procederá a recoger aquellas bacterias con 5 ml de MgSO4 a una concentración de 10 mM, luego se incubarán en medio LB por otras 12 horas con la adición en el medio de 50 mg-ml de KM. Por último seleccionaremos las colonias y comprobaremos la presencia del plásmido en Agrobacterium tumefaciens.

- Transformación de Musa spp

La transformación se realizará con una suspensión de células embriogénicas, se utilizara un medio Murashige y Skoog, se le colocara la Agrobacterium tumefaciens para la modificación de las células embrionarias, en el medio tambien se incluira sucrosa, benzilaminopurina y agar. Posteriormente se realizarán dos medios mas, uno para para el co-cultivo y el de selección, el medio de selección tendrá kanamicina. Luego del crecimiento de las células embriogénicas se las trasladará a un medio de proliferación. Para mantener los brotes transgénicos se los debe trasladar periódicamente (cada seis semanas) a medios nuevos con kanamicina (50mg/L).

- Comprobación de resistencia a kanamicina:

Para la comprobación de la resistencia de las plantas transgénicas previamente transformadas con la resistencia al antibiótico KM, se procederá a cultivar pequeños explantes con el fin de producir callos. Estos callos serán pesados en aproximadamente 0.5 g de peso fresco y colocados en frascos con medio de cultivo selectivo con diferentes concentraciones de KM. Al cabo de 45 días a una temperatura de 27 °C. Luego de éste tiempo se calculará el peso nuevamente de los callos para obtener valores de la concentración inhibitoria (IC).

- PCR y análisis de ARN

Se realizará una comparación de DNA de Musa paradisiaca sin transformar con las transformadas, se usará el modelo de nptII con sus respectivos primers. Se realizará la extracción con nitrógeno líquido (-80°C), con el método de CTAB, luego de la extracción de realizará la PCR y posteriormente se observaran las bandas en geles de agarosa para observar si las plantas fueron transformadas. El RNA se extraerá con el método de CTAB, este será separado en geles de agarosa y se pondrán en una membrana de nylon. Se hibridiza el RNA con sondas del gen PPO a 68 °C. Las sondas seran preparadas con PCR DIG (prove synthesis kit), en donde se realizarán detecciones de quimioluminiscencia (Guiquin, et al 2011).

- Análisis de PPO en callos de Banano:

Para el análisis de PPOs en los callos de banano se pesará aproximadamente 2 a 3 gramos de masa y se colocará en un frasco tipo Erlenmeyer de 100 ml con medio líquido Murashige y Skoog y se procederá a incubar durante 3 días a 27 °C y 100 rpm. Para continuar con el análisis se trabajará a 4 °C. Por medio de filtración se recogerán las células y se someterán a homogeneizar en dos volúmenes de un tampón fosfato 10 mM con un pH de 7.2 el cual será colocado Polyclar SB-100 en un volumen de 10% conjuntamente con Polytron como homogeneizador durante un tiempo de 2 minutos. El sobrenadante se obtendrá como extracto crudo luego de centrifugar por 30 minutos a una velocidad de 16000 x g.Para la determinación de proteínas se utilizará un método específico de detección como el método de Lowry utilizando SBA (Suero Albúmina Bovina) como estándar. Para la estimación de la cantidad de proteína PPO se utilizará un anticuerpo PPO anti-banano por medio de ELISA y Western blot. Para el Western blot se medirá la densidad de la banda densitométricamente. Para la actividad enzimática se utilizará un tampón McIIvaine a un pH 4 con el uso de ácido clorogénico como sustrato y la absorbancia se medirá a 320 nm. Éstas mediciones se medirán en dos repeticiones con callos transgénico y callos no transgénicos y las mediciones serán evaluadas por medio del programa Statview 4.0.

- Determinación de protocolo de micropropagación para la especie vegetal:

Se utilizara un medio Murashige Skoog, el cual tendrá sacarosa 40 g/L, BTA 5 g/L, inositol 100 g/L, Tiamina-HCL 1 mg/L, se cultivarán con un fotoperiodo de 16 horas y agitación 100 rpm. Luego se realizaran subcultivos cada dos días por tres semanas. Para la propagación masiva de los brotes se realizan en el mismo medio pero con agar 0.8% y se transfieren cada semana, para evitar pudrición. Para promover el enraizamiento se transfieren los brotes a medio MS, suplementado con AIA, cuando aparezcan las raíces se los transfiere a semilleros (Angarita, et al 1998).

4) Resultados esperados

La producción del banano transgénico asegurará una producción mucho mayor en comparación al producto original, aportando las mismas propiedades nutricionales del fruto pero con mayor aceptación en el mercado.Por otra parte, el fruto modificado genéticamente brindará un aspecto visual superior al fruto original por lo que al ser consumido no generaría rechazo por parte de la población. Éste producto en general es de masiva producción por lo que al país le genera muchos ingresos en sus exportaciones, de esta manera al ser un producto modificado sin ningún tipo de riesgos asociados y de mejor calidad por su aspecto, aportaría con mayores exportaciones siendo un país potencia en exportación de éste producto y consumo nacional por lo que beneficiaría a productores y comerciantes.El aspecto y duración del producto sería de mayor duración por lo que al inhibir la acción de enzimas causantes de la oxidación del fruto éste tendría una mayor duración en perchas de comerciantes y a su vez el tiempo de consumo del producto aumentaría.Se espera una correcta inserción de genes modificadores de la producción de las enzimas PPOs por lo que es indispensable que los resultados primero sea a escala de laboratorio y luego aclimatación al campo por consiguiente el proyecto sería apto para ser adaptado a las diferentes zonas productoras de banano del país. Éstos genes serán aislados de frutos comestibles ordinarios por lo que al insertar y modificar genéticamente el fruto, sólo mejoramos la calidad y funcionalidad para bien y no su calidad nutricional.

Por último esperamos que la inserción de genes se de a nivel de fruto por lo que el uso específicos de genes para la expresión de proteínas es necesario en la parte principal que es el fruto, con esto garantizamos una correcta transformación del producto transgénico.

5) Sostenibilidad

El objetivo del proyecto es desarrollar un producto transgénico a nivel de laboratorio por lo que con ayuda de varias instituciones privadas y públicas se pretende extender al campo para su comercialización.Contaremos con el apoyo de la Universidad de las Américas al brindarnos el uso de laboratorios para la investigación y parte del presupuesto del proyecto para financiar reactivos y materiales y pago de investigadores.El Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador (CIBE) se suma al proyecto con su gran aporte en el área de investigación en banano transgénico por ser los pioneros en trabajar en investigar este fruto. También aportarán con el desarrollo del producto con sus implementos y laboratorios y presupuesto.El apoyo de instituciones públicas como el Ministerio de Agricultura (MAGAP) brinda un financiamiento en capacitaciones para los investigadores en el área de agricultura y manejo de cultivos de banano en el país por lo que se suma al aporte del proyecto.Por último contaremos con un financiamiento por parte de la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT) el cual aportará con un crédito para la investigación.El proyecto se desarrollará en dos fases por lo que la primera fase estará cubierta en su totalidad por dichas instituciones y la segunda fase tendrá una sostenibilidad propia por aportes de grandes productores de banano del país con el fin de lograr expandir al campo a gran escala

6) Presupuesto

CATEGORÍA CIBE UDLA MAGAP SENESCYT Total

Implementos de Laboratorio

4,000 3,000 7,000

Pago a Investigadores e investigación

10,000 10,000

Crédito para investigación

50,000 50,000

Capacitaciones 10,000 10,000

Desarrollo del producto

15,000 15,000 30,000

Total 107,000

7) Referencias Bibliográficas:

- Angarita, A. Peria, M. (1998). Micropropagación de plátanos y bananos. Recuperado el 30 de junio del 2015 de: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Cultivo%20de%20Tejidos%20en%20la%20Agricultura/capitulo22.pdf

- Boyer, R. (2000). Modern experimental Biochemestry. Pearson Education.

- EL AGRO. (2013). El banano en el Ecuador y el mundo.Revista El Agro. Recuperado el 24 de junio del 2015 de: http://www.revistaelagro.com/2013/04/29/el-banano-en-ecuador-y-el-mundo/

- Guiqin,L. Jing, Q. Yuxing, Z. Zhihua, G. Dongqian, X. Huixuan, L. Chenmin, H. (2011). Construction and transformation for the antisense expression vector of the polyphenol oxidase gene in Yali pear. College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding, China. Springer.

- Guerrero, C. (2009). INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA POLIFENOLOXIDASA EXTRAÍDA DEL BANANO (Cavendish valery) MEDIANTE SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS CON ISOESPINTANOL Y ÁCIDO ASCÓRBICO . Universidad nacional de Colombia. Medellín. Recuperado el 29 de junio del 2015 de: http://www.bdigital.unal.edu.co/1820/1/98380674.2009.pdf

- Po-Yen, C. Chen-Kuen, W. Shaw-Ching, S. (2002). Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants Recuperado el 30 de junio del 2015 de: http://download.springer.com/static/pdf/807/art%253A10.1023%252FA%253A1023475710642.pdf?originUrl=http%3A%2F%2Flink.springer.com%2Farticle%2F10.1023%2FA%3A1023475710642&token2=exp=1435763539~acl=%2Fstatic%2Fpdf%2F807%2Fart%25253A10.1023%25252FA%25253A1023475710642.pdf%3ForiginUrl%3Dhttp%253A%252F%252Flink.springer.com%252Farticle%252F10.1023%252FA%253A1023475710642*~hmac=8c9c094059b67cf5c9c769a70acb7990a2b0f6cc6f9bf1af0d980c210bd52911

- Hernandez, L. (2009). El plátano, cultivo tradicional con importancia tradicional. Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. Recuperado el 30 de junio del 2015 de: http://www.saber.ula.ve/dspace/bitstream/123456789/30260/3/ff2009_iiplatano.pdf

- Hernández, C. (2009). Acción y efectos de la polifenoloxidasa en alimentos. Universidad de Veracruz. Veracruz, México. Recuperado el 24 de junio del 2015 de: http://cdigital.uv.mx/bitstream/123456789/32464/1/hernandezvaldez.pdf

- Dirección de Inteligencia Comercial e Inversiones. (2013). Análisis del sector banano. Recuperado el 29 de junio del 2015 de http://www.proecuador.gob.ec/wp-content/uploads/2013/09/PROEC_AS2013_BANANO.pdf

- MAGAP, (2013). banano. Recuperado el 29 de junio del 2015 de: http://sinagap.agricultura.gob.ec/phocadownloadpap/BoletinesCultivos/banano.pdf

- Murata, M. Nishimura, M. et al (2000). A transgenic Apple Callus Showing Reduced Polyfenol Oxidase Activity And Lower Browing Potential. Tokyo, Japan.

- Sanchez, E. Santos, E. (2010). Estandarización del protocolo de transformación genética de células embriogénicas de banano de la variedad “williams” (AAA) mediada por Agrobacterium tumefaciens. Espol. Guayaquil, Ecuador.

- Varoquaux, P. Wiley, C. (1994). Biological and Biochemical Changes in Minimally Processed Refrigerated Fruits and Vegetables. Springer Science+Business Media Dordrecht.

- Sánchez, M. (2004). Modificación por oxidación del almidón de plátano (Musa paradisiaca L) y su caracterización parcial. Yaupetec-Morelos. Recuperado el 24 de junio de 2015 de http://itzamna.bnct.ipn.mx/dspace/bitstream/123456789/7300/1/Mirna%20Mara%20Snchez.pdf

- Pérez. E, et al. (1994). Biotecnología aplicada a la micropropagación de frutales. IICA - PROCIANDINA: Venezuela.

- Rosales. F. (2004). Producción y comercialización de Banano orgánico en la Región del Alto Beni. INIBAP: Bolivia.

- Wang, J., Liu, B., Xiao, Q., Li, H., & Sun, J. (2014). Cloning and Expression Analysis of Litchi (Litchi Chinensis Sonn.) Polyphenol Oxidase Gene and Relationship with Postharvest Pericarp Browning. PLoS ONE, 9(4), e93982. doi:10.1371/journal.pone.0093982

8) Anexos:

Gráfico 1: Producción de banano

Fig 1.: Producción de banano en Ecuador (Magap,2013)

Fig 2.: vector de clonación

Fig 3.: Construcción antisentido de CDNa para ser insertado en Plásmido.