INFORME Nº 004/MAPS/BA/CPIA

De : INGO MARCO JURO ARAMBURU A : LIC. ELENA GONZALES Asunto : MONITOREO DE FERMENTABILIDAD Y CRECIMIENTO DE DISTINTAS FUENTES DE CARBONO

I. RESUMEN

En la presente prác tic a e n te nta ete rm in ar l recim ie nto e e vaduras e Saccharomyces cerevisiae y determinar la curva de crecimiento, bajo diferentes fuentes de carbono. Con la finalidad de determinar la habilidad de un microorganismo de degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un acido o acido y gas, como fuente de carbono utilizaremos glucosa, sacarosa, lactosa y fructuosa respectivamente luego aremos una comparación con la levadura cual de ellos es el que produce mayor cantidad de CO2 .todo esto podremos observar gracias a la introducción de la campana durham en el tubo de ensayo.

II. INTRODUCCIÓN

El hombre viene sirvién dose e a s e vaduras esde ace uchos ig lo s ara fermentar zumos de frutas, para esponjar el pan y para hacer sabrosos y nutritivos ciertos productos alimenticios, su importancia es aún ayor oy ue n ie m pos pasados, porque nosotros las empleamos en los procesos fermentativos más diversos, y además , ara in te tiz ar ie rta s ita m in as, rasas rote ín a s p rtie n do d azúc ares encillo s e itróge no a oniac al. Se sabe, además , ue lg unas e vaduras ausan nfe rm edades n a s la nta s n o s animales y que otras alteran los alimentos y deterioran los productos textiles y otros materiales; las levaduras está n uy ifu ndid as n a atu rale za. e ncuentran n a s frutas, los granos y otras materias nutritivas que contienen azúc ares; n l uelo (especialmente en los viñe dos n o s uerto s), n l ir e, n a ie l n l n te stin o de los animales y en algunos insectos. Las levaduras no contienen clorofila y, por consiguiente, dependen de las plantas superiores y de los animales para obtener su energí a , a ual ueden onseguir or desasimilación xid ante erobia or e rm enta ció n a aerobia. L s l v aduras s n, por lo general, organismos unicelulares, y se presentan en formas muy variadas, desde las esfé r ic as, void es lip soid ale s, a s ilín d rica s, q e p eden s r m y alargadas y aun filamentosas. Estas formas, aunque diversas según a s specie s, on lo bastante caracterí s tic as ara er ase e la sific ació n .

III. OBJETIVOS

• Determinar la habilidad de un microorganismo de degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o gas.

• Determinar la velocidad de fermentación utilizando un medio definido con diferentes fuentes de carbono.

• Identificar que fuentes de carbono que son fermentables por las levaduras Saccharomyces cerevisiae.

• Controlar la fermentación por producción de CO2 y decrecimiento en peso del medio de cultivo.

IV. MARCO TEÓRICO 4.1 FERMENTACIÓN

Puede definirse como el proceso metaból ic o ue ransfo rm a o s id rato s e arbono carbohid rato s) en alcoholes, á c id os rgáni co s, a de hído s o e ona s co la fo m ación de ió id o de c rb no. Esta denominación stá d da s bre l b se d l s a te racio n es q e e p esencia d l v aduras o urren e los jugos azucarados de frutas que se transforman en otros compuestos más sta ble s enom in ados vinos. Podemos también efin ir a e rm enta ció n c m o l o ida ció n i n o m pleta d e ca bohidra tos, aminoá c id os usta ncia s im ila res or a cció n d l s m croorganism os.

4.1.1 Fermentación de carbohidratos solubles.

La ruta de degradació n e a lu cosa n o s is tem as naerobio s roporcio na om o rin cip ale s productos á c id os rasos olá ti le s , H 2 y CO2. La estequiometría ue e ropone ara ste roceso aría en función e a u ente onsulta da. na stequio m etría b sada e p in c ip ios b oe nergétic o s y termodinám ic os, onsid erando a nergía p oducida e l r spira ció n y a c o sum ida pa a la s í te s is celular de los microorganismos responsables, las fracciones de glucosa consumida para la respiración y para la sín tesis on, espectiv am ente, .5 04 .4 96. a rin cip al uta eta bóli c a d d gradació n d e glucosa para formar á c id os rgán i co s e l d E bden-M eyerhof, q e t e n e c m o p in c ip a l intermediario el piruvato. La fermentació n e zúca res s r aliz a p r d ve rsos t p o s d microorganismos, siguiendo diferentes rutas metaból ic as, n u nció n d l o ganism o r sponsable, y obteniendo productos finales diferentes. Los principales microorganismos son los que producen butír ic o uta nol, ási ca m ente d l g ner o Cl strid iu m , qu co vierten la g l co sa y l un os aminoá c id os n ci d o b tír i c o , ac tico , CO 2 y H2. La glucosa se convierte en piruvato mediante la ruta Embden-Meyerhof, y el piruvato se desdobla a Acetil-CoA y CO2. El Acetil-CoA se reduce en los productos de fermentación m ple ando om o ransporta dor e le ctrones l ADH eriv ado e a s reacciones glucolít ic as e a uta m bden-M eyerh of. as roporcio nes e o s iv ersos roducto s e modifican por la duración a s ondic io nes e a e rm enta ció n , s en do e b tíri c o y l ac tico los productos mayoritarios si el pH se mantiene alcalino.

Fuente: Jorgensen- Hansen. Microbiología de las fermentaciones industriales. Editorial Acribia.

Simplificación de las rutas metabólicas de degradación de la glucosa por las

bacterias acidogénicas (Mosey, 1993).

Levadura

Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscóp ic os unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Aunque en algunos textos de botá n ic a e onsid era ue a s e vaduras verdaderas" erte necen ólo a l c as e Ascomycota, desde una perspectiva microbiológ ic a e a enom in ado e vadura todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes. A veces suelen estar unidos entre sí formando cadenas. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúc ares. na e a s e vaduras ás c nocid a s e l e pecie (Saccharomyces cerevisiae). Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia realizando fermentación alcohól ic a. or sta azón s e plea e m chos procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura quí m ic a, por ejemplo en la producción e cerveza, vino, hidromiel, pan, producción e antibiót ic os, etc... Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproducción sexual, na ueva yema surge de la levadura padre cuando se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa del padre al alcanzar un tamaño dulto . Fuente: Martín Viladón. Ingeniería de las fermentaciones. Folleto FT1294 I.S.P.J.A.E. Salle, A.J. Bacteriología

Levadura en polvo

Microfotografía de levadura

4.2 Saccharomyces cerevisiae

La (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular, es un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación el pan, cerveza y vino. Se divide por gemación y puede tener una reproducción sexual cuando se encuentra en su forma haploide, y de manera sexual cuando a partir de un cigoto se forma un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. Las utilidades industriales má s m porta nte s e sta e vadura on a roducció n d cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióx id o e arbono y etanol durante el proceso de fermentación . Bá s ic am ente ste roceso e le va abo uando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúc ares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metaból ic as que le permiten obtener un mayor rendimiento energé t ic o, or a nto o ealiz a a fermentación . Necesidades mínimas para el crecimiento de S. cerevisiae

• Fuente de carbono: azú c ares • Fuente de nitróg eno: sulfato amón ic o , urea o aminoá c id os • Biotina, también la m ada vitamina B8 o vitamina H • Sales y elementos traza

Sacharomyces cerevisiae

Sustratos

Por razones económ ic as a lu cosa a acarosa uras ara ez on tiliz adas om o nic a u ente e carbono excepto en los procesos que exigen el control exacto de la fermentació n . l xtracto e alta es excelente para levaduras ya que contiene alrededor de un noventa por ciento de carbohidratos. Los líq uid os ulfít i c o s d p peler as, p oductos r sid u ales q e c ntie n en a úcar de la in u stria d e pa el, son muy utilizados para el cultivo de levaduras por su alto contenido en azú c ares obre o do exosas. La celulosa está ie ndo xte nsam ente stu dia da om o ustrato e e rm enta ció n , l m yor p rte d e la existe como residuos: paja, desechos de madera, turba, residuos de papel, etc., no es posible utilizarla directamente como fuente de carbono, ha de ser hidrolizada primero quím ic a nzim áti c a m ente. E metanol es el sustrato de fermentació n ás b rato, l s l v aduras s n d l s p cos m croorganism os capaces de metabolizarlo.

Las melazas son el sustrato fundamental para la producción e e vaduras om o Saccharomyces cerevisiae (levadura de la panadería ) as ela zas on n roducto a teral e a roducció n d a úcar de caña e em ola cha on tiliz adas ara a roducció n d e an ol, s en do f e cuentem ente l levadura seca un producto lateral. La levadura de panadería uede er onsid erada om o na o rm a especializada de proteina unicelular y la producción undia l s onsid erable m ás d 2 0.00 0 toneladas por año e eso eco).

4.2 NUTRICION MICROBIANA

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.

Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para biosíntesis y mantenimiento celular.

No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro (> 10 –4 M)

que están representados por las fuentes de C, H, N, O, S, P, K y Mg; b) Micronutrientes o elementos trazas (< 10 –4 M) representados por las sales de

Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y

c) Factores de crecimiento, que son generalmente componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica especifica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc..

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los componentes, en 1) medios sintéticos o medios químicamente definidos, tanto en cantidad como en calidad y 2) medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable.

También se pueden clasificar en medios mínimos, que contienen únicamente los nutrientes esenciales y medios ricos, que consisten en medios que contienen los nutrientes esenciales suplementados con otros nutrientes que puede actuar como fuentes alternativas de elementos (aminoácidos, vitaminas, precursonres de ácidos nucleicos)

En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos. 4.2.1 El diseño de un medio de fermentación

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos.

4.2.2 Requerimientos nutricionales

Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del CO2 como las algas y algunas bacterias, ó heterotrófico que lo poseen organismos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial esta determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. E1 O2 es el oxidante mas común en el metabolismo energético. En la ausencia de éste, el NO3

-- ó SO42- son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Otras

protistas obtienen su energía, en condiciones anaerobias por reacción de oxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.

Otro requerimiento nutricional esta constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. E] nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoacidos, aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su incorporación a la pared de la células. En algunos casos se requieren también peptidos de histidina.

Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de fosfatos y sulfatos (ó aminoácidos azufrados). E1 fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.

Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero esta unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento. El ion K actúa como coenzima y probablemente actúa como catión en la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ion Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato.

4.2.2.1 Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías: a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, etc. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo.

Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotetico, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.

4.2.2. 2 Disponibilidad de los componentes

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar

disponibles para ser usados por la célula. Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metálicos cuya

concentración es modificada por quelación, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actúan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminoácidos, hidroxiacidos, hidróxidos, y los aniones fosfato y carbonato.

Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentración y prevenir la precipitación de los iones metálicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algún agente quelante agregado, como el EDTA o ácido cítrico.

En medios complejos de uso industrial la situación es aún más complicada ya que existe una gran variedad de sustancias orgánicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metálicos reduciendo la concentración iónica disponible. Entre dichos

compuestos podemos citar: aminoácidos, proteínas, ácidos orgánicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unión a elementos metálicos disminuyendo su concentración efectiva, como ocurre también con los aminoácidos y proteínas que tienen los grupos reactivos R-COO-, RHN-, RS-, RO, que son los mas importantes. La dinámica de formación del complejo está determinada por la constante de equilibrio de formación del complejo metal-ligando, y por la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido.

4.2.3 Materias primas fundamentales

Los componentes empleados en la industrias de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de muchos productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo de los medios.

Las materias primas mas importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrogeno. Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina. 2) Alcoholes como el glicerol y manitol. 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano otros. Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destileria, alpechin y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos. Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el amoniaco o sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser: 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimatica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseina, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipeptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma.

3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmóisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, peptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y 5) “Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz que tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas. Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas. 4.2.4 Formulación

La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas.

Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composición elemental y típica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. La composición de un medio mínimo basado en este principio, que además tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energía, figura el la tabla 3, que ha sido calculada por Pirt para la producción de 10 g/l de Klebsiella aerogenes.

Tabla 3. Composición de un medio mínimo para Klebsiella aerogens (Adaptado de Pirt) Componente Elemento provisto/función Masa del Componente (g) Glucosa C, Energía 22.7 NH4CI N 4.37 KH2PO4 P + K 1.13 MgSO4-7H20 S + Mg 0.232 CaCI2.2H20 Ca 0.011 FeSO4 7H20 Fe 0.007 MnSO4.4H20 Mn 0.002 ZnSO4-.7H20 Zn 0.002 CuS04.5H20 Cu 0.0004 CoCl2.6H20 Co 0.0004 EDTA, Sal disódica dihidrato

Agente quelante 0.394

H2O (destilada) - 1,000 ml

Por el conocimiento de la estequiometria de crecimiento y de formación del producto, es posible formular adecuadamente un medio de cultivo. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentación: Fuente de C + fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos → biomasa + productos + CO2 + H2O.

Supongamos que queremos formular un medio para la producción de biomasa de levadura de panificación. En este caso se puede establecer la siguiente ecuación basada en la estequiometria:

0-585 C12 H22 O12 (sacarosa)+ 3.205 O2 + 0.61 NH3 → C3.72 H6 11 O1.95 N0.61 (biomasa)

+ 3.30 CO2 + 4.29 H2O + 387 Kcal.

La ecuación anterior representa así la formación de 100 g de biomasa a partir de 200 g de sacarosa. Debe aclararse que en la fórmula de la levadura que representa lo composición centesimal de la misma faltan los elementos menores como el P, el S y el Mg por lo cual la suma no da 100 g sino 90.46. Es conveniente utilizar en lugar de la formula centesimal la correspondiente a la formula mínima que resulta de dividir el porcentaje de cada elemento por 3.72, o sea haciendo uno al carbono. En este caso se considera que toda la fuente de carbono se emplea para la formación de biomasa y de CO2 que se desprende sin formación de otros productos.

En la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas cantidades de biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada cantidad de fuentes de carbono y de nitrógeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no son necesarios de incluir en las ecuaciones.

Aplicando este criterio podemos establecer entonces que para obtener una determinada concentración de biomasa, por ejemplo 30 g/-l, debemos formular el medio como mínimo con 60 g/l de fuentes de carbono asimilable, que es en el caso anterior la sacarosa. Con respecto a las fuentes de nitrógeno, esta debe estar en concentración tal como para satisfacer la ecuación anterior, que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g, lo que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composición centesimal de otros componentes menores podemos establecer así las cantidades a agregar.

sabemos que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, ácido pantotenico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de producción de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con costos de producción mínimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono, nitrógeno y de vitaminas y minerales mas económicos y disponibles que podamos encontrar. Surge así la elección lógica de las melazas de caña de azúcar o de remolacha que reúnen la mayor parte de las condiciones.

Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio.

4.2.5 Optimización

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:

1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.

2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de micro elementos y factores de crecimiento.

3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.

4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.

5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales. La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales

se varía la concentración del componente a ensayar manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso, se analiza el efecto

de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentración de biomasa obtenida.

Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el método resulta poco práctico. Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente dependa de los niveles de los otros, o sea, se produzca interacción entre componentes. Se puede mejorar mucho la optimización en match empleando técnicas estadísticas o utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos (tema que se vera en el desarrollo de este curso) es posible obtener un cultivo limitado por un solo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.

En la fig. 1 se muestra la optimización de un medio lograda por el método de los pulsos trabajando con un cultivo continuo y en el cual se gráfica la variación de la concentración de biomasa en función del tiempo después del pulso de un componente dado.

Figura 1. Optimización de medios de Fermentación. 1. Nutriente no limitante. 2. Nutriente limitante. 3. Nutriente limitante a mayor concentración. 4. Nutriente tóxico. 4.2.6 Disponibilidad de nutrientes y estabilidad de los medios de cultivo Los nutrientes con los cuales se formulan los medios de cultivo deben estar disueltos para que los mismos se encuentren disponibles para ser utilizados por los microorganismos. Los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo son sólidos en suspensión, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes. Las modificaciones pueden ser beneficiosas o perjudiciales. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura, duración del calentamiento, pH del medio y de la agitación. De modo que la disponibilidad de los nutrientes puede modificarse tanto cuantitativamente como cualitativamente debido a reacciones entre componentes, antes, durante o después de la esterilización. Algunos de los ejemplos son: • Dentro de los macroelementos, los azúcares pueden descomponerse por la acción del

calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos.

ø sales sacarosa hidroliza H+ • Los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de las proteínas,

aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible.

azúcares reductores + -NH2 condensación Por este motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos. • La esterilización de los HPO4

= utilizados como fuente de P y buffer, debe realizarse separada de las sales de Mg, Na, o K, ya que las sales de PO4 con Mg y Na o Mg y NH4 al calor poseen baja solubilidad, lo que disminuye la disponibilidad de todos los nutrientes mencionados.

NaMgPO4 NH4MgPO4 poseen baja solubilidad KMgPO4 • El Fe puede precipitar, y por lo tanto no estar disponible cuando el medio no es

suficientemente ácido. Para aumentar su disponibilidad se usan quelantes que lo atrapan y lo mantienen disuelto (EDTA), o ácido cítrico.

• Los aminoácido, factores de crecimiento y vitaminas son lábiles al calor, por lo tanto

se los prepara disolviéndolos separadamente en pequeños volúmenes de agua, en soluciones muy concentradas y luego se los esteriliza por filtración. Finalmente se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solución por cada litro de medio) en condiciones de asepsia.

• Si la fuente de N utilizada son sales de NH4

+ se deben autoclavar a un pH menos que 7 para evitar su volatilización como NH3. Si ésta es urea debe esterilizarse por filtración ya que a pH bajos (cercanos a 5) por la acción del calor se descompone en NH3 y CO2, no quedando disponible urea disuelta para ser utilizada por el microorganismo.

Tiempo de esterilización: existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60 min se producen perdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso.

V.- MATERIALES Y EQUIPOS • Leche, almidón, sacarosa,

gelatina • 5 placas petri • 5 pipetas de 10ml.

• 3 baguetas • Un rollo de papel de despacho o

craft • Un autoclave

• Mechero de bunsen • 4 asas de siembra. • Una balanza analítica • 4 bicker de 250ml.

• Papel filtro • Papel higiénico blanco. • 2 pizetas.

VI.- procedimiento experimental.

• Preparar caldo nutritivo y se añade glucosa al 1% • Se hace lo mismo con los otros azucares tales como la leche, sacarosa, gelatina, etc. es importante

considerar que los azucares no se deben mezclar dado que pueden producirse reacciones cruzadas. • Luego esterilizar a 121ºC por 5 min. Dado que los azucares por más tiempo se pueden caramelizar. • Activar la levadura (0.5% del volumen total de cada azúcar) a 35ºC a40ºC aprox. En agua destilada

suficiente para diluirla y dejar reposar unos minutos hasta desarrollo de efervescencia. • Una vez frió los medios se siembra cada envase con la levadura además de otros. Se incuban a

temperaturas adecuadas durante 24- 48 hrs. Pasando este tiempo realizar la lectura correspondiente. Características culturales Gram+ Gram- En muestras frescas Sembrar en tubos.

Adicionar 1g. + 100 ml. H2O destilada.

Almidón sacarosa glucosa lactosa

Preparar agua peptonada:

X = (25.5gr*90ml.)/100ml. X = 2.29 gr. De agar

Preparar agar plate count.

Y = (23.5gr.*80ml)/100ml. Y = 1.88 gr.

Fermentabilidad: • Lactosa 1gr. + 10ml. H2O peptonada. • Sacarosa 1gr. + 10ml. H2O peptonada. • Fructosa 1gr. + 10ml. H2O peptonada. • Glucosa 1gr. + 10ml H2O peptonada.

8ml. En cada uno de los tubos, en cada uno de ellos se introducen la muestra y se lleva al autoclave. VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES

6.1.- RESULTADO

Los resultados de la glucosa, sacarosa, fructuosa y leche se tuvo a las 24 hr por que los tubos durham comenzaron a flotar en la superficie de los tubos de ensayo de las respectivas muestras con excepción de la lactosa que no reacciono y el tubo durham seguía en la profundidad de la muestra.

Lactosa glucosa sacarosa fructuosa

Se tuvo los resultados de crecimiento de microorganismos a las 36 hr, por que a las 24 hr no hubo crecimiento en las placas.

Muestra(hr) Horas p/m Resultado de

crecimiento Total de m.o. por placa

Pan 6.38 55 x 8 440 Levadura 6.35 83 x8 664 Queso1 6.39 50 x8 400 Queso1 6.39 45 x8 360 Queso1 6.39 30 x8 240 A.- VELOCIDAD DE FERMENTACIÓN: Leche: las levaduras es incapaz de producir la lactosa y hay muerte microbiana. Glucosa: existencia de menor muerte. Fructosa: hay un equilibrio de vivencia y muerte de los microorganismos. Sacarosa: Aquí se dio más la muerte, que en los demás substratos. Números de colonias observadas: Por superficie: muestra de pan.

Pan 40 colonias de levaduras

Por profundidad: mustra queso. (miercoles) Nºcol. = 32* 8 = 256 colonias en general. Por superficie pan (jueves) Nº col. = 50*8 = 400 Por superficie: muestra de pan (se tomaron 2 placas) Sembrado: 6:35pm. – 65*8 = 520 6:39pm. – 55*8 = 440 Levaduras: 6:35pm. – 83*8 = 664

B.- ENSAYOS DE FERMENTACIÓN

Cuadro Nº 03: Producción de CO2,

Característica Glucosa Sacarosa Lactosa-Leche

Intensa +++ +++ +++

Moderada + + +

Débil + + +

Formación de película sobre la superficie del medio

Característica Glucosa Sacarosa Lactosa-Leche

Intensa

Moderada + + +

Débil + + + + + +

6.2.- DISCUSIONES:

• Según la bibliografía las levaduras trasforman la glucosa y sacarosa en etanol y CO2 en medio anaerobio, por lo que disminuye el peso de la muestra que contiene glucosa, verificando los pesos de glucosa en la tabla Nº 02 vemos la disminución de peso según trascurre el tiempo, lo cual indica la perdida de fuente de carbono parte de este trasformado en CO2 por lo que disminuye el peso.

• Analizando el cuadro Nº 02 se observa que trascurrido 24 horas el peso del matras con almidón disminuyo en 3.12g, luego de ese tiempo el peso permanece constante, lo cual indica que no hay fermentación alguna o no existe el desdoblamiento de la glucosa y sacarosa.

• La sacarosa no llego a desdoblarse en su totalidad es por ello que su peso disminuye lentamente. • En cuanto a la lactosa no hubo cambio alguno debido que desde el momento que se ajusto con

hidróxido de sodio para ajustar a pH de 3.8, se corto, la lactosa no es una buena fuente para la fermentación anaerobia.

• En el caso de las cuatro fuentes de carbono que se ha hecho las respectivas pruebas, (López Díaz, Martha Inés, (2004), Estudio de las levaduras en los alimentos) , nos menciona que estos van ha tener mayor grado de importancia de acuerdo a la fuente de hidratos de carbono, es decir que la cantidad de carbohidratos presente en una fuente , también determina la velocidad de fermentación y por ende del desprendimiento mas audaz del co2 en comparación a otras fuentes carbonadas.

• Este mismo autor, nos menciona que el poder edulcorante de los carbodritados o azucares es de preponderancia y vital importancia, para acelerara los procesos de fermentación, ya que la glucosa tiene 0.7 de poder edulcorante, la sacarosa 1.0 y el almidón es muy bajo porque tiene en proporcione menores a estas; pero en el caso de nuestra practica con estos dos anteriores sucede lo que dice el autor.

VII.- CONCLUSIONES

• Aunque las cé l u la s lte ran l edio ebid o a o m a e ubstrato s a ecreció n de producto metabó l ic o, a elo cid ad e recim ie nto erm anece onsta nte durante la fase logarí t m ic a. a elo cid ad e recim ie nto s n dependie nte e a concentració n e ubstrato n a nto ue xis ta xceso e ubstrato .

• La velocidad de aumento de la biomasa esta relacionada con la velocidad específ ic a e recim ie nto on a oncentració n d l b om asa.

• La velocidad de fermentación es determinada por el gasto de substrato que hay en el medio, la cual varía de acuerdo a la fuente carbonada utilizada como medio fermentable.

• la glucosa es una fuente carbonada más fácilmente fermentable que las otras fuentes que se utilizaron. Por lo cual el proceso fermentativo es más acelerado.

• La fuente de carbono que es en mayor grado mas fermentable para el caso de Saccharomyces cerevisiae. Es la glucosa sacarosa y glucosa que si han tenido un margen de consumo significativo, pero no así la lactosa que no es recomendable como una fuente de carbono que sea fermentable y que le de al microorganismo las condiciones adecuadas para su crecimiento.

• En el caso del control de la fermentación por producción de CO2 y decrecimiento en peso del medio de cultivo, se ha verificado y demostrado que la glucosa es la que mejor se adapta a este tipo de medición, ya que es la que ha tenido en mayor grado un mayor consumo de sustrato y por ende una mayor de producción , porque al acabar el sustrato presente ya empieza la fase de declive en la que el microorganismo después de desarrollarse al máximo , ya tiene que llegar a fermentar y por ende darnos el producto que es deseado.

• La fermentabilidad esta relacionada al fuente de carbono que se utiliza como sustrato, ya que cada una de ellas tienen diferente complejidad como estructura y en muchas de ellas requieren de una hidrólisis previa para que pueda ser fermentada por las levaduras.

• La lactosa presenta nada de producción de CO2, debido a que no ha tenido un consumo valuable o significativo, y que incentivo a que no haya consumo de sustrato y mucho menos no ha habido producción de CO2.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

• WILLET, Hilda. ZINSSER Microbiología. Segunda edición. Editorial Médica Panamericana S.A. España 1994

• FRAZIER, W. C. Microbiología de los Alimentos. Tercera edición, Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España 1978

• JÖRGENSEN, Alfred. Microbiología de las Fermentaciones Industriales. Sétima edición. Editorial Acribia. Zaragoza España 1959

• CARPENTER, Philips. Microbiología.. primera edición Español Editorial Interamericana, S.A México 1969

• Jorgensen- Hansen. Microbiología de las fermentaciones industriales. Editorial Acribia. • Martín Viladón. Ingeniería de las fermentaciones. Folleto FT1294 I.S.P.J.A.E. • http://CrecesEducación.mht • http://html.rincondelvago.com/microbiologia_13.html • http://biocity.iespana.es/micro/leva.htm • http://www.cervezas-argentinas.com.ar/Las_levaduras_algo_sobre_ellas.htm • http://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae • Salle, A.J. Bacteriología. E:\bio\Gram.htm