MODULACION DEL CALCIO INTRACELULAR POR INSULINA EN EL CARDIOMIOCITO DE...

Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Laboratorio de Transducción de Señales

MODULACION DEL CALCIO INTRACELULAR POR

INSULINA EN EL CARDIOMIOCITO DE RATA ADULTA

Memoria para optar al título de Química Farmacéutica

DEISY CAROLINA PIVET SILVA

Profesor Patrocinante: Directores de Memoria:

Dr. Sergio Lavandero G. Dr. Sergio Lavandero G.

Dr. Ariel Contreras F.

Santiago de Chile, 2010

ii

AGRADECIMIENTOS

Primero quisiera agradecer a mis padres Mary y Eduardo,

quienes me han apoyado toda mi vida y sin duda han sido

pilares fundamentales en mi formación académica, gracias a

ustedes por el cariño, la preocupación y por confiar en mí

siempre. También a mi hermana Evelyn y su familia, mi cuñado

Ariel y mis adorables sobrinos Catalina y Alonso por ser parte

de mi vida y a la vez motivos de felicidad.

A Pedro por su continuo soporte desde el momento en que

nos conocimos cuando era yo mechona y su permanente

entrega de amor, indiscutiblemente eres muy importante en mi

vida. A su familia, en especial a sus padres Carmen y Rubén

por su preocupación y por integrarme como una más de

ustedes.

Al Profesor Sergio Lavandero por darme esta oportunidad de

conocer un mundo nuevo para mí y guiarme en este proceso y

por supuesto a todos los miembros del Laboratorio tanto de

Cardios como de Fibros por ayudarme en este arduo camino.

Particularmente quisiera agradecer a Fidel, Ruth, mi compañera

Coni y mi infaltable compañero de confocal David por hacer

más feliz la estadía, así como también a mi tutor Ariel quien me

enseñó gran parte de lo que aprendí. Gracias también al

Profesor Guillermo Díaz por su preocupación y consejos.

Muchas gracias a todos ustedes quienes formaron parte de

esta hermosa etapa de mi vida ya que sin vosotros todo

hubiese sido distinto.

iii

Esta memoria se realizó en el Laboratorio de Transducción de Señales del Centro

FONDAP Estudios Moleculares de la Célula y Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular, Facultad Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile y

contó con el financiamiento de los Proyectos FONDECYT 1080436 y FONDAP

1501006 (Dr. Sergio Lavandero).

iv

INDICE GENERAL

INDICE GENERAL ....................................................................................................... iv

INDICE DE FIGURAS ................................................................................................... vi

ABREVIATURAS ......................................................................................................... viii

RESUMEN ..................................................................................................................... x

SUMMARY ................................................................................................................... xii

1. INTRODUCCION ........................................................................................................... 1

1.1 Corazón y diabetes mellitus ............................................................................. 1

1.2 Características estructurales y funcionales de los cardiomiocitos adultos ........ 2

1.3 Insulina y su sistema transduccional ................................................................ 4

1.4 IGF-1 y su sistema transduccional ................................................................... 6

1.5 Acciones de Insulina en el corazón .................................................................. 7

1.6 Calcio ............................................................................................................... 9

1.7 Insulina y calcio .............................................................................................. 10

2. HIPOTESIS ................................................................................................................. 12

3. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 12

4. OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................ 12

5. MATERIALES Y METODOS ........................................................................................ 13

5.1 Reactivos ....................................................................................................... 13

5.2 Animales ........................................................................................................ 13

5.3 Obtención de cardiomiocitos de rata adulta .................................................... 14

5.4 Obtención de extractos proteicos para electroforesis ..................................... 15

5.5 Determinación de proteínas ........................................................................... 15

5.5.1 Método de Lowry ........................................................................................ 15

5.5.2 Método de Bradford .................................................................................... 16

5.6 Electroforesis en geles de poliacrilamida ........................................................ 16

5.7 Electrotransferencia de proteínas ................................................................... 16

5.8 Inmunowestern blot ........................................................................................ 16

5.9 Determinación de los niveles intracelulares de calcio ..................................... 17

5.10 Inmunofluorescencia indirecta ........................................................................ 18

5.11 Caracterización de cardiomiocitos adultos ..................................................... 18

v

5.11.1 Cardiomiocitos adultos para inmunowestern blot e Inmunofluorescencia ... 18

5.11.2 Cardiomiocitos adultos para medición de calcio por microscopía confocal . 19

5.12 Expresión de resultados y análisis estadístico ............................................... 21

6. RESULTADOS ............................................................................................................ 22

6.1 Activación de la vía de señalización canónica de

insulina en cardiomiocitos adultos .................................................................. 22

6.1.1 Efecto de insulina sobre la fosforilación del receptor de insulina ................ 22

6.1.2 Efecto de insulina sobre la fosforilación de Akt ........................................... 23

6.1.3 Efecto de insulina sobre la fosforilación de ERK 1/2 ................................... 23

6.2 Efecto de insulina en los niveles intracelulares de

calcio en el cardiomiocito adulto ..................................................................... 25

6.2.1 Efecto de insulina en los niveles de calcio intracelular de

cardiomiocitos adultos en ausencia de calcio externo ................................ 26

6.2.2 Efecto de insulina en los niveles de calcio intracelular y frecuencia de

contracción de cardiomiocitos adultos en presencia de calcio externo ....... 31

6.3 Efecto de IGF-1 sobre los niveles de calcio intracelular de

cardiomiocitos adultos .................................................................................... 37

6.3.1 Efecto de IGF-1 en los niveles de calcio intracelular de cardiomiocitos

adultos en ausencia de calcio externo ........................................................ 37

6.3.2 Efecto de IGF-1 en los niveles de calcio intracelular y frecuencia de

contracción de cardiomiocitos adultos en presencia de calcio externo ....... 37

6.3.3 Respuesta diferencial de cardiomiocitos adultos frente a IGF-1 1 µM ....... 41

6.4 Participación del calcio en la activación de la vía de

señalización del receptor de insulina .............................................................. 42

6.4.1 Participación del calcio en la fosforilación del receptor de insulina ............. 42

6.4.2 Participación del calcio en la fosforilación de Akt ........................................ 42

7. DISCUSION ................................................................................................................. 44

8. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 49

9. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................ 50

vi

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Caracterización de los cardiomiocitos adultos.............................................. 20

Figura 2. Insulina estimula la fosforilación del receptor de insulina (RI) y

de las proteínas kinasas Akt y ERK2 en el cardiomiocito adulto .................. 24

Figura 3. Identificación de zonas de análisis (ROI) en el cardiomiocito adulto ............ 25

Figura 4. Efecto de insulina sobre la liberación de calcio desde reservorios

intracelulares en el cardiomiocito adulto evaluado en el citoplasma celular . 28


intracelulares en el cardiomiocito adulto evaluado en el núcleo celular ....... 29


intracelulares en el cardiomiocito adulto evaluado en la membrana celular . 30

Figura 7. Efecto de insulina sobre los niveles de calcio intracelular en

presencia de calcio externo evaluado en el citoplasma celular .................... 32


presencia de calcio externo evaluado en el núcleo celular .......................... 33


presencia de calcio externo evaluado en la membrana celular .................... 34

Figura 10. Efecto de insulina sobre la frecuencia de contracción de

cardiomiocitos de rata adulta ....................................................................... 36

Figura 11. Experimento que resume el efecto de insulina sobre los niveles

de calcio intracelular .................................................................................... 36

vii

Figura 12. Efecto de IGF-1 sobre la liberación de calcio desde reservorios

intracelulares en el cardiomiocito adulto ...................................................... 39

Figura 13. Efecto de IGF-1 sobre el calcio intracelular en presencia de

calcio externo y la frecuencia de contracción............................................... 40

Figura 14. Respuesta diferencial de cardiomiocitos adultos frente a IGF-1 1 µM ......... 41

Figura 15. Participación del calcio en la fosforilación del receptor de insulina

y proteína kinasa Akt ................................................................................... 43

viii

ABREVIATURAS

µg = Microgramo

µL = Microlitro

µm = Micrómetro

µM = Micromolar

ADP = Adenosina difosfato

ATP = Adenosina trifosfato

BAPTA-AM = BAPTA-acetometil éster

BDM = 2,3 butanodiona monoxima

BSA = Seroalbúmina de bovino

Ca2+ = Calcio

CICR = Liberación de calcio inducida por calcio

DHP = Dihidropiridina

DTT = Ditiotreitol

ECC = Acoplamiento excitación contracción

EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético

EGTA = Ácido etilenglicoltetraacético

ERK = Proteína kinasa regulada extracelularmente

Fluo-3 AM = Fluo-3 acetometil éster

g = Gramo

GH = Hormona de crecimiento

h = Hora

HEPES = ÁcidoN-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfónico)

IGF-1 = Factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1

IGFBP = Proteínas transportadoras de IGF-1

IGF-1 R = Receptor de IGF-1

Ins = Insulina

Iono = Ionomicina

IP3 = inositol-1,4,5-trifosfato

IP3R = Receptor de inositol 1,4,5-trifosfato

IRS = Primer sustrato del receptor de insulina

Iso = Isoproterenol

kDa = Kilo Dalton

ix

Kd = Constante de disociación

M199 = Medio 199

mA = Miliamperes

MAPK = Proteína kinasa activada por mitógenos

MEC = Matriz extra celular

mg = Milígramo

min = Minuto

mL = Mililitro

mM = Milimolar

NADH = Nicotinamida adenina dinucleótido reducido

nm = Nanómetro

nM = Nanomolar

N.S. = No significativo

PBS = Tampón fosfato salino

PDK = Kinasa de la piruvato deshidrogenasa

PI3K = Fosfatidil inositol 3-Kinasa

PIP2 = Fosfatidil inositol 4,5- bifosfato

PIP3 = Fosfatidil inositol 3,4,5- trifosfato

PKA = Proteína kinasa A

PKB = Proteína kinasa B (Akt)

aPKC = Proteína kinasa C atípica

PLC = Fosfolipasa C

PMSF = Fenilmetanosulfonil fluoruro

RI = Receptor de Insulina

ROI = Región óptica de interés

rpm = Revoluciones por minuto

RyR = Receptor de ryanodina

SDS = Dodecil sulfato de sodio

SEM = Error estándar de la media

Túbulo T = Túbulo transverso

TIRF = Fluorescencia de reflexión total interna

V = Volt

VLDL = Lipoproteina de muy baja densidad

Zn2+ = ión Zinc

x

RESUMEN

El cardiomiocito adulto es una célula terminalmente diferenciada con escasa

capacidad replicativa y responsable de la contracción del miocardio. El ión calcio en

conjunto con el AMP cíclico son los segundos mensajeros que regulan la contracción

del cardiomiocito. Por otra parte la diabetes mellitus tipo II se asocia a un mayor riesgo

cardiovascular (“cardiomiopatía diabética”), siendo muy frecuentes alteraciones

sistólicas y diastólicas en el corazón de un paciente diabético. Dado que insulina es la

principal hormona asociada a la diabetes es importante determinar si existe alguna

relación entre ella y el calcio en el cardiomiocito adulto. En una investigación previa de

nuestro Laboratorio se describió que insulina aumenta el calcio intracelular en cultivos

primarios de cardiomiocitos neonatos, presentando esta respuesta dos componentes,

uno rápido dependiente del calcio externo y el canal tipo L y receptor de ryanodina y

otro lento dependiente de la vía transduccional IP3/receptor IP3. Interesantemente, este

último componente media los efectos de insulina a nivel de la translocación del GLUT4

a la membrana plasmática y el posterior ingreso de glucosa a estas células. En base a

estos antecedentes se propuso en esta memoria como hipótesis que insulina también

aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito adulto a través de un

mecanismo dependiente del Ca2+ extracelular y del almacenado en reservorios

intracelulares.

Nuestro objetivo consistió en estudiar la activación del sistema de señalización río

abajo del receptor de insulina y su dependencia del calcio y el efecto tanto de insulina

como IGF-1 en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto de rata.

Las células se expusieron a insulina 100 nM por distintos períodos de tiempo y se

evaluó la activación del receptor mediante su autofosforilación en tirosina y de las

proteínas kinasas Akt (Ser 473) y Erk 1/2 mediante Western blot. La presencia del

receptor de insulina en el cardiomiocito de rata adulta se detectó por

inmunofluorescencia en tyr1150/1151. Las tres proteínas evaluadas alcanzaron un

máximo de activación significativo con respecto a los controles a los 5 min post-

estímulo con insulina. Por otra parte, las células preincubadas con la sonda

fluorescente para calcio Fluo3- AM se estudiaron por microscopía confocal para

determinar cambios en los niveles de calcio intracelulares inducidos por insulina e IGF-

xi

1. Ambos péptidos no produjeron aumentos significativos en los niveles de calcio

intracelulares tanto en medio de reposo sin calcio como en medio de reposo con calcio

y evaluando distintas zonas celulares y concentraciones de los compuestos, mientras

que conocidos estímulos (ionomicina y KCl), empleados como controles positivos,

aumentaron el calcio intracelular. Asimismo, insulina e IGF-1 no modificaron la

frecuencia de contracción del cardiomiocito adulto. Sin embargo, ensayos de

fosforilación de la proteína Akt (Ser 473) en ausencia de calcio intracelular mediante el

uso de BAPTA-AM mostraron niveles inferiores a los observados en presencia de este

catión. En cambio, la fosforilación del receptor de insulina no se modificó al quelar el

calcio intracelular en el cardiomiocito adulto.

Estos resultados sugieren que probablemente las diferencias en cuanto a fenotipo y

genotipo, así como las diferencias en las preferencias de sustratos energéticos de

cardiomiocitos neonatos y adultos podrían constituir razones por las cuales ambos

tipos celulares se comportan de manera distinta en cuanto a la relación insulina y

calcio.

En conclusión, insulina activa su vía transduccional en el cardiomiocito adulto. No

obstante, ni insulina ni IGF-1 inducen cambios en los niveles intracelulares de calcio en

el cardiomiocito adulto ya sea afectando la entrada desde el extracelular o la salida

desde reservorios intracelulares de manera detectable con Fluo3- AM. Sin embargo,

dado que este catión moduló la activación de la vía de señalización de insulina a nivel

de la proteína kinasa Akt, futuras investigaciones deberán aclarar estas discrepancias.

xii

SUMMARY

Intracellular calcium modulation by insulin in adult rat cardiomyocytes

Cardiomyocytes are fully differentiated cells with limited proliferation capacity and

responsible for myocardial contraction. Ca2+ and cyclic AMP are second messengers

regulating cardiomyocyte contraction. On the other hand type II diabetes mellitus has

been associated with increased cardiovascular risk (diabetic cardiomyopathy), being

frequent systolic and diastolic alterations in the diabetic heart. Because insulin is the

main hormone linked to diabetes, it is important to determine whether there is any

relationship between this peptide hormone and calcium in the adult cardiomyocyte. In a

previous work in our laboratory, we reported that insulin increased intracellular Ca2+ in

primary cultured neonatal cardiomyocytes. This response has two components, a rapid

one characterized by its dependence by external Ca2+ and the L-type Ca2+

channel/ryanodine receptor, and a slow component depending on IP3/IP3 receptor

signaling pathway. Interestingly the latter component mediates insulin effects on GLUT4

translocation to the plasma membrane and subsequent glucose uptake. Based on this

evidence, we propose that insulin also increases intracellular Ca2+ levels in isolated

adult rat cardiomyocytes through a mechanism involving extracellular and intracellular

Ca2+.

The aim of this work was to study the activation of insulin receptor downstream

signaling pathway and its regulation by Ca2+ as well as the effects of insulin and IGF-1

on the intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes.

To this end, cells were exposed to 100 nM insulin for different time periods and the

activation of the insulin receptor was assessed by its tyrosine autophosphorylation and

the phosphorylation of protein kinases Akt (Ser 473) and Erk 1/2 by Western Blot. The

presence of tyr1150/1151 insulin receptor in the adult rat cardiomyocyte was

investigated by indirect immunofluorescence. These three signaling proteins reached a

maximum activation at 5 min after insulin stimulation. On the other hand, cells

preincubated with the fluorescent probe for calcium Fluo3-AM were studied by confocal

microscopy to determine changes on intracellular Ca2+ levels induced by insulin and

IGF-1. Both peptides did not produce any significant increases in intracellular calcium

xiii

levels both in presence and absence of extracellular calcium and evaluating different

cell areas and concentrations of the compounds. Stimuli like ionomycin and KCl, used

as positive controls, increased intracellular Ca2+ levels in cardiac cells. Furthermore,

insulin and IGF-1 did not affect the frequency of adult cardiomyocyte contraction.

However, Akt phosphorylation on Ser 473 was lower in cells cultured with the

intracellular calcium chelator BAPTA-AM that those cultured with medium containing

this cation. In contrast, insulin receptor phosphorylation was not modified by BAPTA-

AM on isolated adult rat cardiomyocytes.

These results suggest that probably the differences in phenotype and genotype, as

well as differences in energy substrate preferences by neonatal and adult

cardiomyocytes could explain why both cell types behave differently with regard to the

relationship between insulin and calcium.

In summary, insulin activates its canonical signaling pathway in adult

cardiomyocytes. However, neither insulin nor IGF-1 changed intracellular Ca2+ levels in

isolated rat adult cardiomyocytes. However Ca2+ modulated the activation of the

canonical insulin receptor signaling pathway at the level of Akt and future research

should clarify these discrepancies.

1

1. INTRODUCCION

1.1. Corazón y diabetes mellitus

El sistema cardiovascular posee dos principales componentes: el sistema

circulatorio compuesto por vasos sanguíneos que distribuyen la sangre a través de

todo el cuerpo y tejidos y el corazón como órgano central. Este último está situado

entre los pulmones en el centro del pecho y es una bomba muscular que expulsa la

sangre hacia las arterias con el fin de entregar a las células oxígeno y nutrientes y a su

vez retirar los desechos producidos en el metabolismo (1).

Por otro lado, en Chile la prevalencia global de diabetes de acuerdo a la Encuesta

Nacional de Salud de 2003 fue de 4,2%, 4,8% en hombres y 3,8% en mujeres. Sin

embargo, este valor se ve aumentado en el rango etario de 45-64 años a 9,4% y a

15,2% en mayores de 65 años (2). En consecuencia, esta enfermedad se ha

posicionado en la sociedad con una alta prevalencia contra la cual la lucha cada día se

hace más ardua.

La diabetes mellitus es un factor de riesgo conocido para la insuficiencia cardiaca

congestiva. Se piensa que este riesgo está asociado a enfermedades en arterias

coronarias y sus complicaciones, especialmente aterosclerosis (3). Al momento del

diagnóstico de diabetes tipo 2, es común que los pacientes presenten manifestaciones

de aterosclerosis. La principal causa de insuficiencia cardiaca congestiva es la

enfermedad cardiaca isquémica a pesar de los avances en la prevención y en el

tratamiento; por lo tanto diabetes e insuficiencia cardiaca están relacionadas (4). La

diabetes mellitus también puede afectar la función y estructura cardiaca en ausencia de

cambios en la presión sanguínea y de enfermedad de arterias coronarias, esta

condición se denomina cardiomiopatía diabética (5).

La cardiomiopatía diabética es una condición clínica diagnosticada cuando se

desarrolla disfunción ventricular diastólica en pacientes con diabetes y en ausencia de

aterosclerosis e hipertensión arterial (6). Algunas alteraciones del corazón diabético

incluyen hipertrofia de cardiomiocitos, fibrosis intersticial y microangiopatía

intramiocardica (4). A su vez, en pacientes con diabetes mellitus se observa una

2

disminución en la contractilidad cardiaca, esta alteración puede ser explicada por

diversos mecanismos, entre ellos están daño en la homeostasis del calcio,

desregulación del sistema renina-angiotensina, aumento del estrés oxidativo,

metabolismo alterado y disfunción mitocondrial (5).

1.2. Características estructurales y funcionales de los cardiomiocitos adultos

Dos tercios de corazón adulto está compuesto por células no musculares

principalmente fibroblastos. Estos fibroblastos cardiacos están inmersos dentro de la

matriz extracelular (MEC) del tejido conectivo y son responsables de su síntesis. Bajo

condiciones fisiológicas, los fibroblastos proveen un soporte mecánico para los

cardiomiocitos y participan en la coordinación de la función contráctil del corazón (7).

Además de secretar componentes de la matriz extracelular, los fibroblastos cardiacos

producen una serie de factores de crecimiento que probablemente median una

interacción entre fibroblastos y cardiomiocitos (8). Estrés externo, como por ejemplo

una herida, produce un cambio en el fenotipo de los fibroblastos cardiacos a otro tipo

celular conocido como miofibroblasto (9).

Aproximadamente un tercio del corazón está compuesto por células musculares

responsables de la contracción de este órgano, los cardiomiocitos. No obstante,

existen numerosas diferencias entre los tipos celulares de cardiomiocitos adultos y

neonatos o fetales que apuntan a satisfacer las necesidades del corazón propias de la

etapa de desarrollo en que se encuentra. Es así como los cardiomiocitos adultos de

mamíferos han experimentados cambios para llegar a un fenotipo adulto diferenciado.

Esto incluye disminución de la expresión de genes fetales y aumento de la expresión

de genes responsables del fenotipo adulto. Estos cambios permiten conseguir una

diferenciación de la estructura del cardiomiocito para suplir las necesidades del

corazón que avanzan hacia una mayor presión sistólica luego del nacimiento. Por lo

tanto, se produce un cambio en las isoformas y tipos de proteínas relacionadas con la

estructura y la contractilidad cardiaca, originándose una sarcomerización más

desarrollada y compacta que en la edad neonata. Junto con esta diferenciación se

produce una diferenciación terminal cuando además los cardiomiocitos pierden su

capacidad de dividirse (10).

Otra de las diferencias dice relación con el acoplamiento excitación- contracción

(ECC) de los cardiomiocitos. El acoplamiento excitación- contracción es la base de la

3

función cardiaca a nivel celular. Este proceso involucra varios componentes que

comunican la excitación eléctrica de la membrana celular a la generación de señales

de calcio citosólicas que gatillan la contracción celular (11).

En ambos casos, cardiomiocitos adultos y neonatos, se ha visto que al remover el

calcio del medio extracelular de los cardiomiocitos cesa la contracción de los mismos,

por lo tanto el influjo de calcio desde el extracelular sería indispensable para la

contracción del músculo cardiaco. El calcio entra a los cardiomiocitos principalmente a

través de los canales de calcio tipo L sensibles a dihidropiridinas (DHP). Sin embargo,

en células cardiacas adultas, la mayor parte del calcio responsable de la contracción

proviene del almacenamiento interno en el retículo sarcoplásmico (12). Al parecer, a

diferencia de los cardiomiocitos adultos, los neonatos carecerían de sistema de túbulos

T el cual juega un rol central en el acoplamiento excitación- contracción de

cardiomiocitos ventriculares adultos y por lo tanto las células cardiacas neonatas

tendrían la capacidad de mantener la señalización de calcio citosólico sin liberación de

calcio desde el retículo sarcoplásmico produciéndose señalizaciones más

heterogéneas (11).

En cardiomiocitos, la contracción se inicia por la apertura de los canales tipo L

sensibles a voltaje, los cuales son más abundantes en los túbulos transversos (túbulos

T). El influjo de calcio producido a partir de esta apertura provoca que se abra el

receptor de Ryanodina (RyR) que a su vez es canal de calcio, liberándose el calcio

desde el interior del retículo sarcoplásmico hacia el citoplasma celular. Este proceso es

conocido como liberación de calcio inducida por calcio (del inglés: “calcium induced-

calcium release”, CICR). Posteriormente este calcio se adosa a la maquinaria contráctil

generándose la contracción celular. La interacción entre el canal de calcio tipo L y el

receptor de Ryanodina estaría dada por la existencia de los túbulos T (13).

Posterior al nacimiento, el corazón requiere aumentar el gasto cardíaco para ser

capaz de operar contra una resistencia vascular aumentada y de adaptarse a

variaciones en la tasa metabólica total y al suministro de sus requerimientos de

sustratos energéticos vitales (14). Es así como el corazón de mamíferos posterior al

nacimiento utiliza ácidos grasos de cadena larga como principal sustrato para la

producción de ATP, mientras que el corazón fetal, que funciona en un ambiente

relativamente hipóxico, obtiene su energía a partir del catabolismo de glucosa y lactato

dado que la producción glicolítica de ATP es más eficiente en cuanto al oxígeno que la

4

oxidación de ácidos grasos. Los cambios en el suministro de sustratos energéticos al

corazón, los cambios en el control hormonal del metabolismo energético en el corazón

y los cambios subcelulares dentro del miocardio son los responsables de las

diferencias en las preferencias energéticas del corazón después del nacimiento (15).

1.3. Insulina y su sistema transduccional

Insulina es un péptido de 51 aminoácidos secretado por las células β del páncreas y

la principal hormona que participa en la captación de glucosa y la homeostasis de la

misma. El monómero de insulina maduro está compuesto por dos cadenas, una

cadena A (de 21 aminoácidos) y una cadena B (de 30 aminoácidos) unidas por 3

puentes disulfuro (16). El proceso de liberación de insulina comienza con las células β

pancreáticas sensando los niveles de glucosa sanguínea elevados e introduciéndola al

interior de las mismas a través de un transportador de glucosa de alta capacidad y baja

afinidad, GLUT-2. Una vez al interior de las células la glucosa es fosforilada a glucosa-

6-fosfato por una glucokinasa y posteriormente es metabolizada a través de la

glicólisis obteniéndose como producto piruvato, NADH y ATP (17). Los procesos

oxidativos derivados del ingreso de glucosa a las células β-pancreáticas se traducen en

mayor producción de ATP en la mitocondria y por lo tanto una razón ATP/ADP mayor

en el citoplasma. El aumento de esta razón cierra los canales de potasio sensibles a

ATP produciéndose una disminución en el flujo de salida hiperpolarizante de potasio

conduciendo a una despolarización de la membrana plasmática, un influjo de calcio

extracelular a través de los canales de calcio dependientes de voltaje y en

consecuencia a un gran aumento en los niveles de calcio intracelular que gatilla la

exocitosis de las vesículas que contienen la insulina almacenada (18) en forma de

hexámeros. Estos hexámeros están compuestos por 3 dímeros unidos entre sí a través

de dos iones de Zn2+ que se encuentran en el centro y a su vez, los monómeros que

conforman los dímeros están unidos a través de puentes de hidrógeno en sus cadenas

principales. Sin embargo, la insulina debe disociarse a monómero para actuar sobre su

receptor (16).

El receptor de insulina (RI) pertenece a la superfamilia de los receptores con

actividad tirosina kinasa intrínseca. A diferencia de otros integrantes de esta familia, el

RI completo es una glicoproteína heterotetramérica compuesto por dos subunidades α

y dos subunidades β unidas entre sí por puentes disulfuro de la forma (αβ)2. La

subunidad α del RI es de 135 kDa y de ubicación extracelular, mientras que la

5

subunidad β pesa 95 kDa y contiene una porción extracelular, una secuencia

transmembrana y un dominio tirosina kinasa intracelular (19). Insulina se une a su

receptor a través de la subunidad extracelular α del mismo. Esta unión produce un

acercamiento de las dos subunidades α con lo cual se produce un cambio

conformacional que permite que el ATP se una al dominio intracelular de la subunidad

β. Esta unión activa la autofosforilación del receptor que a su vez activa la actividad

kinasa del mismo hacia sustratos proteicos intracelulares (20). Los primeros sustratos

proteicos en ser fosforilados son las proteínas sustratos del receptor de insulina (IRSs)

incluyendo IRS-1, IRS-2, IRS-3, IRS-4, Gab-1 y Shc, que están ligadas a la activación

de dos principales vías de señalización: la vía de la fosfatidil inositol 3- kinasa (PI3K) –

Akt/ proteína kinasa B (PKB), la cual es responsable de la mayoría de las acciones

metabólicas de insulina, y la vía de las MAPK (Ras- mitogen activated protein kinase),

que regula la expresión de algunos genes y junto con la vía PI3K controlan el

crecimiento celular y la diferenciación (21).

La unión de IRSs a la subunidad regulatoria de PI3K resulta en su activación, la cual

fosforila al fosfatidil inositol 4,5- bifosfato (PIP2) en la posición tres convirtiéndolo en

fosfatidil inositol 3,4,5- trifosfato (PIP3). Este fosfolípido activa las proteínas kinasas

PDK1 y PDK2, resultando en la activación de la proteína Akt/PKB y una proteína

kinasa C atípica (PKC λ y PKC ζ). La proteína kinasa B (Akt) activada fosforila al

sustrato de 160 kDa (AS160), el cual participa en la translocación de vesículas de

GLUT4 mediada por insulina hacia la membrana plasmática. La activación de aPKC

también está involucrada en esta translocación en respuesta a insulina (22).

Además de la vía de señalización de insulina dependiente de PI3K, otra rama

importante de esta vía compromete a la proteína Shc. Shc se une al receptor de

insulina activado y es fosforilada por un mecanismo similar a IRS-1, luego une una

proteína adaptadora, Grb2 (23). Esta unión resulta en la activación del factor de

intercambio de GTP, Sos que a su vez activa la GTPasa pequeña Ras, que recluta la

kinasa serina/treonina Raf a la membrana donde es completamente activada.

Posteriormente la señal es amplificada a través de dos kinasas río abajo: MAP kinasa

kinasa, MAPKK (MEK o ERK kinasa) y las kinasas reguladas extracelularmente, ERK

1/2, las que son únicamente reguladas por fosforilación. MEK es fosforilada en dos

residuos de serina por Raf y luego las ERK son fosforiladas en un residuo de tirosina y

6

en otro de treonina por MEK (24). Esta rama dependiente de MAPK de la señalización

de insulina modula acciones tales como crecimiento, sobrevida y diferenciación (25).

También se ha visto que la proteína c-Cbl participa de manera relevante en la

acción de insulina. Esta función estaría regulada por dos proteínas adaptadoras, APS

(adapter containing PH and SH2 domains) y CAP (Cbl-associated protein). CAP

interactúa constitutivamente con Cbl a través de su dominio SH3 C- terminal. Luego de

la estimulación, el receptor de insulina cataliza la fosforilación de APS en tirosina. Una

vez fosforilada, APS recluta a c-Cbl hacia el receptor de insulina para posteriores

fosforilaciones en tirosina. Luego de la fosforilación de Cbl, el complejo CAP/Cbl migra

hacia la membrana plasmática, esto conduce al reclutamiento del complejo Crk/C3G

hacia la membrana donde C3G, un factor de intercambio de GTP activa a la proteína G

pequeña TC10. La activación de TC10 ocurre de manera independiente de la vía PI3K

y parece colaborar en la translocación de GLUT4 hacia la membrana estimulada por

insulina (26).

1.4. IGF-1 y su sistema transduccional

IGF-1 es un péptido de cadena simple de 70 aminoácidos estructuralmente

homólogo a la pro-insulina. Es sintetizado principalmente en el hígado y el riñón

aunque la producción de manera local en otros tejidos pareciera ser importante para

mediar, a través de mecanismos paracrinos o autocrinos, los efectos anabólicos y de

promoción del crecimiento de la hormona del crecimiento (GH). IGF-1 circula unido a

proteínas transportadoras (IGFBPs), las cuales sirven además para prolongar su vida

media, modular la especificidad de tejidos y potenciar o neutralizar sus acciones

biológicas (27). El receptor de IGF-1 (IGF-1 R) y el receptor de insulina (RI) comparten

un alto grado de identidad en sus estructuras. Al igual que el receptor de insulina, el

receptor de IGF-1 está compuesto de dos subunidades α extracelulares donde se une

el ligando y dos subunidades β transmembrana que poseen actividad tirosina kinasa

intrínseca. El mayor grado de homología entre el receptor de insulina y el receptor de

IGF-1 se encuentra en el dominio transmembrana con actividad tirosina kinasa

intrínseca (subunidades β) con alrededor de 84% de homología, mientras que el mayor

grado de diferencia se encuentra en los dominios C- terminales, donde comparten

alrededor de un 44 % de identidad (28).

7

La unión de IGF-1 a su receptor promueve la dimerización del receptor y la

autofosforilación en residuos de tirosina, conduciendo a la posterior fosforilación de

proteínas tales como las proteínas sustratos del receptor de insulina (IRSs) y el

acoplamiento de proteínas que contienen homología Src (Shc) (29), transduciendo

señales a efectores río abajo. A través de estos efectores, IGF-1 activa dos cascadas

de señalización principales, la vía Ras- Raf- MEK- ERK y la vía PI3K- Akt/PKB (30).

1.5 Acciones de insulina en el corazón

Los principales blancos de insulina son el músculo esquelético, el tejido adiposo y el

hígado, aquí la insulina participa en la regulación de etapas críticas en el metabolismo

intermediario. Sin embargo, muchos otros tejidos expresan receptores de insulina y por

lo tanto sus funciones podrían estar reguladas por este péptido. Entre las acciones de

insulina en el corazón podemos distinguir algunas indirectas y otras directas. Insulina

aumenta la síntesis de proteínas y suprime su degradación en hígado y músculo

esquelético contribuyendo a la economía de carbohidratos y nitrógeno. A su vez afecta

la degradación de triglicéridos en el tejido adiposo, aumentando la disponibilidad de

ácidos grasos que pueden ser sustratos de la β-oxidación (31). Estos efectos

constituyen acciones indirectas.

Insulina también posee acciones directas sobre el metabolismo cardíaco como por

ejemplo en la captación de glucosa, el metabolismo de ácidos grasos, y la glicólisis. En

cuanto a la captación de glucosa se sabe que se requiere insulina para promover la

translocación del transportador de glucosa más distribuido en el corazón, GLUT4 hacia

la membrana celular desde compartimientos intracelulares a través de tráfico de

vesículas (32). No obstante, insulina no es el único estímulo que induce captación de

glucosa sino también lo hacen la contracción del tejido cardíaco (33) y el ejercicio

aunque de distintas maneras (34). Más aún, insulina estimula la captación de glucosa a

través de la promoción de la expresión génica de GLUT (32).

En ausencia de estímulo, los transportadores GLUT-4 permanecen en

compartimientos intracelulares con una combinación de exocitosis lenta y endocitosis

rápida (35). Insulina promueve la translocación de GLUT-4 a la membrana celular a

través de la estimulación de la exocitosis y también disminuye la endocitosis. El efecto

8

de estimulación de insulina sobre la captación de glucosa alcanza 2 a 14 veces en los

cardiomiocitos y ha sido atribuida principalmente a la translocación de GLUT-4 (36).

Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos contribuyen en un 70% al ATP total

generado por un corazón aeróbico. Insulina controla los niveles circulantes de ácidos

grasos y lipoproteínas actuando sobre el tejido adiposo y sobre el hígado, pero también

regula el metabolismo de ácidos grasos en el corazón. Sin embargo, el corazón tiene

baja capacidad de sintetizar y almacenar ácidos grasos, por lo cual recibe ácidos

grasos exógenos como ácidos grasos unidos a albúmina y lipoproteínas ricas en

triglicéridos tales como la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y los

quilomicrones (37). Además, insulina regula la síntesis de lipoproteina lipasa en

cardiomiocitos, enzima responsable de la hidrólisis de triglicéridos plasmáticos en la

superficie del lumen de las células vasculares endoteliales (31), liberando ácidos

grasos a la circulación y permitiendo su disponibilidad para el corazón.

Otro proceso metabólico afectado por insulina es la glicólisis. La vía glicolítica

permite producir dos moléculas de piruvato a partir de una molécula de glucosa- 6-

fosfato y tiene la ventaja de producir ATP sin requerir de oxígeno (38). En este proceso

hay varios pasos involucrados, pero la fosfofructokinasa-1 es considerada una de los

participantes más importantes de esta vía, más específicamente, la enzima regulatoria

clave. Esta enzima cataliza la transformación de fructosa 6-fosfato a fructosa 1,6-

bifosfato, utilizando un ATP.

La enzima fosfofructokinasa es inhibida por altos niveles de ATP o citrato y el

control de esta enzima es crucial para regular la glicólisis. Es conocido que la forma

cardiaca de fosfofructokinasa- 2, la cual es una enzima bifuncional que forma fructosa

2,6 bifosfato, un activador alostérico potente de la proteína limitante de la glicólisis,

fosfofructokinasa-1 (39), tiene una función importante en la activación de la glicólisis

estimulada por insulina. Este rol está dado tal vez por el control que ejerce la fructosa

2,6-bifosfato sobre la enzima fosfofructokinasa- 1 debido a que es capaz de superar los

efectos inhibitorios del ATP (40).

La hexokinasa también es afectada por insulina de manera indirecta. La hexokinasa

puede ser inhibida por la glucosa 6-fosfato, por lo tanto cuando los niveles de insulina

disminuyen, hay una acumulación de fructosa 6-fosfato y de glucosa 6-fosfato que es

una consecuencia de la carencia de estimulación de la fosfofructokinasa-1. Sin

9

embargo, altos niveles de insulina estimulan la fosfofructokinasa- 1 y no hay inhibición

de la hexokinasa. Hay algunos trabajos que declaran que la estimulación de la glicólisis

por insulina en el corazón está dada por el reclutamiento de GLUT-4 y también por el

aumento de fructosa- 2,6- bifosfato (41) y que esta activación de la fosfofructokinasa-2,

así como el transporte de glucosa, está mediada por la PI3K, uno de los componentes

de la vía de señalización de insulina (42).

1.6. Calcio

El calcio es un mensajero muy ubicuo y de mucha importancia para la señal

intracelular en las células vivas que ha demostrado regular diversas actividades como

por ejemplo la transcripción de genes, la proliferación celular y la contracción muscular.

Las células modulan la duración, la amplitud, la frecuencia y la extensión espacial de

los eventos de señalización de calcio, razón por la cual el calcio regula procesos tan

variados como los antes mencionados (43). Las señales de calcio pueden ocurrir del

orden de los microsegundos para desencadenar procesos como la exocitosis, del

orden de minutos u horas para controlar el crecimiento celular y la transcripción génica

y también pueden ocurrir en distintos espacios celulares, pueden llevarse a cabo en

dominios microscópicos, entrar a organelos o permanecer en el citoplasma para

producir una señal en toda la célula, así como también puede coordinar las actividades

entre células vecinas, ya sea difundiendo a través de uniones “gap” o por liberación de

mensajeros paracrinos (44).

Es así como cada tipo celular expresa un conjunto único de componentes de la

señalización de calcio para crear sistemas de señalización de calcio con diferentes

propiedades espaciales y temporales. Casi todos los sistemas de señalización de

calcio funcionan generando pulsos breves de calcio que son creados por variaciones

en las llamadas reacciones de encendido que son aquellas que introducen calcio al

citoplasma y las de apagado a través de las cuales las señales de calcio son

removidas ya sea por acción de tampones, bombas e intercambiadores (45).

Específicamente en el corazón, el calcio además contribuye a alcanzar la

despolarización celular de manera sincronizada y posteriormente a activar proteínas

contráctiles a través del mecanismo de ECC. Como se describió anteriormente, este

10

mecanismo consiste en la ocurrencia de la liberación de calcio desde reservorios

intracelulares, principalmente el retículo sarcoplásmico, en respuesta a la

despolarización de la membrana plasmática a través de los canales- receptores de

Ryanodina (RyR), proceso conocido como liberación de calcio inducida por calcio

(CICR) (46). Sin embargo, el calcio no sólo es importante para la contracción y

relajación normal del músculo, sino también es un importante segundo mensajero de

varias vías de señalización en el corazón. Se ha observado que la homeostasis del

calcio, así como también las vías de señalización dependientes de calcio son

importantes en el desarrollo de hipertrofia, insuficiencia y arritmias cardiacas (47).

1.7. Insulina y calcio

La regulación del calcio intracelular en el miocardio es determinante de la función

contráctil. Es por esta razón que en diversos estudios se ha planteado la posibilidad de

que la homeostasis del calcio en las células tenga alguna implicancia en la

cardiomiopatía diabética. Se ha observado que en animales diabéticos hay defectos en

la contracción que incluyen disminuciones en las cinéticas de acortamiento y relajación,

es decir, menor velocidad de contracción, prolongación de la contracción y retraso de

la relajación y también disminución en la presión, menor gasto cardiaco y menor

frecuencia cardiaca en reposo (48). Asimismo, se postula que los contenidos de calcio

de corazones diabéticos pueden estar alterados debido a que defectos en la

contractilidad cardiaca pueden deberse a cambios en la capacidad del miocardio para

regular el calcio durante la diabetes (49).

Los efectos de insulina sobre los niveles de calcio intracelular y sobre las corrientes

de calcio provenientes del exterior han sido objeto de algunos estudios en distintos

tipos celulares. En hepatocitos de rata, insulina aumenta las oscilaciones de calcio en

el núcleo de estas células y este aumento es independiente del calcio extracelular,

pero cuya señalización involucraría a la proteína fosfolipasa C (PLC) y al inositol

trifosfato (IP3) atribuyéndole un rol a insulina en el crecimiento del hígado y su

regeneración (50).

Acercándonos más a nuestro modelo celular, en músculo esquelético de ratas

neonatas se observó que insulina estimula las corrientes de calcio de canales tipo L

11

produciéndose un aumento en el calcio intracelular debido a la apertura posterior de los

canales- receptores de Ryanodina y que no involucraría según los resultados la vía

PLC-IP3. (29). Más aún, existen estudios previos en este mismo tipo celular que

especifican aumentos en el calcio intracelular estimulado por insulina particularmente

localizados en la zona próxima a la membrana celular y no en el calcio citosólico global

(51).

Por otro lado, se ha visto en ratones diabéticos tipo 1 que poseen un defecto en la

contractilidad cardiaca y una disminución de las corrientes de calcio de canales tipo L

debido a una menor actividad de señalización de la vía PI3K en el corazón (52). A su

vez, de manera concordante con estos datos, se ha demostrado en cardiomiocitos

auriculares de humanos y en cardiomiocitos ventriculares de ratas adultas a través de

técnicas electrofisiológicas que insulina induce un aumento en las corrientes de calcio

tipo L en un 86 ± 11% y un 140 ± 12 % respectivamente sobre los niveles basales

(53,54).

Estudios previos en nuestro laboratorio utilizando cardiomiocitos de rata neonata

como modelo, han logrado establecer que insulina produce un aumento transitorio en

el calcio intracelular compuesto por dos señales diferentes. La primera provendría de la

apertura de los canales de calcio tipo L y la posterior apertura de los canales-

receptores de Ryanodina y la segunda de la liberación de calcio desde el retículo

sarcoplásmico mediada por el receptor de IP3 (55).

Como se ha planteado anteriormente, existen diversos estudios que avalan la

participación de insulina en la homeostasis del calcio intracelular en distintos modelos

celulares. Particularmente en el corazón, se han evaluado los efectos de insulina sobre

los movimientos de calcio llegando a establecerse que insulina induce un aumento en

las corrientes de calcio mediadas por los canales tipo L y un aumento en el calcio

intracelular a través de los receptores de Ryanodina y de IP3 en el retículo

sarcoplásmico. No obstante, a la fecha no se ha establecido el rol de insulina en la

regulación del calcio en el cardiomiocito adulto que corresponde a un modelo que se

asemeja más al fisiopatológico real y que posee diferencias marcadas en el fenotipo y

genotipo con el cardiomiocito neonato. Estas variaciones nos conducen a pensar en

posibles disimilitudes en su comportamiento frente a insulina, por lo tanto nos parece

fundamental estudiar la relación insulina y calcio en el cardiomiocito adulto.

12

2. HIPOTESIS

Insulina induce un aumento en los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito

adulto a través de un mecanismo dependiente del Ca2+ extracelular y del almacenado

en reservorios intracelulares.

3. OBJETIVO GENERAL

Estudiar el papel del Ca2+ como segundo mensajero de la acción de insulina en

cardiomiocitos adultos aislados.

4. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estudiar la activación canónica del sistema transduccional de insulina en

cardiomiocitos aislados de corazón de rata adulta.

Caracterizar las cinéticas de Ca2+ inducida por diferentes concentraciones de

insulina en medio de reposo con y sin calcio externo.

Caracterizar las cinéticas de Ca2+ inducida por diferentes concentraciones de

IGF-1 en medio de reposo con y sin calcio externo.

Estudiar la participación del Ca2+ en la activación de la vía de señalización

canónica de insulina.

13

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Reactivos

Los siguientes reactivos se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,

EEUU), medio M199, SDS, NaVO4, PMSF, glicerol, DTT, Tween-20, ácido pirúvico

(Cat. No. 501568), reactivo de Folin Ciocalteau, 2,3-butanodiona monoxima (Cat. No.

B0753-100G), anticuerpo monoclonal anti-beta-actina (Cat. No. A5316) y anticuerpo

monoclonal anti-beta-tubulina (Cat. No. T0198). De Merck (Darmstadt, Alemania) se

obtuvieron: NaOH, HCl, Na2CO3, Na2HPO4, CuSO4•5H2O, NaF, pirofosfato de sodio,

Tritón X-100, MgCl2, 2-propanol. De Amresco (Solo, OH, EEUU): NaCl, leupeptina,

aprotinina, HEPES sal sódica, Tris base, acrilamida, bisacrilamida, EGTA. De

Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU) se adquirió: laminina (natural mouse, Cat. No. 23017-

015). De Molecular Probes (actualmente subsidiaria de Invitrogen) se obtuvieron:

fluo3-acetoximetilester (Fluo3-AM), BAPTA-AM, ácido plurónico y Alexa fluor 488 anti-

rabbit. De Winkler (Santiago, Chile) se obtuvieron: KCl, 2-mercaptoetanol, TEMED,

BSA. De Calbiochem (La Jolla, CA, EEUU) se adquirieron: anti-IgG conejo, anti-IgG

ratón. Los anticuerpos primarios anti p-Akt, Akt, p-Erk, p-RI se adquirieron en Cell

Signaling Technology. El anticuerpo primario anti Erk1/2 (K-23) se obtuvo de Santa

Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EEUU). Otros reactivos: reactivo de Bradford

(BioRad, EEUU), Dako (Dako Cytomation, CA, EEUU). El reactivo quimioluminiscente

para Western blot (Western Lightning) se adquirió en PerKinElmer Life Sciences, Inc.

(Boston, MA, EEUU). Ketamina y xilazina utilizadas fueron de uso veterinario.

Colagenasa A (Cat. No. 11088793001) se adquirió de Roche (Mannheim, Alemania).

5.2. Animales

Se utilizaron ratas macho Sprague- Dawley adultas de aproximadamente 2 meses

de edad con un peso entre 200- 250 g, provenientes del bioterio de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. Todos los estudios con

animales contaron con la aprobación del Comité de Bioética de nuestra institución.

14

Esta investigación se realizó acorde a la guía “Guide for the care and use of laboratory

animals” publicada por Instituto de Salud de Estados Unidos, (NIH publicación N°85-23,

revisada en 1985).

5.3. Obtención de cardiomiocitos de rata adulta

Las ratas se anestesiaron con una mezcla ketamina: xilacina (2:1). Luego se extrajo

el corazón desde la cavidad torácica y se puso en un recipiente que contenía buffer

Gerard (0,19 mM NaH2PO

4, 1,01 mM Na

2HPO

4, 10 mM HEPES, 128 mM NaCl, 4 mM

KCl, 1,39 mM MgSO4, 5,5 mM glucosa, 2 mM ácido pirúvico, pH 7,4) frío.

Inmediatamente el corazón se canuló a través de la arteria aorta en una bomba

peristáltica para proceder a una retroperfusión. Se hizo pasar por el corazón 3

soluciones en medio Gerard consecutivamente: CaCl2 2,6 mM por 1 min o hasta que el

corazón no contuviera sangre, EGTA 2,5 mM por 2 min o hasta que dejase de

contraerse el corazón y colagenasa A 0,1- 0,13% por 30 min en recirculación para

digerir el corazón. Una vez finalizado este proceso el corazón se retiró de la bomba, se

cortó longitudinalmente y se disgregó mecánicamente con ayuda de un par de pinzas.

Posteriormente se introdujo en una botella plástica, se agregó solución de colagenasa

A y se llevó a baño termorregulado (37°C) por 15 min y en constante agitación. Luego

se tomó el sobrenadante y se traspasó a un tubo plástico de 15 mL y se centrifugó por

2 min a 500 rpm para obtener los cardiomiocitos adultos separados de otros tipos

celulares. El tejido remanente se volvió a poner en agitación con nueva solución de

digestión en el baño termorregulado. Una vez obtenidos los pellets celulares de al

menos 2 digestiones en el baño termorregulado, las células se resuspendieron en

M199 (HEPES modificado) suplementado con 2,3-butanodiona monoxima (BDM) 5 mM

(para evitar la contracción y favorecer el pegado de las células) y se procedió al

sembrado de los cardiomiocitos en las placas de trabajo pre tratadas durante 24 h. con

laminina 5 µg/mL en PBS estéril. Después de 15 min se cambió el medio de las células

por M199 fresco con/sin BDM dependiendo del experimento que se realizaría.

Finalmente las células se incubaron (5% CO2 y 95% aire a 37°C) 2-3 h antes de

realizar los ensayos.

15

5.4 Obtención de extractos proteicos para electroforesis

Luego de los tiempos de estímulos necesarios para realizar los experimentos las

células se lavaron con PBS (NaCl 80%, KCl 2%, Na2HPO4 *7H2O 19,5%, KH2PO4 0,2%

(p/v)) frío (4°C) 3 veces. Posteriormente, las células se trataron con buffer de lisis (10

mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Tritón X-100, 1% deoxicolato, 5 mM

EDTA) suplementado con 20 mM NaF, 1 mM pirofosfato de Na, 1 mM NaVO4, y 1 mM

PMSF, 1 µg/mL leupeptina, 1 µg/mL aprotinina. Una vez obtenido el lisado celular, este

se centrifugó a 15.000 rpm por 10 min a 4°C y posteriormente se separó el pellet

(desecho) del sobrenadante puesto que esta última es la fracción utilizada.

La concentración de proteínas de las muestras se determinó a través de 2 métodos:

Bradford (Bio-Rad protein assay) y Lowry. Posterior a la cuantificación, las muestras se

prepararon utilizando un 25% de tampón SDS-PAGE 4x (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 32%

v/v glicerol, 20% 2-mercaptoetanol, 9,2% SDS, 0,02% azul de bromofenol), fracciones

solubles de las muestras (c.s.p.) y H2O (c.s.p.) y se incubaron por 7 min a 95ºC. Luego

se guardaron las muestras a -20°C.

5.5. Determinación de proteínas

5.5.1. Método de Lowry

Para este método primero se preparó el reactivo A mezclando partes iguales de una

solución de cobre-tartrato-carbonato (preparado por mezcla de 50 mL de 0,2% p/v

CuSO4•5H2O y 0,4% p/v tartrato dipotásico con 50 mL de 20% p/v Na2CO3), SDS 10%

y NaOH 0,8N. Luego se preparó el reactivo B diluyendo 1 volumen del reactivo de Folin

Ciocalteau con 5 volúmenes de agua nanopura. Posteriormente en tubos Eppendorf se

mezcló 5 µL de muestra de proteínas con 395 µL de agua nanopura y 400 µL de

reactivo A, se dejó reposar por 10 min a temperatura ambiente y luego se agregó 200

µL de reactivo B (Folin). Esta mezcla se incubó a 40ºC por 30 min y se midió la

absorbancia a 750 nm. Para realizar la curva de calibración se utilizó albúmina de

suero bovino (BSA).

16

5.5.2. Método de Bradford

Se mezclaron 5 µL de muestra con 200 µL de reactivo de Bradford (Bio-Rad protein

assay) y 795 µL de agua. Se midió absorbancia a 595 nm. Como estándar para realizar

la curva de calibración se utilizó albúmina de suero bovino (BSA).

5.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida

La separación de las proteínas de acuerdo a su masa molecular se realizó mediante

electroforesis en geles de poliacrilamida entre el 8% y 12%. Para la detección se

cargaron entre 25 y 40 µg de extracto proteico. La electroforesis se realizó a un voltaje

constante de 100 Vs por 2,5 h. en tampón de electroforesis 1x que se obtuvo a partir

de una dilución de buffer de electroforesis 10x (tris base 30,25 g, glicina 144 g, SDS 10

g, agua 1000 mL).

5.7. Electrotransferencia de proteínas

Una vez realizada la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una

membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm (BioRad) a amperaje constante (400 mA)

durante 90 min en tampón de transferencia 1x que se obtuvo mezclando 100 mL de

tampón de transferencia 10x (glicina 144 g, tris base 30,25 g, agua 1000 mL), 200 mL

de metanol y 700 mL de agua destilada.

5.8. Inmunowestern blot

Una vez transferidas, las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo (TBS

1x; Tween-20 0,1%; BSA 3%) durante 60 min a temperatura ambiente y posteriormente

se incubaron con los anticuerpos primarios en solución de bloqueo toda la noche a las

diluciones recomendadas por los fabricantes: pAkt, Akt, pERK, pRI 1:1000; ERK 1/2

(K23), tubulina, actina 1:2000 y a 4°C.

Posterior a la incubación con los anticuerpos primarios, las membranas se lavaron 3

veces por 5 min con TBS 1X / Tween-20 al 0,1%, y se incubaron por 2 h a temperatura

17

ambiente con anti-IgG de ratón o conejo, según correspondiera, conjugados con

peroxidasa, en solución de bloqueo a un título de 1:5.000.

Una vez pasado el tiempo de incubación con el anticuerpo secundario las

membranas fueron lavadas 3 veces por 5 min con TBS 1x - Tween-20 al 0,1% y se

procedió a la detección de la unión específica de los anticuerpos a las proteínas. Para

esto, las membranas se incubaron por 1 min en solución de ECL (enhanced

chemiluminescence) y luego se expusieron a la película de fotografía Kodak-Biomax.

Las películas obtenidas se digitalizaron y las imágenes se analizaron por densitometría

mediante el programa ImageJ 1.42q.

Para detectar otras proteínas en las mismas membranas, éstas se sometieron a un

proceso que permite quitar los anticuerpos adheridos a la membrana en corto tiempo

(“mild stripping”: glicina 1,5% p/v, SDS 0,1% p/v, tween 20 1% v/v, pH 2,2). Posterior a

este proceso, las membranas se lavaron 3 veces por 5 min con TBS 1x- Tween-20 al

0,1% y luego se procedió a bloquear nuevamente las membranas y de esta manera se

continuó con el proceso anteriormente descrito.

5.9. Determinación de los niveles intracelulares de calcio

Para realizar estos ensayos se trabajó con células adheridas en cubreobjetos de

25 mm (pre-tratados con laminina 5 µg/mL) que a su vez estaban contenidos en placas

de 6 pocillos o 35 mm. Los cardiomiocitos adultos se lavaron utilizando medio Krebs

con calcio (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1

g/mL glucosa, pH 7,4), se incubaron con la sonda fluorescente para calcio Fluo3-AM

(5,5 µM) durante 25 min a temperatura ambiente y luego se lavaron nuevamente con

medio Krebs con calcio o sin calcio (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,0 mM EGTA, 1 mM

MgCl2, 10 mM HEPES-Na, 5,6 mM glucosa, pH 7,4) dependiendo del experimento que

se llevaría a cabo. Luego el cubreobjetos que contenía las células fue montado en una

cámara especial de 1 mL de capacidad y esta cámara se posicionó en un microscopio

confocal (Carl Zeiss Axiovert 135 M-LSM Microsystems) a través del cual se realizaron

los registros. Las imágenes fluorescentes se recolectaron cada 0.983 seg con el lente

63x, con una configuración para Fluo3-AM, excitación 488 nm; emisión 526 nm. y en

modo de campo completo o escaneo en línea según correspondiese.

18

Una vez obtenidos los registros, éstos se analizaron con el programa ImageJ 1.42q

midiendo la fluorescencia en una región óptica de interés (ROI) al interior de las células

y en todas las imágenes adquiridas. La intensidad de fluorescencia es proporcional al

calcio que se encuentra al interior de las células. Esta intensidad se expresó como

Porcentaje de fluorescencia relativa a la fluorescencia basal de cada célula.

5.10. Inmunofluorescencia indirecta

Los cardiomiocitos adultos se sembraron en cubreobjetos de vidrio pre-tratados

(18 mm) como ya se mencionó anteriormente, en placas de 12 pocillos. Transcurrido

el periodo de estimulación, las células se fijaron con paraformaldehído (4% p/v en PBS,

20 min), se permeabilizaron (PBS-0,3% v/v Tritón X-100, 30 min) y se bloquearon (2%

p/v BSA en PBS, 1 h). Este procedimiento se realizó sobre hielo a 4°C con lavados

entre cada paso, utilizando PBS frío (4°C). Posteriormente, las células se incubaron

con el anticuerpo primario, anti fosfo-Receptor de Insulina (RI) 1:100 diluido en PBS-

2% BSA toda la noche, se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario IgG de

conejo conjugado a Alexa 488, (1:400) diluido en PBS-2% BSA, con Rodamina-

Faloidina (1:500 para marcar la actina sarcomérica) y Hoescht (1:1.000 para marcar los

núcleos celulares) por 2 h y protegido de la luz. Finalmente, a los cubreobjetos se les

agregó 10 µL de DAKO para extender el tiempo de decaimiento del fluoróforo y fueron

montados en portaobjetos. Las muestras así tratadas se observaron en microscopio

confocal.

5.11. Caracterización de cardiomiocitos adultos

Los cardiomiocitos adultos que se utilizaron para realizar los experimentos

cumplían con ciertas exigencias ya sea analizando el cultivo en general o las células

individuales dependiendo de los experimentos que se llevarían a cabo.

5.11.1. Cardiomiocitos adultos para inmunowestern blot e inmunofluorescencia

Para realizar estos experimentos lo más importante fue evaluar la confluencia

de células lograda luego de la extracción en las placas de cultivo. Se consideró

suficiente una confluencia superior a 50% e insuficiente bajo este porcentaje. En el

19

caso de que las placas no alcanzaran la confluencia establecida, estas eran

desechadas ya que el número de células existentes no sería el necesario para llevar a

cabo estos experimentos de manera exitosa, representando un alto riesgo de fracaso

del experimento. La Figura 1A muestra dos cultivos representativos de ambos casos.

5.11.2. Cardiomiocitos adultos para medición de calcio por microscopía confocal

Para las mediciones de los niveles de calcio intracelulares la cantidad de

células no necesariamente debe ser muy alta, sin embargo, debido a que se registra

sólo un campo por cubreobjetos y en muchos casos este campo posee entre 1 a 3

cardiomiocitos adultos, es imperativo elegir muy bien las células que se van a registrar

basándose en características morfológicas de viabilidad. Lo primero que observamos

es la forma de la célula, esta debe ser tipo bastón, también conocida como “rod-shape”

y no células en forma esférica (“round-shape”) ya que esas son células apoptóticas que

se caracterizan por la compactación de su volumen celular. Es muy importante también

diferenciar las células viables de aquellas que a pesar de tener forma de bastón

corresponden a las llamadas células necróticas, que al igual que las células

apoptóticas no son viables y que se caracterizan por su estructura cilíndrica que solo

es mantenida por el citoesqueleto y en las cuales existe pérdida de la integridad de la

membrana celular junto con un aumento del volumen de la célula. En el caso de los

registros de calcio realizados en presencia de calcio externo se consideró además,

como muestra de viabilidad de los cardiomiocitos adultos, la presencia de contracción

celular, es decir, en lo posible, se registró sólo células que mantuvieran una

contracción basal constante. No obstante, debido a razones evidentes, para la elección

de células en las mediciones de calcio en ausencia de calcio extracelular solo nos

basamos en las características morfológicas de viabilidad mencionadas anteriormente.

21

Figura 1. Caracterización de los cardiomiocitos adultos. (A) Esta imagen (izquierda)

muestra el porcentaje de confluencia aceptable para realizar experimentos de Western blot e

inmunofluorescencia, mientras que a la derecha vemos una cantidad de células insuficientes

para este tipo de experimentos. (B) Viabilidad de cardiomiocitos adultos de acuerdo a su

morfología. (C) Cardiomiocito en su estado basal (izquierda) y en contracción (derecha).

5.12. Expresión de resultados y análisis estadístico

Los resultados mostrados corresponden al promedio ± SEM de, al menos, tres

experimentos independientes. Los datos se analizaron con el programa GraphPad

Prism5 y la significancia estadística se evaluó mediante test de Student o ANOVA de

una vía. Los post-test ANOVA utilizados fueron Tuckey´s o Dunnett según

correspondiera. Se consideró como límite de significancia estadística, valores de

p<0,05.

La fluorescencia se expresó como porcentaje de fluorescencia relativa a la

fluorescencia basal de cada célula,[(F-F0)/F0] x100, donde F representa el valor de

fluorescencia en cada punto y F0 representa el valor basal de fluorescencia.

22

6. RESULTADOS

6.1. Activación de la vía de señalización canónica de insulina en cardiomiocitos

adultos

Lo primero que se realizó a nivel experimental fue asegurarnos de que el sistema de

señalización de insulina funcionaba en nuestro modelo celular. Para este fin se

utilizaron dos técnicas previamente descritas en Materiales y Métodos, el

inmunowestern blot y la inmunofluorescencia indirecta. Los cardiomiocitos de rata

adulta se trataron con insulina 100 nM por distintos periodos entre 5 a 60 min.

Posteriormente, se evaluó la fosforilación de proteínas que canónicamente se activan

al ser estimulado el receptor de insulina por su ligando.

6.1.1. Efecto de insulina sobre la fosforilación del receptor de insulina

La Figura 2A muestra el resultado del Western blot para el receptor de insulina

fosforilado (p-RI) en cardiomiocitos adultos estimulados con insulina. Se observa que la

fosforilación del receptor en los residuos Tyr1150/1151 pasa de un basal prácticamente

inexistente a una fosforilación máxima al ser estimulado con insulina 100 nM por 5 min

(p<0,01). A medida que el tiempo de estímulo con insulina aumenta, la fosforilación del

receptor tiende a disminuir, sin embargo, esta tendencia no posee significancia

estadística.

La presencia del receptor de insulina (RI) fosforilado a los 5 min post-estimulación

con insulina se corroboró por inmunofluorescencia indirecta como se muestra en la

Figura 2B, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-fosfo receptor de insulina

(Tyr1150/1151), obteniéndose como resultado un aumento de la marca del p-RI

respecto al control y una localización subcelular más definida. A su vez, se puede

apreciar un pequeño desplazamiento de la colocalización de la marca del p-RI con

respecto a la actina sarcomérica en las células estimuladas con insulina en relación al

control.

23

6.1.2. Efecto de insulina sobre la fosforilación de Akt

Continuando río debajo de la vía de señalización del receptor de insulina se

investigó qué sucedía con la fosforilación de la proteína Akt en presencia de insulina

100 nM y a los tiempos anteriormente mencionados. La Figura 2C muestra que la

fosforilación de Akt alcanzó su máximo a los 5 min de estímulo (p<0,001). Este nivel de

fosforilación se mantuvo a los 10 min de estímulo y comenzó a decaer ya a los 20 min.

Esta fosforilación decayó drásticamente a los 60 min posteriores al pulso de insulina.

6.1.3. Efecto de insulina sobre la fosforilación de ERK 1/2

En el caso de las proteínas kinasas ERK 1/2 (Figura 2D) se observó un

comportamiento diferencial de la isoforma ERK 2 (p42) respecto a ERK 1 (p44),

reflejándose esta diferencia en que la fosforilación de ERK 1 casi no se modificó por la

acción de insulina en nuestro modelo; sin embargo, ERK 2 aumentó significativamente

su fosforilación (p<0,001), alcanzando su nivel máximo a los 5 min al igual que las

otras proteínas analizadas.

24

Figura 2. Insulina estimula la fosforilación del receptor de insulina (RI) y de las proteínas

kinasas Akt y ERK2 en el cardiomiocito adulto. La fosforilación del RI (A), Akt (C) y ERK2

(D) se evaluó mediante Western blot, observándose la máxima fosforilación para las 3 proteínas

a los 5 min de estímulo con insulina 100 nM. (B) Inmunofluorescencia contra el receptor de

insulina fosforilado. Los datos mostrados son representativos de un mínimo de 3 experimentos

independientes.

25

6.2. Efecto de insulina en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito

adulto

El efecto de insulina sobre los niveles intracelulares de calcio se evaluó utilizando

microscopía confocal y la sonda fluorescente Fluo3-AM como se describió en

Materiales y Métodos. Las mediciones se realizaron en ausencia o presencia de calcio

externo para estudiar la procedencia del calcio detectado por la sonda al interior de las

células.

Los análisis de los registros de mediciones de los niveles de calcio en presencia de

insulina ya sea utilizando medio externo con o sin calcio se efectuaron en distintas

zonas celulares: citoplasma, núcleo y membrana celular. La Figura 3 muestra una

representación gráfica de las zonas evaluadas en los cardiomiocitos adultos.

Figura 3. Identificación de zonas de análisis (ROI) en el cardiomiocito adulto. En la imagen

se señalan las 3 zonas analizadas para determinar si se producían movimientos de calcio

estimulados por insulina.

26

6.2.1. Efecto de insulina en los niveles de calcio intracelular de cardiomiocitos

adultos en ausencia de calcio externo

Para estudiar los cambios que pudiese producir insulina en el calcio, los

cardiomiocitos adultos se expusieron a distintas concentraciones de insulina (Ins) entre

10 nM y 10 µM, manteniéndolos en una primera instancia sin calcio externo con el fin

de investigar si el calcio que pudiera movilizar insulina en el cardiomiocito adulto

proviene de reservorios intracelulares. A partir de estos experimentos se obtuvo las

cinéticas de calcio que se observan en las figuras sucesivas. Estas mediciones se

efectuaron en el modo campo completo.

La primera zona evaluada fue el citoplasma celular. La Figura 4A muestra las

cinéticas de calcio desprendidas del análisis de una región de interés (del inglés

“region of interest”, ROI) ubicada en el citoplasma del cardiomiocito representativas de

cada una de las concentraciones de insulina ensayada.

Debido a que a simple vista, basándose en las cinéticas de calcio, pareciera no

haber liberaciones de este catión desde reservorios intracelulares estimuladas por

insulina, se expresó las mediciones en variables objetivas como fluorescencia relativa

promedio y fluorescencia relativa máxima posterior al estímulo con respecto a los

valores basales y a su vez con respecto a los controles (cinéticas no mostradas), dado

que en la mayoría de las cinéticas pareciera haber una pendiente en la fluorescencia

que a medida que transcurre el tiempo se mantiene, pero cuya fluorescencia cada vez

se hace mayor. La Figura 4B muestra los gráficos correspondientes a fluorescencia

relativa promedio y fluorescencia relativa máxima evaluadas en el citoplasma celular.

Como se observa en estos gráficos no hay diferencias significativas en ninguno de

estos dos parámetros.

Como se mencionó anteriormente, además del citoplasma celular, se analizó la

zona nuclear y aquella próxima a la membrana plasmática del cardiomiocito adulto. La

Figura 5A muestra las cinéticas de calcio representativas correspondientes al análisis

de la región de interés (ROI) ubicada en alguno de los dos núcleos celulares del

cardiomiocito adulto para las concentraciones de 10 nM, 100 nM, 1 M y 10 M de

insulina (Ins). En la figura 5B se muestran los gráficos de fluorescencia relativa

promedio y fluorescencia relativa máxima que se realizaron a partir de las cinéticas de

calcio. A su vez, en la Figura 6A se muestran las cinéticas de calcio correspondientes

27

al análisis de la región de la membrana de los cardiomiocitos adultos a las distintas

concentraciones antes mencionadas de insulina y en la Figura 6B se presenta la

fluorescencia relativa promedio y fluorescencia relativa máxima para la misma zona. Al

igual que en la región citoplasmática, en las regiones nucleares y de membrana los

niveles de calcio intracelular no se ven afectados al estimular las células con insulina.

La mayoría de los registros de movimientos de calcio se acompañaron de

controles positivos que permiten demostrar que las células responden a otros

estímulos distintos de insulina y que el método utilizado es adecuado y que, por lo

tanto, en nuestro modelo celular no hay liberación de calcio desde reservorios

intracelulares dependiente de insulina de manera detectable con Fluo3-AM.

28

Figura 4. Efecto de insulina sobre la liberación de calcio desde reservorios intracelulares

en el cardiomiocito adulto evaluado en el citoplasma celular. (A) Los cardiomiocitos se

trataron con distintas concentraciones de insulina en medio de reposo sin calcio y fueron

sometidos a mediciones de calcio mediante microscopía confocal. (B) Las fluorescencias

relativas promedio y máxima no se ven modificaron significativamente por las concentraciones

de insulina ensayadas de forma detectable con Fluo3-AM. Los datos son representativos de 3

experimentos independientes.

29


en el cardiomiocito adulto evaluado en el núcleo celular. (A) Los cardiomiocitos se trataron

con distintas concentraciones de insulina en medio de reposo sin calcio y fueron sometidos a

mediciones de calcio mediante microscopía confocal. (B) Las fluorescencias relativas promedio

y máxima no se modificaron significativamente por las concentraciones de insulina ensayadas

de forma detectable con Fluo3-AM. Los datos presentados son representativos de, al menos, 3


30


en el cardiomiocito adulto evaluado en la membrana celular. (A) Los cardiomiocitos fueron

tratados con distintas concentraciones de insulina en medio de reposo sin calcio y sometidos a


y máxima no cambiaron significativamente. Los resultados son representativos de, al menos, 3


31

6.2.2. Efecto de insulina en los niveles de calcio intracelular y frecuencia de

contracción de cardiomiocitos adultos en presencia de calcio externo

Posterior a las mediciones realizadas en ausencia de calcio, se estudió si insulina

inducía un aumento de calcio en el interior de los cardiomiocitos adultos dependiente

de una entrada de calcio desde el extracelular, ya que según lo observado

anteriormente insulina no produce liberaciones de calcio detectables con Fluo3-AM

desde reservorios intracelulares del cardiomiocito adulto.

Con este fin, los cardiomiocitos se cultivaron en presencia de calcio externo durante

las mediciones de calcio y expusieron a distintas concentraciones de insulina: 10 nM,

100 nM, 1 µM y 10 µM. La Figura 7A muestra las cinéticas representativas derivadas

del análisis del citoplasma celular obtenidas de estos ensayos. En la Figura 7B se

muestran los datos cuantitativos del efecto de insulina en sus distintas concentraciones

sobre el calcio intracelular de cardiomiocitos en presencia de calcio externo medido en

una región de interés ubicada en el citoplasma celular. Estos gráficos muestran que no

hay diferencias significativas en las fluorescencias relativas promedio y máxima

posterior al estímulo con respecto a la fluorescencia previa al estímulo y comparado

con los controles.

Al igual que para las mediciones de cinéticas de calcio en ausencia de calcio

externo, también se evaluó el comportamiento de otras zonas del cardiomiocito adulto

en cuanto a los movimientos de los niveles de calcio intracelular. Cabe destacar que

como se mencionó previamente en Materiales y Métodos, las células elegidas para

estos registros presentaban un nivel de contracción basal y se usó como prueba de su

vialidad. En la Figura 8A se muestran las cinéticas de calcio correspondientes a la

evaluación de los niveles de calcio en un núcleo. La Figura 8B muestra los gráficos de

fluorescencia relativa promedio y fluorescencia relativa máxima de la misma zona. De

manera similar, la Figuras 9A y B presentan los movimientos de calcio evaluados en la

membrana celular y los correspondientes gráficos de fluorescencia relativa promedio y

fluorescencia relativa máxima desprendidos de estas cinéticas, respectivamente. El

análisis estadístico indicó que no hay diferencias significativas entre las fluorescencias

relativas promedio y máxima en células estimuladas con insulina y sus controles.

Estos resultados permiten concluir que insulina tampoco induce entrada de calcio

desde el medio extracelular a los cardiomiocitos adultos de manera detectable con

Fluo3-AM.

32

Figura 7. Efecto de insulina sobre los niveles de calcio intracelular en presencia de calcio

externo evaluado en el citoplasma celular. (A) Los cardiomiocitos se trataron con distintas

concentraciones de insulina en medio de reposo con calcio y fueron sometidos a mediciones de

calcio mediante microscopía confocal. (B) Las fluorescencias relativas promedio y máxima no

se modificaron significativamente por las concentraciones de insulina ensayadas de forma

detectable con Fluo3-AM. Los datos presentados son representativos de al menos 3


33


externo evaluado en el núcleo celular. (A) Los cardiomiocitos se trataron con distintas

concentraciones de insulina en medio de reposo con calcio y fueron sometidos a mediciones de

calcio mediante microscopía confocal. (B) Las fluorescencias relativas promedio y máxima no

cambiaron significativamente por las concentraciones de insulina ensayadas de forma

detectable con Fluo3-AM. Los datos presentados son representativos de al menos 3


34


externo evaluado en la membrana celular. (A) Los cardiomiocitos se trataron con

concentraciones crecientes de insulina en medio de reposo con calcio y fueron sometidos a


y máxima no se modificaron significativamente por insulina de forma detectable con Fluo3-AM.

Los datos presentados son representativos de al menos 3 experimentos independientes.

35

A continuación se evaluó si insulina tenía algún efecto sobre la frecuencia de

contracción de los cardiomiocitos adultos. Con este fin se realizaron experimentos con

cardiomiocitos adultos en presencia de calcio extracelular y registro en el modo

escaneo en línea (“line scan”). La Figura 10 muestra que insulina no cambia la

frecuencia de contracción de cardiomiocitos adultos a ninguna concentración de las

ensayadas. En esta serie de experimentos, la presencia de contractilidad sirvió como

medida cualitativa de viabilidad, además de las características morfológicas

comentadas en Materiales y Métodos.

A modo de resumen, la Figura 11A muestra un gráfico que presenta el

comportamiento del calcio intracelular del cardiomiocito adulto en presencia de insulina

100 nM, isoproterenol 10 µM e ionomicina 1 µM. Insulina no afecta los niveles de calcio

intracelular mientras que isoproterenol aumenta notoriamente la frecuencia de

contracción e ionomicina induce un drástico aumento en los niveles de calcio interno al

generar poros en la membrana plasmática. La Figura 11B muestra el aumento agudo

que produce insulina en los niveles de calcio intracelular en los cardiomiocitos

neonatos, acción previamente descrita por nuestro Laboratorio.

36

Figura 10. Efecto de insulina sobre la frecuencia de contracción de cardiomiocitos de rata

adulta. La frecuencia de contracción no se modificó significativamente a las concentraciones de

insulina ensayadas de forma detectable con Fluo3-AM.

Figura 11. Experimento que resume el efecto de insulina sobre los niveles de calcio

intracelular. Efecto secuencial de insulina (100 nM), isoproterenol (10 µM) e ionomicina (1 µM)

en los niveles intracelulares de calcio en cardiomiocitos adultos (A) o de insulina (100 nM) y KCl

(50 mM) en cardiomiocitos neonatos (B).

37

6.3 Efecto de IGF-1 sobre los niveles de calcio intracelular de cardiomiocitos

adultos

En la siguiente serie de experimentos se buscó investigar si IGF-1, un análogo

estructural de insulina, aumentaba los niveles de calcio intracelular en cardiomiocitos

adultos. Estos experimentos, de igual manera que los anteriores, se realizaron por

microscopía confocal utilizando la sonda Fluo3-AM para detectar los cambios del calcio

al interior de las células tanto en medio de reposo con y sin calcio externo. En estos

experimentos sólo se registraron los cambios en el citoplasma celular.

6.3.1. Efecto de IGF-1 en los niveles de calcio intracelular de cardiomiocitos

adultos en ausencia de calcio externo

Para estudiar el efecto de IGF-1 sobre el calcio intracelular de cardiomiocitos

adultos se expusieron las células a un medio externo en ausencia de calcio a fin de

dilucidar si IGF-1 estimulaba liberación de calcio desde los reservorios intracelulares.

Luego las células se trataron con dos concentraciones de IGF-1: 100 nM y 1 µM. Los

registros de las cinéticas y datos cuantitativos se muestran en las Figuras 12A-B,

respectivamente. Las fluorescencias relativas promedio y máxima muestran que no hay

diferencias significativas en los parámetros medidos a ninguna de las dos

concentraciones ensayadas (Figura 12B) Sin embargo, a 1 µM hubo una tendencia al

aumento de la fluorescencia relativa máxima, sin que llegara a ser significativa. En las

cinéticas representativas también se muestran controles positivos para descartar

problemas de viabilidad o fallas de la metodología empleada.

6.3.2. Efecto de IGF-1 en los niveles de calcio intracelular y frecuencia de

contracción de cardiomiocitos adultos en presencia de calcio externo

A fin de estudiar si existía un componente externo de calcio que pudiese ser

movilizado por IGF-1 se realizaron experimentos en presencia de calcio externo. A

similitud de los experimentos anteriores se utilizaron concentraciones de IGF-1: 100 nM

y 1 µM. La Figura 13A muestra las cinéticas de calcio representativas con los

respectivos controles positivos. La Figura 13B muestra que las fluorescencias relativas

máxima y promedio no se modificaron significativamente con IGF-1 respecto al

comportamiento basal de las células. También se apreció una tendencia a aumentar la

38

fluorescencia relativa promedio a 1 µM de IGF-1, pero que no alcanzó a ser

estadísticamente significativa.

Finalmente mediante el análisis de escaneo en línea se investigó si IGF-1

modificaba la frecuencia de contracción del cardiomiocito adulto. Los registros de

frecuencia de contracción de cardiomiocitos muestran que IGF-1 100 nM ó 1 µM no

modificaron significativamente este parámetro respecto al control (Figura 13C).

39

Figura 12. Efecto de IGF-1 sobre la liberación de calcio desde reservorios intracelulares

en el cardiomiocito adulto. (A) Los cardiomiocitos se incubaron con distintas concentraciones

de IGF-1 en medio de reposo sin calcio y fueron sometidos a mediciones de calcio mediante

microscopía confocal. (B) Las fluorescencias relativas promedio y máxima no se modificaron

significativamente a las concentraciones de IGF-1 ensayadas de forma detectable con Fluo3-

AM. Los datos presentados son representativos de 3 experimentos independientes.

40

Figura 13. Efecto de IGF-1 sobre el calcio intracelular en presencia de calcio externo y la

frecuencia de contracción. (A) Los cardiomiocitos se trataron con IGF-1 a las concentraciones

indicadas en medio de reposo con calcio y fueron sometidos a mediciones de calcio mediante

microscopía confocal. (B) Las fluorescencias relativas promedio y máxima y (C) la frecuencia

de contracción no cambiaron significativamente por acción del IGF-1 en forma detectable con

Fluo3-AM. Los datos presentados son representativos de al menos 3 experimentos

independientes.

41

6.3.3 Respuesta diferencial de cardiomiocitos adultos frente a IGF-1 1 µM en

presencia de calcio externo

A medida que realizamos los análisis correspondientes a IGF-1 1 µM advertimos

que los cardiomiocitos adultos tenían distintos patrones de respuesta al IGF-1. La

Figura 14A muestra una cinética de calcio correspondiente a las células que

respondían a IGF-1 y las imágenes representativas de cada período que comprende

esta cinética. La Figura 14B muestra que los movimientos de calcio intracelular no se

modificaron por acción del IGF-1 1 µM y las imágenes representativas de cada periodo

de tiempo. De un total de 23 células analizadas se observó que un 39% (9 células)

responde frente a IGF-1 1 µM mientras que un 61% (14 células) no lo hizo (Figura

14C).

Figura 14. Respuesta diferencial de cardiomiocitos adultos frente a IGF-1 1 µM. (A)

Cinética de calcio representativa de las células que responden frente a estímulos de IGF-1

aumentando el calcio intracelular y la frecuencia de contracción. (B) Cinética de calcio

representativa de células que no responden a estímulos de IGF-1. (C) Porcentaje de respuesta

a IGF-1 1 µM.

42

6.4. Participación del calcio en la activación de la vía de señalización del receptor

de insulina

A continuación se estudió a través de otra técnica distinta de la microscopía

confocal, si insulina participaba de alguna manera en movimientos de calcio al interior

de las células. Para este fin se investigó la fosforilación de dos proteínas blanco de

insulina: su propio receptor RI y la proteína kinasa Akt mediante Western blot tal como

se describe en Materiales y Métodos. A su vez, las células se preincubaron con

BAPTA-AM, un quelante de calcio que ingresa a la célula y/o EGTA, un quelante de

calcio que no atraviesa la membrana plasmática y que por lo tanto actúa sobre el

calcio extracelular.

6.4.1. Participación del calcio en la fosforilación del receptor de insulina

La Figura 15A muestra que el receptor de insulina se fosforila por acción de insulina

100 nM a los 5 min. La preincubación de los cardiomiocitos adultos con BAPTA- AM

(50 µM) y/o EGTA (2 mM) por 30 min previos al pulso de Insulina de 5 min mostró que

ninguno de los dos quelantes modificó la fosforilación del RI dependiente de insulina.

Es decir, el calcio externo y el interno no participan en la fosforilación del receptor de

insulina.

6.4.2. Participación del calcio en la fosforilación de Akt

La Figura 15B muestra que la proteína quinasa Akt se fosforila a los 5 min post-

exposición a insulina 100 nM. Los cardiomiocitos adultos, al igual que en la figura

anterior, se preincubaron con BAPTA- AM (50 µM) y/o EGTA (2 mM) por 30 min

previos al pulso de insulina. Los análisis muestran que la fosforilación de Akt aumentó

100 veces sobre el basal en presencia de insulina 100 nM por 5 min (p<0,001) y que

en presencia de BAPTA- AM (50 µM) esta fosforilación decayó a niveles cercanos al

basal con una diferencia estadísticamente significativa (p<0,001) con respecto a

insulina.

En el caso de la participación del calcio extracelular, EGTA 2 mM no afectó la

fosforilación de Akt y su magnitud es similar a la observada en presencia sólo de

43

insulina (p<0,001 vs control). En presencia de insulina, BAPTA- AM y EGTA, la

fosforilación de Akt fue menor en comparación a las células tratadas sólo con insulina

(p<0,01) y por lo tanto no habría participación del calcio extracelular en la fosforilación

de Akt.

Figura 15. Participación del calcio en la fosforilación del receptor de insulina y proteína

kinasa Akt. Las células se preincubaron con BAPTA- AM (50 µM) y/o EGTA (2 mM) por 30 min

previos a la estimulación con insulina 100 nM por 5 min. (A) La fosforilación del receptor de

insulina no se modificó por la presencia/ausencia de calcio intracelular ni extracelular. (B) La

fosforilación de la proteína Akt inducida por insulina disminuye en presencia del quelante

intracelular de calcio pero no se modifica por la presencia de EGTA. Los datos mostrados son

representativos de un mínimo de 3 experimentos independientes.

44

7. DISCUSION

Nuestro Laboratorio ha estado estudiando la acción de la insulina en el

cardiomiocito, su sistema de transducción y su vinculación con el metabolismo

energético, específicamente a nivel del transporte de glucosa y la regulación de la

dinámica mitocondrial. En un trabajo previo realizado en cultivos primarios de

cardiomiocitos neonatos se encontró que el calcio intracelular media los efectos de

insulina a nivel de la translocación del GLUT4 a la membrana plasmática y el posterior

ingreso de glucosa a estas células. El cardiomiocito neonato es el principal modelo

utilizado en la actualidad, caracterizándose por obtener ATP a través del metabolismo

de la glucosa. Por el contrario, el cardiomiocito adulto normal genera energía a través

de la utilización de ácidos grasos. Sin embargo, bajo condiciones de estrés se produce

un switch metabólico en el cardiomiocito adulto, retornando al uso de glucosa como

principal combustible energético. Dado estos antecedentes, en esta tesis se investigó

si esta nueva vía transduccional del receptor de insulina dependiente de calcio también

opera en el cardiomiocito adulto. En primer término en el presente trabajo se corroboró

la presencia del receptor de insulina en el cardiomiocito de rata adulta y que su

activación produce la autofosforilación del receptor y posterior aumento de los niveles

de las formas fosforiladadas de Akt y Erk ya a los 5 minutos de estimulación con

insulina tal como se ha observado en estudios anteriores (56). Estos hallazgos

permiten establecer que insulina activa la vía canónica de señalización del receptor de

insulina en el cardiomiocito adulto.

Por otra parte, utilizando las mismas herramientas experimentales que permitieron

estudiar los cambios en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito neonato,

no fue posible detectar movimientos de calcio intracelulares inducidos por insulina en el

cardiomiocito adulto. Insulina no estimuló el ingreso de calcio extracelular ni su

movilización desde reservorios intracelulares, pues células incubadas en ausencia de

calcio externo y otras en presencia de calcio externo no mostraron cambios en los

niveles de calcio al ser estimuladas con insulina de manera detectable con la sonda

utilizada. Más aún, los análisis realizados en las distintas zonas celulares del

cardiomiocito adulto arrojaron los mismos resultados. En ninguna de las zonas

analizadas, es decir, ni en el citoplasma, núcleo ni en la membrana celular se logró

45

detectar variaciones de los niveles de calcio inducidos por insulina. Estos datos difieren

en parte con algunos estudios previos donde se logró detectar aumentos de calcio

inducidos por insulina en núcleos de hepatocitos de rata adulta con la sonda Fluo4- AM

(50) y en los cuales a su vez en músculo esquelético se evaluaron los niveles de calcio

utilizando una sonda lipofílica derivada de Indo-1, conocida como FIP18, que permite

evaluar las señales de calcio en la zona cercana a la membrana celular (57), llegando

a la conclusión de que insulina producía aumentos en los niveles de calcio sólo en la

zona cercana a la membrana celular pero no en el calcio citosólico global detectado

utilizando la sonda Indo-1 que es de ubicación citoplasmática (51). No obstante, se

puede estar seguro de la bioactividad de insulina a partir de los resultados obtenidos

de los estudios de inmunofluorescencia y Western blot.

Para eliminar la posibilidad de la ausencia de resultados positivos debido a perdida

de la viabilidad celular, además de evaluar la morfología celular, en cada uno de los

registros de movimientos de calcio se realizaron controles positivos que permitieron

establecer que la célula seleccionada podría responder a estímulos que aumentan los

niveles de calcio intracelular. Con este fin, se utilizó KCl para despolarizar la membrana

celular (58) o ionomicina, un ionóforo para calcio utilizado para investigar procesos que

requieren movimientos de calcio (59). Las células estudiadas respondieron a estos

estímulos aumentando sus niveles intracelulares de calcio comprobando que nuestra

sonda detectaba niveles de calcio elevados y que las células respondían a estímulos

que producen aumentos del catión en su interior.

Como se mencionó anteriormente, nuestro laboratorio determinó la presencia de

transientes de calcio estimuladas por insulina en cardiomiocitos neonatos logrando

establecer que estas transientes estaban compuestas por dos señales claramente

identificadas. La primera dada por el ingreso de calcio desde el extracelular a través de

los canales dependientes de voltaje de tipo L y una posterior apertura de los canales

de calcio receptores de Ryanodina permitiendo un aumento brusco y agudo en el calcio

citosólico. La segunda señal está compuesta por la salida de calcio desde el interior del

retículo sarcoplásmico pero esta vez mediada por el receptor de IP3 (55). En base a

estos antecedentes se evaluó movimientos de calcio en cardiomiocitos neonatos con el

propósito de determinar si éramos capaces de detectar movimientos de calcio

inducidos por insulina en este modelo celular y así poder descartar la posibilidad de un

mal manejo del protocolo de medición de calcio. Es así como a partir de estos análisis

46

se logró reproducir los resultados obtenidos previamente en el laboratorio en

cardiomiocitos neonatos, lo cual indica que el procedimiento efectuado para concretar

las mediciones y los análisis de las mediciones de calcio se ejecutó adecuadamente.

También se estudió por microscopía confocal en el formato “line scan” si insulina

modifica la frecuencia de las espigas de calcio asociadas a la contracción. Los

resultados mostraron que insulina no modificó la frecuencia de contracción de

cardiomiocitos adultos a ninguna de las concentraciones ensayadas de manera

detectable con Fluo3- AM.

Debido a la similitud entre insulina e IGF-1 y a otros trabajos efectuados en nuestro

Laboratorio, se evaluó si IGF-1 produciría movimientos de calcio en el cardiomiocito

adulto. Como se indicó antes, datos previos señalan que IGF-1 aumenta los niveles de

calcio en cardiomiocitos de rata neonata a través de una vía de señalización que

involucra la participación de PI3K- PLC- IP3 (30). En base a estos antecedentes

efectuamos mediciones de calcio a través de microscopía confocal similares a los

realizados con insulina. IGF-1 no aumentó los niveles intracelulares de calcio ya sea

por su movilización desde el extracelular o del almacenado en reservorios

intracelulares. Usando los controles positivos respectivos y realizando evaluaciones

morfológicas de las células estudiadas, se estableció que las células eran viables. Sin

embargo, se observó que el 39% de las células estudiadas respondían a

concentraciones muy altas de IGF-1 (1 µM). Tampoco IGF-1 logró cambios en las

espigas contráctiles del cardiomiocito adulto, pudiendo establecer que IGF-1, al igual

que insulina, no modificó la frecuencia de contracción.

Finalmente se evaluó la participación del calcio en la activación de la vía de

señalización canónica de insulina en nuestro modelo celular. Los niveles del receptor

de insulina fosforilado no se modificaron por la ausencia de calcio intracelular lograda

con la presencia de BAPTA- AM ni en ausencia de calcio extracelular lograda con la

presencia de EGTA. Sin embargo, la fosforilación de la proteína kinasa Akt

dependiente de insulina disminuyó en presencia de BAPTA- AM, pero no en presencia

de EGTA. Estos resultados sugieren que el calcio intracelular claramente tiene un rol

en la activación de la vía de señalización de insulina en el cardiomiocito adulto ya que

la fosforilación de Akt en ausencia de este catión cae a niveles cercanos al basal. Por

lo tanto, este último dato invita a meditar acerca de la posibilidad de que tal vez la

sonda utilizada para medir los niveles de calcio intracelular no es la más adecuada,

47

aunque Fluo3- AM posee una Kd de 390 nM y en consecuencia tiene una sensibilidad

adecuada.

Los cardiomiocitos adultos son células bastante grandes que poseen túbulos T en

su membrana en estrecha relación con el retículo sarcoplásmico. Por lo tanto, en caso

de producirse liberaciones de calcio desde el retículo sarcoplásmico inducidos por

insulina, estas señales podrían estar localizadas en la proximidad de la membrana

plasmática del cardiomiocito adulto. Es decir, podría existir una compartamentalización

de las señales de calcio. En nuestros análisis intentamos medir calcio en la cercanía de

la membrana plasmática, sin embargo esta es una aproximación gruesa ya que esa

zona claramente puede estar siendo enmascarada por el calcio que permanece en el

citoplasma celular. Para evitar este problema y como una manera de descartar

definitivamente la posibilidad de movimientos de calcio inducidos por insulina en el

cardiomiocito adulto a futuro se sugiere usar una sonda que permita localizar las

mediciones en la región próxima a la membrana celular que es donde se encuentran

los canales de calcio tipo L en los túbulos T en estrecha relación con el retículo

sarcoplásmico de las células. Otra posibilidad sería utilizar microscopía TIRF (Total

internal reflection fluorescence), la cual permite excitar sólo los fluoróforos ubicados en

los primeros 200 nM desde la superficie a estudiar.

En resumen, existen tareas pendientes que permitirían comprobar o rechazar

nuestra hipótesis de trabajo ya que con los antecedentes actuales sólo podemos decir

que insulina no induce movimientos de calcio en el cardiomiocito adulto de manera

detectable con la sonda Fluo3- AM, pero si podemos afirmar que el calcio participa en

la activación de la vía de señalización de insulina de una forma aún desconocida. No

obstante, un gran aporte de este trabajo a nuestra experiencia como investigadores es

el hecho de que trabajar con un modelo celular u otro, en este caso con cardiomiocitos

neonatos o adultos, marca una gran diferencia en los resultados que podrían

obtenerse. Como se sabe, existen distintas preferencias en cuanto a los sustratos

metabólicos utilizados por cardiomiocitos neonatos y adultos. Los primeros utilizan

principalmente glucosa para obtener energía y los segundos ácidos grasos. Esta

diferencia podría ser de gran relevancia a la hora de mirar objetivamente los resultados

obtenidos en el presente trabajo y constituir una razón por la cual los cardiomiocitos en

sus distintas etapas de desarrollo se comportarían de manera disímil.

48

Cabe destacar que la presente investigación es una primera aproximación al estudio

de enfermedades cardiovasculares vinculadas a la diabetes, como por ejemplo

cardiomiopatía diabética, en el modelo adulto que es comúnmente el afectado por

estas patologías. El conocimiento del comportamiento normal de los cardiomiocitos

adultos frente a insulina es el primer paso para posteriormente estudiar y entender las

modificaciones celulares en el estado patológico, específicamente en condiciones de

hipertrofia celular, característica principal de la cardiomiopatía diabética.

49

8. CONCLUSIONES

El receptor de insulina está presente en el cardiomiocito de rata adulta de

manera relativamente homogénea en el citoplasma celular y en la membrana

celular.

Insulina activa su cascada de señalización canónica en el cardiomiocito adulto,

estimulando la fosforilación de su receptor y las proteínas kinasas Akt y Erk1/2.

Insulina e IGF-1, a las distintas concentraciones ensayadas, no aumentaron los

niveles de calcio, evaluados por microscopía confocal y la sonda sensora

Fluo3-AM, en los compartimentos citosólico, nuclear y en la membrana celular

del cardiomiocito adulto.

La fosforilación de la proteína kinasa Akt dependiente de insulina es regulada

por el calcio intracelular en el cardiomiocito adulto.

En base a estos antecedentes, el calcio forma parte del sistema transduccional

del receptor de insulina en el cardiomiocito neonato pero no en el cardiomiocito

adulto.

50

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MODULACION DEL CALCIO INTRACELULAR POR INSULINA EN EL CARDIOMIOCITO DE...

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