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MONOGRAFÍAS DR. ANTONIO ESTEVE

MODELOSEXPERIMENTALESDE PATOLOGÍA

INFECCIOSA

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J.M. Miró • J.M. Gatell

© 2000, Fundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 2. E-08032 Barcelona.Teléfono: 93 436 84 05 Fax: 93 450 48 99.Correo electrónico: [email protected]: http://www.esteve.org

Depósito legal: B.- 20.237-2000Coordinación y producción:Ediciones Doyma, S.L.Travesera de Gracia, 17-21. E-08021 BarcelonaImpreso en España por Gráficas AlmogávaresPrinted in Spain

La Fundación Dr. Antonio Estevecontempla como objetivo prioritario elestímulo del progreso de la terapéutica por medio de la comunicación y ladiscusión científica. La Fundación quiere promover la cooperación internacional en lainvestigación farmacoterapéutica y, a talfin, organiza reuniones internacionalesmultidisciplinarias donde grupos reducidosde investigadores discuten los resultadosde sus trabajos. Estas discusiones sonrecogidas en las publicaciones de losEsteve Foundation Symposia. Otras actividades de la Fundación Dr. Antonio Esteve incluyen la organizaciónde reuniones dedicadas a la discusión deproblemas de alcance más local ypublicadas en el formato de la presentemonografía. La Fundación participatambién en conferencias, seminarios,cursos y otras formas de apoyo a lasciencias médicas, farmacéuticas ybiológicas y, con carácter bienal, concedeun premio al mejor artículo publicado porun autor español dentro del área de lafarmacoterapia. Más recientemente, se ha iniciado lapublicación de la serie Pharmacotherapyrevisited: An Esteve Foundation Series, enla cual a través de diferentes volúmenes se recopilan, en edición facsímil, losprincipales artículos que sentaron lasbases de una determinada disciplina.

Los diferentes apartados de la presentemonografía recogen la opinión de loscorrespondientes autores, por lo que laFundación Dr. Antonio Esteve no se hacenecesariamente partícipe de su contenido.

AGRADECIMIENTOS

La Fundación Dr. Antonio Esteve desea expresarsu agradecimiento a la Sociedad Española de En-fermedades Infecciosas y Microbiología Clínica(SEIMC) y a la Sociedad Española para las Cien-cias del Animal de Laboratorio (SECAL) por acep-tar el patrocinio científico de la reunión y de la ac-tual monografía. También agradece a MarcelBrosa el diseño del programa System Chair y suadaptación técnica para la gestión informática dela moderación de las mesas redondas que danlugar a la edición de estas monografías, así comoa Pere Gavaldà y colaboradores por su contribu-ción en las distintas fases de dicho proceso, aAnna Guerra por la transcripción de las discusio-nes y a Cristina García de la Maria y FrancescMarco por la revisión de los manuscritos.

J.M. MIRÓ Y J.M. GATELL

Introducción 9

F. MARCO, J. LIÑARES Y J.M. MIRÓ

Utilidad de los estudios in vitropara seleccionar los estudios in vivo 11

F. FUENTES, M.J. GIMÉNEZ Y J. PRIETO

Modelos experimentales en farmacodinamia 23

J. GAVALDÀ Y A. PAHISSA

El modelo de farmacocinética humanizada en los modelos animales de infección 35

J. GAVALDÀ, J.M. MIRÓ Y M.L. FERNÁNDEZ

Modelo de endocarditis 47

C. CABELLOS, J. PACHÓN Y B. ALMIRANTE

Modelo de meningitis 71

J. PACHÓN, J. GAVALDÀ Y J.M. MIRÓ

Modelo de neumonía 81

J.A. CAPDEVILA, A. PASCUAL Y A. SITGES-SERRA

Modelo de infecciones por cuerpo extraño 91

M.C. BALAGUÉ, E.M. TARGARONA Y M. CAINZOS

Modelo de infecciones intraabdominales 103

M. CUENCA-ESTRELLA, J.L. RODRÍGUEZ-TUDELA Y J. GAVALDÀ

Modelos animales de infecciones fúngicas 119

P.J. CARDONA, V. AUSINA Y J. CAYLÀ

Modelos de tuberculosis experimental 135

M. GOMIS, J. BARBERÁN Y J. ARIZA

Modelos experimentales de osteomielitis 149

M. DOMINGO, J. CANTÓ Y J. PUJOLS

Cómo debe organizarse un estabulario con modelos de patología infecciosa 163

J.M. GATELL

A modo de conclusión 177

CENTROS CON MODELOS EXPERIMENTALESDE PATOLOGÍA INFECCIOSA QUE HANPARTICIPADO EN ESTA MONOGRAFÍA 179

ÍNDICE DE MATERIAS 181

Modelos experimentales de patología infecciosa

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Relación de participantes* BENITO ALMIRANTEServicio de Enfermedades InfecciosasHospital Universitario Vall d’HebronPg. Vall d’Hebron, 119-12908035 Barcelona

JAVIER ARIZAServicio de Enfermedades InfecciosasCiudad Sanitaria de BellvitgeFeixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

VICENÇ AUSINAServicio de MicrobiologíaHospital Germans Trias i PujolCarretera del Canyet, s/n08916 Badalona

M. CARMEN BALAGUÉServicio de Cirugía General y DigestivaIDIBAPS**-Hospital Clínic Universitaride BarcelonaVillarroel, 17008036 Barcelona

JOSÉ BARBERÁNServicio de Enfermedades InfecciosasHospital Gómez UllaGlorieta del Ejército, s/n28047 Madrid

FÈLIX BOSCHFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

CARMEN CABELLOSServicio de Enfermedades InfecciosasCiudad Sanitaria de BellvitgeFeixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

JORDI CANTÓServicio de EstabularioUniversitat Autònoma de Barcelona08193 Bellaterra

*Participantes de la mesa redonda organizada por laFundación Dr. Antonio Esteve el 12 de mayo de 1999en Barcelona.**IDIPAPS = Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer.

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JOSEP ANTON CAPDEVILAServicio de Enfermedades InfecciosasHospital Universitario Vall d’HebronPg. Vall d’Hebron, 119-12908035 Barcelona

PERE-JOAN CARDONAServicio de MicrobiologíaHospital Germans Trias i PujolCarretera del Canyet, s/n08916 Badalona

MANUELCUENCA-ESTRELLAServicio de MicologíaCentro Nacional de MicrobiologíaInstituto de Salud Carlos IIICtra. Majadahonda-Pozuelo, km 228220 Majadahonda

MARIANO DOMINGOUnidad de Anatomía PatológicaFacultad de VeterinariaUniversitat Autònoma de BarcelonaCampus de Bellaterra

SERGIO ERILLFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

FERNANDO FUENTESMARTÍNEZDepartamento de MicrobiologíaFacultad de MedicinaUniversidad Complutense de MadridAvda. Complutense, s/n28040 Madrid

CRISTINA GARCÍADE LA MÀRIAServicio de MicrobiologíaIDIBAPS-Hospital Clínic Universitaride BarcelonaVillarroel, 17008036 Barcelona

JOSÉ M.ª GATELLServicio de Enfermedades InfecciosasIDIBAPS-Hospital Clínic Universitaride BarcelonaVillarroel, 17008036 Barcelona

JOAN GAVALDÀServicio de Enfermedades InfecciosasHospital Universitario Vall d’HebronPg. Vall d’Hebron, 119-12908035 Barcelona

AMÉRICA GIMÉNEZEstabulario Facultad de MedicinaUniversitat de BarcelonaCasanova, 14308036 Barcelona

FRANCESC GUDIOLServicio de EnfermedadesInfecciosasCiudad Sanitaria de BellvitgeFeixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

JOSEFINA LIÑARESServicio de MicrobiologíaCiudad Sanitaria de BellvitgeFeixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

FRANCESC MARCOServicio de MicrobiologíaIDIBAPS-Hospital Clínic Universitaride BarcelonaVillarroel, 17008036 Barcelona

JOSÉ MARÍA MIRÓServicio de EnfermedadesInfecciosasIDIBAPS-Hospital Clínic Universitaride BarcelonaVillarroel, 17008036 Barcelona

JERÓNIMO PACHÓNServicio de Enfermedades InfecciosasHospitales Universitarios Virgen delRocíoAvda. Manuel Siurot, s/n41013 Sevilla

ALBERT PAHISSAServicio de Enfermedades InfecciosasHospital Universitario Vall d’HebronPg. Vall d’Hebron, 119-12908035 Barcelona

ÁLVARO PASCUALDepartamento de MicrobiologíaFacultad de MedicinaApdo. 91441080 Sevilla

JOAN PUJOLSUnidad de Sanidad AnimalIRTAVia Circulació Nord, tram 6h08040 Barcelona

JUAN LUIS RODRÍGUEZTUDELAServicio de MicologíaCentro Nacional de MicrobiologíaInstituto de Salud Carlos IIICtra. Majadahonda-Pozuelo, km 228220 Majadahonda

EDUARDO M.ªTARGARONAServicio de Cirugía General yDigestivaHospital de la Santa Creu i Sant PauSant Antoni M.ª Claret, 16708025 Barcelona

M.ª FE TUBAUServicio de MicrobiologíaCiudad Sanitaria de BellvitgeFeixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

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Relación de colaboradores* MIGUEL CAINZOSServicio de Cirugía General y DigestivaHospital General de GaliciaGaleras, s/n15705 Santiago de Compostela

JOAN CAYLÀServicio de EpidemiologíaInstitut Municipal de la SalutPlaça Lesseps, 108023 Barcelona

MANUEL LUISFERNÁNDEZ-GUERRERODivisión de Enfermedades InfecciosasFundación Jiménez DíazAvda. de los Reyes Católicos, 228040 Madrid

MARÍA JOSÉ GIMÉNEZMESTREDepartamento MédicoSmithKline Beecham S.A.Madrid

MANUEL GOMISServicio de Enfermedades InfecciosasHospital del AireArturo Soria, 8228027 Madrid

JOSÉ PRIETODepartamento de MicrobiologíaFacultad de MedicinaUniversidad Complutense de MadridAvda. Complutense, s/n28040 Madrid

ANTONIO SITGES-SERRADepartamento de CirugíaHospital Universitario del Mar. IMIMPg. Marítim, 25-2908003 Barcelona

*Coautores de las ponencias y los artículos generadospor la mesa redonda organizada por la FundaciónDr. Antonio Esteve el 12 de mayo de 1999 en Barcelona.

Los modelos animales que reproducen unadeterminada enfermedad infecciosa constituyen,desde hace más de un siglo, uno de los pilaresen los que se fundamenta el desarrollo de la me-dicina al mejorar nuestro conocimiento sobre sufisiopatología, y desde hace más de 50 años hanservido para estudiar su prevención y su trata-miento con antimicrobianos, permitiendo, ade-más, evaluar el desarrollo de nuevas moléculasantiinfecciosas o de nuevas estrategias terapéu-ticas frente a la aparición de microorganismosmultirresistentes. La mayoría de modelos experi-mentales de enfermedades infecciosas que seestán utilizando en la actualidad reúnen los cri-terios de los modelos discriminativos ideales alreproducir la infección de forma lo más similarposible a lo que ocurre en los seres humanos.Estos modelos intentan tener una técnica de in-fección simple; los microorganismos causantes,la puerta de entrada, la diseminación en el orga-nismo y la afectación tisular deben ser lo másparecidos a lo que ocurre en el ser humano; lagravedad, el curso y la duración de la enferme-dad deben ser predecibles, reproducibles y ana-lizables, y deben ser capaces de medir y repro-ducir la eficacia del tratamiento antimicrobiano.Por tanto, los resultados que se obtengan conestos modelos deben permitir conocer mejor lafisiopatología de la enfermedad infecciosa quereproducen y los resultados preclínicos que seobtengan al evaluar los tratamientos antimicro-bianos deben ser la base para poder diseñar en-sayos clínicos en humanos.

A juzgar por los artículos publicados en las re-vistas médicas de mayor prestigio, el progreso ex-perimentado en los últimos años con el uso deestos modelos es espectacular, y resulta relativa-mente frecuente observar que las contribucionesproceden de grupos españoles. Por dicha razóny gracias al apoyo institucional de la FundaciónDr. Antonio Esteve, el día 12 de mayo de 1999 serealizó una reunión a puerta cerrada con los prin-cipales grupos españoles que trabajan en estecampo que ha permitido ponerlos en contacto,conocer sus opiniones sobre este tema y escribir

esta monografía que analiza varios modelos ex-perimentales de patología infecciosa bacterianay fúngica y que evalúa su utilidad en los avancesen la fisiopatología, profilaxis y tratamiento de lasenfermedades infecciosas. En esta monografía sedescriben los modelos de endocarditis, meningi-tis, osteomielitis, infecciones por cuerpo extraño,infecciones intraabdominales, infecciones fúngi-cas y de la tuberculosis. En todos los casos serealiza una descripción detallada del modelo(s)in vivo de referencia, se comentan las ventajas ylimitaciones del modelo experimental y de formasistemática se revisan los avances que ha su-puesto el modelo en el conocimiento de la fisio-patología de ese proceso infeccioso y en la profi-laxis y el tratamiento del mismo. Además, se hanañadido tres capítulos adicionales que comple-mentan este tema. El primero describe qué estu-dios deben realizarse in vitro para seleccionar losantimicrobianos que se utilizarán en el modeloanimal. El segundo analiza los modelos de far-macodinamia y farmacocinética humanizada conel fin de corregir una de las principales limitacio-nes de la administración de antimicrobianos enlos animales, la diferente farmacocinética que tie-nen con respecto al ser humano. El último capí-tulo describe cómo debe organizarse un estabu-lario con modelos animales de enfermedadesinfecciosas, haciendo hincapié en el diseño delestabulario según el tipo de animales y agentesinfecciosos utilizados, las rutinas de trabajo (pla-nificación, stocks, recepción de animales, aloja-miento, cuarentena, limpieza o control sanitario),las precauciones a tomar en el manejo de los ani-males y la formación que debe tener el personaldel estabulario.

Somos conscientes de que esta monografíapresenta sus limitaciones, ya que no se revisantodos los modelos de enfermedades infecciosasni se analizan todos los temas relacionados conla experimentación animal. Sin embargo, cree-mos que éste puede ser el punto de partida paraque en el futuro puedan realizarse iniciativas si-milares que la complementen y la mejoren. Eneste sentido, queremos agradecer el patrocinio

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Introducción

científico de la Sociedad Española de Enfer-medades Infecciosas y Microbiología Clínica(SEIMC) y de la Sociedad Española para las Cien-cias del Animal de Laboratorio (SECAL). La dis-tribución de esta monografía entre los socios in-teresados de ambas entidades puede mejorar sudifusión. El listado preliminar de los grupos es-pañoles que disponen de modelos de enferme-dades infecciosas y que se describe en el anexofinal de la monografía puede facilitar los contac-tos y la formación de profesionales en nuestro

país, así como la creación de una núcleo de gru-pos de trabajo que a la larga mejore la investiga-ción de la enfermedad infecciosa preclínica ennuestro país.

José M.ª Miró* y José M.ª Gatell***Especialista Senior. Profesor Asociado de Medicina.

Correo electrónico: [email protected]**Consultor. Profesor Asociado de Medicina.

Servicio de Enfermedades Infecciosas.IDIBAPS*-Hospital Clínic Universitari de Barcelona.

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MODELOS EXPERIMENTALES DE PATOLOGÍA INFECCIOSA

*IDIPAPS = Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer.

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CONSUMO DE MEDICAMENTOS Y ACCIDENTABILIDAD:PRESCRIPCIÓN Y USO RACIONAL DE MEDICAMENTOS EN EL PACIENTE CONDUCTOR DE VEHÍCULOS

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RESUMEN

El conocimiento de los métodos utilizados paravalorar la actividad in vitro de los antibióticos esfundamental para el desarrollo de muchos mo-delos experimentales en enfermedades infeccio-sas. La determinación de la concentración míni-ma inhibitoria (CMI) por agar dilución, macro omicrodilución o por E-test, o la determinación dela concentración mínima bactericida (CMB) in-forma acerca de la actividad in vitro de un anti-biótico en particular. Para analizar la actividad dedos antibióticos en combinación deben realizar-se pruebas más complejas como curvas de le-talidad o el método del tablero de ajedrez. Laactividad bactericida del suero (ABCS) aporta in-formación sobre la actividad del suero más el an-tibiótico administrado frente al microorganismoresponsable de la infección. Otras técnicas deutilidad en los modelos experimentales en ani-males son la determinación de las concentracio-nes de los antibióticos en el suero por bioensayoy el cultivo cuantitativo de los tejidos.

Palabras clave:Curva de letalidad. Sinergia. Actividad in vitro.

Introducción

Disponer de un modelo experimental animalque simule una determinada enfermedad ha sidoy sigue siendo uno de los pilares en los que sefundamenta el desarrollo de la medicina. A juzgarpor los artículos publicados en las revistas médi-cas de mayor prestigio, el progreso experimenta-do en los últimos años con el uso de estos mode-los es espectacular. En teoría, la información

obtenida con los modelos experimentales puedeser de gran utilidad para comprender mejor la fi-siopatogenia de la enfermedad objeto de estudio,para intentar mejorar su tratamiento, ya sea conla utilización de fármacos conocidos o de nuevasíntesis o bien, para valorar las posibles opcionesdisponibles destinadas a prevenir su aparición.

Para el desarrollo de un modelo experimen-tal en el que se va a estudiar una determinadaenfermedad infecciosa será necesario conocerdeterminadas metodologías básicas que seránutilizadas, en primer lugar, como paso previo aldesarrollo del modelo y que después se irán em-

UTILITY OF IN VITRO STUDIESTO CHOOSE IN VIVO STUDIES

To develop an experimental animal model ininfectious diseases requieres to know the metho-dology used to determine the in vitro activity ofantibiotics. Information about the in vitro activityof an antibiotic alone is obtained with the deter-mination of agar dilution, macro or microdilutionor E-test minimal inhibitory concentrations (MIC)and the minimal bactericidal concentrations(MBC). Time-Killing curves or checkerboard met-hod studies the in vitro activity of antibiotic com-binations. Serum bactericidal titers inform usabout serum and antibiotic activity against the in-fectious etiological agent. Antibiotic serum levelsdetermination by bioassay and quantitative bac-teriological culture of tissue are useful procedu-res in experimental model animals.

Key words:Time-Killing curve. Sinergy. In vitro activity.

Utilidad de los estudios in vitro para seleccionarlos estudios in vivo

Francesc Marcoa,*, Josefina Liñaresb y José María Miróc

aServeis de Microbiologia y cMalalties Infeccioses.IDIBAPS (Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer)-Hospital Clínic Universitari de Barcelona.

bServei de Microbiologia. Hospital de Bellvitge. L’Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

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*Correo electrónico: [email protected].

pleando a lo largo de su realización. En la rutinadiaria de un laboratorio de microbiología no es in-frecuente que se realicen algunas de las mismas,sobre todo la determinación de la concentraciónmínima inhibitoria (CMI). La información que seobtiene resulta fundamental, ya que, aparte de co-nocer la etiología de la enfermedad infecciosa quequiere estudiarse (microorganismos responsableso frecuencia de aislamiento), se conocerá su sen-sibilidad a los antibióticos (CMI50 y CMI90) o la exis-tencia de posibles problemas particulares de re-sistencia y permitirá plantear la posibilidad deestudiar nuevas combinaciones de antibióticos ode nuevas moléculas de futura comercialización.

Definiciones

Todo investigador en modelos experimentalesde enfermedades infecciosas debe estar familia-rizado con determinados términos utilizados fre-cuentemente en el laboratorio y asociados con elestudio de la actividad in vitro de los antibióticos.Se comentarán a continuación algunos de losmás frecuentes. El término concentración míni-ma inhibitoria (CMI) hace referencia a la concen-tración más pequeña de antibiótico que inhibe elcrecimiento macroscópico de un microorganismodespués de un período de incubación estándar,generalmente de 18 a 24 h. La concentraciónbactericida mínima (CBM) es la concentra-ción más pequeña de un antibiótico que produ-ce una reducción igual o superior al 99,9 % en elnúmero de células viables al compararlo conel inóculo inicial. Podemos utilizar el términoconcentración mínima letal (CML) para referirnosa cualquier microorganismo, incluyendo bacte-rias, hongos o virus.

La actividad bacteriostática del suero (ABTS)es la mayor dilución (o título) de una muestra desuero tomada de un paciente que está recibien-do un tratamiento antimicrobiano que inhibe elcrecimiento macroscópico después de la incu-bación, por lo general de 18 a 24 h. El estudio serealiza con el microorganismo responsable de lainfección del paciente. En la actividad bacterici-da del suero (ABCS) se valora la mayor dilución(o título) de una muestra de suero que produceuna reducción igual o superior al 99,9 % en elnúmero de células viables comparado con el inó-culo inicial después de la incubación. En el efec-to paradójico o fenómeno “Eagle” se produce uninexplicado aumento en el número de células via-bles (que indica un descenso de la actividad bac-tericida) a medida que la concentración del anti-biótico se incrementa por encima de la CMI. Latolerancia es un fenómeno en el que antibióticos

bactericidas parecen carecer o tener reducidaesta actividad frente a determinadas cepas. Amenudo se cree que se debe a una alteración enla actividad enzimática autolítica de la propia bac-teria, aunque podrían estar implicados otros me-canismos. Como parte de la definición de tole-rancia se acepta que cuando detectamos estefenómeno la relación entre la CMB y la CMI esigual o superior a 32 (CMB/CMI � 32). En lascurvas de letalidad (Time-Killing curves) se valo-ra la actividad bactericida de un antibiótico o deuna combinación de antibióticos a una concen-tración determinada efectuando subcultivos a di-ferentes horas durante las 24 h de incubación.Esto permite conocer la disminución del númerode bacterias viables en relación con el inóculo ini-cial según el tiempo de incubación y saber el gra-do de actividad bactericida del antibiótico. El mé-todo del tablero de ajedrez (checkerboard test)valora la actividad in vitro de dos (a veces tres)antibióticos para determinar si la combinación esmás activa que cualquiera de los dos antibióticosadministrados de forma individual.

Métodos para estudiar la actividad in vitrode los antibióticos

Los métodos comentados en esta revisión sonlos siguientes:

Estudios con un solo antibiótico.Determinación de la CMI.

Agar dilución.Macrodilución.Microdilución.E-test.

Determinación de la CMBCombinaciones de dos antibióticos.Curvas de letalidad (Time-Killing curves).Método del tablero de ajedrez (checkerboard).Actividad in vivo de los antibióticos.Actividad bactericida del suero.Otras técnicas útiles.Determinación de las concentraciones de an-

tibióticos en el suero.Cultivo de tejidos.

Estudios con un solo antibiótico.Determinación de la CMI

En la actualidad se dispone de diversos méto-dos que permiten conocer la actividad in vitroque manifiestan algunos fármacos frente a losmicroorganismos, ya sean bacterias, hongos o vi-rus. Sólo se comentarán los de mayor utilidadpráctica. La determinación de la CMI puede rea-

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lizarse por agar dilución, macrodilución, microdi-lución o por el método E-test. La metodología re-comendada para la realización de los tres prime-ros está perfectamente estandarizada en losdocumentos publicados por el National Commit-tee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)1, ylas normas que proporciona el fabricante del mé-todo E-test (AB-Biodisk, Suecia) son fundamen-tales para su realización. Además, es altamenterecomendable la lectura de las metodologías pu-blicadas en manuales de laboratorio como el dela Sociedad Americana de Microbiología (ASM)2,3

y libros de texto especializados4.

Agar dilución

En este método se prepara una batería de pla-cas de agar con el antibiótico a estudiar a diver-sas concentraciones, generalmente dobles, y seinoculan diversas cepas bacterianas con un re-plicador de Steers que permite depositar encimadel medio alrededor de 104 unidades formadorasde colonias (UFC/spot). No nos extenderemos ensu explicación porque se trata de un métodolaborioso que no suele emplearse de forma ruti-naria y su uso queda restringido a estudios o va-loraciones, generalmente de carácter multicén-trico, de nuevos antibióticos.

Macrodilución y microdilución

La determinación de la CMI por macrodilucióno microdilución se realiza en ambos casos con unmedio líquido, y la diferencia fundamental entrelos dos métodos es el volumen utilizado. En elmétodo de macrodilución se suele trabajar convolúmenes de 1 o 2 ml y en el de microdilución

con 100 �l, raras veces con 200 �l (CMI parahongos) o con 50 �l (métodos comercializados).En líneas generales, la sistemática de trabajo sue-le ser la siguiente.

Medio de cultivo. Por la buena reproducibilidadlote a lote, baja presencia de inhibidores y creci-miento satisfactorio para una gran mayoría de mi-croorganismos patógenos, se suele emplear cal-do de Mueller-Hinton suplementado con cationes(Ca++, 20 a 25 mg/l y Mg++, 10 a 12,5 mg/l). Al-gunos microorganismos necesitan la adición desuplementos, como ocurre con los estreptococosque requieren añadir al medio sangre de caballolisada (proporción final: 2-5%). En la tabla I se in-dican los medios utilizados según los microorga-nismos más habituales.

Preparación de los antibióticos a estudiar. Unavez disuelto el antibiótico a partir de sustanciapura valorada (generalmente suministrada porel laboratorio fabricante del antibiótico) se reali-zan las diluciones apropiadas para conseguirlas concentraciones deseadas en los tubos(macrodilución) o placas de microtítulo (micro-dilución). El volumen que se dispensará en lostubos será de 1 ml (aunque también puede tra-bajarse con 0,5 ml) y en los pocillos de microtí-tulo 50 �l.

Inóculo. Se prepara un suspensión bacterianacon una turbidez equivalente a una escala deMcFarland 0.5 (aproximadamente 108 UFC/ml)a partir de un cultivo puro de 24 h o inoculandovarias colonias en un medio de cultivo líquidoque se incubará hasta conseguir la densidad óp-tica deseada. Una vez ajustado el inóculo, se di-

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UTILIDAD DE LOS ESTUDIOS IN VITRO PARA SELECCIONAR LOS ESTUDIOS IN VIVO

TABLA IMEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS PARA DETERMINAR LA CMI SEGÚN

EL TIPO DE MICROORGANISMOMicroorganismo Medio de cultivo ComentariosEnterobacterias Mueller-Hinton más cationes P. aeruginosaEnterococcus spp. “/ídem Incubar 24 h completas para detectar

resistencia a la vancomicinaStaphylococcus spp. “/ídem Añadir 2% de NaCl para la oxacilina

Incubar 24 h completas

Streptococcus spp. Mueller-Hinton más cationes (incluye S. pneumoniae) con 2-5 % de sangre lisada

L. monocytogenes de caballo

Haemophilus spp. Haemophilus TestMedium (HTM)

luirá de forma apropiada según cada método conla finalidad de conseguir que en cada tubo o po-cillo de la placa tengamos alrededor de 5 × 105

UFC/ml (margen de 3-7 × 105 UFC/ml). Es acon-sejable efectuar un recuento de colonias a partirdel inóculo inicial para asegurar que el inóculo fi-nal sea lo más cercano posible al recomendado.

Inoculación de los tubos o las placas de microtí-tulo. En ambos métodos, la inoculación se efec-tuará preferentemente dentro de los primeros15 min después de ajustar el inóculo. En el mé-todo de macrodilución se inoculan los tubos quecontienen 1 ml con las concentraciones de anti-bióticos preparadas (a excepción del tubo con-trol) con 1 ml del medio de cultivo (inóculo). Elvolumen final será de 2 ml. Si se ha optado portrabajar con 0,5 ml el volumen final será 1 ml. Enel método de microdilución el volumen que con-tienen los pocillos con el antibiótico es de 50 �l yse añaden otros 50 �l con el inóculo. Otra op-ción, válida en los dos métodos, es añadir un vo-lumen que no exceda el 10% del volumen final(p. ej., 5-10 �l de inóculo si el volumen final esde 100 �l). Debe tenerse presente que cuandose añade el inóculo (1 ml o 50 �l) se efectúa unadilución 1:2 que disminuye a la mitad la concen-tración del antibiótico. Es aconsejable realizarcontroles de la pureza del inóculo efectuando unsubcultivo en un medio no selectivo.

Incubación. Para los dos métodos, el período deincubación es de 18-20 h a 35 °C en atmósferaaerobia. Para determinados microorganismos laincubación puede ampliarse a 20-24 h (Strepto-coccus spp. o Haemophilus spp.) o a 24 h com-pletas (S. aureus oxacilina resistente o Entero-coccus spp. resistente a vancomicina).

Lectura de la CMI. Una vez comprobada la pre-sencia de crecimiento en el tubo o pocillo controlse determinará la CMI, que corresponderá al pri-mer tubo o pocillo en el que se produce una in-hibición del crecimiento macroscópico del mi-croorganismo estudiado.

Control de calidad. Las cepas recomendadas porel NCCLS son las más adecuadas para esta fina-lidad. Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomo-nas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcusaureus ATCC 29213 y Enterococcus faecalisATCC 29212 son las cepas más útiles, ya que lamayoría de antibióticos tienen unos intervalos dediluciones perfectamente definidos. El empleo deotras cepas ATCC dependerá de los microorga-nismos estudiados.

E-test

La determinación de la CMI por el métodoE-test es relativamente reciente, pero poco apoco se va introduciendo en la rutina diaria de unlaboratorio de microbiología. Los resultados obte-nidos presentan una buena correlación con losmétodos tradicionales (agar dilución, macrodilu-ción o microdilución)5 y tiene la enorme ventajarespecto a estos métodos de que su realizaciónes mucho más sencilla. Por otra parte, es unmétodo que podríamos considerar caro y su apli-cación en el campo de los estudios in vitro enmodelos experimentales quedaría limitado a as-pectos muy concretos. En esencia, el métodoconsiste en aplicar unas tiras de plástico quecontienen el antibiótico que ensayamos en la su-perficie de una placa de agar que previamente hasido inoculada con el microorganismo a estudiar.Tras la incubación y si el microorganismo es sen-sible se produce una elipse de inhibición alrede-dor de la tira con el antibiótico. La lectura de laCMI se realiza en el punto de intersección entreel borde de inhibición de la elipse y la tira con elantibiótico.

Para su realización es aconsejable seguir lasinstrucciones del fabricante, pero los aspectosmás importantes son los siguientes: se utilizan losmedios de cultivo (Mueller-Hinton, otros según elmicroorganismo) y la misma forma de prepara-ción del inóculo (McFarland 0.5) que recomien-da el NCCLS. Para la inoculación de las placas seintroduce un escobillón estéril en la suspensiónbacteriana y al retirarlo, se presiona contra la pa-red interna del tubo para eliminar el exceso de lí-quido. A continuación se siembra la superficiedel agar tres veces, rotando la placa, con la fina-lidad de conseguir una distribución homogéneadel inóculo. Se deja absorber este inóculo un mí-nimo de 10-15 min hasta que la superficie estécompletamente seca y se deposita la tira o tirasde antibióticos (el número dependerá del diá-metro de la placa de Petri utilizada) en la super-ficie del agar. Como las tiras deben guardarse a–20 °C debemos tener la precaución de retirarlaspreviamente y dejarlas a temperatura ambienteunos 30 min. La incubación de las placas no di-fiere de las indicaciones habituales del NCCLS,tras la cual se efectuará la lectura de la CMI comose ha comentado anteriormente.

Determinación de la CMB

Una vez determinada la CMI y para conoceren qué dilución se produce una reducción delinóculo inicial igual o superior al 99,9 % (CMB),

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deben efectuarse subcultivos en medio sólidode todos aquellos tubos o pocillos en los que noexista crecimiento macroscópico. Independien-temente del método utilizado para determinar laCMI (macro o microdilución) es recomendableque el volumen a subcultivar sea de 100 �l,aunque algunos laboratorios utilizan un volu-men inferior (10 �l). Con la ayuda de una pi-peta se mezcla bien el contenido de cada tuboo pocillo sin crecimiento macroscópico aspi-rando de 6 a 10 veces. A continuación se as-piran 100 �l (por duplicado en el método pormacrodilución) y se dispensan en una placa deagar sangre (otro medio si no crece el microor-ganismo). Se deja secar 15-20 min y se extien-de por la superficie del agar. La incubación serealiza a 35 °C durante 24-72 h según el micro-organismo. Tras esta incubación se determinael número de colonias que crecen en las placasy se calcula el número máximo permitido segúnel inóculo inicial. Por ejemplo: 5 × 105 UFC/ml(inóculo) × 0,1 ml (volumen sembrado en lasplacas) × 0,001 (porcentaje de células permiti-das) = 50 UFC. En este caso, cuando la sumadel número de colonias en las dos placas esigual o inferior a 50, la dilución es bactericida.Si se subcultiva un inóculo inferior (10 �l) elcálculo del número de bacterias se realiza se-gún el método de Pearson et al6.

Lectura de la CMB

La CMB corresponderá a aquella dilución en laque tras los subcultivos en placas no existe cre-cimiento bacteriano o el número de colonias esinferior al número máximo permitido. Para pro-fundizar en la metodología utilizada en la deter-minación de la CMB remitimos al lector a la lec-tura de bibliografía especializada4,7,8.

Estudios con dos antibióticos

Curvas de letalidad (Time-Killing curves)

La actividad bactericida de los antibióticostambién puede estudiarse mediante la realiza-ción de curvas de letalidad. En este método sevalora la dinámica de la actividad de los antibió-ticos, solos o en combinación, a lo largo de unperíodo de tiempo de 24 h (hay excepciones se-gún el microorganismo) mediante el recuento delnúmero de bacterias viables a unas horas deter-minadas. No existe una metodología completa-mente estandarizada para su realización y hayciertas diferencias según la bibliografía, por loque la consulta de textos de referencia es im-

prescindible7,9. El estudio se realiza generalmen-te con un volumen total de 10 ml y se utilizan untubo control de crecimiento, un tubo control deesterilidad, un tubo para cada antibiótico sólo ala concentración escogida y un tubo para cadacombinación de antibióticos. Antes de realizaruna curva de letalidad deben conocerse la CMI yla CMB de los antibióticos que quieren valorarsepara decidir las concentraciones de los mismos(p. ej., CMI, 1/2 × CMI, 1/4 × CMI o 2 × CMI). Losaspectos más importantes del procedimiento quecomentaremos son los siguientes:

Medio de cultivo. Se emplea medio de Mue-ller-Hinton suplementado con cationes. Para co-nocer el medio de cultivo más adecuado segúnel microorganismo véase la tabla I.

Preparación del antibiótico. Una vez disuelto elantibiótico se diluirá hasta conseguir una con-centración 100 veces superior a la concentraciónfinal que vayamos a estudiar. En el caso de valo-rar la actividad de un solo antibiótico se añaden100 �l de la solución 100 veces concentrada aun tubo con 9,9 ml de medio de cultivo. Si se tra-ta de estudiar la combinación de dos antibióticosse dispensan 100 �l de la solución 100 vecesconcentrada del antibiótico A y 100 �l de la so-lución 100 veces concentrada del antibiótico B aun tubo con 9,8 ml de medio de cultivo.

Inóculo. Debe prepararse de tal forma que per-mita conseguir, una vez diluido, un inóculo finalentre 5 × 105 y 106 UFC/ml. Una forma de con-seguirlo sería preparar una suspensión bacteria-na con una turbidez equivalente a una escala deMcFarland 1 (aproximadamente 3 × 108 UFC/ml)que se diluirá 1:5 mediante la adición de 1 ml dela suspensión a 4 ml de medio de cultivo (aproxi-madamente 6 × 107 UFC/ml).

Inoculación e incubación. Añadiremos 100 �l delinóculo que contiene 6 × 107 UFC/ml a cadatubo (excepto tubo control de esterilidad) con10 ml de medio más antibiótico(s). La concen-tración final será de 6 × 105 UFC/ml. Se mezclabien con la ayuda de un vórtex y antes de incu-bar a 35 °C se retiran 100 �l del tubo controlpara efectuar diluciones seriadas y sembrar pla-cas de cultivo que permitirán conocer el inóculoreal inicial. Es aconsejable efectuar una siembracon un asa calibrada del tubo con el McFarland1 para asegurar la pureza del inóculo. Algunosautores han intentado utilizar inóculos mayores(107 o 108 UFC/ml) para intentar simular al má-ximo la situación real de la infección in vivo. En

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estos casos se debe ser cauteloso en la interpre-tación de los resultados ya que cuando la con-centración llega a 109-1010 UFC/ml se agotan losnutrientes del medio de cultivo.

A las horas determinadas previamente (p. ej.,4, 8 y 24 h) desde el inicio de la incubación, seretiran los tubos de la estufa, se agitan (vórtex) yse aspira una alícuota de 100 �l de cada tubopara efectuar diluciones seriadas y siembra enplaca de cultivo. Es importante que este procesono se demore más allá de los 10 min para evitarinterrumpir el ciclo de crecimiento.

Lectura de resultados. En primer lugar, se deter-mina el inóculo real mediante el recuento de lascolonias que han crecido en las placas de cultivo(aproximadamente 6 × 105 UFC/ml). Posterior-mente se cuentan las colonias que han crecidoen las placas correspondientes a las diferentesdiluciones realizadas según el tubo y las horas desiembra. Para calcular el número de UFC/ml esaconsejable utilizar las placas cuyo número decolonias sea entre 30 y 300. Placas con recuen-tos inferiores o superiores no son aconsejables,aunque pueden utilizarse si no hay otra opción.Una vez conocido el número de UFC/ml se con-vierten a valores en log10 y se representan en unagráfica como las de la figura 1.

Interpretación de los resultados. Determinar si lascombinaciones de antibióticos estudiadas son si-nérgicas (reducción del crecimiento de al menos2 log10 con la combinación de antibióticos com-parado con el antibiótico solo más activo), anta-gónicas (incremento del crecimiento de al menos2 log10 con la combinación de antibióticos com-parado con el antibiótico solo más activo) o indi-ferentes (cuando existe una variación menor de1 log10, ya sea un incremento o un descenso enel crecimiento con la combinación de antibióticoscomparado con el antibiótico solo más activo). Seconsidera que un antibiótico o combinación deantibióticos es bactericida cuando se produce undescenso de, al menos, 3 log10 en el número debacterias a las 24 h de incubación en compara-ción con el inóculo inicial (fig. 1).

Método del tablero de ajedrez(Checkerboard)

El método del tablero de ajedrez es amplia-mente utilizado en los laboratorios de microbiolo-gía para valorar combinaciones de antibióticos.Con este método se evalúa la actividad inhibito-ria (a veces bactericida) de una combinación deantibióticos utilizando las recomendaciones del

NCCLS para determinar la CMI y la CMB. Puederealizarse en tubos (macrodilución) o en placasde microtítulo (microdilución)9,10.

El intervalo de concentraciones estudiadaspara cada antibiótico suele ser de al menos cua-tro o cinco diluciones por debajo de la CMI y dosdiluciones por encima. Una vez diseñado, el mé-todo consiste en una serie de columnas en lasque cada tubo o pocillo contiene la misma canti-dad de un antibiótico A que está diluido a lo lar-go del eje × (abscisas) y filas en las que cadatubo o pocillo contiene la misma cantidad de unantibiótico B que está diluido a lo largo del eje y(ordenadas) (fig. 2). El resultado es que en cadatubo o pocillo hay dos antibióticos con dos con-centraciones (excepto en la columna o fila con unsolo antibiótico o los controles).

En su realización se seguirán las recomen-daciones comentadas en el apartado de deter-minación de la CMI en cuanto a la preparaciónde antibióticos, diluciones, medio de cultivo,inóculo, incubación y lectura de la CMI. Debetenerse presente el factor de dilución a la horade añadir los antibióticos para calcular su con-centración final.

Para la interpretación de los resultados se de-termina la CMI de los antibióticos solos y en com-binación, y se calcula el índice FIC (concentra-ción inhibitoria fraccionada) para cada antibióticosegún la fórmula siguiente:

FIC = FIC A + FIC B = A/CMIA + B/CMIB.

En la fórmula, A o B son la CMI del antibióticoen combinación y CMIA o CMIB son la CMI delantibiótico solo. Si el índice FIC es � 0,5 se con-sidera que la combinación de antibióticos es si-nérgica, si es > 4, antagónica, y entre > 0,5 y � 4,indiferente. Dentro de este último conceptopodría añadirse una nueva definición que consi-dera una combinación como aditiva cuando el ín-dice FIC es igual a 1. El método puede comple-tarse, a la vez que se convierte en más complejo,si se llevan a cabo subcultivos para conocer laactividad bactericida (CMB) y calcular el índiceFBC. En la figura 2 se representan gráficamenteestos resultados.

¿Qué método escoger para nuestrosestudios?

La primera opción probablemente sería deter-minar por microdilución la CMI y la CMB del an-tibiótico(s) a estudiar frente al microorganismoescogido. Una vez conocida esta información seplanteará efectuar más estudios según el mode-

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lo que se desee estudiar. Por ejemplo, si nuestraintención es valorar la eficacia de un nuevo anti-biótico comparándolo con las pautas de trata-miento recomendadas, la información que nosproporciona la CMI y la CMB es, en principio, su-ficiente. Si lo que pretendemos es estudiar nue-vas combinaciones de antibióticos, deberemosoptar por la realización de curvas de letalidad, yaque proporcionan información sobre la dinámicade la actividad de los antibióticos.

Actividad in vivo de los antibióticos

La actividad bactericida del suero es una prue-ba que, aunque realizada in vitro, informa acercade la actividad in vivo del suero del paciente másel antibiótico(s) que está recibiendo para tratar suinfección. No obstante, debe tenerse presenteque se trata de una prueba realizada in vitro y,como tal, se ve influida por todos los factores queafectan a la determinación de la actividad de un

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ControlAntibiótico AAntibiótico BAntibióticos A + B

8

7

6

5

4

3

2

1

04 8 12 16 20 24 Tiempo (h)Tiempo (h)

UFC/mlLog10

8

7

6

5

4

3

2

1

04 8 12 16 20 24

UFC/mlLog10

Efecto sinérgicoy bactericida

8

7

6

5

4

3

2

1

04 8 12 16 20 24Tiempo (h)

UFC/mlLog10

Efecto indiferente

A B

C

Efecto antagónico

Fig. 1. Curvas de letalidad. Ejemplos de efectos sinérgico (A), antagónico (B) e indiferente (C) obtenidos al combinardos antibióticos (A � B).

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32

16

8

4

2

1

0

CMI

Ant

ibió

tico

A

0 1 2 4 8 16 32 CMIAntibiótico B

A

1 CMI

1/2 CMI

1/4 CMI

1/4 CMI 1/2 CMI 1 CMI

Sinergia

32

16

8

4

2

1

0

CMI

Ant

ibió

tico

A


B

1 CMI

1/2 CMI

1/4 CMI


Antagonismo

32

16

8

4

2

1

0

CMI

Ant

ibió

tico

A


C

1 CMI

1/2 CMI

1/4 CMI


Indiferencia

Fig. 2. Método del tablero de ajedrez. Ejemplos de efectos sinérgico (A), antagónico (B) e indiferente (C) obtenidos alcombinar dos antibióticos (A � B).

antibiótico además del suero del paciente (por lasproteínas que contiene) y el diluyente escogido.

Actividad bacteriostática y bactericidadel suero

Schlichter y MacLean11 fueron los primeros in-vestigadores que utilizaron la determinación de laactividad bacteriostática del suero (ABTS) paravalorar la efectividad de la penicilina en el trata-miento de la endocarditis bacteriana. Poco des-pués, Fisher12 utilizó la actividad bactericida delsuero (ABCS) con el mismo propósito. A pesar desu empleo durante muchos años y en diversasenfermedades, la determinación de la ABCS si-gue siendo motivo de controversias y de desa-cuerdos sobre su verdadera utilidad. Con estaprueba se determina la actividad bacteriostáticay bactericida del suero del paciente que contieneel antibiótico(s) administrado frente al microor-ganismo que le produce la infección. El suero sediluye geométricamente y se añade un inóculoestándar a cada tubo o pocillo antes de su in-cubación a 35 °C durante 24 h. La actividad bac-teriostática del suero (ABTS) es la que corres-ponde a la dilución más alta que inhibe elcrecimiento macroscópico. Después de efectuarsubcultivos de aquellos tubos o pocillos sin cre-cimiento, se determina la dilución más alta queproduce una reducción � 99,9% del inóculo ini-cial (ABCS). Aunque la prueba puede realizarsepor macrodilución, se prefiere el método de mi-crodilución por utilizar menor cantidad de sueroy medio de cultivo, requerir menor tiempo parasu realización y haber demostrado una buena re-producibilidad13,14.

Dilución del suero. Dispensar 50 �l del diluyente(aconsejable suero inactivado, pero también seemplea medio de cultivo) en los pocillos 2 a 12.Utilizar otros pocillos para control de esterilidad ycrecimiento. Añadir 50 �l del suero a estudiar alos pocillos 1 y 2. Efectuar diluciones dobles.

Inóculo. Igual que el empleado para determinar laCMI. Efectuar subcultivos para conocer el inócu-lo real.

Inoculación e incubación. Dispensar 50 �l delinóculo a los pocillos correspondientes. Incubara 35 °C durante 24 h.

Lectura de la actividad bacteriostática. Determi-nar la dilución más alta del suero en la que no seaprecia crecimiento macroscópico. Calcular el

inóculo empleado mediante el recuento de lascolonias. De todos los pocillos en los que no seaprecia crecimiento efectuar subcultivos por du-plicado (10 �l) extendiendo todo el volumen enla superficie de la placa. Incubar las placas24-72 h según el microorganismo.

Lectura de la actividad bactericida. Tras el re-cuento del número de colonias en las placas, laactividad bactericida del suero corresponderá ala dilución más alta del suero del paciente que re-duce el inóculo inicial en un 99,9% o más.

Otras técnicas útiles

Determinación de las concentracionesde antibióticos en el suero

La determinación de las concentraciones deantibióticos en el suero resulta de gran utilidad enun modelo experimental de enfermedad infec-ciosa, ya que permite conocer si el antibiótico ad-ministrado alcanza los valores esperados. Esto esespecialmente importante cuando se utilizan mo-delos de farmacocinética humanizada. Aunquese pueden utilizar diversos métodos (HPLC o in-munoanálisis con técnica EMIT)15 sólo se descri-birá la metodología necesaria para determinar losvalores de los antibióticos en el suero por bioen-sayo, ya que éste suele ser el método más utili-zado en modelos experimentales.

Preparación de placas de agar. Como medio decultivo se suele emplear agar de Mueller-Hintonque una vez esterilizado se dejará enfriar hastauna temperatura de 50-55 °C. A continuación sedispensan 17,5 ml de agar en placas de Petri es-tériles (diámetro 19 mm) y se deja solidificar. Seañade a 100 ml de medio 1 ml de un inóculo Mc-Farland 0,5 preparado a partir de un cultivo detoda la noche y se dispensan 12,5 ml en cadaplaca. De esta forma, el inóculo final será de 105

a 106 UFC/ml. El microorganismo a utilizar de-penderá del antibiótico que se desee medir, perodeberá ser lo suficientemente sensible comopara que el nivel de detección inferior sea de0,5 a 1 �l.

Preparación del patrón de concentraciones dereferencia. Una vez disuelto el antibiótico, seefectúan las diluciones necesarias para obtenerlas concentraciones que se utilizarán como es-tándar. La última dilución (1:1) debe efectuarsecon suero de conejo o del animal de nuestromodelo.

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Preparación de las muestras. El suero obtenidotras centrifugación de la sangre se congela en di-versas alícuotas. Se utiliza una alícuota cada vezdesechando el suero sobrante.

Inoculación de las muestras y estándar. En pla-cas de Petri estériles se colocan diversos discosde papel (especiales para ensayo de antibióti-cos) sobre los que se depositan 20 �l del sue-ro o del antibiótico estándar. A continuación, ycon la ayuda de unas pinzas, se colocarán losdiscos con las muestras de suero o estándar.En cada placa con muestras de suero debe co-locarse un disco con una concentración conoci-da del antibiótico estándar para poder corregirlas variaciones que se produzcan respecto almismo.

Incubación. Se efectúa a 35 °C durante 18-24 h.

Lectura e interpretación de los resultados. La lec-tura de las placas se realiza con la ayuda de unpie de rey midiendo los halos de inhibición alre-dedor de los discos. A partir de las concentracio-nes estándar se calcula la recta de regresión (logy = a + bx) correspondiente, a partir de la cualpodrán calcularse las concentraciones de lasmuestras.

Consideraciones a tener en cuenta. Los bioensa-yos se realizan por triplicado y se emplea la me-dia de los tres valores para realizar los cálculos.Debe procurarse que los halos de inhibición delas muestras se encuentren dentro del rango ob-tenido con el estándar. Si es necesario, se di-luirán las muestras para conseguirlo. Debe cal-cularse el coeficiente de variabilidad inter eintraanálisis de nuestro método mediante repeti-ciones del mismo bioensayo a lo largo de variosdías y en el mismo día.

Cultivo de tejidos

El cultivo de cualquier tejido infectado en unmodelo experimental animal es uno de los pará-metros empleados para valorar la eficacia del tra-tamiento antibiótico utilizado. Puede realizarse deforma cualitativa (hay o no hay crecimiento) ocuantitativa (determinamos el número de UFC/gde tejido y comparamos los resultados según lamedia ± desviación estándar).

Procesamiento. Se extrae el tejido (p. ej., vegeta-ciones cardíacas) objeto de estudio, se pesa y sehomogeneiza en un medio líquido con un volu-men conocido (p. ej., caldo de tripticasa-soja). Se

efectúan diluciones del homogeneizado hasta10 − 6 o 10 − 7 (según la densidad bacteriana es-perada) en el mismo medio liquido y se siembrade cada dilución incluido el homogeneizado,0,1 ml (duplicado) en placas de agar apropiadassegún el microorganismo. Tras una incubaciónde 24-78 h (depende del microorganismo) serealiza el recuento de colonias en cada placa y secalcula el número de bacterias por gramo de te-jido según la siguiente fórmula16:

UFC/g =

Es conveniente sembrar el resto del homoge-neizado (residual) en placas de agar invertidopara mejorar el límite de detección del método encaso de que el número de UFC/g de tejido sea in-ferior a 102.

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número de colonias × dilución × 10× (volumen medio + peso tejido)

��peso tejido

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10. Moody JA. Synergism Testing: Broth MicrodilutionCheckerboard and Broth Macrodilution Methods.En: Isenberg HD, editor. Clinical Microbiology Pro-cedures Handbook. Washington DC: AmericanSociety for Microbiology, 1992; 5.18: 1-28.

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12. Fisher AM. A method for determination of antibac-terial potency of serum during therapy of acuteinfections. Preliminary report. Bull Johns HopkinsHosp 1952; 90: 313-319.

J.M. MIRÓ: ¿Qué criterios utilizarías en el labora-torio para poder seleccionar aquellas combina-ciones de antibióticos o aquellos antibióticosque evaluarías en un modelo in vivo?

F. MARCO: Depende del objetivo que se pretenda.Si se quiere evaluar un fármaco nuevo frente auna pauta ya conocida, probablemente lo pri-mero que hay que hacer es una determinaciónde la CMI y de la CMB. Si únicamente vamos aevaluar un antibiótico, no es necesario hacernada más. En el supuesto de analizar combina-ciones de fármacos conocidos que aún no sehan estudiado, aparte de la CMI y de la CMB,es evidente que se requieren otras pruebascomo una curva de letalidad, que ofrece másinformación sobre la dinámica de actividad delos antibióticos frente a la bacteria que se estáestudiando.

J. GAVALDÀ: Últimamente se ha publicado unanormativa de la Sociedad Americana de Micro-biología que actualiza el concepto de sinergia yacepta que sólo se puede hablar de sinergiacuando uno de los antibióticos utiliza una con-centración que no inhibe el crecimiento de labacteria. Por ello, en muchas de las curvas queaparecen habitualmente en la bibliografía no sepodría hablar de sinergia. ¿Cuál es vuestra opi-nión al respecto?

F. MARCO: Es evidente que cuando se realiza unacurva de letalidad si el antibiótico más activo esbactericida, la curva ya no es de utilidad si loque se pretende es efectuar un análisis de la si-nergia entre diferentes antibióticos.

J. GAVALDÀ: Mi comentario venía a raíz del últimoartículo que publicamos en marzo sobre lascombinaciones de ampicilina y ceftriaxona, enel que Barbara Murray, editora de la revista, no

aceptó de ninguna de las maneras el conceptode sinergia de la combinación, a pesar de quela combinación bajaba tres y cuatro logaritmosel efecto de los fármacos individualmente. Tu-vimos que reinventar el término de “coopera-ción antimicrobiana entre fármacos” para sus-tituir al de sinergia.

J.M. GATELL: Me ha llamado la atención que to-davía estéis utilizando de una manera tan ex-tensa el bioensayo para determinar las concen-traciones de antibióticos. Actualmente en loslaboratorios de farmacología se emplean méto-dos como la HPLC u otros más precisos y me-nos engorrosos. ¿Esto se debe a que lo reserváissólo para antibióticos muy raros en los cualesno se dispone de otro método, o simplementeutilizáis el bioensayo como método más cómo-do para vosotros?

F. MARCO: La HPLC es un sistema con un nivel dedetección mucho mejor y menos subjetivo queel bioensayo, por lo que es el método más re-comendable. Sin embargo, hay antibióticos enlos cuales todavía no está desarrollado el siste-ma de detección por HPLC o no existe la posi-bilidad de utilizarlo; en estos casos, la alternati-va suele ser el bioensayo.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: Me gustaría añadir la si-guiente consideración sobre el tema del bio-ensayo y es que, al menos en el campo delos antifúngicos, es recomendable aplicarambos métodos. Hay algunos antifúngicosque producen metabolitos activos, como esel caso del itraconazol, con los que se ha ob-servado una mejor correlación in vitro–in vivocon el bioensayo que con HPLC, a no serque se determinen itraconazol e hidroxiitra-conazol.

13. National Committee for Clinical Laboratory Stan-dards. Methodology for the serum bactericidal test(2.ª ed.). Villanova, PA: Document M21T. Tentativeguideline, 1992, NCCLS.

14. Griffin J. Serum Inhibitory and Bactericidal Titers.En: Isenberg HD, editor. Clinical Microbiology Pro-cedures Handbook. Washington DC: AmericanSociety for Microbiology, 1992; 5.17: 1-19.

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16. Loebl EC, Marvin JA, Heck EL, Curreri PW, Baxter,CR. The method of quantitative burn wound biopsycultures and its routine use in the care of of the bur-ned patient. Am J Clin Pathol 1974; 61: 20.

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DISCUSIÓN

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J.M. MIRÓ: Lo que ha explicado Francesc Marcosirve fundamentalmente para las bacterias,¿crees que es aplicable también para los hon-gos habituales (Candida, Aspergillus, etc.)?

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: En el campo de los anti-fúngicos nos encontramos todavía en la infanciade lo que se ha explicado. Con determinadosfármacos tenemos una idea más o menos acer-tada de lo que significa la CMI dentro del labo-

ratorio, pero tenemos poca idea de lo que signi-fica la CFM. Se están empezando a hacer otrasdeterminaciones como las curvas de letalidad,aunque la discusión sigue abierta en cuanto alinóculo a utilizar (las recomendaciones son di-ferentes según el país). Nuestra intención esacercarnos un poco más al nivel existente en in-vestigación sobre bacterias, pero creo que to-davía queda mucho camino por recorrer.

RESUMEN

La farmacodinamia estudia los efectos que loscambios en la concentración de un antimicrobianoinducen sobre los microorganismos. Este ampliocampo de investigación puede ser dividido en dosapartados distintos, según la finalidad u objetivo delestudio: por un lado se hallarían los estudios depredicción de eficacia, que tratarían de encontrarparámetros que puedan proporcionar una indica-ción de la actividad del compuesto. De otra parte,se contaría con ensayos dirigidos a determinar unoo más parámetros de tipo farmacodinámico, comopueden ser el efecto postantibiótico o los efectos deconcentraciones subinhibitorias sobre los microor-ganismos. Cada uno de estos apartados incluyemodelos y técnicas tanto in vitro, como ex vivo o invivo. Para el estudio de parámetros o indicadoresde eficacia se utilizan modelos muy estandarizadosy aceptados, como las simulaciones farmacociné-ticas in vitro, la determinación de títulos bacterici-das séricos o los modelos in vivo de sepsis intraab-dominal, neumonía o lesión en el muslo de ratón.Sin embargo, para la determinación de parámetrosfarmacodinámicos específicos la estandarizaciónes menor; tanto los modelos in vitro (curvas demuerte bacteriana modificadas) como in vivo (mo-delos de meningitis, endocarditis, lesión en muslode ratón o neumonía) tienen metodologías varia-bles y no permiten comparaciones significativas.Tanto los modelos in vitro como ex vivo presentanla ventaja de la comodidad y de la reproducibilidad,mientras que los estudios in vivo concuerdan máscon la realidad clínica. Todos estos modelos hansido aplicados ampliamente en el estudio de nu-merosos antimicrobianos, y se han obtenido resul-tados muy interesantes.

Palabras clave:Farmacodinamia. Farmacocinética. Efecto postanti-

biótico.

PHARMACODYNAMIC EXPERIMENTALMODELS

Pharmacodynamics studies the effects thatchanges in antimicrobial concentrations induceon microorganisms. This investigational field ofantimicrobial agents may be divided in two diffe-rent areas according to the objectives/end-pointsto be studied: first, those studies of efficacy pre-diction, designed to determine parameters thatprovide information about the activity of the com-pound; second, those studies designed to inves-tigate one or more pharmacodynamic parame-ters, such as the post-antibiotic effect or the effectof sub-inhibitory concentrations on microorga-nisms. Several standardised and wide-acceptedtechniques are used to determine activity predic-tor parameters, such as in vitro pharmacokineticsimulations, determination of serum bactericidaltitres, or in vivo models including intraabdominalsepsis, pneumonia or thigh infection model inmice. Nevertheless, to determine specific phar-macodynamic parameters, lower standardisedmodels have been used, and both in vitro (modi-fied bactericidal curves) and in vivo (meningitis,endocarditis, pneumonia or thigh lesion models)have variable methodology that do not allow sig-nificant comparisons among them. The advanta-ges of in vitro and ex vivo models are their high re-producibility and relative ease, while in vivomodels are more closely related to clinical outco-me. All these models have been widely applied inthe study of antimicrobial agents, and a highnumber of interesting results have been obtained.

Key words:Pharmacodynamic. Pharmacokinetic. Post-antibio-

tic effect.

Modelos experimentales en farmacodinamia

Fernando Fuentes Martíneza, María José Giménez Mestreb

y José Prieto Prietoa,*aDepartamento de Microbiología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.

bDepartamento Médico. SmithKline Beecham S.A. Madrid.

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Introducción

Los antimicrobianos, al contrario de los demásfármacos utilizados en otros campos de la medi-cina, tienen su diana en receptores que no soncélulas o tejidos del propio paciente, sino de losmicroorganismos causantes de la infección. Estadiferencia básica conlleva una mayor compleji-dad en el estudio de la actividad de estas sus-tancias, ya que deben realizarse los estudiosteniendo en cuenta tres componentes interac-tuantes: el paciente, el microorganismo y el anti-microbiano.

La farmacodinamia estudia la relación exis-tente entre los cambios en la concentración delantimicrobiano y la respuesta que éstos tienensobre el microorganismo. Desde hace algunasdécadas, la farmacodinamia ha cobrado unagran importancia en el campo del estudio de losantimicrobianos, debido principalmente a doshechos: la capacidad de obtener datos que pue-den ser tomados como “predictores” de la efica-cia del antimicrobiano (cociente inhibitorio, áreasobre la curva/concentración mínima inhibitoria[CMI], etc.) y la posibilidad de estudiar ciertosparámetros que pueden ser utilizados en el di-seño y mejora de los regímenes de dosificación

de los antimicrobianos (efecto postantibiótico[EPA] o efecto de concentraciones subinhibito-rias, entre otros).

Para el estudio de la farmacodinamia de losantimicrobianos se han utilizado multitud de mo-delos experimentales, muchos de los cuales seemplean también en el estudio de otras caracte-rísticas de los procesos infecciosos (evolución dela infección, etc.).

Tipos de modelos

Estos modelos pueden clasificarse de distintasformas, atendiendo a diversas variables, como sedescribe en la tabla I. Pueden dividirse en mode-los in vivo, ex vivo e in vitro, pero, además de estaclasificación, pueden agruparse según su fina-lidad: la predicción de eficacia y actividad o elestudio de parámetros determinados (EPA,sub-CMI, etc.). Existen otras clasificaciones “clá-sicas” de los modelos experimentales in vivo queson ampliamente aceptadas, como la de Zak etal1, quienes prefieren agruparlos de la siguienteforma:

1. Modelos básicos de cribado de antimicro-bianos: se utilizan como primeras investigacionesde un antimicrobiano, incluyéndose modeloscomo el de sepsis intraabdominal, neumonía,meningitis y lesión en el muslo en ratones.

2. Modelos ex vivo: permiten, mediante el im-plante de dispositivos (cámaras de diálisis o coá-gulos de fibrina) medir una serie de parámetroscomo la tasa de muerte, los cambios en la mor-fología bacteriana o las concentraciones de anti-microbiano de forma fácil y cómoda.

3. Modelos monoparamétricos: se refieren amodelos en los que se estudia de forma intensi-va un solo parámetro o variable. Similares a los decribado, son empleados en estados más avanza-dos de estudio de un compuesto antimicrobiano.

4. Modelos discriminativos: son los más com-plicados técnicamente, y están diseñados paratener una aproximación lo más real posible a losprocesos infecciosos en humanos.

En el estudio de la farmacodinamia de los an-timicrobianos se utilizan múltiples modelos expe-rimentales. Para su mejor descripción, se utiliza-rá la clasificación mencionada anteriormente demodelos farmacodinámicos para predicción deeficacia y modelos monoparamétricos de estudiode variables farmacodinámicas aisladas. Cadauno de estos apartados incluye tanto modelos invitro como in vivo o ex vivo (tabla II).

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TABLA ICLASIFICACIONES DE LOS MODELOS

EXPERIMENTALES UTILIZADOS ENFARMACODINAMIA ATENDIENDO

A DIVERSOS PARÁMETROSAtendiendo a su finalidad

Modelos de predicción de eficaciaModelos de evaluación de parámetros

farmacodinámicos

Según su desarrolloIn vitroIn vivoEx vivo

Según la etapa de estudio del antimicrobianoModelos de cribado o de actividad frente

a determinados grupos de patógenos(grampositivos, gramnegativos, etc.)

Modelos de determinación de eficaciade distintas dosificaciones

“Clásica”Modelos básicos de cribadoModelos ex vivoModelos monoparamétricosModelos discriminativos

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MODELOS EXPERIMENTALES EN FARMACODINAMIA

TABLA IIRESUMEN ESQUEMÁTICO DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES Y TÉCNICAS IN VITRO

UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE LA FARMACODINAMIA DE ANTIMICROBIANOSVariable de estudio In vitro Ex vivo In vivo

Predicción de eficacia

Efecto postantibiótico

Efecto deconcentracionessubinhibitorias

Efecto sobre lamorfología bacteriana

Efecto sobrela producción defactores de virulencia

Efecto sobre laadherenciabacteriana

Inmunomodulación

Curvas de muertebacteriana(concentraciónconstante)

Curvas de muertebacteriana(simulaciónfarmacocinética)

Curvas de muertebacteriana in vitrocon eliminación delantimicrobiano pordilución, inactivacióno centrifugación

Curvas de muertebacteriana in vitrocon eliminación delantimicrobiano pordilución, inactivacióno centrifugación.Adicción deconcentracionessub-CMI

Observación de célulasbacterianas trasexposición: enmedios líquidos osobre superficiessólidas o semisólidas

Producción deexotoxina A, elastasa,fosforilasa,lipopolisacáridos

A células epiteliales deltracto urinario

A superficies plásticas

Determinación títuloséricos

Actividad bactericidasérica en curvas demuerte bacteriana

Adherencia,quimiotaxis,fagocitosis

Efecto posleucocitario(fase EPA)

Modelo de sepsisintraperitoneal enratones

Modelo de neumoníaen ratones

Modelo de infecciónen el muslo deratón neutropénico

Modelo de infecciónen muslo de ratónneutropénico

Modelo de meningitisen conejos

Modelo deendocarditis enratas

Modelo de cámarasen conejos

Modelo de piezas dealgodón en ratones

Los mismos que enel apartado anteriorpero consimulacionesfarmacodinámicas

Observación decélulas bacterianastras: infecciónintraperitonealo meningitis enconejos

1. Títulos bactericidas séricos7,8. Es quizá unade las técnicas que más se valoran en el estudiode la actividad de un antimicrobiano. Es una for-ma de “titulación” de la actividad que incluyecomo factores la concentración del antimicrobia-no y su CMI frente al microorganismo. Se empleageneralmente para su determinación el suero devoluntarios que han recibido una dosis del anti-microbiano, y se obtiene la dilución máxima delsuero que es capaz de matar al 99,9 % de lasbacterias (con un período de incubación de24 h), realizándose comparaciones según eltiempo de extracción del suero y la concentraciónde antimicrobiano.

2. Actividad bactericida sérica en curvas demuerte bacteriana9. De forma semejante a lascurvas de muerte bacteriana con PMN descritasen los modelos in vitro, en este modelo se añadeal cultivo de microorganismos el suero de volun-tarios que han recibido una dosis del antimicro-biano, en vez de exponer éste directamente alantimicrobiano. Se valora de esta forma la reduc-ción del inóculo en vez de establecer un títulobactericida del suero, observándose hechos far-macodinámicos que tienen efecto en tiemposcortos (duración del ensayo de 2-4 h). Al mismotiempo se puede estudiar si la acción de los PMNaumenta la muerte bacteriana en presencia delantimicrobiano, comparando la reducción delinóculo de curvas con suero de voluntarios másPMN y una curva con sólo células PMN y micro-organismos.

Modelos in vivo. Como se ha comentado ante-riormente, los modelos in vivo de predicción deeficacia mediante evaluaciones de la farmacodi-namia de un antimicrobiano pueden estudiar di-versos parámetros que actuarían como predicto-res de eficacia. Dado el elevado número demodelos en animales y teniendo en cuenta elposterior desarrollo de muchos de ellos en otroscapítulos, se enumerarán a continuación los quepermiten el estudio de un mayor número de mi-croorganismos (más inespecíficos), debido al tipode infección que se causa al animal.

1. Modelo de sepsis intraperitoneal en rato-nes7,10. Este modelo se utiliza ampliamente comoprimera indicación de actividad in vivo de uncompuesto. Su finalidad es cuantificar la super-vivencia de ratones infectados intraperitoneal-mente con un inóculo alto y capaz de matar alanimal en pocos días u horas. En principio se uti-liza para determinar parámetros como la dosisefectiva que protege al 50% de los ratones (DE50).Sin embargo, en estadios más avanzados de es-

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Modelos utilizados en la predicciónde eficacia

Modelos in vitro. Se emplean principalmente deforma exploratoria y ofrecen una información am-plia sobre los posibles efectos del antimicrobiano.Destacan por su importancia los siguientes:

1. Curvas de muerte bacteriana. Generalmen-te, la técnica más empleada en el estudio farma-codinámico de un antimicrobiano. Esta técnicasimple, en la que se enfrenta un microorganismoa concentraciones constantes de un antimicro-biano en condiciones de crecimiento óptimas, esuno de los primeros pasos a llevar a cabo en lainvestigación de la actividad “dinámica” de uncompuesto, después de conocer, obviamente, suactividad “estática” (CMI o concentración míni-ma bactericida [CMB]). Sobre esta técnica sepuede, sin embargo, incluir una serie de varian-tes que pueden ofrecer una dimensión más am-plia y adaptada a la realidad in vivo (ensayo enpresencia de células polimorfonucleares [PMN])2,3.En estas curvas se pueden obtener diversos re-sultados, el más interesante de los cuales es elporcentaje de reducción del inóculo inicial a dis-tintos tiempos del ensayo (la duración en totalsuele ser de 8-12 h) con distintas concentracio-nes (desde 1 a 10 o 20 veces la CMI).

2. Curvas de muerte bacteriana con simula-ciones farmacocinéticas. La exposición a con-centraciones constantes de antimicrobiano nomuestra lo que realmente ocurre in vivo, dondelos valores de estos compuestos son cambiantesa lo largo del intervalo de dosificación. Existen va-rios modelos que “simulan” estos valores, obte-niéndose resultados más comparables y ajusta-dos a la realidad: sistemas de “cultivo continuo”4

(mediante bombas peristálticas) y sistemas de fil-tración-centrifugación5,6, como el Centriprep-10,en los que a distintos tiempos se elimina el anti-microbiano por filtración-centrifugación, aña-diendo una nueva concentración hasta el si-guiente tiempo, en el que se repite el proceso.

Al igual que en el caso anterior, la finalidad yobjeto del estudio es observar la cinética demuerte bacteriana medida por la reducción delinóculo inicial, pero permiten establecer una re-lación con parámetros farmacocinéticos determi-nados previamente (relación con tiempo sobreCMI [T > CMI] o área bajo la curva [ABC], etc.).

Modelos ex vivo. Se considera dentro de estegrupo a los modelos que emplean técnicas in vi-tro para estudiar muestras obtenidas in vivo. Seenumeran a continuación los más relevantes:

tudio de un antimicrobiano la dosificación sepuede diseñar de forma que simule la de huma-nos y la determinación de las concentracionesdel antimicrobiano en el suero permite una com-paración de parámetros farmacocinéticos conporcentaje de supervivencia.

2. Modelo de neumonía en ratones11. La fina-lidad es la misma que la del modelo anterior, ytambién se pueden utilizar un gran número demicroorganismos capaces de producir infeccio-nes en el pulmón o neumonías. En muchas oca-siones, los ratones son inmunodeprimidos me-diante inyección de ciclofosfamida o irradiación,aumentando la capacidad invasiva del patógeno.Además de la supervivencia, se puede realizartambién un recuento de bacterias en los pulmo-nes de los animales a distintos tiempos.

3. Modelo de infección en el muslo de ratónneutropénico12,13. Resulta técnicamente sencilloy poco complejo, y se puede utilizar en diversasdeterminaciones de parámetros farmacodinámi-cos, como se verá a continuación en otros apar-tados. En este modelo se causa una infecciónintramuscular en el muslo de ratones inmunode-primidos; los animales son tratados con el anti-microbiano, y durante un período corto (8-16 h),se realizan recuentos de bacterias viables en elmuslo homogeneizado de los ratones sacrifica-dos cada hora o cada 2 h. Como en los anterio-res, el diseño de los regímenes de dosificación(número de dosis, concentración, etc.) permiteuna correlación entre la eficacia (medida comoreducción de unidades formadoras de colonias[UFC] en el muslo) y los distintos parámetrosfarmacocinéticos (determinados en el suero delratón).

Modelos utilizados en la determinaciónde parámetros farmacodinámicos

Existen multitud de parámetros o variables detipo farmacodinámico que determinan la activi-dad de los antimicrobianos. Muchos de ellos sonespecíficos en cuanto a los microorganismos, y lamayoría están relacionados con el mecanismo deacción del compuesto frente a la bacteria. A con-tinuación se describen brevemente los modelosexperimentales que se han desarrollado para es-tudiar cada uno de ellos.

Efecto postantibiótico (EPA). Se ha definido elEPA como la supresión persistente del creci-miento bacteriano tras la exposición a una sus-tancia antimicrobiana. De esta forma, todos losmodelos empleados en su estudio han “aprove-chado” técnicas tanto in vitro como in vivo en las

que se “expone” el microorganismo al antimicro-biano, retirando éste después y cuantificando elcrecimiento bacteriano en su ausencia.

Las técnicas más sencillas son las desarrolla-das in vitro. Análogamente a las descritas en lascurvas de muerte bacteriana, el microorganismose expone a concentraciones constantes del an-timicrobiano durante un tiempo corto (de 1 a 2 h)generalmente en caldo, procediéndose entoncesa la retirada de éste. Para este procedimiento, seutilizan principalmente tres técnicas: dilución,inactivación por enzimas (sólo para betalactámi-cos) y centrifugación. Tras este proceso se rea-lizan recuentos bacterianos para cuantificar elretraso en el crecimiento, comparándolo con cul-tivos control sin exposición previa al antimicro-biano14.

Sin embargo, el estudio in vivo de este pará-metro permite una mejor aproximación a la reali-dad clínica. Para su estudio en animales se hanempleado los siguientes modelos.

1. Modelo de infección en el muslo de ratónneutropénico12,13. Descrito ya en el apartado an-terior, es tal vez el más utilizado. Para estudiar elEPA, los ratones infectados son tratados con do-sis bajas del antimicrobiano que aseguran unaexposición corta del microorganismo. Al determi-nar las concentraciones del antimicrobiano en elsuero, se puede calcular cuándo descienden dela CMI y, por tanto, el posible retraso en el creci-miento del inóculo.

2. Modelo de meningitis en conejos. Autorescomo Sande et al15 pusieron este modelo enpráctica para estudiar el efecto de una sola dosisde ampicilina sobre Streptococcus pneumoniae.

3. Modelo de endocarditis en ratas. En estemodelo, utilizado también por varios autores16, seproduce una endocarditis en las válvulas aórticao tricúspide. Un día más tarde se administra elantimicrobiano por vía intramuscular y posterior-mente se determinan el número de UFC y la con-centración del antimicrobiano en las vegetacio-nes producidas en las válvulas.

4. Modelo de cámaras en conejos. Este mo-delo es, tal vez, el menos utilizado17. Se utilizancámaras de acero en forma de red (tissue cagefluid) que contienen un tampón (buffer) y queson implantadas 4 semanas antes del experi-mento en la espalda de conejos sanos. Tras es-tablecerse un equilibrio entre los líquidos inters-ticiales y de la cámara, el día del experimento seintroduce en la cámara el inóculo que previa-mente han sido expuesto a la acción de antimi-crobiano in vitro.

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5. Modelo de piezas de algodón en ratones.Renneberg y Walder18 han puesto a punto estemodelo que, junto con el de infección en el mus-lo, son probablemente los mejor estandarizados.En vez de cámaras, se colocan piezas de algodóninoculadas bajo la piel de ratones.

En todos estos modelos, la determinación delEPA se realiza por recuento de UFC en el lugarde la infección, observando la diferencia entreanimales controles y tratados. El principal pro-blema está en distinguir el EPA del efecto de lasconcentraciones sub-CMI, siempre presentestras un tratamiento.

Efecto de las concentraciones subinhibitorias so-bre el crecimiento bacteriano. Las concentra-ciones subinhibitorias actúan de distinta manerasobre las bacterias en fase de crecimiento loga-rítmico, fase estacionaria o microorganismos pre-viamente expuestos a la acción del antimicrobia-no (fase de EPA)19.

Los modelos in vitro son los mismos que sehan descrito para el EPA, con la diferencia deque tras la eliminación del antimicrobiano se aña-den concentraciones subinhibitorias para obser-var su actividad sobre bacterias controles (ECS)o en fase de EPA (ECS-EPA).

En cuanto a los modelos en animales, se hanutilizado también varios de los modelos descritosanteriormente para el estudio del EPA in vivo (in-fección en el muslo de ratón, neumonía, implan-te de piezas de algodón o cámaras en conejos).El posible efecto de estas concentraciones sub-CMI se observaría al inocular bacterias cuandolas concentraciones de antimicrobiano han des-cendido de la CMI, y cuantificar su crecimiento.

Efectos sobre la morfología bacteriana. Los cam-bios en la morfología de las bacterias se han es-tudiado tanto con microscopio de luz como elec-trónico, ya que este segundo medio permite laobservación de alteraciones en la ultraestructurade las células20. Los modelos experimentales uti-lizados in vitro se pueden dividir en dos catego-rías: estudios en medios líquidos o sobre superfi-cies sólidas o semisólidas (exposición a discos deantimicrobiano o colocación de membranas conmicroorganismos sobre placas de agar con con-centraciones sub-CMI).

En cuanto a los modelos in vivo, el modelomás utilizado ha sido, por su sencillez y comodi-dad, el de infección intraperitoneal21. En estecaso, el tratamiento debe ser corto, para permi-

tir una tasa de muerte bacteriana baja, recupe-rando el microorganismo del líquido peritonealcuando las concentraciones del antimicrobianoen suero se encuentren por debajo de la CMI. Sepueden utilizar otros modelos, como el de me-ningitis en conejos anteriormente descrito, yaque permitiría una monitorización en el propio lí-quido cefalorraquídeo de las concentraciones delantimicrobiano.

Otros efectos farmacodinámicos sobrelos microorganismos

1. Efectos sobre la adherencia a superficies.Algunos modelos permiten el estudio de la adhe-rencia de microorganismos a diversas superficiestras ser tratados con antimicrobianos. En con-creto, se han utilizado superficies como célulasepiteliales del tracto urinario y superficies plás-ticas22.

2. Efectos sobre la producción de factores devirulencia. Se ha observado la supresión por par-te de eritromicina en concentraciones sub-CMIde la producción in vitro de exotoxina A, elastasay fosforilasa de algunos microorganismos comoPseudomonas aeruginosa23. Cepas con cápsulamucosa y no mucosa de esta misma especie hansido expuestas a la acción de concentracionessub-CMI de aminoglucósidos, betalactámicos yciprofloxacino, observándose en los primeros unareducción de la excreción de la cápsula de algi-nato y de sideróforos quelantes de acero.

3. Efectos inmunomoduladores. Dentro deeste apartado se puede estudiar (con técnicas exvivo) el efecto que los antimicrobianos inducenen los microorganismos y que influyen en las fun-ciones de las células defensivas (PMN y macró-fagos). En concreto, se pueden observar modifi-caciones tanto en la quimiotaxis como en laadherencia, fagocitosis o muerte intracelular me-diante la preexposición de los microorganismosal antimicrobiano. También se han estudiado ex-tensamente mediante estas técnicas el efectopostantibiótico leucocitario o la mayor suscepti-bilidad de las bacterias a ser fagocitadas cuandose encuentran en fase de EPA.

Ventajas y limitaciones

Todos los modelos experimentales expuestosanteriormente presentan una serie de ventajas einconvenientes que condicionan su desarrollo.Por un lado, pueden señalarse diferencias inhe-rentes a su naturaleza (estudios in vitro o in vivo)y posteriormewnte puede distinguirse entre los

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modelos que presentan un mejor ajuste a la rea-lidad que se pretende conocer.

Estudios in vitro o in vivo

La principal ventaja de los estudios in vitro es,obviamente, su menor laboriosidad y su capaci-dad de obtener resultados más rápidamente ycon una mayor reproducibilidad que los modelosin vivo. Sin embargo, estas técnicas in vitro sólopueden ofrecer resultados de forma aproximada,ya que el número de variables que se tienen encuenta son limitadas. Cabe destacar la mayoraproximación a la realidad in vivo mediante lossistemas de simulación farmacocinética, muy uti-lizados actualmente en detrimento de los mode-los que emplean concentraciones “constantes”de antimicrobianos.

Un paso adelante lo componen sin duda lossistemas y modelos ex vivo, que medirían me-diante técnicas in vitro los efectos de fluidos y/océlulas humanas (PMN o suero), y cuya princi-pal ventaja es la capacidad de “cuantificar” laactividad de un antimicrobiano (p. ej., ofrecien-do su título bactericida sérico). Tal vez la mayorventaja de estos modelos es la superior estanda-rización de las técnicas que se utilizan, siendoésta una de las desventajas de los modelos in

vivo, sobre todo de los que se emplean en la de-terminación de algunos parámetros farmacodi-námicos.

Si bien los modelos in vivo tienen una mayoraproximación a la realidad clínica, es tambiéncierto que deberían servir para responder a cues-tiones específicas más que para dar una ideaglobal de la actividad o eficacia de un antimi-crobiano. Los modelos in vivo que estudian lapredicción de eficacia son muy utilizados yla comparación de datos es fiable, pero otros,como los empleados en la determinación delEPA, no han sido lo suficientemente estandariza-dos como para que los datos puedan reflejar másdiferencias significativas entre antimicrobianosque entre los propios modelos. Además, las dife-rencias entre la farmacocinética de animales yhumanos debe ser tenida en cuenta a la hora deestablecer comparaciones, ya que son en gene-ral muy diferentes1. En la tabla III se resumen lasprincipales ventajas y limitaciones en el uso demodelos tanto in vitro como ex vivo e in vivo.

Estudios de predicción de eficacia

Es en este campo en el que existe una mayorestandarización en cuanto a todos los modelosempleados, ya que se trata de técnicas utilizadas

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TABLA IIIPRINCIPALES VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS MODELOS IN VITRO, EX VIVO E IN VIVO

In vitro Ex vivo In vivoVentajas

Limitaciones

ComodidadRapidez en la obtención

de resultadosAlta reproducibilidadTécnicas

estandarizadas yaceptadas

Sólo ofrecenindicaciones deactividad, y de formageneralizada

Aún en simulaciones,ponen en juegopocas variablesfarmacodinámicas

Las mismas que in vitroMayor aproximación a la

realidad in vivoCapacidad de

“cuantificar” laactividad (p. ej., títulosséricos) y compararlaluego in vivo

Aunque más que in vitro,no respondena cuestionesespecíficas, sólogenerales

Más complejas que lasin vitro por lanecesidad de extraercélulas y/o fluidoshumanos o animales

Infecciones controladasy reproducibles

Identificación rápida defalta de actividad invitro

Interacción de multitudde variables queinfluyen en la eficacia

Laboriosidad y necesidadde instalacionesespecíficas

Infecciones a menudopoco naturales(infeccionesfulminantesy artificiales)

Farmacocinética pocosimilar a la de humanos

Modelos a veces pocoestandarizados (enEPA, sub-CMI,morfología)

habitualmente en el estudio de antimicrobianos yde amplia difusión. Todos ellos son imprescindi-bles en el estudio de antimicrobianos, ya queofrecen una idea de la actividad de un producto.Por tanto, sus ventajas principales son su rapidezy el alto número de datos que se pueden obteneren poco tiempo. Sin embargo, estos estudios,como se apuntaba anteriormente, deben com-plementarse de forma inevitable con estudiosmás detallados en infecciones similares a las pro-ducidas en clínica humana.

Estudios de parámetros farmacodinámicos

El gran interés despertado hace unas décadaspor el estudio de ciertos parámetros farmacodiná-micos como el EPA contribuyó a que se desarro-llaran un gran número de modelos tanto in vitrocomo in vivo. De esta forma, los numerosos datosobtenidos sobre la mayoría de los antimicrobianosno permiten su comparación de forma significati-va. El EPA de un antimicrobiano puede ser dife-rente en duración según el modelo utilizado14,existiendo notables diferencias entre los valoresobtenidos in vitro e in vivo (más altos generalmen-te en este último caso). Los modelos in vivo, ade-más, pueden subestimar los efectos de concen-traciones subinhibitorias, que falsearían el EPA14

como se ha demostrado en alguna ocasión24.Como ejemplo de esta falta de estandarización

o establecimiento de un protocolo unitario desta-ca que las fórmulas para determinar la duraciónde estos efectos suelen variar ampliamente de unmodelo a otro, lo que ha llevado a la imposibili-dad de comparación de resultados. Es en estegrupo de modelos en los que sí puede aplicarsela característica de ser “indicadores” de paráme-tros clínicos, ya que ofrecen una idea aproxima-da de lo que se pretende cuantificar.

Aplicabilidad

Dado el elevado número de estudios realizadoscon los modelos expuestos anteriormente, eneste apartado realizaremos un resumen del ám-bito de aplicación de estos modelos y técnicas,resaltando principalmente la experiencia de losautores en este campo, con una sinopsis de loque ha sido y es el estudio de la farmacodinamiade los antimicrobianos.

En primer lugar, destaca la enorme importan-cia que tienen actualmente los datos de predic-ción de actividad en el estudio de la eficacia deun antimicrobiano. Todos los modelos de estudioen este apartado conducen al establecimiento de

patrones de actividad frente a los microorganis-mos. Para la determinación de estos patrones, sesiguen habitualmente una secuencia de tipo ló-gico en los ensayos a realizar1:

1. Demostración in vitro de la disminución demasa bacteriana (o inóculo inicial) mediante cur-vas de muerte (preferentemente en simulacionesfarmacocinéticas).

2. Demostración ex vivo y/o in vivo de esta ca-pacidad in vitro mediante los modelos de super-vivencia enumerados en apartados anteriores.

3. Posible extrapolación a humanos.

Como ejemplo pueden citarse los estudios rea-lizados para explicar la eficacia de las penicilinas(en concreto de amoxicilina) sobre cepas de S.pneumoniae, aun cuando la tasa de resistenciade este microorganismo a betalactámicos escada vez más preocupante. Mediante estudios invitro e in vivo se ha podido determinar la eficaciade amoxicilina incluso con una cepa de neumo-coco resistente a penicilina, utilizando para ellola mayoría de los modelos tanto in vitro como invivo que ya hemos descrito. En otros casos sepuede establecer una relación entre la observa-ción de uno o más parámetros farmacodinámi-cos y su capacidad para influir en la actividad deun compuesto. De esta forma, en otros estudioshemos empleado modelos como el de lesión enel muslo de ratón neutropénico para comprobarsi la duración del EPA podía influir en los regí-menes de dosificación de varios antimicrobia-nos25,26, observándose que en compuestos conEPA no significativo (como algunos betalactámi-cos) los regímenes con dosificaciones más espa-ciadas eran poco eficaces en relación con anti-microbianos que sí tenían EPA (macrólidos oquinolonas).

A este respecto, debe citarse como aplicaciónrealmente interesante los trabajos de Vogelmanet al con este mismo modelo in vivo, en el quecorrelacionaron parámetros farmacocinéticoscon la eficacia de varios compuestos de distintasclases de antimicrobianos13. Frente a varios mi-croorganismos y utilizando varias dosificacionesdistintas, se establecieron correlaciones entre eltiempo sobre CMI o CMB, ABC, etc., con los re-cuentos de bacterias en el muslo de los ratones,estableciendo indicadores de eficacia con losque poder ayudar en el diseño de regímenes dedosificación en humanos. De forma similar, sehan realizado estudios con otros modelos comoel de neumonía en ratones, relacionando farma-cocinética y eficacia en recuentos de UFC en elpulmón11.

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Entrando en el campo del estudio de paráme-tros farmacodinámicos, se han aplicado los mo-delos descritos a un gran número de antimicro-bianos. Existen amplias revisiones de los valorestanto de EPA como de otros efectos relacionados(concentraciones subinhibitorias o morfología)con modelos tanto in vitro como in vivo14, si bienestos trabajos se llevan a cabo actualmente deforma rutinaria en la mayoría de nuevos antimi-crobianos y su trascendencia parece haber dis-minuido. También hay que destacar el elevadonúmero de trabajos en los que se comparan lasdistintas técnicas o modelos (sobre todo in vitro)que se utilizan en este tipo de ensayos27.

Teniendo en cuenta todos ellos, se han esta-blecido “patrones” de comportamiento de lascombinaciones antimicrobiano-microorganismoen relación con estos parámetros. De nuestra ex-periencia, al igual que de la de otros muchos in-vestigadores, se ha establecido que existen cier-tos grupos de antimicrobianos que carecen deEPA o éste es poco significativo (betalactámicoscon grampositivos), mientras que otras clasescomo los macrólidos, aminoglucósidos o quino-lonas poseen unos valores altos frente a la mayo-ría de los microorganismos ensayados, tanto in vi-tro como in vivo14,25,26.

El mismo comportamiento se puede seguiren la valoración de parámetros como el efectode las sub-CMI sobre el crecimiento o la morfo-logía bacteriana. Parece existir una relación en-tre la duración del EPA y la de los efectos de lasconcentraciones sub-CMI; antimicrobianoscomo los macrólidos o quinolonas parecen im-pedir el recrecimiento de las bacterias hasta en24 h, mientras que en betalactámicos esteefecto (aunque también significativo), es másreducido19. Por contra, los efectos de estos úl-timos sobre la morfología bacteriana son másvariados, tal vez a causa del mecanismo de ac-ción, más relacionado con la forma de las célu-las que en los macrólidos o quinolonas. Encuanto a la inmunomodulación, se ha observa-do que tanto los betalactámicos (amoxicilina,cefotaxima, etc.) como las fluorquinolonas y losmacrólidos parecen inducir un incremento dela funciones de PMN (actividad bactericida ofagocitosis)9,28.

Conclusiones

Como conclusiones destaca que la utilidad delos modelos in vitro e in vivo en el estudio de lafarmacodinamia ha llevado en las últimas déca-das a la obtención de un altísimo número de re-sultados que engloban a la práctica totalidad de

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los antimicrobianos de interés general. Si bien al-gunas técnicas y modelos necesitarían un mayorconsenso para su estandarización, la realidad esque todos los resultados que se obtengan ten-drán, sin duda, un gran valor en el estudio de lafarmacodinamia de los antimicrobianos. Desdelos estudios in vitro, necesarios para tener un es-timación del comportamiento de un compuesto,hasta los modelos in vivo que ofrecen un datomás aproximado de lo que puede ocurrir en la clí-nica humana, todos han demostrado presentar,en general, una adecuada correlación con los da-tos obtenidos de ensayos clínicos y de la expe-riencia clínica.

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J. PASCUAL: Una de las limitaciones de los estudiosin vitro es que la mayoría de los métodos que sehan explicado se hacen en un medio acelular,es decir, se hacen con un medio de cultivo arti-ficial y obviamente la situación in vivo es muydistinta. Me gustaría reclamar la importanciaque en nuestra opinión tiene un parámetro far-macológico que sería estudiar la concentraciónintracelular de los antibióticos y su correlación

con la actividad intracelular. Es decir, creo quees un parámetro importante no sólo en aquelloscasos en los que hablamos de microorganismosque sean patógenos intracelulares estrictos sinoque la mayoría de las bacterias en un momentodeterminado de la patogenia de la enfermedadvan a tener un comportamiento intracelularo van a tener una multiplicación intracelular. Enese sentido, creo que es un parámetro que, con

DISCUSIÓN

33


vistas a modelos experimentales, puede aportaruna información importante.

F. FUENTES: Los parámetros farmacodinámicosestán bastante relacionados con la farmacoci-nética. En todos los modelos que he revisado,tal vez un poco rápido, la farmacocinética debeestar bastante controlada. Es importante saber

los valores que se van a alcanzar para poste-riormente poder compararlos con otros re-sultados de efectos postantibióticos en otrosmodelos, incluso en el mismo con otras con-centraciones más altas. Hay una relación im-portante entre los modelos de farmacocinéticay farmacodinámica.

RESUMEN

La eficacia in vivo de un antimicrobiano se veafectada por su farmacocinética y farmacodinamia.Probablemente la mayor limitación de los estudiosde eficacia terapéutica que utilizan modelos ani-males de infección la podemos hallar en las dife-rencias entre la farmacocinética de los animales yla de los humanos. Dado que la farmacocinética delos antibióticos influye en la respuesta in vivo de losantimicrobianos deberían tenerse en cuenta las va-riaciones de la farmacocinética interespecies. Losfármacos pueden ser administrados a los animalesa dosis que hagan alcanzar concentraciones séri-cas similares a las humanas, pero de forma inva-riable, son eliminados más rápidamente en los ani-males que en los humanos. Este problema puedesolucionarse de dos formas: manteniendo cons-tante la relación entre la vida media del antibióticoy su intervalo de dosificación, de manera que la ad-ministración del antibiótico se realice cada cuatrovidas medias o simulando el perfil farmacocinéticohumano en los animales, lo que se ha denomina-do farmacocinética humanizada. La adaptación ala farmacocinética humana puede conseguirsemediante diferentes técnicas como son la dosifica-ción repetida fraccionada, la disminución de la eli-minación del fármaco mediante la alteración de sueliminación biliar o renal o la infusión continua delantibiótico para simular la farmacocinética huma-na en el animal. Sin embargo, estas técnicas estánlimitadas porque se presupone el conocimiento delos perfiles farmacocinéticos en humanos y esta in-formación se obtiene en una fase tardía del desa-rrollo de los nuevos compuestos. Por tanto, sólopueden utilizarse cuando se conoce la farmacoci-nética en humanos de un antibiótico.

Palabras clave:Farmacocinética humanizada. Farmacocinética ani-

mal. Farmacocinética humana.

HUMAN-LIKE PHARMACOKINETIC MODELIN ANIMAL INFECTION MODELS

Although the in vitro potency of an antimicro-bial remains a critical predictor, the pharmacoki-netics and pharmacodynamics of any particularagent can dramatically affect the in vivo efficacy.Perhaps the greatest limitation in the use of ani-mal models for studiying chemotherapy, and per-haps the single most-ignored parameter, involvesdifferences in the pharmacokinetic parameters ofantibiotics between humans and animals. Thepredominate differences lie in the faster elimina-tion of drugs in small animals, compared to hu-mans. Although the dosage of antimicrobial agentadministered can often be adjusted to mimic thepeak serum levels found in humans, compensa-ting for the faster elimination of most drugs is in-deed more difficult.

Consideration of these pharmacokinetic diffe-rences has led some researchers to adapt anti-microbial dosing to override faster elimination ofcompounds by animals in order to obtain phar-macokinetics more similar to those expressed byhumans. Repeated fractional dosing, renal im-pairment, and continuos infusion have all beenused to mimic human pharmacokinetics of anti-microbial agents in small animals.

Key words:Human-like pharmacokinetic. Animal pharmacoki-

netics. Human pharmacokinetic.

El modelo de farmacocinética humanizadaen los modelos animales de infección

Joan Gavaldà* y Albert PahissaServei de Malalties Infeccioses. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona.

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Introducción

Los modelos discriminativos están ideadospara que se asemejen al máximo a la infecciónque se produce en humanos (p. ej., endocarditisy osteomielitis en conejos y ratas o meningitis enconejos). Estos modelos poseen una serie deventajas prácticas y científicas sobre los estudiosclínicos que los hacen altamente recomendablesen la evaluación de nuevas pautas terapéuticas.Variables como el estadio de la enfermedad, lagravedad de las complicaciones, la heterogenei-dad de la población y la farmacocinética, que soncomplejas y que podrían confundir los resultadosde los estudios clínicos por su gran variabilidad,pueden mantenerse de manera constante e inal-terable en los estudios en el modelo animal. Asímismo, los parámetros que ofrecerán los resulta-dos son muy concretos y, por tanto, estadística-mente fáciles de comparar (p. ej., número de mi-croorganismos en el tejido infectado). A su vez,los resultados son reproducibles, lo que les otor-ga una mayor validez. Finalmente, es posibleutilizar el número de animales necesario pararesponder a las cuestiones planteadas, lo que re-sulta imposible de realizar en estudios clínicos deenfermedades tan poco frecuentes como la en-docarditis o la meningitis. Con la utilización deeste tipo de modelos se han contestado pregun-tas, por otra parte, difíciles o imposibles de com-probar en clínica, como la importancia del efectoantibiótico bactericida en comparación con elbacteriostático, o cuál es la dosis mínima eficaz oel intervalo de dosificación más favorable de unantibiótico, entre otras.

A pesar de todas estas ventajas, la extrapola-ción de los resultados a los humanos debe ha-cerse con una gran cautela. Para evitar al máxi-mo los errores hay que tener en cuenta lassiguientes consideraciones:

1. La infección ha de simular al máximo lo queocurre en humanos, fundamentalmente encuanto al inóculo que la induce, a la respuestadel huésped a la misma y a su evolución.

2. En estudios de eficacia terapéutica, debeexistir una comparación con las pautas de trata-miento consideradas como de elección con efi-cacia clínica demostrada.

3. Dado que la farmacocinética de los anti-bióticos influye en la respuesta in vivo de los an-timicrobianos deberían tenerse en cuenta las va-riaciones de la farmacocinética interespecies.Los fármacos pueden ser administrados a losanimales a dosis que hagan alcanzar concentra-ciones séricas similares a las humanas, pero in-

variablemente, son eliminados de forma más rá-pida en los animales que en los humanos. Esteproblema puede solucionarse de dos formas:manteniendo constante la relación entre la vidamedia del antibiótico y su intervalo de dosifica-ción, de manera que la administración del anti-biótico se realice cada cuatro vidas medias o si-mulando el perfil farmacocinético humano en losanimales, lo que se denomina farmacocinéticahumanizada.

Para destacar la importancia que puede tenerla “humanización” de la farmacocinética en losanimales puede ponerse como ejemplo la endo-carditis. La endocarditis infecciosa es una infec-ción difícil de curar. Aunque muchos de los mi-croorganismos que la producen son susceptiblesa un buen número de antimicrobianos, el trata-miento debe prolongarse varias semanas paraconseguir curar al paciente. Hay diferentes razo-nes que se han esgrimido para explicar la dificul-tad en esterilizar las vegetaciones: a) la baja pe-netración de los antibióticos en las vegetaciones;b) el estado metabólico alterado de los microor-ganismos que se encuentran en el interior de lavegetación, y c) la ausencia de mecanismos dedefensa del huésped en el seno de la vegetación.Estos factores, considerados desde hace tiempocomo clásicos, se han visto complementados porotros dos que son la farmacocinética de penetra-ción de los antimicrobianos en el interior de la ve-getación y la farmacodinamia específica de estainfección. El grupo de Claude Carbon demostrótres patrones diferentes de difusión en el interiorde la vegetación, después de estudiar la farma-cocinética de penetración de 10 antimicrobianosmediante autorradiografía de las vegetaciones1,2:a) el primero es el hallado para teicoplanica 14Cen el que el antibiótico está concentrado en la pe-riferia de la vegetación sin penetrar en su seno;b) el segundo es el que presenta la ceftriaxona14C y, en menor medida, la penicilina 14C, que sedifunden progresivamente hacia el interior de lavegetación, aunque persiste un gradiente muyelevado de concentraciones entre la periferia y elseno de la vegetación, y c) el tercer patrón pre-senta una distribución homogénea del antibióti-co marcado en la totalidad de la lesión. Este pa-trón fue observado para tobramicina, pefloxacino,temofloxacino, esparfloxacino y daptomicina.

Por otra parte, trabajos que han utilizado elmodelo de endocarditis experimental han de-mostrado una serie de factores farmacodiná-micos, relacionados con la dosificación de losantimicrobianos, específicos para la endocarditis.Así, diversos estudios en el modelo de endocar-

36


ditis, a diferencia de lo que sucede en el modelode infección subcutánea y en el de neumonitis3,han demostrado que el mantenimiento de unaconcentración de betalactámicos por encima dela concentración mínima inhibitoria (CMI) no fuesuficiente para asegurar la esterilización de lasvegetaciones4. A su vez, estos estudios demues-tran que una vez obtenida una concentraciónadecuada de antibióticos, el parámetro de efica-cia más importante es la duración del tiempo decontacto entre los antimicrobianos y la bacteria yno la concentración del betalactámico por sí mis-ma. También para otros antimicrobianos no be-talactámicos, su farmacocinética, su farmacodi-namia y el patrón de difusión en el interior de lavegetación pueden ser factores muy importantespara determinar su dosificación en el tratamien-to de la endocarditis. Así, para los glucopéptidosel porcentaje de letalidad bacteriana no es de-pendiente de su concentración pico sérica, sinodel tiempo en el que existen concentracionesplasmáticas inhibitorias del crecimiento bacteria-no5. En el caso de los aminoglucósidos, estudiosrecientes han demostrado la posibilidad de suadministración una vez al día frente a su admi-nistración fraccionada debido a unas caracterís-ticas farmacodinámicas muy concretas6-11.

Por lo anteriormente reseñado, parece reco-mendable que para poder extrapolar a humanoslos resultados de los estudios de eficacia te-rapéutica en el modelo de endocarditis experi-mental, la farmacocinética de los antibióticosanalizados debe ser lo más parecida a su farma-cocinética en humanos (farmacocinética huma-nizada).

Diferentes autores han empezado a utilizar elmodelo de farmacocinética humanizada de losantimicrobianos en sus estudios terapéuticos rea-lizados en diversos modelos animales12-31. De larevisión de estos trabajos se deducen una seriede consideraciones: a) preguntas que se habíanplanteado sobre eficacia terapéutica, cuya res-puesta todavía no estaba totalmente contestadaen trabajos previos, han podido ser definitiva-mente respondidas al utilizar la farmacocinéticahumanizada, y b) la utilización de farmacocinéti-ca no humanizada puede inducir errores tanto deinfra como de supravaloración de la eficacia dedeterminados antimicrobianos. Este hecho haríacasi imprescindible el uso de la farmacocinéticahumanizada en estudios de eficacia terapéuticaque compararan antimicrobianos de diferentescategorías (p. ej., betalactámicos frente a gluco-péptidos).

La adaptación a la farmacocinética humanapuede conseguirse mediante diferentes técnicas

como la dosificación repetida fraccionada, la dis-minución de la eliminación del fármaco median-te la alteración de su eliminación biliar o renal, ola infusión continua del antibiótico para simularla farmacocinética humana en el animal. Sin em-bargo, estas técnicas están limitadas porque sepresupone el conocimiento de los perfiles farma-cocinéticos en humanos y esta información seobtiene en una fase tardía en el desarrollo denuevos compuestos. Por tanto, sólo pueden utili-zarse cuando se conoce la farmacocinética enhumanos de un antibiótico.

Dosis repetida fraccionada

Se puede simular la farmacocinética humanaen suero repetida de dosis decrecientes del fár-maco, con lo que la eliminación más rápida delfármaco en el animal se contrarrestará con in-yecciones repetidas de más compuesto. Esta téc-nica ha sido utilizada por Gerber et al13-16,26,28,29

en modelos de infección en muslo de ratón porPseudomonas aeruginosa para conocer los pará-metros farmacocinéticos relacionados con la efi-cacia terapéutica de diferentes clases de antibió-ticos. La conclusión que se extrae de los modelosde Gerber, y que probablemente puede genera-lizarse, es que la utilización de farmacocinéticano humanizada puede inducir errores tanto deinfra como de supravaloración de la eficaciade determinados antimicrobianos. Esta técnicatambién ha sido utilizada por Hatano et al32, quie-nes consiguieron simular en ratones el perfil far-macocinético humano de diferentes cefalospori-nas. Estos autores desarrollaron una fórmulamatemática para predecir las dosis necesariasque deben administrarse a los animales, me-diante la administración fraccionada del fármacopara simular la farmacocinética humana. Me-diante esta fórmula estos autores fueron capacesde obtener los perfiles farmacocinéticos humani-zados en ratones para cefpiroma, flomoxef y cef-tacidima.

Disminución de la eliminación biliar

El 40% de la eliminación de ceftriaxona en hu-manos se produce por vía biliar. La administra-ción de diclofenaco junto con ceftriaxona en co-nejos demostró que las concentraciones séricasy los valores del área bajo la curva (ABC) de cef-triaxona fueron similares a los que se encuentranen humanos a las dosis utilizadas habitualmente.Estas alteraciones en la farmacocinética produci-das por el diclofenaco vinieron determinadas porla disminución de su eliminación biliar.

37

EL MODELO DE FARMACOCINÉTICA HUMANIZADA EN LOS MODELOS ANIMALES DE INFECCIÓN

Disminución de la eliminación renal

La alteración de la función renal mediante di-ferentes nefrotóxicos induce a una eliminaciónmás lenta de los antimicrobianos y, con ello, sufarmacocinética de eliminación es más similar ala de los humanos. En ratones, esto se consiguemediante la inyección subcutánea de 10 mg/kgde nitrato de uranilo. Esta técnica fue utilizadapor Craig et al33 para evaluar la eficacia de la ad-ministración en una sola dosis diaria de amikaci-na frente a su administración fraccionada en mo-delos de infección de muslo y neumonía enratones netropénicos. Con esta técnica, estosautores pudieron simular la farmacocinética hu-mana de una sola dosis diaria de amikacina y de-mostrar que su eficacia era similar a la adminis-tración fraccionada.

Administración intravenosa continuapara alcanzar el estado de equilibrio

Para contrarrestar la administración más rápidade los antimicrobianos animales se ha utilizado laadministración continua intravenosa hasta alcan-zar la fase de stedystate. Esto se ha realizado me-diante infusión intravenosa utilizando bombas deinfusión o bombas osmóticas que liberan de formamantenida fármaco intravascularmente. Estos mo-delos no simulan el perfil farmacocinético humanode dosificación fraccionada, por lo que la extrapo-lación de resultados resulta limitada, ya que en hu-manos no es frecuente la utilización de infusióncontinua de antibióticos. Con esta técnica puedencompararse tratamientos mediante administraciónfraccionada frente a infusión continua, pero los re-sultados de la administración fraccionada del fár-

maco tenderán las limitaciones propias de la utili-zación de la farmacocinética del animal.

La técnica de farmacocinética humanizada sebasa en la administración de dosis decrecientesde antibiótico al animal por vía intravenosa me-diante una bomba de infusión intravenosa con-trolada por ordenador que permite simular en elanimal el perfil farmacocinético humano del an-tibiótico (fig. 1).

El esquema de trabajo de los estudios de far-macocinética humanizada en los animales se di-vide en tres partes:

1. Estudio de la farmacocinética de los distintosantimicrobianos en el animal. Determinación delas concentraciones séricas tras la administraciónintravenosa, en bolo, de cada uno de los antimi-crobianos en el conejo. A partir de las concentra-ciones séricas se determinarán el perfil farmacoci-nético, las constantes de eliminación y distribución(ésta en el modelo bicompartimental), y el volu-men de distribución. Estos valores son imprescin-dibles para aplicar el modelo matemático de hu-manización de la farmacocinética en animales.

2. Aplicación de un modelo matemático. Estemodelo permitirá conocer las dosis que debenirse administrando en cada período de tiempo alanimal para pasar de un perfil farmacocinéticoanimal a uno humanizado.

3. Estudio de la farmacocinética humanizadaen los animales. Práctica del ensayo de farmaco-cinética humanizada de los distintos antimicrobia-nos en el animal. Esto se realiza mediante la de-terminación de las concentraciones séricas deantibiótico tras la administración intravenosa, me-diante una bomba de infusión controlada por or-denador, de las dosis halladas tras la aplicacióndel modelo matemático. Este sistema de infusiónpermite administrar volúmenes distintos a dife-rentes intervalos de tiempo. Así, por ejemplo, unasecuencia que se podría realizar sería: 2.000 �l/hdurante 6 min, después 1.500 �l/h durante 3 min,etc., y así sucesivamente. También permite repe-tir esta secuencia tantas veces como deseemos.Por tanto, si se considera una secuencia como laadministración de una dosis de un antimicrobianoen humanos, puede administrarse al animal untratamiento que simule al máximo la administra-ción del fármaco al hombre (p. ej., 2 g /4 h de am-picilina intravenosa).

Estudio de la farmacocinética de los distintosantimicrobianos en el animal

Este estudio se realiza en grupos de entre 5 y10 conejos sanos para cada uno de los antimi-

38


Bomba de perfusiónHarvard 22

Fig. 1. Esquema de la farmacocinética humanizada.

crobianos. Los antibióticos, las dosis y los tiemposde extracción de las muestras son arbitrarios. Detodas formas, por lo general se puede tomar comonorma que los tiempos de extracción (en minutosdespués de la inyección) podrían ser de 5, 15, 30,40, 50, 60, 90, 120 y 180 para los antimicrobia-nos que siguen un modelo monocompartimentaly de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 60, 90, 120,150, 180, 210, 240, 300, 360 y 480 para aque-llos con un modelo bicompartimental.

La extracción de sangre puede realizarse porpunción de la vena marginal de la oreja, aunquees recomendable realizarla a través de un catétercolocado en la arteria carótida o la vena yugularcomún. Los tiempos finales de extracción pue-den variar dependiendo de los resultados de losprimeros ensayos.

La determinación de las constantes farmaco-cinéticas necesarias será diferente dependiendode si los antibióticos siguen un modelo de cinéti-ca de primer orden monocompartimental abiertoo bicompartimental.

En el modelo monocompartimental, una vez co-nocidas las concentraciones séricas en el animal,se realizará la gráfica de la concentración en sue-ro-tiempo y, posteriormente, utilizando el métodode los mínimos cuadrados se obtendrán la cons-tante de eliminación del fármaco (kel) y la con-centración plasmática a tiempo 0 (C0) mediante larelación lineal existente entre el logaritmo neperia-no de la concentración sérica en el eje de orde-nadas y el tiempo de extracción en el de abscisas:

y = A − b x

siendo C0 = eA y kel = b

En este caso, la relación lineal tendrá la si-guiente forma:

Ln Cp = Ln C0 − kel × t,

donde Cp = concentración plasmática en el tiem-po (t).

El volumen de distribución (Vd) se obtiene apartir de:

Vd = D/C0

donde D = dosis administrada en mg/kg.

En el modelo de cinética de primer orden bi-compartimental abierto la eliminación de los fár-macos depende, al igual que en el monocom-partimental, de la distribución y de la eliminación,

pero adquiriendo en este caso una especial rele-vancia el proceso de distribución, hecho que nosucedía en el modelo monocompartimental. Enel modelo de primer orden bicompartimentalpueden diferenciarse dos fases:

1. Una primera fase o rápida, determinadapor la constante de disposición �, en la que elfármaco desaparece del compartimento endo-vascular, en gran parte, por paso al comparti-miento periférico (tejidos) (aunque simultánea-mente se estén produciendo un cierto grado deeliminación y un cierto grado de retorno de los te-jidos a la sangre).

2. Una segunda fase o lenta, determinada porla constante de disposición �, en la que ya se haalcanzado un equilibrio entre el compartimientocentral y periférico; en esta fase las concentracio-nes plasmátiaos disminuyen principalmente porla eliminación desde el compartimiento central.

El curso temporal de las concentraciones plas-máticas depende de la suma de los procesos ex-ponenciales, el � y el �:

Cp = A0 × e−� × t + B0 × e−� × t

donde A0 = concentración plasmática parat = 0 en la fase de distribución.B0 = concentración plasmática para t = 0 en lafase de eliminación.

Tras la administración de una dosis del fárma-co a 5 animales, realizamos extracciones de san-gre a diferentes tiempos, y determinamos las di-ferentes concentraciones séricas. Calculamos lamedia a partir de los valores de los 5 animales, yrealizamos gráficas a partir de los puntos obteni-dos (curva de concentraciones plasmáticas-tiem-po). Según estas gráficas, consideramos a partirde qué momento se inicia la fase de eliminación.Las concentraciones obtenidas en los tiemposposteriores nos permitirán obtener mediante elmétodo de los mínimos cuadrados los valores deB0 y � mediante la relación lineal existente entreel logaritmo neperiano de la concentración séri-ca en el eje de ordenadas y el tiempo de extrac-ción en el de abscisas:

y = A − b x

siendo B0 = eA y kell = �.

En este caso, la relación lineal tiene la siguien-te fórmula:

Ln Cp = Ln B0 − � × t

39


donde Cp = concentración plasmática en el tiem-po (t).

Posteriormente mediante la suma de residua-les, se ajustan las concentraciones de la fase dedistribución a los valores de B0 y � obtenidos pre-viamente y después, también por el método delos mínimos cuadrados, se obtienen los valoresde A0 y �. A partir de estos resultados podemoscalcular: Vc = volumen de distribución del com-partimento central; k21 = constante de distribu-ción del compartimiento periférico al central;k13 = constante de eliminación, y C0 = concen-tración plasmática teórica a tiempo 0:

C0 = A0 + B0

Vc = D/C0 (D = dosis (mg/kg)VdA = (�/K21) × Vc (volumen distribución área)k21 = (A × � + B × �)/C0

k13 = � × �/k21 = kel

Aplicación de un modelo matemático

Administración intravenosa en infusión cortasegún el modelo de cinética de primer ordenmonocompartimental abierto. La cinética de eli-minación en los fármacos que poseen una ciné-tica de primer orden monocompartimental abier-to se rige por la siguiente relación matemática:

Cp = C0 × e−kel × t

donde Cp = concentración plasmática del fárma-co en �g/ml.C0 = concentración plasmática a tiempo 0.kel = constante de eliminación.t = tiempo en horas.

Entendemos, pues, que la única diferencia en-tre la cinética humana y la del conejo estriba enel valor de la kel, que es superior en el roedor(kelh < kelc) o, en otras palabras, que el tiempode vida media del fármaco en humanos (kel == 0,693/t1/2) es más elevado que el del roedor:

kelh = constante de eliminación en el hombre.kelc = constante de eliminación en el conejo.

El sistema que utilizamos para humanizar la ci-nética de eliminación en el conejo se basa en lanecesidad de proporcionar a este animal canti-dades de fármaco decrecientes que contrarres-ten esta velocidad de eliminación elevada:

1. Determinamos unos intervalos de tiempo(Tx) durante los que administraremos la canti-

dad de fármaco necesaria para pasar de la con-centración sérica en el animal a la deseada hu-mana.

2. En el límite final de estos intervalos (Tx), laconcentración plasmática del fármaco será máselevada en la cinética humana que en la del co-nejo (puesto que kelc > kelh). Determinamos laconcentración que hemos de conseguir (Cy) paracontrarrestar esta diferencia. La concentracióndeseada (Cy) se obtendrá restando la concentra-ción que deseamos alcanzar (Chx = concentra-ción humana) de la concentración existente en elanimal (Ccx), mediante la siguiente proporción,donde x = número del intervalo:

Cy = Chx − Ccx

donde

para x = 1 Ch1 =C0 ×e−kelh × t1 y Cc1=C0 ×e−kelc × t1

para x = 2 Ch2 =C0 ×e−kelh × t2 y Cc2=Ch1 ×e−kelc × t2

siendo

t = duración del tiempo en horas desde t = 0 has-ta el final del intervalo Tx T = duración del tiem-po en horas del intervalo Tx.

Así pues, la fórmula general sería, para x = 1,2, 3...,

Chx = C0 × e−kelh × tx

Ccx = Chx−1 × e−kelc × Tx

3. La cantidad de fármaco que hemos de ad-ministrar mediante infusión intravenosa continua,durante el intervalo de tiempo Tx, para conseguirla concentración deseada (Cy) (en mg/h) vienedeterminada por la siguiente relación:

Qx = (Cy × Vdc × kelc × P)/(1 − e−kelc × Tx)

donde

Qx = dosis de antibiótico a administrar duranteTx (mg/h).Vdc = volumen de distribución del fármaco en elconejo (l/kg).Tx = intervalo de tiempo (h). P = peso del animal (kg).

Obviamente, la primera dosis a administrar es-tará destinada a obtener C0 y vendrá determina-da por:

Qx = (C0 × Vdc × kelc × P)/(1 − e−kelc × Tx)

40


4. Puesto que realizaremos una infusión con-tinua, la velocidad de infusión a la que hemos deprogramar la bomba de infusión (Vx, en ml/h) de-penderá de la concentración de la disolución deantibiótico que administremos (S, en mg/ml):

si Vx = Qx/S

Así pues, el volumen al cual programaremos labomba de infusión que administrá la cantidadnecesaria de antibiótico durante cada uno de losintervalos de tiempo, para conseguir la concen-tración deseada que contrarrestará la eliminaciónsuperior del conejo respecto a la humana, con elobjeto de imitar la cinética de eliminación huma-na en los fármacos con modelo de distribuciónmonocompartimental es el siguiente:

Vx = ([C0 × e−kelh × tx] − [Chx−1 × e−kelc × Tx] ×× Vdc × kelc × P/[1 − e−kelc × Tx] × S)

Administración intravenosa en infusióncontinua según el modelo de cinética deprimer orden monocompartimental abierto

1. Fase de infusión inicial

La cantidad de fármaco que debe administrar-se mediante infusión intravenosa continua (Qx,mg/h) para conseguir la concentración deseada(Cy) viene determinada por la siguiente relación:

Qx = (Cy × Vdc × kelc × P)/(1 − e−kelc × tx)

donde

Qx = dosis de antibiótico a administrar durantetx (mg/h).Vdc = volumen de distribución del fármaco en elconejo (l/kg).Tx = intervalo de tiempo (h). P = peso del animal (kg).Cy = concentración deseada a conseguir (�g/ml)

La velocidad de infusión a la que hemos deprogramar la bomba de infusión (Vx, en ml/h) de-penderá de la concentración de la disolución deantibiótico que administremos (S, en mg/ml):

Vx = Qx/S

2. Fase de mantenimiento

La cantidad de fármaco que debe adminis-trarse mediante infusión intravenosa continua(Qx, mg/h) para mantener la concentración de-

seada (Cy) viene determinada por la siguiente re-lación:

Qx = Cy × Vdc × kelc × P

donde

Qx = dosis de antibiótico a administrar durantetx (mg/h).Vdc = volumen de distribución del fármaco en elconejo (l/kg).Tx = intervalo de tiempo (h). P = peso del animal (kg).Cy = concentración deseada a mantener (�g/ml).

Como anteriormente, la velocidad de infusióna la que hemos de programar la bomba de infu-sión (Vx, en ml/h) dependerá de la concentraciónde la disolución de antibiótico que administremos(S, en mg/ml):

Vx = Qx/S

Administración intravenosa en infusión cortasegún el modelo de cinética de primer orden bi-compartimental abierto. La cinética de los fár-macos que siguen un modelo de primer orden bi-compartimental abierto se rige por la siguienterelación matemática:

Cp = A0 × e−� × t + B0 × e−� × t

donde

A0 = concentración plasmática para t = 0 en lafase de distribución.B0 = concentración plasmática para t = 0 en lafase de eliminación.

El propósito de este modelo matemático es ha-llar las cantidades de antibiótico que deben ad-ministrarse al animal para contrarrestar su elimi-nación más rápida respecto a los humanos. Estemodelo queda resumido a continuación:

1. Determinar la concentración sérica huma-na que queremos obtener una hora después delinicio de una infusión de 0,5 h de duración(Ch1h). Una vez determinada esta concentración,obtener la concentración sérica humana al finalde la infusión de 0,5 h (Ch0,5 h) mediante la si-guiente fórmula:

Ch0,5h = Ah0 × e−�h × 0,5 + Bh0 × e−�h × 0,5

donde

41


Ah0 y Bh0 se obtienen con el siguiente sistema deecuaciones:

Ch1h = Ah0 × e−�h × 1 + Bh0 × e−�h × 1 �kh21 = (Ah0 × �h + Bh0 × �h)/(Ah0 + Bh0)

siendo �h, �h, kh21 constantes humanas cono-cidas.

2. Dividir el perfil farmacocinético en las dosfases características del modelo bicompartimen-tal: en primer lugar hasta el final de la fase de dis-tribución y, en segundo, la fase de eliminación.

3. Fase de distribución

1. Determinar la duración de esta fase en elconejo (t�).

2. Obtener la concentración sérica en el co-nejo al final de este período (Cc�) mediante la si-guiente fórmula:

Cc� = Ar0 × e−�r × t� + Br0 × e−�r × t�

donde

Ar0 y Br0 se obtienen con el siguiente sistema deecuaciones:

Cr0 = Ar0 + Br0 �kr21 = (Ar0 × �r + Br0 × �r)/(Ar0 + Br0)

siendo

�r, �r, kr21 las constantes farmacocinéticas en elconejo previamente obtenidas y Cr0 igual a Ch0,5h

también obtenido previamente.

3. Obtener la concentración necesaria al finaldel período de distribución (Cx�) que contrarres-te la distribución más rápida del fármaco en elanimal que en el humano, mediante la diferenciade la concentración sérica humana (Ch�) de ladel conejo (Cc�) al final de este período. Así:

Cx� = Ch� − Cc�

donde

Ch� = Ah0 × e−�h × t� + Bh0 × e−�h × t�

Cc� = Ar0 × e−�r × t� + Br0 × e −�r × t�

4. Fase de eliminación

1. Determinamos unos intervalos de tiempo(Tx) durante los que administraremos la cantidad

de fármaco necesaria para pasar de la concen-tración sérica en el animal a la deseada humana.

2. En el límite final de estos intervalos (Tx), laconcentración plasmática del fármaco será máselevada en la cinética humana que en la del co-nejo (puesto que kc > kelh). Determinamos laconcentración que hemos de conseguir (Cx�) paracontrarrestar esta diferencia. La concentracióndeseada (Cx�), se obtendrá restando la concen-tración que deseamos alcanzar (Ch�x = = con-centración humana) de la concentración existen-te en el animal (Cc�x), mediante la siguienteproporción, donde x = número del intervalo:

Cx� = Ch�x – Cc�x

donde

para Tx = 1 Ch�1 = Ah0 × e−�h × t1 + Bh0 × e−�h × t1

y Cc�1 = Ch� × e − kelc × T1

para Tx = 2 Ch�2 = Ah0 × e−�h × t2 + Bh0 × e−�h × t2

y Cc�2 = Ch�1 × e − kelc × T2

siendo

tx = duración del tiempo en horas desde t = 0 has-ta el final del intervalo Tx. Tx = duración del tiempo en horas del intervalo Tx.Ch� = concentración sérica humana al final delperíodo de distribución.

5. La cantidad de fármaco que hemos de ad-ministrar mediante infusión intravenosa continua(Qx, en mg/h), durante la fase de distribución (t�)y durante los intervalos de tiempo Tx de la fase deeliminación, para conseguir la concentración de-seada en la fase de distribución y de eliminación(Cx� y Cx�) viene determinada por la siguienterelación:

Fase de distribución: Q�x = (Cx� × Vdc × kelc × P)/(1 + ([�c − kelc/�c − �c] × e−�c × t�) + ([kelc −− �c/�c − �c)] × e−�c × t�)

Fase de eliminación: Q�x = (Cx� × Vdc × kelc × P)/(1 + ([�c − kelc/�c − �c) × e−�c × Tx) + ([kelc −− �c/�c − �c] × e − �c × Tx)

6. Puesto que realizaremos una infusión con-tinua, la velocidad de infusión a la que hemos deprogramar la bomba de infusión (Vx, en ml/h) de-penderá de la concentración de la disolución deantibiótico que administremos (S, en mg/ml):

Vx = Qx/S

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7. La primera dosis viene determinada por laúltima fórmula, siendo Cx la concentración hu-mana al fin de la infusión de 0,5 h (Ch0,5h).

Administración intravenosa en infusióncontinua según el modelo de cinéticade primer orden bicompartimental abierto

1. Fase de infusión inicial

La cantidad de fármaco que hemos de admi-nistrar mediante infusión endovenosa continua(Qx, mg/h) para para conseguir la concentracióndeseada (Cy) viene determinada por la siguienterelación:

Qx = (Cy × Vdc × kelc × P)/(1 + [�c − kelc/�c −− �c] × e−�c × tx) + ([kelc − �c/�c − �c] × e−�c × tx)

donde

Qx = dosis de antibiótico a administrar durantetx (mg/h).Vdc = volumen de distribución del fármaco en elcompartimiento central en el conejo (l/kg).tx = intervalo de tiempo (h). P = peso del animal (kg).Cy = concentración deseada a conseguir (�g/ml).�c = constante de disposición � en el conejo (h−1).�c = constante de disposición � en el conejo (h−1).kelc = constante de eliminación en el conejo; k13

(h−1).

La velocidad de infusión a la que hemos deprogramar la bomba de infusión (Vx, en ml/h) de-penderá de la concentración de la disolución deantibiótico que administremos (S, en mg/ml):

Vx = Qx/S

2. Fase de mantenimiento

La cantidad de fármaco que hemos de admi-nistrar mediante infusión intravenosa continua(Qx, mg/h) para mantener la concentración de-seada (Cy) viene determinada por la siguiente re-lación:

Qx = Cy × VdAc × �c × P

VdAc = volumen de distribución área en el cone-jo (l/kg).

Como anteriormente, la velocidad de infusióna la que hemos de programar la bomba de infu-sión (Vx, en ml/h) dependerá de la concentración

de la disolución de antibiótico que administremos(S, en mg/ml):

Vx = Qx/S

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44


J.M. GATELL: ¿Cómo divides los intervalos de tiem-po para realizar estas restas y recálculos suce-sivos?

J. GAVALDÀ: Se trata de jugar con la hoja de cál-culo. Es decir, debemos conseguir una veloci-dad de infusión que esté dentro de los interva-los que admite la bomba.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: ¿Aparecen problemas detoxicidad con la farmacocinética humanizadaen los animales? y ¿se comprueban las concen-traciones séricas a modo de seguimiento paraconfirmar que los cálculos del ordenador hansido correctos?

J. GAVALDÀ: No aparecen problemas de toxicidad.En cuanto a tu segunda pregunta, los estudios serealizan en tres partes: en primer lugar, el estu-dio de farmacocinética en el animal; en segundolugar, el modelo matemático y, en tercer lugar, serealiza la comprobación de todo ello en el animal.

J. CANTÓ: Lo presentado estaba básicamente rea-lizado en el modelo de conejo. ¿Se produce estemismo efecto que diferencia la conducta o larespuesta del animal respecto al humano, porejemplo, en otros modelos como en rata, perro,cerdo o primates?

J. GAVALDÀ: En animal no roedor no tengo cons-tancia, aunque sí en rata. En rata se ha estu-diado y se trabaja en modelos de endocarditiscon farmacocinética humanizada y el compor-tamiento es idéntico; quizás un poco más mar-cado porque el metabolismo es más aceleradoy la vida media resulta mucho más corta.

J. PACHÓN: En el modelo in vivo en animal infec-tado, ¿se ha comparado si utilizando farmaco-cinética humanizada o no humanizada hay di-ferencia en los resultados?

J. GAVALDÀ: No, esto no lo hemos comparado. Setrata de la eterna cuestión. Como bien sabes,en nuestros laboratorios es tremendamentecomplicado poner un estudio en marcha, con-seguir que todo funcione correctamente y aca-bar el trabajo. Entonces, siempre nos plantea-mos que realizar estos estudios implicaríamuchísimo trabajo y tiempo. Eso quiere decir, alo mejor, uno o 2 años de trabajo simplementepara validar la necesidad o la obligatoriedad deutilizar farmacocinética humanizada. Parece re-comendable que en estudios de eficacia tera-péutica, la farmacocinética sea lo más parecidoa la humana y por ello lo utilizamos.

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DISCUSIÓN

RESUMEN

Los modelos animales de infección han de-mostrado su eficacia para aumentar nuestro co-nocimiento de determinadas infecciones y de losfactores que influyen en su tratamiento. Mientrasque los métodos de sensibilidad in vitro ofreceninformación sobre la actividad de un antimicro-biano ante un microorganismo en particular, suefectividad in vivo frente a determinadas infec-ciones puede ser diferente. Una de estas infec-ciones es la endocarditis infecciosa. Desde elprincipio de la era antibiótica se supo que la en-docarditis infecciosa no podía tratarse de formaparecida a otras infecciones a pesar de que losresultados in vitro predijeran lo contrario. Dadoque los métodos in vitro han demostrado ser ine-fectivos para predecir los fallos terapéuticos, fuenecesario desarrollar un modelo animal en cone-jos o ratas que permitiera probar diferentes es-trategias terapéuticas y conocer los factores de-terminantes del éxito o fracaso terapéutico. Delmismo modo, el modelo animal de endocarditisinfecciosa ha permitido conocer aspectos muyimportantes de la patogenia, fisiopatología y pro-filaxis antibiótica de esta infección. En este ar-tículo revisamos los modelos animales de endo-carditis infecciosa, así como las bases y avancesde la profilaxis antibiótica de las endocarditis porestreptococos del grupo viridans y enterococo ydel tratamiento de las endocarditis por estrepto-cocos del grupo viridans, Streptococcus bovis,enterococo, Staphylococcus aureus y S. epider-midis.

Palabras clave:Endocarditis experimental. Profilaxis. Tratamiento.

ENDOCARDITIS MODEL

Animal models of infection have proven extre-mely valuable in furthering our understanding ofthe factors that influence the chemotherapy of in-fectious diseases. While in vitro sensitivity testingof antibiotics may give general information regar-ding the activity against specific pathogen, the ef-fectiveness of the drug in vivo in certain infec-tions may be quite different. One of suchinfections is bacterial endocarditis. It was recog-nized quite early in the antibiotic era that bacte-rial endocarditis needed to be treated of differentform that other infections although in vitro testssuggest other results. Since in vitro tests provedineffective in predicting these therapeutic failu-res, it was necessary to develop an animal modelof the disease in rabbits or rats to test the besttherapeutic strategies and to know the factorsthat determine the success or failure of antibiotictreatment. Moreover, the animal model of endo-carditis has been shown to be a reliable modelfor evaluation of physiopathology, pathogenesisand antibiotic prophylaxis of this infection. In thischapter we review the animal models of infectiveendocarditis and the basis and advances in theantibiotic prophylaxis of endocarditis caused byviridans group streptococci and enterococci andthe antibiotic therapy of endocarditis caused byviridans group streptococci, Streptococcus bo-vis, enterococci, Staphylococcus aureus andS. epidermidis.

Key words:Experimental endocarditis. Prophylaxis. Therapy.

Modelo de endocarditisJoan Gavaldàa,*, José María Mirób y Manuel Luis Fernándezc

aServei de Malalties Infeccioses. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona. bServicio de Enfermedades Infecciosas.IDIBAPS (Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer)-Hospital Clínic Universitari. Barcelona.

cDivisión de Enfermedades Infecciosas. Fundación Jiménez Díaz. Madrid.

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Introducción

Los modelos animales de infección han demos-trado su eficacia para aumentar nuestro conoci-miento de determinadas infecciones y de los fac-tores que influyen en su tratamiento. Mientras quelos métodos de sensibilidad in vitro ofrecen infor-mación sobre la actividad de un antimicrobianoante un microorganismo en particular, su efectivi-dad in vivo frente a determinadas infecciones pue-de ser diferente. Una de estas infecciones es la en-docarditis infecciosa. Desde el principio de la eraantibiótica se supo que la endocarditis infecciosano podía tratarse de forma parecida a otras infec-ciones, a pesar de que los resultados in vitro pre-dijeran lo contrario. Dado que los métodos in vitrodemostraron ser inefectivos para predecir los fallosterapéuticos, fue necesario desarrollar un modeloanimal que permitiera probar diferentes estrate-gias terapéuticas y conocer los factores determi-nantes del éxito o fracaso terapéutico. Del mismomodo, el modelo animal de endocarditis infeccio-sa ha permitido conocer aspectos importantes ydifíciles de investigar en humanos con esta infec-ción, así como de la patogenia, fisiopatología, in-munología y profilaxis de esta infección.

Descripción de los distintos modelosy de los factores que influyen en la patogenia y evolución de la endocarditis experimental

El primer modelo de endocarditis fue desa-rrollado en perros a finales de la década de los cin-cuenta e inicios de los sesenta por Hamburguer1-3.En primer lugar, se inducía una insuficiencia aór-tica mediante la escisión de un disco de 3 mm delas valvas de la válvula aórtica. Esta intervenciónse realizaba mediante un catéter de biopsia intro-ducido a través de la aorta ascendente duranteuna toracotomía. A las 3 semanas de la interven-ción se inyectaban por vía intravenosa 107-108

unidades formadoras de colonias (UFC)/ml deStaphylococcus aureus. Entre un 55 y un 60 %de los animales desarrollaban endocarditis a los4-12 días, que se manifestaba en forma de letar-gia, fiebre y bacteriemia. Los animales morían alos 6 días si no eran tratados y se podía demostrarendocarditis en la autopsia por cultivo e histologíade las vegetaciones valvulares aórticas.

Sapico et al4,5 también utilizaron el modelo deendocarditis en perros para evaluar la sinergiade la combinación de penicilina y estreptomicinaen el tratamiento de la endocarditis enterocócica.Mejoraron la técnica de Hamburguer, ya que nopracticaban toracotomía sino que lesionaban las

valvas aórticas mediante una aguja que se mani-pulaba a través de un catéter introducido por laarteria carótida. La mortalidad operatoria fue del28 %. El 83 % de los animales a los que se lesadministraban 107 UFC/ml de Enterococcus fae-calis desarrollaban endocarditis. La eficacia deltratamiento se evaluó mediante hemocultivoscuantitativos antes y después de la administracióndel antibiótico. Aunque este modelo produce in-fección endocárdica, la problemática de trabajarcon animales de gran tamaño y la dificultad téc-nica que comporta restringe su uso en la actuali-dad. Todo ello a pesar de que, probablemente, losresultados podrían ser más extrapolables a la clí-nica humana porque la farmacocinética de losantimicrobianos en estos animales es más pare-cida a la del hombre.

El modelo de endocarditis en conejos fue de-sarrollado a principios de los setenta por Garri-son, Perlman y Freedman6-8, y fue modificadoposteriormente por Sande e Irwin9, Durack y Be-eson10-13 y Gutschik y Christensen14-20. Santoro yLevison21 demostraron que la rata podía ser utili-zada para el estudio de la endocarditis experi-mental inducida por cateterismo. Este modeloofrecía las ventajas del coste y cuidado diario delanimal sobre el modelo en conejos. Otros inves-tigadores adoptaron este modelo con alguna mo-dificación22. Imataka et al23,24 desarrollaron unmodelo experimental de endocarditis por estrep-tococos del grupo viridans en conejos a los quepreviamente se les había producido un prolapsomitral mediante estimulación vagal cervical.

Overholser et al25 desarrollaron una novedosaadaptación del modelo de endocarditis experi-mental inducida por cateterización para investi-gar la importancia de enfermedad periodontalpreexistente (un mecanismo que se ha propues-to para la patogenia de la endocarditis humana).Provocaron una enfermedad periodontal en ratasalimentadas con dieta alta en sucrosa tras la ma-nipulación de los dos primeros molares median-te su ligadura con seda. Después de la cateteri-zación transcarotídea los dientes eran extraídos yposteriormente las ratas eran sacrificadas. Cercade la mitad de las ratas (48%) desarrollaron en-docarditis infecciosa, a diferencia del 7% de lasratas control sin enfermedad periodontal. En el si-guiente estudio26 intentaron relacionar los culti-vos de muestras seriadas de sangre obtenida in-mediatamente después de la extracción de losdientes con el desarrollo de endocarditis. Evi-denciaron que ciertos microorganismos poseíanunos factores de virulencia que les permitían pro-ducir endocarditis. Por otro lado, no hallaron unarelación entre la intensidad de la bacteriemia

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después de la extracción dentaria y el porcenta-je de endocarditis producida. Esta observacióncontrastaba con estudios previos que utilizabanla inyección intravenosa del inóculo.

Grogan et al27 desarrollaron en 1980 un sofis-ticado modelo de endocarditis protésica tricúspi-de en terneros. La endocarditis protésica precozse producía tras la inyección 102-103 UFC/ml deS. aureus en la prótesis durante la intervenciónquirúrgica. La endocarditis protésica tardía (ino-culación 2 meses después de la intervención qui-rúrgica) se desarrolló en 6 de 6 terneros despuésde la inoculación intravenosa de más de 107

UFC/ml de S. aureus. Este modelo de endocardi-tis protésica experimental puede ser utilizadopara: a) estudiar problemas técnicos en el reem-plazamiento de válvulas protésicas; b) estudiar lahistoria natural de la endocarditis protésica val-vular; c) valorar la eficacia de la profilaxis y deltratamiento, y d) observar la interacción de loscomponentes de la sangre y los microorganismoscon el cuerpo extraño. Obviamente, la mayordesventaja de este modelo es que precisa un ani-mal caro, de difícil estabulación y una técnicaquirúrgica muy sofisticada.

El modelo de endocarditis en conejos es elmás utilizado para los estudios terapéuticos y fi-siopatológicos27a. Este modelo, al igual que el de-sarrollado en perros y ratas, se basa en la coloni-zación y posterior infección de una lesión en laválvula aórtica producida por un catéter que seha colocado previamente en el interior del ven-trículo. La arteria carótida derecha es tunelizadapor un catéter que se inserta a través de ella has-ta pasar la válvula aórtica y alojarse dentro delventrículo izquierdo. La colocación del catéter esrelativamente sencilla, ya que cuando está en elinterior del corazón se evidencian unas pulsacio-nes muy características. A pesar de ello, y paraasegurar que el catéter atraviesa la válvula y que-da en posición intracavitaria, es recomendablemonitorizar la presión arterial a través del catéter.A los pocos minutos ya se observa una lesión val-vular microscópica y a las 24 h son visibles, ma-croscópicamente, trombos de fibrina y plaquetas.Estas lesiones son muy susceptibles de ser colo-nizadas por microorganismos inyectados a travésdel catéter o por vía intravenosa. En el primer mo-delo desarrollado, Garrison y Freedman6-8 colo-caban un catéter que, previamente, había sidollenado con S. aureus. Con la intención de simu-lar la patogenia de la endocarditis humana, Du-rack y Beeson10-13 modificaron el modelo de Ga-rrison usando una vía intravenosa periférica(vena marginal de la oreja) para inyectar el inó-culo, produciendo así una bacteriemia transitoria.

Después de la adhesión de las bacterias a lostrombos valvulares, se produce la infección por re-plicación de los microorganismos en el interior dela vegetación. El número de bacterias que debeinyectarse depende de la especie e incluso de lacepa a estudiar. La inyección intravenosa de103-104 UFC/ml de S. aureus puede producir in-fección7, mientras que son necesarias más de 105

UFC/ml de estreptococos del grupo viridans28 omás de 108 UFC/ml de Staphylococcus epidermi-dis29 para que se produzca endocarditis en losanimales. Después de la inyección de las bacte-rias y una vez que se han adherido a la vegetaciónen un número suficiente, éstas se multiplican ensu interior, acelerándose el depósito de plaquetasy fibrina con el consiguiente aumento de tamañode la misma. Media hora después de la inocula-ción intravenosa de 1010 UFC/ml de Streptococ-cus sanguis en un conejo con catéter intracavita-rio ya pueden encontrarse microorganismos en lasuperficie valvular13. A las 6 h ya se observan co-lonias y a las 24 h la concentración de bacteriasen el interior de la vegetación oscila entre 107

y 1010 UFC/g de vegetación. Los microorganismosse disponen entre capas de fibrina y de plaquetasapareciendo como una formación organizada13.Las vegetaciones crecen permanentemente porla continua adhesión de microorganismos circu-lantes. Estos gérmenes adheridos a la superficiede la vegetación estimulan la activación de trom-boplastina tisular, que a su vez activa el procesode la coagulación y el depósito de fibrina y pla-quetas30.

Durack y Beeson11 demostraron la existenciade dos poblaciones bacterianas diferentes en elinterior de la vegetación mediante la incorpora-ción de alanina tritiada a las vegetaciones. La pri-mera se encuentra en las capas superficiales,está en fase de multiplicación exponencial, pro-voca la bacteriemia y mediante el mecanismo an-teriormente comentado es responsable del creci-miento de la vegetación. La segunda, situada enel interior de la vegetación, está metabólicamen-te inactiva y, por tanto, sin replicación celular.

La valoración de la existencia o no de endo-carditis se realiza mediante hemocultivos antesde iniciarse el tratamiento antibiótico. Se consi-dera que los animales con hemocultivo positivoestán afectados de endocarditis.

La presencia o ausencia del catéter en po-sición intracavitaria tiene gran influencia en lapatogenia y evolución de la endocarditis experi-mental en conejos. Perlman y Freedman8 de-mostraron que la endocarditis izquierda o dere-cha por S. aureus en conejos seguía activamientras se mantenía el catéter. El curso de la in-

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MODELO DE ENDOCARDITIS

fección se modificaba cuando los catéteres eranretirados después de que los animales fueran in-fectados. El cambio era mayor en los animalescon endocarditis derecha, ya que el 83% de lasvegetaciones se esterilizaban a la semana de laretirada del catéter, mientras que este hecho su-cedía en el 57% de los animales con endocardi-tis izquierda. Freedman y Valone31 hallaron quepara que la infección se estableciera era impor-tante el tiempo transcurrido entre la retirada delcatéter y la producción de la bacteriemia. Si la in-yección intravenosa de las bacterias se producíaa las 24 h de la retirada del catéter, la infecciónse desarrollaba en el 95% de los conejos. Al con-trario, sólo se infectaban el 56% de los animalessi la retirada se realizaba de 8 a 15 días después.Durack et al12, en sus primeros trabajos, tambiénsugirieron que la susceptibilidad de los conejos adesarrollar infección endocárdica disminuía alaumentar el tiempo entre la cateterización y laproducción de la bacteriemia. Pujadas32 demos-tró que la endotelización del catéter y de las ve-getaciones estériles, que se completaba a los2-3 meses después de ser colocado el catéter,protegía a los animales de desarrollar endocardi-tis tras serles inyectados Streptococcus mitis porvía intravenosa. La presencia del catéter aumen-ta la gravedad de la infección y la dificultad paraesterilizar las vegetaciones con el tratamiento.Este hecho no influye de igual manera en la efi-cacia de diferentes tratamientos antibióticos. Pe-lletier et al42 en la endocarditis experimental porS. sanguis comprobaron que la retirada del caté-ter tenía mucho mayor efecto en el tratamientocon penicilina que con la combinación de peni-cilina y estreptomicina.

Otro de los factores que influyen en la evolu-ción de la endocarditis experimental es la locali-zación de la infección en el ventrículo derecho oizquierdo. Al principio de los setenta6-8 ya se ob-servaron diferencias en la gravedad del procesoal comparar la infección estafilocócica producidaen el lado derecho del corazón con la endocardi-tis izquierda. Mientras que los animales que de-sarrollaban endocarditis izquierda morían dentrode las 2 semanas de inducida la infección, losanimales con endocarditis derecha sobrevivían aeste período de tiempo. Así mismo, observaronque la concentración bacteriana en las vegeta-ciones derechas era mucho menor que la de lasvegetaciones izquierdas. Por otra parte, como yase ha comentado anteriormente6-8, la esteriliza-ción de las vegetaciones derechas, después de laretirada del catéter, acontecía con mayor fre-cuencia que en las vegetaciones izquierdas. Al-gunos años más tarde, Durack12 halló resultados

similares en conejos con endocarditis por estrep-tococos del grupo viridans. Los factores propues-tos para estas diferencias fueron que el creci-miento bacteriano en el lado izquierdo estabafavorecido por la mayor concentración de O2 aeste nivel y la posibilidad de que los factores dedefensa del huésped estuvieran potenciados enel lado derecho del corazón. Bayer et al34,35 tam-bién propusieron que la mayor pO2 en las cavi-dades izquierdas era el factor más importantepara el mayor número de UFC de Pseudomonasaeruginosa que se recuperaban de las vegetacio-nes del ventrículo izquierdo.

El tiempo transcurrido entre la infección y el ini-cio del tratamiento también influye en la eficaciade los antibióticos usados para la terapéutica dela endocarditis experimental. Cuanto más prontose inicie el tratamiento mejores resultados se ob-tienen, incluso con fármacos sin eficacia clínica.Carrizosa et al36 iniciaron el tratamiento de cone-jos con endocarditis enterocócica a diferentes pe-ríodos de tiempo después de la infección. Cuan-do se iniciaba a las 6 h de inducida la infección,la penicilina sola curaba a todos los animales en3 días. Si se iniciaba a las 72 h, era totalmenteinefectiva, incluso con pautas de 7 días de dura-ción. La eficacia de la combinación de penicilinay estreptomicina, gentamicina o sisomicina tam-bién disminuía al aumentar el tiempo transcurri-do entre la infección y el inicio del tratamiento.

Los antibióticos utilizados se administran porvía intramuscular a menos que sea necesario eluso de la vía intravenosa, como en el caso de lavancomicina. La dosis, el intervalo de dosificacióny la duración del tratamiento varían dependiendodel antibiótico usado, el microorganismo a estu-diar y la hipótesis de trabajo. Para que las con-clusiones puedan extrapolarse a la clínica huma-na es importante que la farmacocinética de losantibióticos utilizados sea lo más parecida posiblea la que tiene en el ser humano. Generalmente,la dosis debe relacionarse con las concentracio-nes séricas y los intervalos de dosificación con lavida media del fármaco. Habitualmente la vidamedia de los fármacos es menor en conejos yaque su metabolismo es mayor. Para poder so-brellevar esta cuestión se han desarrollado losmodelos animales de farmacocinética humani-zada que no comentaremos y que se desarrollanen otro artículo de esta monografía.

La eficacia terapéutica puede ser evaluada pordistintos parámetros: cultivos cuantitativos de lasvegetaciones, riñones, proporción de hemoculti-vos positivos en los distintos días de tratamiento(porcentaje de errradicación de la bacteriemia),porcentaje de esterilización de las vegetaciones,

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recidivas después de un determinado número dedías tras la finalización del tratamiento y apariciónde resistencias antibióticas durante el mismo. Encaso de utilizar la concentración bacteriana delas vegetaciones como índice de la eficacia tera-péutica, los animales son sacrificados despuésde un determinado número de tratamientos, lasvegetaciones de la válvula aórtica son separadasde manera aséptica y cultivadas cuantitativa-mente. Las vegetaciones pueden también estarsituadas en la raíz de la aorta y en la pared ven-tricular, pero Francioli et al37 demostraron que laconcentración bacteriana de estas lesiones eramenor, a pesar de encontrarse a pocos milíme-tros de la válvula aórtica. Los resultados se ex-presan por convención como logaritmo10 de UFCpor gramo de vegetación (log10 UFC/g), aunqueel peso total de las vegetaciones raramente esmayor de 100-150 mg.

Las comparaciones estadísticas entre los dife-rentes grupos de tratamiento se llevan a cabo, amenudo, utilizando el método de la t de Student.Esta prueba estadística puede indicar falsamen-te ausencia de diferencia (error tipo II) cuando losdatos no siguen una distribución normal y la va-riancia es amplia. Una prueba como la suma declasificaciones de Mann-Witney es más apropia-da en estos casos. Cuando se comparan tres omás grupos debe utilizarse la prueba de análisisde la variancia. No deben hacerse comparacio-nes múltiples con el prueba de la t de Studenta menos que se realice la corrección de Bonfe-rroni o de Scheffé. La valoración de eficacia porcuración o recaída, tasa de erradicación de labacteriemia o de vegetaciones estériles puederealizarse mediante la prueba de la 2 para com-paraciones apareadas o múltiples.

Dado que existen diferencias en la patogenia,curso de la infección y farmacocinética de los an-tibióticos en el animal de laboratorio respecto alos humanos, es peligrosa la comparación direc-ta o extrapolación a humanos para responder aproblemas planteados en clínica humana. La efi-cacia terapéutica de un determinado régimensólo debe ser interpretada tras la comparación delos resultados obtenidos con una pauta terapéu-tica con eficacia clínica demostrada.

Lecciones aprendidas del modelo animalpara la profilaxis de la endocarditisinfecciosa

Dado que el riesgo de desarrollar endocarditisinfecciosa tras una bacteriemia es muy bajo y nopueden realizarse estudios clínicos, el modeloanimal de endocarditis experimental ha sido uti-

lizado para evaluar la eficacia de diferentes pau-tas antibióticas en la prevención de esta enfer-medad. Se han empleado los modelos de conejoy rata. El catéter se coloca como mínimo 24 h an-tes de la infección y se deja implantado durantetodo el experimento. Se administra una dosis deantibiótico 30 min antes de la inyección del inó-culo bacteriano, y si se desea, una o varias dosisdespués. La eficacia de la profilaxis se evalúa me-diante el sacrificio de los animales 24-72 h des-pués de la administración de los antibióticos, de-terminando el porcentaje de animales infectadosmediante el cultivo cuantitativo de las vegetacio-nes valvulares. Un grupo control sin tratamientoantibiótico debe también ser infectado y evalua-do. Glauser et al38 han sugerido que deben utili-zarse una serie de inóculos, entre uno que infec-te al 90 % de los animales inoculados (ID90) yotros con densidades entre 10 y 1000 veces su-periores a la ID90. Estos investigadores han de-mostrado que la eficacia profiláctica es inócu-lo-dependiente para algunos antibióticos ymicroorganismos39,40. Los antibióticos adminis-trados a los conejos o ratas deben de producirunas concentraciones séricas, en el momento deinyectar los microorganismos, similares a las quese obtienen en humanos con una determinadadosis y vía de administración. Las diferencias en-tre los distintos grupos de tratamiento y el grupocontrol se analizan con el método de la 2 o el deFisher para valorar si existe significión estadística.

En el modelo de endocarditis por estreptoco-cos del grupo viridans, Durack et al41 demostra-ron que la penicilina sola era eficaz si se admi-nistraba a dosis elevadas y se continuabadurante 24 h más después de la inoculación.La vancomicina sola o penicilina o ampicilinacombinadas con estreptomicina fueron efectivasen dosis única antes de la inoculación. Agentesbacteriostáticos como el cotrimoxazol, tetracicli-nas, eritromicina o clindamicina no fueron efi-caces41-44. Para la endocarditis experimental porEnterococcus sp. la administración de ampicili-na o vancomicina con gentamicina en dosis úni-ca antes de la infección fue la pauta más efi-caz45. Estos trabajos sugieren que es necesarioque los antibióticos utilizados posean actividadbactericida. Sin embargo, estudios más recien-tes38-40,46-53a, sugieren que concentracionessubactericidas, agentes considerados tradicio-nalmente como bacteriostáticos (p. ej., clindami-cina o macrólidos) o antibióticos bactericidas endosis única antes de la infección pueden tam-bién ser efectivas si el inóculo infectante es delorden de la ID90. Para ello es necesario que exis-ta una actividad antibiótico inhibitoria como mí-

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nimo durante 6 h53b. En caso de utilizar inócu-los de 10 a 1.000 veces el ID90 son necesariasdosis plenas y suplementarias de �-lactámicos(en caso de estreptococos sensibles a penicilina)o de la combinación (para Enterococcus sp.).Los mecanismos que se apuntan para explicarestos resultados son: a) disminución de la ad-hesión de los microorganismos a los depósitos fi-brino-plaquetarios de la válvula lesionada, yb) eliminación de la pequeña polación bacteria-na que existe en la vegetación en su fase másinicial. La eficacia de las dosis pequeñas impli-caría que no sería necesario mantener una acti-vidad bactericida sérica53b.

Parece razonable considerar que las pautasque aportan mayor seguridad, a partir de los da-tos generados en el modelo animal, serían las do-sis múltiples de penicilina o amoxicilina para laprofilaxis de la endocarditis por estreptococos delgrupo viridans y la terapia combinada (ampicili-na o vancomicina con gentamicina) para la pre-vención de la endocarditis enterocócica54. En elcaso de la prevención de la endocarditis por es-treptococos del grupo viridans sensibles a la pe-nicilina, Rouse et al53a demostraron, utilizandouna cepas de S. milleri (concentración mínimainhibitoria [CMI]/concentración mínima bacteri-cida [CMB] < 0,125/ < 0,125 �g/ml), que la ad-ministración de dos dosis de amoxicilina, clinda-micina, claritromicina o azitromicina era eficazpara prevenir el desarrollo de endocarditis en el100, 100, 97,5 y 99% de los animales, respecti-vamente. Sin embargo, la incidencia de resisten-cia a la penicilina en los estreptococos del grupoviridans está aumentando los últimos años y nose sabe si estos antibióticos pueden ser eficacespara prevenir la endocarditis por cepas resisten-tes a la penicilina. Miró et al55 efectuaron un es-tudio para valorar la eficacia de los antibióticos re-comendados para la profilaxis de la endocarditispor estreptococos del grupo viridans cuando lacepa era resistente a penicilina. Para ello utiliza-ron una cepa de S. mitis resistente a la penicilina(CMI/CMB 8/8 �g/ml) y tolerante a la clindamici-na (CMI/CMB 0,03/ > 32 �g/ml) y los glucopép-tidos (CMI/CMB 0,5/ > 128 �g/ml). El inóculoadministrado fue igual a la ID90. En los resultadosse observó que todos los animales del grupo con-trol (n = 20) y los que recibieron amoxicilina(n = 21) o amoxicilina más gentamicina (n = 20)se infectaron. Por contra, la administración declindamicina (n = 23), vancomicina (n = 22) oteicoplanina (n = 22) protegió a un 87, 82 y 95%de los animales, respectivamente. Estos datos in-dican que si los niveles de resistencia a la penici-lina aumentan en los estreptococos del grupo

viridans, deberá replantearse el papel de la amo-xicilina como fármaco de primera elección parala prevención de este tipo de endocarditis.

Las respuestas a la pregunta sobre la impor-tancia del tratamiento posterior a la aparición dela bacteriemia en la profilaxis de la endocarditis in-fecciosa experimental son controvertidas. Berneyet al56, en un estudio de profilaxis con amoxicilinaintravenosa en dosis única de la endocarditis in-fecciosa experimental en ratas por S. sanguis, de-mostraron que la administración de amoxicilinadespués de la infección era eficaz cuando el inó-culo estaba alrededor del ID90. Al contrario, eraineficaz al aumentar el inóculo o si se administra-ba a partir de las 4 h de la infección. James et al57

no pudieron demostrar lo mismo al administraramoxicilina 6 h después de la infección conS. sanguis a conejos con endocarditis trombóticano bacteriana.

En ausencia de pautas antibióticas con proba-da eficacia clínica que puedan ser empleadascomo estándar de referencia en los modelos ani-males, los resultados de estos experimentos sondifíciles de trasladar a recomendaciones clínicasconcretas. Petersdoff et al58 critican una serie dehechos de los modelos animales de profilaxiscomo el uso de inóculos muy altos que son clíni-camente irrelevantes, la presencia del catéter in-tracavitario y la farmacocinética diferente de losantibióticos. Probablemente, es razonable con-cluir que los regímenes terapéuticos eficacesbajo las estrictas condiciones estandarizadas porDurack41,45 podrían ser eficaces en humanos.Por otra parte, los agentes que no ofrecen pro-tección bajo condiciones menos estrictas no de-berían ser considerados en la práctica clínica.

Lecciones aprendidas del modelo animalpara el tratamiento de la endocarditisinfecciosa

Principios generales de tratamiento

A través de los años han sido establecidosunos principios generales de tratamiento de laendocarditis infecciosa a partir de los resultadosobtenidos en los estudios con el modelo animal.

1. Para obtener una curación absoluta es im-prescindible el uso de antibióticos que actúen deforma bactericida. Los estudios histológicos handemostrado la ausencia de macrófagos y poli-morfonucleares en el seno de la vegetación10. Esdecir, la endocarditis infecciosa es una infecciónque acontece en un área donde las defensas delhuésped están disminuidas. Por tanto, son ne-

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cesarios antibióticos que eliminen la bacteriapara lograr la esterilización de las vegetaciones.Los antibióticos que inhiben el crecimiento bac-teriano (agentes bacteriostáticos) pueden esteri-lizar los hemocultivos y disminuir la fiebre, perocuando se retira el tratamiento antibiótico, seproduce un crecimiento bacteriano que lleva a larecaída de la infección. La tetraciclina fue inefi-caz en el tratamiento de la endocarditis infeccio-sa experimental por estreptococos del grupo vi-ridans43. Se ha demostrado antagonismo entreagentes bacteriostáticos y bactericidas en el mo-delo de endocarditis estreptocócica. La asocia-ción de penicilina y cloranfenicol fue menos efi-caz que el tratamiento con penicilina sola de laendocarditis infecciosa experimental estreptocó-cica59. En relación con lo anteriormente expues-to se ha evaluado el poder bactericida del suero(PBS) como un supuesto índice de eficacia du-rante el tratamiento antibiótico. El PBS es el efec-to del suero del paciente junto con los antibióti-cos ante el microorganismo productor de laendocarditis infecciosa aislado de los hemocul-tivos. Los modelos animales han demostradouna correlación directa entre el PBS (con títulosde 1/8 a 1/16) y el éxito terapéutico60-62. Basán-dose en estos estudios, algunos autores han re-comendado que el PBS valle debe ser mayor oigual a 1/8 durante el tratamiento de la endocar-ditis infecciosa en humanos63. A pesar de ello,en la bibliografía científica existe desacuerdoacerca del valor pronóstico del PBS en el trata-miento de la endocarditis infecciosa64,65. Algunosautores consideran que el PBS por sí sólo nopuede predecir el éxito o el fracaso terapéutico.El PBS puede ser útil clínicamente para monito-rizar concentraciones de antibiótico en suero ypara demostrar que una determinada pauta an-tibiótica es bactericida.

2. La eliminación de los microorganismos du-rante el tratamiento de la endocarditis infecciosaes mucho más lenta que in vitro, lo que se debea una serie de factores: a) la concentración bac-teriana en la vegetación es extraordinariamentealta (> 108 UFC/g vegetación), mucho mayor quela densidad utilizada en el caldo de cultivo en losestudios de susceptibilidad in vitro. Debido a estola actividad metabólica bacteriana en el interiorde la vegetación está disminuida respecto a loscultivos en caldo11, y b) varios autores66,67 handemostrado que la penetración de los antibióti-cos en el seno de la vegetación está disminuidao alterada.

Estos factores explican, en parte, la menor sus-ceptibilidad bacteriana in vivo a muchos antimi-crobianos, fundamentalmente de los betalactá-

micos, cuya actividad es mucho mayor ante mi-croorganismos que se multiplican rápidamente.También podría explicar la aparición de recaídascuando el período de tratamiento es corto68. Portanto, la duración del tratamiento de la endocar-ditis infecciosa debe ser mayor que la de otras in-fecciones.

3. El porcentaje de letalidad bacteriana in vitroproducido por antibióticos solos o en combina-ción puede predecir la erradicación de las bacte-rias de la vegetación infectada in vivo. La combi-nación de un betalactámico y un aminoglucósido,si actúan de manera sinérgica in vitro por curvasde letalidad, esterilizará más rápidamente las ve-getaciones infectadas que el betalactámico solo.

Tratamiento de la endocarditis infecciosapor estreptococos del grupo viridansy Streptococcus bovis

En relación con este grupo de microorganis-mos, la capacidad bactericida de distintos agen-tes antimicrobianos o combinaciones de ellos invitro ha sido, en general, predictiva del porcenta-je de erradicación bacteriana de las vegetacionesin vivo.

En el modelo de endocarditis experimental porestreptococos del grupo viridans sensibles a pe-nicilina pueden realizarse las siguientes observa-ciones:

1. El tratamiento con penicilina sola es efi-caz9,33,44,60,61,69.

2. La adición de estreptomicina o gentamicinaa penicilina provoca una eliminación más rápidade los microorganismos de las vegetaciones(3-4 días) que el tratamiento con penicilina sola(7-10 días)9,44.

3. La administración de cloranfenicol, unahora antes de la dosis de penicilina, antagonizala actividad bactericida de este antibiótico59, aun-que la prolongación del tratamiento con penicili-na también consigue esterilizar las vegetaciones.

4. El tratamiento puede complicarse por laaparición de estreptococos con tolerancia o re-sistencia moderada a penicilina. En el modeloanimal: a) la combinación de penicilina y estrep-tomicina es mejor que la penicilina sola, tanto enla prevención70 como en el tratamiento de la in-fección71-74, y b) la combinación de penicilina yestreptomicina es menos eficaz cuando los ani-males son infectados con una cepa penicilín-re-sistente que con una penicilín-tolerante72. A pe-sar de que faltan más estudios, se considera queexisten suficientes datos generados por el mode-lo animal para recomendar el uso de tratamiento

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combinado de betalactámicos más aminoglucó-sidos en estos casos.

5. El modelo de endocarditis experimentalpor estreptococos nutricional-deficientes fuedescrito en 1985 por Van de Rijn75. A partir deeste trabajo Bouvet et al76 y Henry et al77 hanllevado a cabo dos trabajos más que nos permi-ten realizar las siguientes consideraciones: a) eltratamiento con penicilina más gentamicina oestreptomicina es más eficaz que penicilinasola; b) la administración de vancomicina solaes tan eficaz como las pautas de penicilina másaminoglucósidos, y c) el tratamiento con vanco-micina más aminoglucósido no es más eficazque la vancomicina sola.

A diferencia de los estudios con otros estrep-tococos del grupo viridans, no existe una correla-ción total entre los resultados de las curvas de le-talidad in vitro y los obtenidos in vivo. A pesar deello, los resultados apoyan las recomendacionesdel uso de penicilina más aminoglucósido para eltratamiento de la endocarditis por estas cepas yapuntan que la vancomicina sola podría ser sufi-ciente en el paciente alérgico a penicilina, aun-que faltan datos clínicos para confirmar este últi-mo punto.

6. Otra de las cuestiones relevantes en el tra-tamiento de la endocarditis experimental por es-treptococos del grupo viridans es la dosis mínimade aminoglucósido que mantiene la sinergia invivo de la combinación penicilina más aminoglu-cósido. Enzler et al28 demostraron que la admi-nistración de gentamicina a dosis de 1,05 mg/kg(pico plasmático 3 �g/ml) era suficiente. Estos re-sultados en el modelo animal llevaron a reco-mendar que las concentraciones plasmáticaspico de gentamicina no deben superar 3 �g/mlen el tratamiento de la endocarditis infecciosa porestreptococos sensibles a penicilina en humanos.

7. La posibilidad del tratamiento oral de la en-docarditis estreptocócica ha sido explorada por elgrupo de Moreillon al evaluar la eficacia de trova-floxacino en el modelo. Pudieron constatar que,a la dosis utilizadas mediante farmacocinéticahumanizada que simulaban 200 mg/12 h, su efi-cacia fue inferior a la de la ceftriaxona78.

El modelo animal ha demostrado claramenteque la adición de un aminoglucósido a penicilinaacelera la eliminación de estreptococos del gru-po viridans de las vegetaciones. Estas observa-ciones sirvieron de base a los estudios clínicos deWilson et al79 para demostrar que la pauta de2 semanas de tratamiento con penicilina más es-treptomicina era tan efectiva como el tratamien-to con penicilina sola durante 4 semanas.

Tratamiento de la endocarditis infecciosapor Enterococcus sp.

E. faecalis y Enterococcus faecium son muchomás resistentes a los antibióticos betalactámicosque los estreptococos del grupo viridans y que S.bovis con CMI a penicilina G 10-100 veces supe-riores. Los enterococos toleran uniformementelos agentes activos ante la pared celular, conCMB 100 veces superiores a sus CMI80,81.

Los estudios en el modelo experimental deendocarditis infecciosa por E. faecalis y E. fae-cium han demostrado poca actividad del trata-miento con penicilina sola. La eficacia de laspenicilinas (penicilina o ampicilina) aumenta alañadir gentamicina o estreptomicina14,20,36,82,83.Desde mediados de los años sesenta, se hadescrito un porcentaje creciente de cepas conun alto nivel de resistencia a estreptomicina(CMI > 2.000 �g/ml). Este fenómeno se asociaa ausencia de sinergia con la penicilina. Estascepas continúan siendo relativamente sensiblesa la gentamicina y mantienen la sinergia con lapenicilina84-86. Los estudios en el modelo animalde endocarditis infecciosa han corroborado losresultados de los estudios in vitro. Cuando laCMI a estreptomicina es superior a 2.000 �g/ml,este antibiótico no aumenta la acción de la pe-nicilina, mientras que la gentamicina mantienela sinergia14,60,83. Basándose en estos hallazgos,se ha recomendado que la asociación de peni-cilina y gentamicina debe utilizarse para tratarinfecciones causadas por cepas con un alto ni-vel de resistencia a estreptomicina, aunque noestá totalmente demostrado en estudios clínicosque la estreptomicina sea totalmente ineficaz87.La netilmicina y la sisomicina también resultaneficaces en el modelo animal de endocarditisenterocócica60,62. Es interesante destacar que lagentamicina sola posee una cierta eficacia en eltratamiento de la endocarditis enterocócica ex-perimental, a pesar de que los pruebas in vitrodemuestren una resistencia relativa88.

La toxicidad relacionada con el uso de ami-noglucósidos está presente en un número im-portante de pacientes, fundamentalmente an-cianos89. Estudios in vitro90 han demostradoque numerosas cepas mantienen la sinergiaentre la penicilina y un aminoglucósido, inclu-so con concentraciones muy bajas de este últi-mo90. Estos resultados sugieren que los amino-glucósidos podrían administrarse a dosis muybajas, reduciéndose el riesgo de toxicidad ymanteniéndose una adecuada actividad bacte-ricida en sangre. Dos grupos han investigadoesta cuestión en el modelo animal con diferen-

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tes resultados. Carrizosa y Levison82 trataron aratas con endocarditis experimental por E. fae-calis con penicilina y diferentes dosificacionesde gentamicina. Dosis bajas de gentamicinafueron menos eficaces que dosis mayores a pe-sar de que ambos regímenes presentaban si-nergia in vitro. Henry y Wilson91 no hallaron di-ferencias en la eficacia de penicilina más dosisbajas de estreptomicina (pico sérico 9,2 �g/ml)frente a la misma combinación con dosis altade estreptomicina (pico sérico 26,8 �g/ml).

La ampicilina es más activa que la penicilinaen las pruebas de susceptibilidad in vitro ante E.faecalis y a menudo sustituye a la penicilina en eltratamiento de la enfermedad en humanos. Noexiste ningún estudio que compare directamen-te ampicilina y penicilina en el modelo animal,aunque Tight92 curó a conejos con 21 días de tra-tamiento con ampicilina sola manteniendo lasconcentraciones séricas siempre por encima dela CMB. La vancomicina se ha usado como sus-tituto de la penicilina en humanos y los resulta-dos en el modelo experimental corroboran estehecho83. Nuevos glucopéptidos como la teicopla-nina y la daptomicina también se han probado enel modelo animal. El tratamiento con teicoplaninaha resultado ser tan eficaz como con ampicili-na93,94 o con vancomicina94 en el modelo animal.La administración de daptomicina fue menos efi-caz que el tratamiento con penicilina o vancomi-cina. Sin embargo, la combinación de daptomi-cina más gentamicina fue más eficaz que ladaptomicina sola, igual que penicilina más gen-tamicina y menos eficaz que vancomicina másgentamicina95. Las combinaciones de penicilinasisoxazólicas (meticilina, nafcilina u oxacilina) congentamicina fueron ineficaces96. La asociaciónde cefalotina más gentamicina fue eficaz sólo sila dosis de cefalotina era 10 veces superior a laCMI de la cepa infectante97, dosis fuera del inter-valo terapéutico en humanos. El imipenem no esbactericida in vitro ante enterococo e, inclusocombinado con gentamicina o estreptomicina, esmenos eficaz en el modelo experimental de en-docarditis infecciosa que ampicilina más genta-micina98,99. El tratamiento con ciprofloxacino soloo en combinación con gentamicina fue menoseficaz que la penicilina sola o combinada congentamicina. La asociación de penicilina más ci-profloxacino no fue más eficaz que la penicilinasola100. A pesar de que el cotrimoxazol tiene bue-na actividad in vitro frente a E. faecalis, este anti-biótico fue menos eficaz que la ampicilina sola enel modelo animal101. El tratamiento con mezloci-lina fue más efectivo que la ampicilina en cone-jos con endocarditis experimental enterocócica.

La adición de gentamicina aumentó la actividadde las dos penicilinas, y la eficacia de ambaspautas resultó similar. En este último estudio ladosis utilizada de mezlocilina fue excesivamenteelevada102.

En los últimos años se han descrito aisla-mientos de enterococos con alta resistencia apenicilina por producción de una betalactama-sa. La resistencia de estas cepas a penicilina nose detecta por las pruebas de rutina de suscep-tibilidad en disco, debido a un efecto inóculo.Cuando se usa un inóculo bajo la cepa parecesensible, pero con un inóculo elevado (107

UFC/ml) son resistentes con CMI superiores a500 �g/ml103. La ausencia de eficacia de la pe-nicilina ante estas cepas se ha confirmado enestudios con el modelo animal104,105. En estosestudios se demuestra que el tratamiento conampicilina más un inhibidor de la betalactamasa(ácido clavulánico o subactam) fue más eficazque ampicilina o penicilina sola y con una efi-cacia similar a la vancomicina y la daptomicina.

La aparición de enterococos con alta resisten-cia (CMI > 2.000 �g/ml) a todos los aminoglucó-sidos ha complicado el tratamiento de las infec-ciones graves por este microorganismo querequieren la adición del aminoglucósido (endo-carditis, meningitis, osteomielitis y pacientes neu-tropénicos), lo que se debe a que este nivel deresistencia elimina, de manera invariable, la es-perada sinergia entre el aminoglucósido y elinhibidor de la síntesis de la pared celular bacte-riana106. La primera descripción de alta resisten-cia y pérdida de sinergia fue para la estreptomici-na. El problema actual se basa en cómo tratar alos pacientes con endocarditis enterocócica cau-sada por cepas con alta resistencia a todos losaminoglucósidos. Queda claro, por estudios in vi-tro y en el modelo animal, que la adición de unaminoglucósido a un agente activo ante la paredcelular no añade beneficio alguno85,106. Thauvinet al107, en un estudio de endocarditis experimen-tal en rata producida por una cepa altamente re-sistente a gentamicina, demostraron que la infu-sión continua de ampicilina a dosis elevada eramás eficaz que su administración fraccionada.Esta observación no pudo ser corroborada por elgrupo de Wilson en el mismo modelo experimen-tal en conejos108. Hay que tener en cuenta que lacepa utilizada en el primer estudio no presentabatolerancia a ampicilina, mientras que la utilizadaen el segundo sí la presentaba. Otros estudios invitro y en el modelo animal con otros antibióticos(vancomicina, imipenem, ciprofloxacino o dapto-micina) no han aportado ninguna solución a esteproblema95,99,100,106,109-112. Recientemente, Ga-

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valdà et al113 han comunicado la existencia de si-nergia in vitro entre ampicilina y ceftriaxona fren-te a 9 cepas de E. faecalis con resistencia de altonivel a aminoglucósidos. En este mismo trabajodemuestran que el tratamiento con esta combi-nación, a dosis simuladas en los animales de2 g/4 h de ampicilina y de 2 g/12 h de ceftriaxo-na, podría ser eficaz en conejos con endocarditisexperimental inducida por estas cepas.

Actualmente, y en espera de estudios más sa-tisfactorios, parece razonable que el paciente conendocarditis causada por Enterococcus sp. conalta resistencia a aminoglucósidos sea tratadocon ampicilina a dosis de 2 g/4 h asociada a 4 gal día de ceftriaxona, planteándose el recambiovalvular precoz en los casos con mala evolucióno en las recidivas.

La problemática del tratamiento de las infec-ciones causadas por Enterococcus sp. con resis-tencia a glucopéptidos no ha podido ser resueltahasta el momento. Diversos estudios en los quese ha utilizado el modelo animal de endocarditisexperimental han abordado esta cuestión sin en-contrar resultados aplicables a clínica humana.Landam et al114 demostraron que la combinaciónde ampicilina y ciprofloxacino era menos eficazque ambos antibióticos en solitario. Este mismogrupo evidenció que las combinaciones de peni-cilina y ramoplanina115 o penicilina y clinofloxaci-no116 disminuían significativamente la concen-tración bacteriana de las vegetaciones y eranmás eficaces que los antibióticos en solitario,pero no tienen aplicación clínica porque ni ramo-planina ni clinafloxacino están comercializadas.Brandt et al117 demostraron que la combinaciónde ampicilina e imipenem podría ser muy activa,aunque no lo corroboraron en más de una cepa,por lo que este hallazgo podría ser característicode cepa y no de especie. Finalmente, aunque lascombinaciones de vancomicina, gentamicina ypenicilina118 o ceftriaxona119 han demostrado po-seer una eficacia muy importante en el modelode endocarditis experimental producida por es-tas cepas, los estudios de recaída evidenciaron laaparición entre el 10 y el 20% de resistencias ala combinación. Este último dato desecha suutilización en clínica humana. Por tanto, en la ac-tualidad no existe un tratamiento demostrado efi-caz para la endocarditis producida por Entero-coccus sp. con resistencia a glucopéptidos.

Tratamiento de la endocarditis infecciosapor S. aureus

Hamburger et al1-3 fueron los primeros investi-gadores que estudiaron la endocarditis estafilo-

cócica experimental y hallaron que la erradica-ción de los microorganismos de las vegetacionesrequería un antibiótico bactericida (oxacilina) ad-ministrado durante un período de tiempo prolon-gado. Un antibiótico bacteriostático como latetraciclina fue ineficaz para esterilizar las vege-taciones, apareciendo resistencias durante el tra-tamiento3.

En el modelo de endocarditis experimental porS. aureus sensible a meticilina en ratas o conejos,los animales pueden ser curados con 5-10 díasde tratamiento con un antibiótico bactericida,tanto si la endocarditis es derecha119a como iz-quierda120. La adición de un aminoglucósido re-duce el tiempo de esterilización de las vegetacio-nes a la mitad. El tratamiento con meticilina,nafcilina y oxacilina tiene igual eficacia a pesar deexistir diferencias en su actividad intrínseca y far-macocinética120.

Los resultados de los estudios que evalúan lasdiferencias en la eficacia entre las pautas de tra-tamiento con cefalosporinas o penicilinas soncontradictorios. En un primer estudio, Carrizosa etal61 demostraron que el tratamiento con meticili-na o nafcilina disminuía la concentración bacte-riana en las vegetaciones más rápidamente quecefazolina o cefalotina. Estos mismos autores, enun estudio posterior en el que utilizaron la mismacepa, no pudieron corroborar estas diferencias.Fernández-Guerrero et al121 no encontraron dife-rencias entre la nafcilina y la cefazolina. Steckel-berg et al122 evidenciaron que la nafcilina fue másactiva que ceftizoxima, ceftriaxona, cefotaxima,cefoperazona, cefuroxima o cefazolina. Cefpiromay ceftazidima fueron las cefalosporinas de amplioespectro más activas, tan eficaces como nafcilinay más efectivas que ceftizoxima o cefotaxima. Laeficacia terapéutica se relacionaba con la CMI delantibiótico frente a S. aureus, excepto en el casode ceftacidima. Otros antimicrobianos que handemostrado ser eficaces en la endocarditis expe-rimental por S. aureus son la vancomicina120, lateicoplanina123-125, la daptomicina124,126-128, el imi-penem129,130, la ticarcilina-ácido clavulánico131 yla clindamicina a dosis altas132.

Un número importante de cepas de S. aureuspresentan sinergia ante la combinación de un be-talactámico y un aminoglucósido133. Este he-cho también se demuestra en el modelo ani-mal120,134,135. La adición de un aminoglucósidoreduce el tiempo de esterilización de las vegeta-ciones a la mitad134. Estos resultados sugirieronque la combinación podría tener su utilidad enclínica humana. En los estudios clínicos subsi-guientes136-138 se observó que se producía unareducción de los días de bacteriemia y de fiebre,

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aunque no se pudo demostrar una disminuciónde la tasa de mortalidad respecto a los pacientestratados sin la adición de un aminoglucósido. Laposibilidad de la existencia de un efecto benefi-cioso sobre la mortalidad que no fuese reconoci-do (error �) es considerable dado el número re-ducido de pacientes incluido en los estudios.

Las quinolonas han sido evaluadas en el mo-delo de endocarditis experimental estafilocóci-ca78,121,139-153. Un buen número de estudios handemostrado que estos antimicrobianos presentanuna eficacia similar a las pautas habituales. Porotra parte, la combinación de ciprofloxacino y ri-fampicina fue superior a cada uno de ellos porseparado121,141. Este último estudio fue la basepara su utilización con éxito en el tratamiento depacientes con endocarditis estafilocócica tricús-pide. Sin embargo, una serie de estudios plan-tean dudas relacionadas con el tratamiento conquinolonas. Por un lado, un trabajo en el que secomparaba pefloxacino y vancomicina150 refirióque la segunda producía un inicio más rápido delefecto antimicrobiano. Por otra parte, diferentestrabajos sobre endocarditis estafilocócica144-149

han demostrado la aparición de resistencias du-rante el tratamiento con ciprofloxacino.

Existen algunos hechos a destacar entre los es-tudios que valoran la eficacia de distintos trata-mientos en la endocarditis infecciosa producidapor S. aureus meticilín-resistentes (SARM). Algu-nos aislamientos meticilín-resistentes pueden pa-recer sensibles a cefalosporinas por los métodosde dilución en caldo o de difusión en agar. Es ob-jeto de discusión si las infecciones causadas porestas cepas pueden ser tratadas con cefalospori-nas. Chambers et al154 demuestran que la cefa-zolina no es eficaz en el tratamiento de la endo-carditis infecciosa experimental por cepasmeticilín-resistentes y cefazolín-sensibles. Losconejos infectados con esta cepa que recibíancefazolina durante 4 días tenían una densidadbacteriana en la vegetación de 7,5 log UFC/g,mientras que si eran tratados con vancomicina ladensidad era de 3,6 log UFC/g. Cuando la cepainfectante era meticilín-sensible, la cefazolina fuetan eficaz como la vancomicina. Así mismo, eltratamiento con cefalotina aumentó la expresiónde la resistencia a betalactámicos en las cepasmeticilín-resistentes durante el tratamiento. Estosautores concluyen que las cefalosporinas no de-berían ser usadas en el tratamiento de infeccio-nes graves por S. aureus meticilín-resistente,aunque los estudios in vitro demuestren suscep-tibilidad.

La utilización de un betalactámico asociado aun inhibidor de las betalactamasas (ácido clavu-

lánico o sulbactam) para el tratamiento de infec-ciones por cepas meticilín-resistentes es unacuestión muy interesante. Varios estudios155-159

han demostrado una eficacia similar de estacombinación ante cepas meticilín-sensibles o re-sistentes y en este último caso sin diferencias convancomicina. Esto podría deberse a una gran afi-nidad de amoxicilina o ampicilina a la nueva PBP(Penicillin Binding Protein) que aparece en estascepas (PBP 2a) junto a la función de inhibiciónno competitiva de las betalactamasas por partedel ácido clavulánico o del sulbactam160.

Otra asociación que ha demostrado su efica-cia en estudios experimentales es la de fosfomi-cina y antibióticos betalactámicos como imipe-nem o ceftriaxona. Marco et al161 demostraronen estudios in vitro la actividad sinérgica y bac-tericida de esta combinación frente a 9 cepasde SARMA procedentes de diversos hospitalesespañoles. En el modelo experimental de en-docarditis por SARM, Miró et al161 demostraronla sinergia in vivo de fosfomicina y ceftriaxonao imipenem administrados siguiendo un mode-lo de farmacocinética humanizada, por lo quelos animales eran tratados de manera que si-mulaban la dosis de 2 g de fosfomicina cada6 h i.v., 2 g de ceftriaxona cada 24 h i.v. y 1 gde imipenem cada 6 h i.v. que serían las dosisa administrar en humanos. Tras 2 días de trata-miento, la combinación de fosfomicina más unbetalactámico resultó significativamente másefectiva que la administración de 1 g de vanco-micina cada 12 h i.v. siguiendo el modelo defarmacocinética humanizada (p < 0,05). El73% de los animales (n = 25) tratados con fos-fomicina e imipenem y el 62% de los que reci-bieron fosfomicina y ceftriaxona (n = 16) tuvie-ron vegetaciones estériles, mientras que estosólo ocurrió en el 31 % de los animales (n = 16)que fueron tratados con vancomicina. En elgrupo de fosfomicina en monoterapia, la tasade aparición de resistencia fue de un 42 %,mientras que no se detectó resistencia a la fos-fomicina en los grupos que recibieron la combi-nación de fosfomicina y un betalactámico.

Resumiendo los estudios de endocarditis ex-perimental por SARM o por SARMA (S. aureusresistente a la meticilina y a los aminoglucósidos)puede afirmarse que el cotrimoxazol es menoseficaz que la vancomicina162 y que a excepciónde la combinación de fosfomicina con imipenemo ceftriaxona161,163, ninguno de los tratamientosestudiados en el modelo de endocarditis porSARM o por SARMA ha demostrado ser más efi-caz que la vancomicina sino tan ineficaz como lamisma. Los tratamientos que cumplen esta pre-

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misa son los siguientes: trovafloxacino78,151, levo-floxacino164, el nuevo glucopéptido LY333328165,vancomicina más netilmicina166, ampicilina-sul-bactam más rifampicina167 y vancomicina másácido fusídico168.

En los últimos años la descripción de cepas deSARM con resistencia intermedia a la vancomici-na (GISA) ha incrementado un problema ya gra-ve por sí mismo. Los estudios preliminares in vi-tro e in vivo de Climo169,170 demuestran que lacombinación de vancomicina y cloxacilina es si-nérgica frente a estas cepas, hecho que debeconfirmarse en más estudios.

Tratamiento de la endocarditis infecciosapor S. epidermidis

S. epidermidis es el agente etiológico más fre-cuente en la endocarditis protésica precoz. Lamayoría de los aislamientos clínicamente signifi-cativos son meticilín-resistentes pero frecuente-mente son sensibles a vancomicina, gentamicinay rifampicina171. Los métodos in vitro a menudoindican susceptibilidad a las cefalosporinas pero,como en el caso de S. aureus meticilín-resisten-te, aparecen subpoblaciones heterorresistentesen las cepas meticilín-resistentes171,172. La resis-tencia a rifampicina se desarrolla in vitro de ma-nera muy rápida171 debido a una alta frecuenciade mutación por resistencia ribosómica. El usode un segundo antibiótico en combinación pre-viene de manera uniforme la aparición de cepasresistentes173.

Todos los estudios en el modelo animal se hanrealizado con cepas de S. epidermidis metici-lín-resistentes. El tratamiento con nafcilina, meti-cilina, cefalotina y cefamandol es ineficaz174,175.Lowy et al175 observaron un aumento de la pro-porción de las subpoblaciones cefalotín y metici-lín-resistentes en el interior de las vegetacionesdurante el tratamiento con cefalotina. Este hechoes similar al observado con cepas de S. aureusmeticilín-resistente. Sin embargo, Vazquez y Ar-cher174 no detectaron este fenómeno.

La vancomicina, la gentamicina y la rifampici-na poseen actividad in vivo cuando se usan porseparado174,175. El tratamiento con rifampicinasola no es efectivo, ya que implica la aparición deresistencias durante el tratamiento174. Sorpren-dentemente, el uso de cefalotina más rifampici-na no previno la aparición de resistencias a esteúltimo antibiótico171. Las diferentes combinacio-nes con los antibióticos anteriores son tan o másefectivas que los antibióticos administrados porseparado171,175. Las combinaciones más acti-vas fueron vancomicina-rifampicina o vancomi-

cina-rifampicina-gentamicina. La ausencia deeficacia de los betalactámicos y la rifampicinacuando se utilizan solos y la actividad de las com-binaciones observada en el modelo animal haninfluido en el diseño de esquemas terapéuticosen los humanos. Las recomendaciones actualesincluyen vancomicina y rifampicina con o singentamicina frente a S. epidermidis meticilín-re-sistente y penicilinas isoxazólicas con o sin gen-tamicina para las cepas meticilín-sensibles.

Principios de dosificación antibióticaaprendidos del modelo animal

El modelo animal de endocarditis ha sido utili-zado en muchos casos para estudiar las condi-ciones que influyen en la actividad in vivo de losantibióticos y, especialmente, la importancia dela dosificación en su eficacia.

Es necesario considerar el patrón de distribu-ción de los antibióticos en las vegetaciones infec-tadas antes de valorar la importancia de las dife-rentes pautas de dosificación en la eficacia in vivo.Gengo et al176 evaluaron la distribución de la me-ticilina administrada en infusión continua en val-vas cardíacas lesionadas o normales de conejos.Demostraron que las concentraciones de metici-lina en las valvas lesionadas eran superiores queen las valvas normales. En otro estudio177 demos-traron que después de la administración intermi-tente de meticilina a los animales, la curva farma-cocinética en las valvas aórticas lesionadas fuesimilar a la del suero. La concentración en las val-vas lesionadas se equilibró rápidamente con laconcentración sérica, mientras que en las valvasnormales y en el músculo la concentración demeticilina era siempre menor que la sérica. Seconsideró que el equilibrio alcanzado entre lasvalvas lesionadas y el suero se debía a que éstasestán compuestas por plaquetas y fibrina y no tie-nen la integridad del tejido valvular normal. Con-trepois et al178 demostraron que el moxalactam yla gentamicina penetraban rápidamente en las ve-getaciones después de una infusión intravenosarápida, con valores pico que aparecían al mismotiempo que en el suero. Así mismo, la vida mediade los antibióticos en las vegetaciones y en el plas-ma fue idéntica. Estos autores también compro-baron que las concentraciones de antibióticoseran menores en las vegetaciones infectadas queen las que no lo estaban. Estos estudios demos-traron que las vegetaciones infectadas son unfoco de intercambio rápido con el plasma, y quelas concentraciones locales de antibióticos pue-den ser fácilmente modificadas por cambios en ladosis y en el modo de administración del fárma-

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co. También sugieren que las concentracionesséricas pueden ofrecer una información indirectade las concentraciones antibióticas en las vegeta-ciones cardíacas, ya que la vida media es similaren ambos compartimientos. Sin embargo, hayque considerar que estos datos están generadospor la determinación de las concentraciones anti-bióticas de los homogeneizados de vegetacionescardíacas, sin considerar la posible heterogenei-dad de la difusión de los antibióticos hacia su in-terior. Este hecho fue comprobado por Cremieuxet al67 mediante autorradiografía de las vegetacio-nes tras la administración de diferentes antibióti-cos marcados con 14C.

Antibióticos administrados en solitario

1. Betalactámicos

Diversos estudios en este modelo corroboranlos conceptos obtenidos por Eagle en la déca-da de los cincuenta en infecciones agudas enratones tratados con penicilina. Carrizosa yKaye60 trataron a animales con endocarditis porS. sanguis con penicilina a diferentes dosis, in-tervalos de dosificación y duración del tra-tamiento. Fue necesaria una dosis mínimapara producir la muerte bacteriana; dosis de18.750 U/6 h durante 10 días fueron inefica-ces, mientras que la misma dosis total admi-nistrada como 37.500 U/6 h durante 5 días fueeficaz. Así mismo, se observó un intervalo críti-co de dosificación: dosis de 37.500 U/6 h fue-ron ineficaces y la misma dosis administradacada 12 h en un número igual de dosis fue unfallo terapéutico.

Gengo et al179 examinaron las condiciones queinfluían en la eficacia in vivo de meticilina en elmodelo animal de endocarditis estafilocócica. To-dos los animales recibían la misma cantidad totalde meticilina, pero las dosis e intervalos de dosi-ficación variaban. La eficacia de los grupos detratamiento con intervalos de 4 a 8 h era similar,mientras que cada 12 h era generalmente menoro ineficaz. Con la infusión continua de meticilinase conseguían concentraciones séricas iguales ala CMB del microorganismo, pero eran menoseficaces que las pautas de administración inter-mitente cuyas concentraciones séricas supera-ban en varias veces la CMB. Este último hechodemostraba que la mínima dosis eficaz debíaconseguir concentraciones plasmáticas que ex-cedieran significativamente la CMB. Estos auto-res demostraron que la eficacia de los betalactá-micos dependía fundamentalmente del tiempodurante el cual las concentraciones séricas per-

manecían por encima de la CMB y de la dura-ción, si es que existía, del efecto postantibiótico.

Thauvin et al107 en el tratamiento de la endo-carditis enterocócica experimental hallaron quela infusión continua de ampicilina era más eficazque la administración intramuscular fraccionada.La vida media muy corta (0,8 h) de la ampicilinaintramuscular podría ser la causa del fallo tera-péutico, ya que aunque las concentracionesplasmáticas eran altas (54 mg/l) los intervalos dedosificación eran cada 8 h. En un modelo similarutilizando una cepa de enterococo con alta resis-tencia a aminoglucósidos, el grupo de trabajo deWilson105 no halló los mismos resultados puestoque la eficacia de la ampicilina en infusión conti-nua fue similar a la pauta de 100 mg/kg i.m. tresveces al día. Estos dos trabajos son de difícil com-paración ya que hay muchas variables experi-mentales diferentes entre sí: a) la especie animalutilizada (rata frente a conejo); b) la duración deltratamiento (4 frente a 3 días), y c) la susceptibi-lidad a ampicilina de la cepa de enterococo utili-zada (CMI/CMB ampicilina [-�g/ml] 1/1 frente a2/ > 256).

Cometta et al180 demostraron que dosis cre-cientes de penicilina G benzatina que alcanza-ban valores de 20, 40, 500 y 1.000 veces la CMIno aumentaban la letalidad in vivo, resultados si-milares a los hallazgos in vitro (porcentaje de le-talidad de penicilina G constante, a pesar de au-mentar la concentración del fármaco: 2 × CMI,10 × CMI y 100 × CMI).

Con las cefalosporinas se ha demostrado quela ceftriaxona es eficaz al ser administrada unavez al día a conejos con endocarditis experimen-tal por Escherichia coli. Se halló una relación li-neal entre: a) las concentraciones de antibióticosérico y en la vegetación, y b) la densidad bacte-riana de la vegetación y la concentración que elantibiótico alcanzaba en su interior181. El aumen-to de la eficacia de la ceftriaxona por el incre-mento de la dosis unitaria podría deberse al ma-yor tiempo durante el que las concentracionesplasmáticas del fármaco se encuentran por enci-ma de la CMB o a la penetración aumentada delfármaco en el seno de la vegetación. Esta últimaconsideración fue demostrada por Cremieux etal182 utilizando una técnica de autorradiografía delas vegetaciones después de la infusión i.v. deceftriaxona-14C en conejos. Demostraron que:a) hay un gradiente de concentración de la peri-feria hacia al seno de la vegetación, y b) que estegradiente es menor cuando el estudio se realizauna vida media después de la infusión respectoa si se realiza 30 min después de la administra-ción i.v. del fármaco.

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Todos estos estudios con betalactámicos apo-yan el concepto de que se deben inducir valoresséricos que excedan significativamente la CMBdel microorganismo durante la totalidad del in-tervalo y que este último debe ajustarse basán-dose en la vida media sérica de eliminación y enla dosis administrada.

2. Glucopéptidos

En un esfuerzo para hallar los factores que po-dían contribuir a los fallos terapéuticos de la tei-coplanina en el tratamiento de la endocarditis enhumanos, Chambers et al125 estudiaron la im-portancia de la dosis y de los valores pico y valleséricos en el tratamiento de la endocarditis expe-rimental por S. sanguis. Hallaron que a pesar deque las concentraciones séricas de teicoplaninasuperaban varios cientos de veces la CMI del mi-croorganismo infectante, el tratamiento con pe-nicilina esterilizaba más rápidamente las vegeta-ciones. También se observó que una pauta i.v. deteicoplanina con un pico muy alto pero con unvalle muy bajo era menos eficaz que la mismadosis administrada i.m. en la que el valle era ma-yor y el pico menor. Estos resultados les llevarona considerar que, probablemente, para que tei-coplanina fuera eficaz era necesaria una con-centración sérica por encima de la CMI duranteun intervalo de tiempo importante más que unosvalores pico muy elevados durante poco tiempo.

Resultados similares fueron descritos por Con-trepois et al183, quienes compararon la vancomi-cina y la teicoplanina en el modelo de endocardi-tis estafilocócica en conejos. Comprobaron quepara que la eficacia de teicoplanina fuera similara la de vancomicina, la teicoplanina debía ser ad-ministrada cada 16 h, que era el mismo múltiplode t1/2� que correspondía a la pauta de dos vecesal día de vancomicina. Estos resultados sugierenque el intervalo entre las dosis de teicoplanina esel mayor determinante de su eficacia in vivo.También demuestra que para la comparación dedos fármacos del mismo grupo, el intervalo dedosificación debe ser determinado sobre sus res-pectivos t1/2�.

3. Quinolonas

Ingerman et al184 compararon la eficacia deciprofloxacino y de dos betalactámicos (BMY28142 y ceftazidima) en el modelo de endocar-ditis experimental por P. aeruginosa. En los estu-dios in vitro se pudo observar que los betalactá-micos tenían un velocidad de letalidad muy lentay que no presentaban efecto postantibiótico (EPA)

ante el microorganismo infectante. Por este mo-tivo, in vivo, debieron ser administrados en dosismúltiples y con intervalos de dosificación relati-vamente cortos para conseguir que sus valoresestuvieran el mayor tiempo posible por encimade la CMB del microorganismo infectante. Encambio, el ciprofloxacino, debido a su rápida ve-locidad de letalidad y a la inducción de un EPAmuy significativo, pudo administrarse de maneraeficaz en dosis más elevadas a intervalos menosfrecuentes.

Contrepois et al185 compararon la eficacia deltratamiento con fleroxacina o ciprofloxacino de laendocarditis experimental por E. coli en conejos.La susceptibilidad antibiótica del microorganismoinfectante y el patrón farmacocinético en conejosfue similar para los dos antimicrobianos: T1/2�:0,75 h). Para la misma dosis unitaria las concen-traciones plasmáticas de fleroxacina (9,5 mg/l)duplicaron las de ciprofloxacino (4,7 mg/l). La efi-cacia de fleroxacina fue superior a la de ciproflo-xacino administrados ambos cada 12 h durante4 días en el tratamiento de la endocarditis expe-rimental por E. coli.

Estos resultados podrían sugerir que las qui-nolonas tienen un efecto dosis-dependiente.

Combinaciones antibióticas de betalactámicosy aminoglucósidos

El papel del intervalo de dosificación de losaminoglucósidos, y en concreto la posibilidad desu administración una vez al día, en las pautas debetalactámicos más aminoglucósidos ha sido in-vestigado en el modelo animal de endocarditispor estreptococos del grupo viridans, enteroco-cos y E. coli.

En el modelo de endocarditis por E. coli, Fan-tin et al demostraron sinergia in vivo de la combi-nación de ceftriaxona y netilmicina administradasuna sola vez al día a dosis (15 mg/kg y 6 mg/kg,respectivamente) que eran poco eficaces cuan-do estos antibióticos eran administrados por se-parado. Este efecto se asoció con un aumentomuy significativo del PBS valle con la combina-ción (1/8 con la combinación frente a 1/2 y me-nos de 1/2 con ceftriaxona y netilmicina, respec-tivamente)186.

Los mismos autores del trabajo anterior, Fan-tin y Carbon187, en el modelo de endocarditis ex-perimental por E. faecalis, demostraron que lacombinación de penicilina más netilmicina12 mg/kg/día administrada tres veces al día eramás eficaz que la misma combinación con netil-micina administrada una vez al día. Así mismo,penicilina más netilmicina en administración

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fraccionada fue la única pauta que indujo unaactividad bactericida del suero en el valle signifi-cativa. Estos autores concluyeron que eran ne-cesarias concentraciones plasmáticas de amino-glucósido durante un tiempo prolongado paraque la combinación betalactámico-aminoglucó-sido fuera eficaz en el modelo de endocarditis ex-perimental por E. faecalis. Esta observación hasido contestada posteriormente por Gavaldà etal188, quienes demostraron que la eficacia de lagentamicina administrada una vez al día eraidéntica a su administración fraccionada. En esteestudio se utilizó la técnica de la farmacocinéticahumanizada para la administración de ampici-lina, por lo que los animales eran tratados condosis para conseguir un perfil sérico idéntico alde los humanos tras la administración de 2 gcada 4 h.

Existen cinco trabajos relacionados con estetema en el modelo de endocarditis experimentalpor estreptococos del grupo viridans. Blatter etal189 utilizaron 2 cepas de S. sanguis: una alta-mente sensible a ceftriaxona (CMI 0,032 �g/ml)y otra resistente a penicilina y con una CMI algomayor a ceftriaxona (CMI penicilina-ceftriaxona[�g/ml] 2-2). La combinación de ceftriaxona másnetilmicina (18 mg/kg) administradas una vez aldía fue más eficaz que la administración de am-bos antibióticos por separado. Estos resultadosfueron válidos para los animales infectados tantopor la cepa sensible como por la resistente a pe-nicilina. El grupo de Wilson190 estudió la eficaciade gentamicina administrada una vez al día jun-to con ceftriaxona o penicilina en el tratamientode la endocarditis experimental por estreptoco-cos del grupo viridans sensibles a penicilina. Lascombinaciones con 3 mg/kg de gentamicina ad-ministrada una o tres veces al día fueron igual-mente eficaces. Las combinaciones de 25 mg/kgde ceftriaxona y de 3 mg/kg de gentamicina ad-ministradas ambas una vez al día fueron menoseficaces que la pauta estándar de penicilina ygentamicina (1 mg/kg) tres veces al día. Estosautores consideran que probablemente las di-ferencias en la eficacia de las pautas de cefriaxo-na o penicilina podrían deberse a diferencias far-macocinéticas entre estos dos antibióticos.Chambers et al191, en un estudio muy parecido alanterior, hallaron los mismos resultados. Sin em-bargo, a diferencia del anterior, destaca que noencontraron diferencias entre las pautas de gen-tamicina en administración en una sola dosis aldía y su administración fraccionada cada 8 h jun-to con ceftriaxona o penicilina. En el estudio delgrupo de Carbon192, en el que comparan la efi-cacia de tres regímenes de tobramicina sola o

combinada con penicilina en el modelo de endo-carditis experimental por estreptococos del gru-po viridans nutricional-deficientes, los animalesfueron tratados durante 4 días con 1 o 4 mg/kgde tobramicina administrada cada 8 h y 12 mg/kguna vez al día, tanto sola como combinada conpenicilina. La eficacia de las tres pautas de peni-cilina y tobramicina fue parecida. Por tanto, nofue necesario obtener valores de aminoglucósidomantenidos durante todo el intervalo de dosifica-ción para conseguir un efecto bactericida in vivocon penicilina y tobramicina ante estreptococosnutricional-deficientes. Finalmente, el grupo dePahissa193 realizó un estudio evaluando la efica-cia de la administración de gentamicina una vezal día frente a su administración fraccionada tresveces al día en el tratamiento de la endocarditisexperimental producida por cuatro cepas dife-rentes de estreptococos del grupo viridans, unasensible, una tolerante y dos resistentes a penici-lina. Demostraron que el intervalo de dosificaciónde la gentamicina no tenía ninguna influencia enla eficacia terapéutica de la combinación y que ladosis mínima que se debía administrar una vez aldía era de 3 mg/kg, ya que a dosis de 1 mg/kg laeficacia era inferior que la administración frac-cionada.

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J.M. MIRÓ: Últimamente algunos grupos trabajancon modelos humanizados en rata por tratarsetal vez de un animal más económico, por lo queen el futuro podría ser un modelo a implemen-tar igual que el de conejo. ¿Cuáles son las dife-rencias fundamentales entre el modelo en ratay en conejo?

J. GAVALDÀ: Con rata es más económico y las con-diciones de estabulación son más sencillas,aunque existe el gran inconveniente de que lavegetación es muy pequeña y la cantidad debacterias existente en la vegetación es, por tan-to, relativamente pequeña, respecto a lo que seobserva en conejo. Esto limita la realización deestudios de aparición de resistencias con esteanimal, por lo que se considera preferente elempleo del modelo con conejo.

J.M. GATELL: No me queda claro por qué desapa-rece o por qué se cura de una forma espontá-nea la endocarditis al retirar el catéter, ya queesto es una diferencia importante con lo queocurre en el hombre.

J. GAVALDÀ: Los mecanismos inmunitarios de losanimales son totalmente diferentes a los de loshumanos. Posiblemente, aunque la vegetaciónsea madura, necesita una noxa permanentepara que haya más depósitos de plaquetas ypara que las células inmunitarias del torrentecirculatorio no consigan entrar en la circulacióny curarlas. Son pequeños trucos que tienen losmodelos que intentan sobrepasar este aumen-

to de la inmunidad que ocurre en los animalesde laboratorio.

F. MARCO: Has comentado que se sacrifican losanimales a las 24 h, pero si esperamos muchotiempo corremos el riesgo de que se produzcaun recrecimiento de las bacterias en el interiorde las vegetaciones. ¿Podemos jugar con estetiempo dependiendo de la semivida del anti-biótico, del grado de permeabilidad o de pe-netración del antibiótico al interior de la vege-tación?

J. GAVALDÀ: Me refería a un tiempo de 24 h parael caso de administración intramuscular sin far-macocinética humanizada; es decir, que tene-mos la última administración a las 8 h del díaanterior, por lo tanto hay valores de antibióticodurante mucho tiempo. Creemos que se debesacrificar los animales cuando no haya antibió-tico pero tampoco haya posibilidades de recre-cimiento. Si has utilizado farmacocinética hu-manizada, probablemente podrás sacrificar losanimales al cabo de 2 h de acabar la infusiónporque ya están en el valle y no habrá efecto re-sidual. Si tardamos más, el problema del so-brecrecimiento es muy importante porque, evi-dentemente, tendremos animales que a lomejor están curados, animales que tendrán100 o 1.000 bacterias y animales que a lo me-jor tienen 10.000. Nos podemos encontrar queel de 1.000 nos crezcan dos logaritmos y el otroya aparezca como el control. Es importante de-

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DISCUSIÓN

mostrar que no haya antibiótico, sobre todo enlos animales curados. Si dices que tienes ani-males curados debes hacer un bioensayo detus homogeneizados para demostrar que nohay trazas de antibióticos, o centrifugar bien loshomogeneizados y resuspenderlos para extraerel posible antibiótico que haya, sobre todo enlos animales curados. En los otros no, porqueya tienes crecimientos y haces diluciones y esteposible efecto residual quedaría anulado.

J.M. MIRÓ: Un tema que es bastante contro-vertido es el momento de iniciar el tratamien-to, porque si comienzas muy pronto aún estásen la fase de crecimiento logarítmico, cuandola vegetación no es madura y en este casoprobablemente los antibióticos betalactámi-cos y aminoglucosídicos podrán tener unamayor actividad. Si, por el contrario, esperasmás de 24-48 h, la vegetación es madura,habrá una subpoblación metabólica latente yquizás ese efecto del antibiótico no quedaráreflejado. ¿Cuáles son los criterios para co-menzar a las 16 o 24 h?, porque la interpreta-ción de los resultados puede cambiar mucho,y en el ser humano, cuando se inicia el trata-miento las vegetaciones son maduras en to-dos los casos.

J. GAVALDÀ: Se trata de limitaciones del modelo.Por ejemplo, en la endocarditis por S. aureus nose pueden alcanzar vegetaciones maduras por-que la sepsis inducida al animal es tan impor-tante que el 70% de ellos muere si esperas laobtención de vegetaciones maduras. Por ello sedebe buscar un punto en que la mortalidad delgrupo de control sea aceptable, es decir, un30 % de muertes, que en S. aureus no puedeser mayor de 16 o 18 h. En los otros modelos esrecomendable esperar como mínimo entre 48 y72 h, aunque también te puedes encontrar queal esperar 48 h muera el 35% de animales delgrupo control. Lo recomendable sería que cadavez que se empieza un experimento con unacepa diferente de una especie diferente se es-tandarizase y, a ser posible, esperar 48 h, perosi la mortalidad a 48 h es muy alta se debe ir re-duciendo el tiempo hasta una mortalidad de al-rededor del 15 o del 20%. Es lo que habitual-mente hacemos y, luego, otro aspecto muyimportante es comprobar que no se curan losanimales sin antibióticos; es decir, la estandari-zación también te ayuda a que en el resto deanimales que sobreviven hasta el final la con-centración bacteriana de la vegetación se man-tenga constante y no descienda.

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RESUMEN

La mortalidad y morbilidad de la meningitisbacteriana no había variado de forma significativaen los últimos años a pesar del uso de potentesantibióticos. En las últimas décadas se han utili-zado ampliamente varios modelos bien estanda-rizados, especialmente el de meningitis neumo-cócica en conejos y el de Haemophilus influenzaeen ratas. Gracias a ellos se ha podido avanzar endos grandes aspectos: un mayor conocimiento dela fisiopatología de las meningitis bacterianas, yespecialmente de algunas etiologías, y el avanceen el estudio de posibilidades terapéuticas, muyimportante desde la aparición de la resistencia ala penicilina y a otros antimicrobianos.

El modelo más utilizado es el de Dacey y San-de. En él se utilizan conejos blancos de NuevaZelanda que son anestesiados con ketamina y xi-lazina, y a los cuales se les coloca sobre el cráneouna pieza metálica protegida y fijada por un cas-co de cemento acrílico. Veinticuatro horas des-pués los animales son anestesiados de nuevo yson colocados en el aparato de estereoataxia,donde quedarán inmovilizados gracias a la piezametálica que se les había colocado previamente.Se introduce una aguja de punción lumbar en lacisterna magna y se inoculan en el espacio sub-aracnoideo Streptococcus pneumoniae u otro mi-croorganismo o sustancia que se desee estudiar.

Dieciocho horas después los conejos son anes-tesiados de nuevo con uretano y fenobarbital yson colocados otra vez en el aparato de estereoa-taxia. Se introduce un catéter intravenoso en lavena marginal de la oreja y se extrae una muestrade líquido cefalorraquídeo pretratamiento. Poste-riormente se pueden administrar las dosis de tra-tamiento y extraer muestras seriadas de líquidocefalorraquídeo según los esquemas prefijados.

Palabras clave:Meningitis experimental. Patología. Tratamiento.

MENINGITIS MODEL

Mortality and morbidity of bacterial meningitishad not changed significantly in the last yearsdespite the use of potent antibiotics. In the lastdecades, several models well standarized havebeen used, specially the rabbit model of pneu-mococcal menigitis and the rat model of Haemo-philus influenzae meningitis. With the use of the-se models the study of several aspects of thephysiopathology of bacterial meningitis, speciallyin some etiologies, and the study of different the-rapeutic possibilities, specially important sincethe breakdown of penicillin resistance have beenpossible. The most currently used model is theDacey and Sande model which uses New Zea-land white rabbits. The animals are anesthetizedwith ketamine and xylazine and a dental acrilichelmet is afixed to the calvarium. This metalicpiece is needed to fix the rabbits to the stereoata-xic frame. Twenty-four hours later the animals areanesthethized again and fixed to the stereoataxicframe. A spinal needle is introduced to the cis-terna magna and S. pneumoniae or other micro-organism or substances are inoculated into thesubaracnoidal space. Eighteen hours later theanimals are anesthethized again with urethaneand phenobarbital and placed again in the frame.A intravenous catheter is instaured in the margi-nal ear vein and a pre-treatment CSF sample istaken. During the next hours the different thera-pies are administered and several CSF samplesare taken at different time points as scheduled.

Key words:Experimental meningitis. Pathology. Therapy.

Modelo de meningitisCarmen Cabellosa,*, Jerónimo Pachónb y Benito Almirantec

aServicio de Enfermedades Infecciosas. Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge. L’Hospitalet de Llobregat. Barcelona. bServicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital Virgen del Rocío. Sevilla.

cServicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona.

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Introducción histórica

La utilización de modelos animales de menin-gitis experimental se ha extendido en las últimas3 décadas debido a la necesidad de estudiar as-pectos no bien conocidos de la meningitis bacte-riana. En los últimos años, y a pesar de la apari-ción de potentes y eficaces antibióticos, no hadisminuido de forma notable la mortalidad deesta enfermedad y especialmente de la meningi-tis neumocócica; esta última etiología es la quepresenta una mortalidad mayor entre los patóge-nos más frecuentes. Los modelos de meningitisneumocócica experimental han sido fundamen-tales para conocer su fisiopatología y los aspec-tos relacionados con su mayor capacidad de ge-nerar respuesta inflamatoria. El segundo aspectoimportante para el que se han utilizado los mo-delos de meningitis ha sido el estudio de nuevasposibilidades de tratamientos antibióticos, espe-cialmente necesarios desde la aparición de la re-sistencia de Streptococcus pneumoniae a la pe-nicilina y a otros antibióticos.

Los primeros modelos que podrían correspon-der a meningitis experimental datan de finales delsiglo XIX. Al mismo tiempo que se describieron lostres principales patógenos meníngeos, se realizóla inoculación directa de líquido cefalorraquídeo(LCR) de pacientes afectados de meningitis aanimales para establecer la posible etiología ypara comprobar los postulados de Koch1. Así seestableció el papel etiológico para Haemophilusinfluenzae, Neisseria meningitidis y S. pneumo-niae en la meningitis bacteriana y se estudiarondiversas modalidades terapéuticas como el usode antisuero2, lavado subaracnoideo con agentesantisépticos3 o enzimas proteolíticas. Finalmen-te, a partir de los años cuarenta se inició el uso deantibióticos.

A lo largo de estos años, se han utilizado unaamplia variedad de modelos que usaban diferen-tes animales incluyendo ratas, cobayas, conejos,gatos, perros, cabras y monos. Se han estudiadouna larga variedad de microorganismos comomeningococo, neumococo, H. influenzae, ente-robacterias, etc., y muy diversas vías de produc-ción de la meningitis. Los intentos de reproducirla meningitis mediante inoculación intravenosade bacterias fracasaban a menos que las menin-ges fueran alteradas antes de la inoculación4.Otras vías que se intentaron fueron intranasal5,intragástrica, intraperitoneal, intrasinusal, intra-orbitaria, subdural o intratecal. La vía intracister-nal se fue situando como la que con mayor fiabi-lidad producía meningitis experimental. Estatécnica se utilizó por primera vez en 19136 y pos-

teriormente se ha confirmado como altamente re-producible en múltiples estudios. El principal in-conveniente de esta vía es que la infección seproduce por inoculación directa y no por disemi-nación hematógena, que es la vía más frecuente,presentando una patogenesia artificial. Así mis-mo, puede existir una mortalidad por lesión di-recta de estructuras de sistema nervioso en lapunción.

Los estudios más importantes realizados conestos modelos han sido con neumococos, H. in-fluenzae y enterobacterias. Se ha podido crear unmodelo en conejos prácticamente para todos es-tos microorganismos, mientras que el uso de ani-males de gran tamaño se ve limitado por el cos-te, y el de animales de pequeño tamaño por lalimitación en el número de muestras de LCR quese pueden obtener. Este modelo en conejos reú-ne, además, la ventaja de su fácil manejo, costebajo y un volumen suficiente de LCR para com-probar la respuesta a los tratamientos antibióticosy determinar la concentración bacteriana.

Modelos de meningitis experimental

Modelo de meningitis neumocócicaen conejos

El modelo de meningitis experimental que seha impuesto con el paso de los años es el de Da-cey y Sande7. Éste es el que más ha contribuidoa avanzar en el conocimiento de la fisiopatologíade la meningitis bacteriana y en el estudio de lasnuevas posibilidades terapéuticas. Ha sido am-pliamente utilizado para estudiar la meningitisneumocócica pero también la meningitis por H.influenzae y por Escherichia coli.

Se utilizan conejos blancos de Nueva Zelanda,preferentemente hembras (porque tienen menosrequerimientos de anestesia), de 2 kg de peso.Los animales deben llegar al estabulario por lomenos una semana antes de ser utilizados parapermitir su adecuada aclimatación. Pueden dis-poner de agua y pienso sin restricciones.

La primera fase necesaria para utilizar el mo-delo consiste en una pequeña intervención qui-rúrgica para la colocación de una pieza fijada ala calota craneal de tal manera que permita la su-jeción al aparato de estereoataxia. Es necesariala presencia de dos personas, una que realizarála cirugía en condiciones de asepsia: bata, guan-tes, mascarilla, gorro, etc., y un ayudante quepreparará al animal y que colaborará para man-tener la asepsia. Al iniciar el procedimiento pue-den utilizarse 0,5 ml de diazepam subcutáneopara tranquilizar al animal y que permita la ad-

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ministración de la anestesia. Como anestesia seutilizan 35 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xila-zina i.m.

Una vez el animal está completamente dormi-do, se rasuran la cara externa de las orejas y lacalota craneal, y se desinfectan con povidona yo-dada. Se coloca el animal sobre el campo quirúr-gico previamente preparado, se cubre con unatalla fenestrada y se procede a la pequeña ciru-gía. Se realiza una pequeña incisión de 2 cm so-bre el eje longitudinal del cráneo, a la altura delcruce de suturas óseas. Se separa el periostio ycon la ayuda de un perforador se realizan cuatropequeños agujeros sobre la calota craneal, sinatravesar completamente el diploe. Estos peque-ños agujeros se sitúan equidistantes y aproxima-damente a 5 mm del cruce de suturas. Se fijan4 tornillos metálicos que servirán para guiar la co-locación de una horquilla metálica, provista deuna rosca donde posteriormente podrá fijarse unvástago. Una vez colocados los tornillos y la hor-quilla se cubre todo con cemento acrílico. Estecemento, habitualmente de uso en odontología,puede obtenerse comercialmente. El cemento seobtiene mezclando un polvo y un líquido mo-mentos antes de su utilización, formando unamasa que se moldea con las manos y se coloca,formando un cubo, sobre las piezas metálicas fi-jadas a la calota craneal de tal manera que cubratodos los metales y la herida quirúrgica. Estecubo de cemento acrílico, que sólo deja libre larosca donde se fijará el vástago, se endurece deinmediato, lo que aumenta de forma importantesu temperatura. Cuando está completamenteduro, se enfría bajo un chorro de agua corriente.Se recuesta el animal y se mantiene en observa-ción hasta la completa recuperación de la anes-tesia, momento en el que puede ser devuelto a lajaula, hasta el día siguiente.

A partir de las 18 h de la cirugía, puede proce-derse a la inoculación. Los animales son aneste-siados de nuevo con ketamina y xilazina. Se colo-ca un vástago metálico enroscado en la pieza quese había fijado sobre la calota craneal. Esta piezametálica será la que servirá para fijarlo al aparatode estereoataxia de tal manera que el conejo po-drá permanecer en la misma posición, sentadocon el cuello erguido y el cráneo en la orientaciónque se precise para realizar la punción lumbar. Elaparato consta de un segundo brazo articulado alque se fijará la aguja de punción lumbar y quepermitirá acercarla y realizar la punción de formacontrolada en el punto que se desee. Este puntose determina previamente por palpación. Se de-sinfecta la zona del cuello con alcohol e inmedia-tamente se pincha con una aguja de PL de 25 G

que se introduce en la cisterna magna hasta no-tar una suave resistencia. Habitualmente se ex-traen unos 200 �l de LCR inmediatamente antesde realizar la inoculación. Para las extracciones yla inoculación se utilizarán agujas de insulina de1 ml que se pueden acoplar a la aguja de punciónlumbar (PL) tras retirar el fiador. Se puede moverla aguja con la ayuda del brazo donde va fijada. Lainoculación en el espacio subaracnoideo se rea-liza, así mismo, en 200 �l de líquido. Se puedeinocular el microorganismo causante de la me-ningitis que se desee estudiar, sustancias de lasque se desee conocer su actuación en el LCR,etc. S. pneumoniae es el microorganismo que hasido objeto de estudio con mayor frecuencia.

Dieciocho horas después la meningitis estarátotalmente establecida. En el modelo más clási-co es el momento de iniciar el tratamiento. Losconejos son anestesiados de nuevo con uretano(1,75 g/kg subcutáneo) y se coloca un catéter in-travenoso (pediátrico) en la vena marginal de laoreja. Así se podrá suplementar la anestesia confenobarbital (5 mg/kg i.v.). Se colocan de nuevolos animales en el aparato de estereoataxia y seextrae una muestra de LCR pretratamiento. Seadministra entonces la primera dosis de antibió-tico; las dosis siguientes se administran a dife-rentes intervalos según el esquema prefijado quedependerá de la farmacocinética del antibiótico,entre otros aspectos. A partir de aquí se podránrealizar extracciones seriadas de LCR cada hora,cada 2 h o según el esquema horario que se hayadefinido para cada experimento, dependiendo delos datos que sea necesario conocer. En los ex-perimentos de tratamiento se suelen mantener24 o 48 h y se extraen muestras de LCR a las ho-ras prefijadas. En los experimentos en los que seestudia el efecto de una sustancia, la extracciónde muestras dependerá del diseño. Las muestrasde LCR pueden procesarse para realizar todo tipode determinaciones microbiológicas y bioquími-cas. Las más usuales son recuento de células,concentración de proteínas y ácido láctico, culti-vo directo y cuantitativo, concentraciones de an-tibiótico y poderes bactericidas en el pico y en elvalle.

Cuando ha finalizado el experimento los ani-males son sacrificados con una sobredosis de fe-nobarbital. Para determinar la presencia de ede-ma cerebral como un parámetro inflamatorio máspuede extraerse el cerebro abriendo la calota cra-neal; se pesa y tras secado durante una semanaen estufa a 100 °C se determina el peso seco. Eledema cerebral se expresa como g de agua por100 g de peso seco. Si el experimento se prolon-ga durante 24-48 h conviene hidratar al conejo

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MODELO DE MENINGITIS

con 20 ml de suero, glucosado y fisiológico a par-tes iguales, que puede administrarse por vía sub-cutánea cada 12 h. Así mismo, conviene vigilar lasituación de los conejos y, si es preciso, sacrifi-carlos antes de finalizar el tiempo prefijado cuan-do aparecen signos de sufrimiento.

Modelo de meningitis por Pseudomonasaeruginosa en cobaya

Este modelo ha sido desarrollado reciente-mente en el Laboratorio de Infección Experimen-tal del Hospital de Bellvitge por J.M. Maiquespara poder estudiar la acción de meropenem enla meningitis por P. aeruginosa, ya que este fár-maco no puede utilizarse en conejos. Se utilizancobayas Hartlem hembras de 400-500 g. Losanimales llegan al estabulario la semana previa alexperimento y permanecen en observación bajola supervisión de un veterinario, durante todoeste tiempo. El procedimiento se inicia con laanestesia, para cada animal (400-500 g) se uti-liza una combinación de 0,1 ml de xilacina(4 mg/kg) y 0,3 ml de ketamina (30 mg/kg) quese administran por punción intramuscular en lanalga (aguja de 26 G). Esta combinación deja rá-pidamente anestesiado al animal en menos de2 min y sus efectos se prolongan durante unahora, tiempo necesario para su manipulación, sinque se hayan observado secuelas posteriores.Una vez que el animal ya ha sido anestesiado, sele rasura el dorso de cuello y la calota con una ra-suradora eléctrica y después se le desinfecta lazona con un solución de povidona yodada.

La inoculación de las bacterias se realiza enuna campana de flujo laminar y por medio de unequipo de infusión de aguja fina (27 G) con ale-tas (Valu-Set 27 G 3/8 0,4 × 10). Con una mi-cropipeta se toma una muestra de 100 �l delvolumen del inóculo bacteriano previamente pre-parado que se inyecta dentro del tubo del equi-po. Después se conecta una jeringuilla de 1 ml, ycon la presión del émbolo se lleva la columna delíquido hasta la base de la aguja. Con un rotula-dor se marca en el tubo el punto hasta donde lle-ga el extremo de dicha columna. Se localiza portacto la hendidura occípito-atloidea en la nucadel cobaya y se introduce la aguja del equipo deinfusión hasta la cisterna subaracnoidea. Se sabeque se está en el sitio adecuado porque al aspi-rar con el émbolo de la jeringa se extrae LCR delanimal. En ese momento se introduce lentamen-te el volumen del inóculo bacteriano. Finalizadoeste proceso los animales son depositados enjaulas apropiadas y alojados en una cámara am-biental de presión negativa, especial para la es-

tabulación de animales infectados y potencial-mente contaminantes. Se vigila que se recuperenbien de la anestesia y se les proporcionan agua ypienso. La respuesta inflamatoria a la infeccióninducida se desarrolla suficientemente en tansólo 4 h, tiempo que se considera adecuado parainiciar los procedimientos terapéuticos objeto deestudio. A partir de este momento se puede pro-ceder a la administración de los antibióticos. Losantibióticos seleccionados se reconstituyen conuna cantidad de diluyente adecuado para que elvolumen del preparado administrado sea seme-jante en todos los casos (0,4-0,5 ml). Este volu-men se administra por vía intramuscular en lanalga del animal con una jeringuilla de 1 ml y unaaguja de 26 G.

En el momento en el que deben obtenerse lasmuestras, los animales son anestesiados con lamisma combinación de xilacina y ketamina men-cionada anteriormente. Después, por puncióncardíaca directa se obtienen entre 5 y 10 ml desangre y por la misma vía se administra 1 ml depentotal sódico que provoca la muerte instantá-nea del animal.

Por cada animal empleado tan sólo es posibleobtener una muestra biológica. La sangre se ob-tiene por la punción cardíaca directa ya mencio-nada. El LCR se obtiene, inmediatamente des-pués de la administración del pentotal, porpunción en la cisterna magna con el mismo equi-po y por un procedimiento semejante al emplea-do en la inoculación. De esta forma se consigueobtener entre 50 y 300 �l de LCR, que se distri-buyen en alícuotas en tubos de Eppendorf parasu posterior análisis. La extracción del cerebroprecisa de una pequeña intervención quirúrgicay conviene hacerla en condiciones de esterilidad.Con ayuda de un bisturí y unas pequeñas pinzasde disección se diseca la piel, la aponeurosis y elperiostio de la zona de la calota. Con un taladromanual se practica un agujero en la confluenciade las suturas interparietal y frontal; a través deeste agujero se introduce la punta de unas pin-zas y por tracción se desarticulan los huesos dela calota dejando expuesta toda la superficie ce-rebral. Se vuelca el cráneo y con un bisturí sesecciona el cerebro a la altura del tronco, depo-sitándolo en un recipiente estéril. En este mo-mento se pueden tomar muestras para cultivo dela superficie meníngea del interior del cráneo conun escobillón de algodón.

Modelo de meningitis por H. influenzae en ratas

Este modelo fue descrito por Moxon et al8. Seutilizan ratas Sprague-Dawley de 5 días de edad

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y H. influenzae serotipo b. Sin necesidad deanestesia previa se inoculan 107 unidades for-madoras de colonias (UFC) en 0,1 ml mediantela inserción de una aguja de 24 G en las fosas na-sales y con una jeringa Hamilton. Hay que tenerespecial cuidado en no lesionar la mucosa. Seproduce posteriormente la presencia de bacte-riemia que condicionará la siembra meníngea. Lapositivización de los cultivos de LCR se produceaproximadamente a las 48 h. Este modelo hasido ampliamente utilizado en los estudios de pa-togenia de meningitis puesto que reproduce másfielmente la de la infección humana, pero no estan útil para el estudio de eficacia antibióticapuesto que al ser un modelo con un animal depequeño tamaño permite obtener una muestrareducida del LCR.

Otros modelos

Un modelo basado en el anterior pero con ino-culación orogástrica se ha desarrollado para es-tudiar la meningitis por E. coli9. Otros modelosque se desarrollaron en su día pero que no sehan impuesto incluyen un modelo de meningitispor H. influenzae en primates10, un modelo demeningitis neumocócica en conejos que utiliza lavía hematógena11, y precisa el pase previo de lacepa S. pneumoniae por peritoneo de ratón, yrealizar una punción en la cisterna magna paraadministrar mucina. Se produce la meningitis porsiembra hematógena a partir de la bacteriemiaen un 80% de los conejos aproximadamente.

Ventajas y limitaciones del modelo

Los modelos experimentales con animales per-miten plantearse e investigar problemas que sonmuy difíciles de estudiar en humanos, como sonlos mecanismos por los que las bacterias pe-netran en la barrera hematoencefálica y sus efec-tos sobre la misma, los mecanismos de defensaen el LCR y su dinámica, el papel de múltiples ci-tocinas en la cascada inflamatoria, el posible pa-pel de anticuerpos monoclonales o antagonistasde sustancias en el tratamiento de la meningitis,etc. Así mismo, pueden ayudar a disminuir el nú-mero de ensayos clínicos antes de la utilizaciónde un nuevo fármaco.

En el caso del modelo de meningitis neumo-cócica en conejos también pueden considerarseventajas su fácil manejo, su coste bajo y el hechode poder tomar muestras seriadas de LCR conun volumen suficiente para realizar diversas de-terminaciones bioquímicas o microbiológicas encada punto horario en el mismo animal. Esto es

una gran ventaja cuando se estudia la respuestaa antibióticos nuevos o combinaciones de las queno existe experiencia.

La principal limitación de este modelo es supatogenia artificial. Reproduce más fielmente lapatogenia de una meningitis neumocócica “defoco contiguo”, como sería la secundaria a lapresencia de una fístula de LCR o de otitis o si-nusitis aguda, pero no la que se produce porsiembra hematógena a partir de un foco de neu-monía o desconocido.

Otra limitación viene dada por la posibilidad detener mortalidad añadida por punción directa deestructuras del sistema nervioso central (SNC) alintentar la punción de la cisterna magna.

Otros modelos, especialmente los que utilizananimales pequeños, tienen el inconveniente deno poder obtener más de una muestra en el mis-mo animal y tener que sacrificar a grupos de ani-males distintos en cada punto horario para cono-cer la evolución en el tiempo. El modelo queutiliza primates está limitado, obviamente, por elcoste.

Avances en la fisiopatología de la meningitisbacteriana

Los estudios realizados con el modelo de me-ningitis por H. influenzae en ratas fueron realiza-dos en su mayoría en las décadas de los setentay ochenta, y permitieron estudiar los mecanismosde defensa12, contribuyeron a los conocimientosprevios para el desarrollo de la vacuna13 y es-tablecieron el papel del complemento en el en-fermedad invasiva14. El modelo de meningitisneumocócica en conejos con inoculación intra-venosa se ha utilizado para estudiar los cambioshemodinámicos que genera la enfermedad15 ypara describir con detalle la inflamación en el es-pacio subaracnoideo16. También se realizaroncon él estudios sobre el efecto de metilpredniso-lona en los parámetros inflamatorios.

El modelo de Dacey y Sande ha sido utilizadopara estudiar el papel del complemento y de lasinmunoglobulinas, que presentan un déficit rela-tivo, importante en una infección donde los anti-cuerpos específicos y el complemento seríanesenciales para la opsonización de los patógenosmeníngeos encapsulados y para conseguir unafagocitosis eficaz. También se han realizado es-tudios sobre la dinámica del LCR17, la penetra-ción de antibióticos en el LCR18 y los diversos me-canismos que influyen en la misma (estado“inflamatorio” de la barrera, peso molecular de lasustancia, grado de ionización, solubilidad en lí-pidos, fijación a proteínas, etc.).

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Un capítulo muy interesante lo constituyen losexperimentos, llevados a cabo por diversos gru-pos, encaminados a conocer la respuesta infla-matoria en la meningitis neumocócica y por H.influenzae. En la infección neumocócica se halogrado demostrar que los polisacáridos capsula-res no son inflamatorios y que sí lo es la pared ce-lular19,20, y dentro de ésta el ácido teicoico, quees capaz de generar pleocitosis, aumento de laconcentración de proteínas en el LCR y edemacerebral. En la meningitis por H. influenzae se hademostrado que este papel generador de res-puesta inflamatoria corresponde al lipopolisacá-rido21. Se ha demostrado que esta endotoxina ge-nera las alteraciones citoquímicas el LCR, alterala circulación cerebral, aumenta la presión intra-craneal y produce edema cerebral. La presenciade estos productos bacterianos en el espaciosubaracnoideo estimula la liberación de media-dores de la inflamación en el LCR, entre ellos elfactor de necrosis tumoral y la interleucina1�22,23, los metabolitos del ácido araquidónico, elfactor activador de las plaquetas24, otras interleu-cinas, proteínas inflamatorias del macrófago (MIP1 y MIP 2), prostaglandinas, etc.25. Toda estacascada ha podido dibujarse gracias al modelo,realizando experimentos que incluyen la demos-tración de concentraciones elevadas de determi-nadas citocinas después de la inoculación debacterias vivas, de pared celular o lipopolisacári-do, o estudiando la respuesta producida por lainoculación intracisternal de estas citocinas cono sin antagonistas o anticuerpos.

Otro punto de la fisiopatología que ha permiti-do estudiar los modelos es la activación de losleucocitos polimorfonucleares26. Éstos se adhie-ren a receptores específicos de las células endo-teliales y liberan productos tóxicos que lesionanlas células endoteliales, provocan un aumentoprogresivo de la separación entre las finas unio-nes de las células y aumentan la formación devesículas pinocíticas. La consecuencia es lo quese conoce como apertura de la barrera hemato-encefálica. Cuando todos estos mecanismos, laactivación de la cascada de citocinas y mediado-res, de las células endoteliales y de los leucoci-tos, y el consiguiente aumento de permeabilidadde la barrera hematoencefálica, se han desenca-denado, se producen el edema cerebral y el au-mento de la presión intracraneal27. En el modeloexperimental se ha podido demostrar cómo el ini-cio del tratamiento antibiótico, especialmente conbetalactámicos, con su destrucción masiva decélulas bacterianas, provoca la exposición degran número de “piezas” bacterianas, como lapared celular neumocócica, capaces de desen-

cadenar la respuesta inflamatoria y, así, ésta seve multiplicada al iniciarse el tratamiento antibió-tico. Se ha podido demostrar este aumento en losmodelos experimentales por E. coli, H. influenzaeo S. pneumoniae28,29. Toda esta visión de la fi-siopatología y de los efectos del tratamiento an-tibiótico llevaron a pensar en nuevas estrategiasterapéuticas que incluyan, además de los anti-bióticos, tratamientos encaminados a modular larespuesta inflamatoria. Los experimentos que sehan realizado incluyen el uso de sustancias quebloqueen a los mediadores de la inflamacióncomo anticuerpos antilinterleucina 1 o antifactorde necrosis tumoral; de momento no se han con-seguido resultados concluyentes como para im-ponerse en la clínica, excepto el uso de dexame-tasona en determinadas etiologías30. También delconocimiento de la multiplicación de la cascadainflamatoria que se ha visto anteriormente nacela recomendación, hoy día plenamente acepta-da, de administrar la dexametasona inmediata-mente antes del inicio del tratamiento antibiótico.

Avances en el tratamiento de la meningitisbacteriana

Los modelos también se han utilizado para es-tudiar la actividad de los antibióticos en el LCR, laforma de administración más adecuada, intermi-tente respecto a perfusión continua, la necesidadde utilizar antibióticos bactericidas, así como lanecesidad de conseguir concentraciones de an-tibióticos de 10 a 20 veces superiores a la con-centración mínima bactericida (CMB)31.

Se han evaluado un amplísimo número de tra-tamientos con el modelo de meningitis experi-mental en conejos, entre los que se incluyen pe-nicilinas de todo tipo, cefalosporinas de diversasgeneraciones, aminoglucósidos, cloramfenicol,glucopéptidos, antifúngicos, etc.

Además de estudiar su posible eficacia en ladisminución de la concentración bacteriana o es-terilizar el LCR, habitualmente se puede estudiarel porcentaje de penetración, la presencia de si-nergia en una combinación antibiótica, etc. Lascefalosporinas de tercera generación, que tantaimportancia tienen actualmente en el tratamien-to de las meningitis bacterianas, fueron amplia-mente evaluadas antes de su aparición y en losprimeros años con los modelos de meningitis ex-perimental, y demostraron cumplir los criterios deconseguir concentraciones en el LCR que exce-día de 10 a 20 veces la CMB32. Como un avancemuy significativo, conseguían poderes bacterici-das en el LCR de 1:64 en situaciones de infec-ción por enterobacterias.

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Con la aparición y extensión mundial de la re-sistencia del neumococo a la penicilina y a lascefalosporinas de tercera generación, el modelode meningitis neumocócica en conejos se ha re-velado como un gran instrumento y se ha utili-zado ampliamente para evaluar posibles alterna-tivas terapéuticas, entre las que se encuentranestudios comparativos de diversas cefalospori-nas, evaluación de nuevas quinolonas33, gluco-péptidos con rifampicina34, estudios de combi-naciones de betalactámicos y glucopéptidos,especialmente ceftriaxona y vancomicina33, be-talactámicos (ceftriaxona, cefotaxima, amoxicili-na o cefpiroma35,36 y rifampicina), betalactámi-cos con fosfomicina35,36, evaluación de nuevosglucopéptidos con y sin ceftriaxona37,38, etc. Engeneral, casi todos los nuevos antimicrobianosque se cree que puede tener un papel en lasinfecciones por grampositivos se evalúan conel modelo de meningitis neumocócica experi-mental39.

Otro grupo importante de experimentos es elque ha permitido demostrar la alteración queproduce el uso de dexametasona en la penetra-ción de determinados antibióticos en el LCR, es-pecialmente la vancomicina, cuya concentracióndisminuye40,41.

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J.M. GATELL: ¿La penetración y la farmacocinéti-ca de los antibióticos en el líquido cefalorraquí-deo (LCR) del conejo se considera que es simi-lar a la humana, o bien se debe determinar oaplicar algún tipo de ajuste? Lo comento pues-to que en humanos el aclaramiento del antibió-tico en LCR suele ser bastante lento.

C. CABELLOS: En general la mayoría de antibióticospresentan los mismos problemas o ventajas ennuestro modelo que en humanos. La penetra-ción de los betalactámicos y los glucopéptidos,

por ejemplo, es relativamente baja pero nor-malmente suficiente, al igual que ocurre en hu-manos. Una excepción es la del meropenem,que debido a que el conejo carece de la enzimadihidropeptidasa, imposibilita su estudio en esteanimal. Habitualmente, en conejo se obtiene unpico de concentración de antibiótico en el LCRa las 2 h. Estudios realizados con antibióticos desemivida más larga, como los empleados enhumanos cada 24 h, suelen evidenciar tambiénen el conejo concentraciones plasmáticas a las

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DISCUSIÓN

24 h, aunque la semivida plasmática se reduceun par de horas.

J.M. MIRÓ: Has comentado que vuestro grupoestá desarrollando un modelo de meningitis encobaya, ¿por qué habéis escogido este animalen lugar del conejo?

C. CABELLOS: Porque lo que queríamos estudiarera la meningitis por Pseudomonas y alternati-vas a su tratamiento, y los antibióticos carbape-némicos, como meropenem y sus combinacio-nes, no se pueden utilizar en el conejo. Por ello,buscamos otro modelo. Conocíamos un mode-lo muy sencillo pero limitado, puesto que con-siste en la punción directa en la cisterna mag-na, la posterior comprobación de que haylíquido y finalmente se inocula directamente,sin el empleo de ninguna otra tecnología. Tansólo se obtiene una única muestra a estudiar(de LCR, de cerebro y un cultivo de la superfi-cie de la meninge).

F. MARCO: ¿Cuál es tu opinión sobre el futuro delas nuevas quinolonas, trovafloxacino, gemiflo-xacino, etc., para el tratamiento de la menin-gitis?

C. CABELLOS: Se dispone de datos sobre clinaflo-xacino con este mismo modelo y funcionó muybien. Estamos corroborando actualmente estosdatos con clinafloxacino y con cepas de lasnuestras. También se ha estudiado alguna otrade las nuevas quinolonas y parece que funcio-nan bien, lo que presupone que se ha resueltoel problema de la penetración que presentaban

las primeras quinolonas. Si surgen problemasde resistencias habrá que estudiar combinacio-nes de antibióticos, de las cuales las más reco-mendables son los betalactámicos o glucopép-tidos con rifampicina, o bien betalactámicoscombinados con glucopéptidos.

J. GAVALDÀ: Querría plantear dos cuestiones rápi-das; en primer lugar, ¿se comprueba fehacien-temente también que estas combinaciones deglucopéptidos y betalactámicos son sinérgicasin vitro? La otra cuestión es si se han producidoproblemas con los cobayas en la administraciónde antibióticos, puesto que es conocida la posi-ble inducción de colitis seudomembranosa enalgunas cepas de estos animales.

C. CABELLOS: Hemos demostrado la eficacia de lascombinaciones estudiadas pero no se analizó laexistencia de sinergia ni en su concepto clásiconi según la definición que se ha comentado endiscusiones previas. Únicamente se demostrósinergia con una cepa de las que utilizó Mc-Cracken en uno de los experimentos. En cuan-to a la segunda pregunta, y de momento, nohan aparecido problemas de colitis en el mode-lo de Pseudomonas con ceftacidima, merope-nem y tobramicina. Esto podría explicarse al tra-tarse de un modelo practicado en un cortoperíodo de tiempo, ya que se sacrifican los ani-males a las pocas horas de iniciado el experi-mento. Probablemente si tuvieran que mante-nerse durante largos períodos de tratamientopodrían aparecer este tipo de problemas.

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RESUMEN

Los modelos experimentales de neumonía seutilizan desde antes del uso clínico de las sulfami-das. Los animales utilizados han sido diversos,como perros, cobayas, ratas y ratones, que pue-den ser inoculados por aspiración o por inhalaciónde aerosoles, entre otros métodos. Las bacteriasutilizadas han sido múltiples, más frecuentemen-te cocos grampositivos y bacilos gramnegativos. Sedescriben los modelos más comunes, los que uti-lizan ratones y cobayas, así como los modelos deneumonía crónica. Las ventajas del modelo es quees discriminativo, o sea, se asemeja a las condi-ciones en las cuales se produce la neumonía enhumanos. Las limitaciones son la farmacocinéticadiferente de los antimicrobianos en los animalesde experimentación y el relativamente gran inócu-lo utilizado, en comparación a lo que ocurre en hu-manos. Por estas razones sus resultados debenser trasladados con precaución a la clínica huma-na. A pesar de estas limitaciones, los modelos deneumonía han permitido conocer aspectos de lapatogenia de la enfermedad, de los fenómenos in-flamatorios que se producen como causantes dela lesión pulmonar y de los mecanismos de la in-suficiencia respiratoria. Los modelos de neumoníacrónica han permitido conocer aspectos relacio-nados con la infección en la fibrosis quística y laenfermedad pulmonar obstructiva crónica. Final-mente, los modelos experimentales de neumoníahan contribuido al conocimiento de la eficacia dedistintos antimicrobianos en neumonías causadaspor distintos microorganismos y de las caracterís-ticas farmacodinámicas relacionadas con la efica-cia del tratamiento.

Palabras clave:Modelo experimental. Fisiopatología de la neumonía.

Tratamiento.

PNEUMONIA MODEL

Experimental models of pneumonia had beenused before the clinical use of sulfonamides. Dif-ferent animal species have been used, as dogs,guinea pigs, rats, and mice, which may be ino-culated by aspiration or by aerosol chambers,among other methods. Multiple bacteria havebeen used, more frequently grampositive cocciand gramnegative bacilli. The more common mo-dels, those using mice and guinea pigs, and thechronic pneumonia models, are described. Thepneumonia models have the advantage to be adiscriminative model, simulating human infectionas closely as possible. The main limitations arethe different pharmacokinetics of antimicrobialsin animals, compared to human beings, and therelatively large inoculum used in the aspirationmodel. For these reasons, their results must beundertaken with caution when extrapolated to theclinical. In spite of these limitations, the pneumo-nia experimental models have contributed to theknowledge on the pathogenesis of the disease, onthe inflammatory process causing lung damage,and on the mechanisms of the respiratory failurein the pneumonias. Chronic pneumonia modelshave been used to study aspects related to the in-fection in the cystic fibrosis and in the chronicobstructive pulmonary disease. Finally, the expe-rimental models of pneumonia have contributedto the knowledge about the efficacy of differentantimicrobials, in pneumonias caused by multi-ple microorganisms, and to know the pharmaco-dinamic parameters related with the efficacy ofthe treatments.

Key words:Experimental model. Pneumonia pathology. The-

rapy.

Modelo de neumoníaJerónimo Pachóna,*, Joan Gavaldàb y Josep Maria Miróc

aServicio de Enfermedades Infecciosas. Hospitales Universitarios Virgen del Rocío. Sevilla. bServei de Malalties Infeccioses. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona. cServei de Malalties Infeccioses.

IDIBAPS (Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer)-Hospital Clínic i Provincial. Barcelona.

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Los modelos experimentales de neumoníabacteriana se han descrito desde antes del usoclínico de las sulfonamidas en 19361. Este mo-delo se ha empleado para estudios sobre pato-genia de la neumonía2, la farmacocinética de losantimicrobianos en el pulmón, y para estudiar laeficacia de distintos antimicrobianos en neu-monías producidas por distintos agentes3. Losprimeros modelos de neumonía experimentalfueron casi exclusivamente neumonías neumo-cócicas. Posteriormente, ante el aumento decasos en humanos de neumonías por bacilosgramnegativos y Staphylococcus aureus, se de-sarrollaron modelos experimentales de neumo-nías causadas por estos microorganismos, inclu-yendo Pseudomonas aeruginosa3, Klebsiellapneumoniae4, Legionella pneumophila5 y Hae-mophilus influenzae6.

Para los modelos experimentales de neumo-nía bacteriana se han utilizado diversas espe-cies animales, incluyendo perros, cobayas, ra-tas y ratones. De igual manera, la forma deinoculación ha sido diversa. El modelo de aspi-ración fue de los primeros en utilizarse, a travésde una instilación intratraqueal o intrabron-quial7. Otros modelos desarrollaron la utilizaciónde aerosoles, en cámaras para tal efecto, paraintroducir el inóculo en vías respiratorias, lo quefacilita la inoculación simultánea de varios ani-males8,9. Un problema en el modelo de neumo-nía experimental es la dificultad de lograr unmodelo reproducible de neumonía mortal. Paraello se han usado varios métodos, el más prác-tico de los cuales es la mezcla de inóculo conmucina gástrica porcina1,10.

Los modelos experimentales de neumoníabacteriana se han utilizado de forma cada vezmás frecuente para estudios preclínicos del de-sarrollo de nuevos antimicrobianos, pero tambiénpara la evaluación de la actividad in vivo de anti-microbianos antiguos frente a bacterias con dis-tintos mecanismos de resistencia.

Modelos de neumonía experimental

Entre los modelos experimentales anterior-mente especificados, los más frecuentes son losque utilizan ratones, ratas y cobayas. La elecciónde una especie animal u otra dependerá de lascaracterísticas de la bacteria que se quiere estu-diar, que debe producir una infección reproduci-ble y eventualmente fatal, lo que vendrá condi-cionado por los objetivos del estudio, así comopor la farmacocinética de los antimicrobianos

que se utilizarán, por la facilidad del modelo y porel coste. Existen modelos de neumonía aguda yde neumonía crónica.

Modelos de neumonía aguda

Descripción del modelo de neumonía en ratones.Un modelo de neumonía bacteriana experimen-tal frecuentemente empleado es el que utiliza ra-tones, inmunocompetentes o neutropénicos. Elmodelo en ratones neutropénicos, mediante laadministración de ciclofosfamida, se utiliza cuan-do se usan bacterias con escasa virulencia parael ratón, con el objetivo de facilitar el estableci-miento de la infección. Se detallará un modelo deneumonía por Acinetobacter baumannii, repro-ducible, que produce una mortalidad en el grupocontrol del 100 %10 y que puede servir de refe-rencia para neumonías experimentales por otrosagentes.

Para la producción de neumonía experimentalse utiliza una modificación del modelo de Espo-sito y Pennington6,7, utilizando ratones inmuno-competentes C57BL/6, hembras, con peso de14-16 g. Los animales se anestesian con 15 �lde tiopental sódico al 5 % intraperitoneal. Unavez anestesiado el animal, se administra el inócu-lo por vía intratraqueal. Para ello, se suspende alanimal verticalmente y con el cuello en hiperex-tensión. Se canaliza la tráquea por vía oral conuna aguja metálica de punta roma conectada auna jeringa Hamilton (Hamilton Co., Reno, NV)conteniendo 50 �l del inóculo bacteriano, desli-zándola hasta sentir el contacto de la aguja romacon el cartílago traqueal. Se inocula lentamente(2-3 min) para evitar la asfixia y la deglución delinóculo. Al finalizar la inoculación el animal per-manece durante 3 min en posición vertical paraevitar que el inóculo pase a la vía digestiva o al ex-terior y posteriormente en decúbito lateral a 30°hasta que despierte.

Se utiliza un inóculo bacteriano de aproxima-damente 108 unidades formadoras de colonias(UFC)/ml, preparado a partir de un cultivo enTSB a 37 °C durante 18 h mezclado al 50 %con mucina gástrica porcina (M-2378; SigmaChemical Co., St. Louis, Mo.) diluida en suerosalino al 10 %. Para conocer el tamaño exactodel inóculo empleado, se realizan dilucionesseriadas, sembrándose 100 �l de cada diluciónen placas de agar-sangre e incubándolas18-24 h a 37 °C.

En otros modelos de neumonía experimentalen ratones, la infección se puede producir a tra-vés de la instilación intranasal de gérmenes par-ticularmente virulentos11.

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Tras la infección, en los experimentos para es-tudiar la eficacia de distintos antimicrobianos, losanimales son adscritos a diversos grupos de tra-tamiento y grupos controles, con la dosificación,intervalos, tiempo de comienzo del tratamiento yduración de éste que más convenga al experi-mento. Durante éste se evalúa la mortalidad de lainfección durante el tiempo prefijado, tanto en elgrupo control como en los animales tratados. Eltratamiento antimicrobiano en este modelo hayque comenzarlo a las 4 h tras la inoculación paraevitar la mortalidad precoz que se produce en losgrupos controles.

Para la realización de estudios farmacocinéti-cos se realizan extracciones de sangre seriada-mente tras la administración de una dosis de losantimicrobianos. Para ello, en el animal aneste-siado con 0,1 ml de tiopental sódico al 5% intra-peritoneal se realiza un corte en el plexo periorbi-tario, extrayéndose aproximadamente 300-500 �lde sangre mediante un tubo Microtainer con se-parador, en la cual se determinarán las tasas deantimicrobianos, calculándose después la Cmax,el área bajo la curva concentración/tiempo, la se-mivida de eliminación (t1/2) y el tiempo en que lasconcentraciones plasmáticas permanecen porencima de la concentración mínima inhibitoria(CMI). Se utilizan grupos de 3 ratones por cadatiempo de la curva que se desea obtener, que ha-bitualmente consta de 5 a 8 puntos distintos parapoder determinar todas las variables farmacoci-néticas. Una vez realizadas las extracciones losanimales son sacrificados.

Tras finalizar el experimento diseñado, losanimales supervivientes son sacrificados 4 hdespués de la última dosis de antibiótico me-diante la administración de 0,2 ml de tiopentalsódico al 5% intraperitoneal. Con técnica asép-tica se procede a la apertura torácica a la altu-ra del esternón con tijeras y pinzas estériles,manteniéndose el tórax abierto con un separa-dor. Posteriormente, y mediante una jeringacon aguja subcutánea, se realiza una punciónintracardíaca para exanguinar al animal y reali-zar hemocultivos cualitativos. A continuación seextraen pulmones y corazón en un bloque, pro-cediéndose sobre una placa de Petri estéril a laseparación cuidadosa de los pulmones, loscuales se pesan en un balanza de precisión yse homogeneizan (Stomacher Lab-Blender 80,Fisher Sc.) durante 2 min, procediéndose en-tonces a realizar cultivos cuantitativos median-te diluciones seriadas del líquido del homoge-neizado, refiriéndose los resultados como log10

UFC/g de pulmón. Junto a la mortalidad ante-riormente comentada, las variables que se ana-

lizan son el número de pulmones estériles y elaclaramiento bacteriano desde el pulmón.

Grupos de animales pueden ser adscritos parala realización de estudios histopatológicos de lospulmones para comprobar la producción de neu-monía experimental y estudiar la celularidad enel tejido pulmonar. Para ello, los pulmones sinhomogeneizar se fijan en formaldehído al 10 %,incluyéndose posteriormente en parafina, se sec-cionan mediante un microtomo y se realizan lastinciones apropiadas.

Descripción del modelo de neumonía en coba-yas. Otro modelo empleado es el de neumonía encobayas. Se especifican las fases de este mode-lo utilizando igualmente como inóculo A. bau-mannii. Se utilizan animales de 350-400 g depeso. Los animales son anestesiados mediante laadministración de 100 mg/kg de ketamina por víaintraperitoneal y, además, 0,2 ml de lidocaína al2% por vía subcutánea en la región anterior delcuello. La posición del animal una vez anestesia-do debe ser en decúbito supino con la cabeza le-vantada con una inclinación de 30° sobre el pla-no horizontal. Con el cuello hiperextendido serasura la región cervical anterior. Posteriormente,mediante técnica aséptica, se practica una inci-sión en la línea media del cuello de unos 15 mmde longitud, procediéndose a continuación a ladisección por planos hasta lograr la exposición dela tráquea del cobaya.

La infección se realiza a través del espacio en-tre dos anillos traqueales, con aguja de 25 G, ins-tilándose 0,25 ml del inóculo, en 3-4 min, queconsiste en una suspensión concentrada me-diante centrifugación previa de A. baumannii enfase de crecimiento logarítmico (cultivo previo du-rante 4 h en caldo de Mueller-Hinton), mezcladaal 50% con una solución de mucina gástrica por-cina (M-2378; Sigma Chemical Co., St Louis,Mo.) diluida al 10 % en suero salino. El tamañodel inóculo es de aproximadamente 1010 UFC/ml.Posteriormente, se mantiene al animal durante30-45 s en posición vertical para asegurar la co-rrecta distribución del inóculo a través del tejidopulmonar.

Tras la infección, en los diseños para cono-cer la eficacia de distintos antimicrobianos, losanimales son adscritos a diversos grupos de tra-tamiento y grupos controles, con la dosificación,intervalos, tiempo de comienzo del tratamientoy duración de éste que más convenga al experi-mento. Durante éste se anota la mortalidad dela infección durante el tiempo prefijado, tantoen el grupo control como en los animales tra-tados.

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MODELO DE NEUMONÍA

Se pueden realizar extracciones de sangre se-riadamente tras la administración de una dosisde los antimicrobianos para el análisis farmaco-cinético. Para ello, en el animal anestesiadocomo anteriormente se ha especificado, se reali-za una punción cardíaca a través la zona subxi-foidea, extrayéndose 0,5-1 ml de sangre para de-terminar las tasas de antimicrobianos, y secalculan los parámetros farmacocinéticos comose ha mencionado anteriormente. Se utilizan gru-pos de 3 cobayas por cada tiempo de la curvaque se desea obtener, que habitualmente cons-ta de 5 a 8 puntos distintos para poder calculartodas los variables farmacocinéticas.

Tras finalizar el experimento se procede al sa-crificio de los animales para el procesamiento delas muestras tisulares, con una inyección letal depentobarbital intraperitoneal. Con el cobaya endecúbito supino se procede a toracotomía “encoraza”, quedando la línea formada por ambasclavículas y articulaciones esternoclaviculares amodo de bisagra. De esta manera permanecenexpuestos el corazón, los grandes vasos y ambospulmones. Entonces se puede proceder a la ex-tracción de hemocultivos mediante punción in-tracardíaca con aguja de 25 G y aspiración de1 ml de sangre. Posteriormente se realiza la ex-tracción en bloque del corazón, los grandes va-sos y los pulmones. Sobre una gasa o placa dePetri estéril se disecan los tejidos para separar lospulmones íntegramente. Tras pesar los pulmonesse homogeneizan (homogeneizador de tejidos,Stomacher 80) y se realizan cultivos cuantitativos,refiriéndose los resultados como log10 UFC/g depulmón. Como en el modelo de neumonía en ra-tones, las variables que se analizarán son la mor-talidad, el número de pulmones estériles y elaclaramiento bacteriano desde el pulmón.

Modelos de neumonía crónica

Se han desarrollado modelos de infección pul-monar crónica, utilizando un inóculo en el cuallas bacterias son introducidas dentro de glóbulosde agar, con el objetivo de restringir la fagocitosisy así disminuir el aclaramiento bacteriano del pul-món12. Estos modelos fueron descritos original-mente en ratas por Cash et al13, comprobándoseque P. aeruginosa permanecía en los pulmonesde las ratas al menos 35 días, mientras que si lasbacterias se inoculaban en suspensión libre eranaclaradas casi completamente después de3 días. Un modelo de neumonía crónica por P.aeruginosa y Burkholderia cepacia se ha desa-rrollado también en ratones, persistiendo las bac-terias en pulmón a la misma concentración du-

rante 21 días14. De igual manera, se ha descritoun modelo en ratas de infección pulmonar cróni-ca por H. influenzae12, con infección pulmonarhasta 14 días, y con cambios histológicos, asícomo una respuesta inmunitaria humoral eleva-da similar a la encontrada en pacientes con en-fermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)15.Para el modelo de neumonía crónica por P. ae-ruginosa se ha desarrollado un modelo que in-cluye las bacterias en glóbulos de alginato, conlos mismos resultados que utilizando glóbulos deagar16.

Ventajas y limitaciones del modeloexperimental

El modelo de neumonía experimental pertene-ce a los modelos discriminativos, diseñados parasimular la producción de la infección lo más pa-recida a la que ocurre en seres humanos. Comotal, reúne los criterios ideales de los modelos ex-perimentales discriminativos: a) técnica de infec-ción simple; b) microorganismos causantes, rutade entrada, diseminación en el organismo y afec-tación tisular idénticos o muy semejantes a lasituación en humanos; c) gravedad, curso y du-ración de la enfermedad predecibles, reproduci-bles y analizables, y d) capacidad de medir yreproducir la eficacia del tratamiento antimicro-biano17. Desde estos puntos de vista permitenconocer aspectos acerca de la patogenia de laenfermedad, de la farmacocinética y de la tole-rancia y eficacia de diversos antimicrobianos,tanto de los nuevos antimicrobianos como denuevas formas de usar antimicrobianos conoci-dos. Los resultados obtenidos con este modelodiscriminativo permiten diseñar ensayos clínicosen humanos o confirmar observaciones clínicasrealizadas en éstos.

Las limitaciones son las derivadas fundamen-talmente de la diferente farmacocinética de losantimicrobianos en los animales de experimen-tación en relación con los seres humanos. Parasubsanar esta limitación es preciso realizar es-tudios farmacocinéticos en los animales paraconseguir que las concentraciones plasmáticase idealmente las pulmonares sean similares alas alcanzadas en humanos18. Otra limitaciónes que el inóculo bacteriano que se utiliza es di-ferente en tamaño a las microaspiraciones cau-santes de las neumonías en las personas, almenos en los modelos que producen la infec-ción a través de la instilación intratraqueal o in-trabronquial. Por último, los resultados de unexperimento pueden cambiar dependiendo deaparentes alteraciones menores en el diseño,

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como el uso de diferentes cepas, la fase de cre-cimiento y el tamaño del inóculo, la edad y elsexo de los animales, así como la dosis, interva-los y vía de administración de los antimicrobia-nos18. Por todos estos factores, los resultadosde diferentes investigadores pueden variar. Portodo ello, la aplicación directa de los resultadosa las neumonías en seres humanos debe reali-zarse con precaución o hacerlo tras la realiza-ción de los ensayos clínicos.

El modelo experimental y el conocimientode la fisiopatología de la neumonía

La mayoría de los estudios experimentales enel modelo de neumonía, encaminados a conocerla fisiopatología y la patogenia de la neumonía,han girado alrededor de la neumonía neumocó-cica. Streptococcus pneumoniae es un agenteetiológico frecuente, pero el mecanismo de la le-sión tisular que produce no está completamentedilucidado. En un modelo de neumonía neumo-cócica experimental en conejos se comprobó quelas preparaciones de la pared celular eran loscomponentes de S. pneumoniae que producíanla mayor respuesta inflamatoria19. Diversos tra-bajos que han utilizado el modelo de neumoníaexperimental han valorado la importancia de lacitotoxina multifuncional neumolisina, así comode la autolisina. En un modelo de neumonía enratas la inyección de neumolisina recombinanteen el lóbulo apical producía una neumonía cuyagravedad estaba relacionada con la concentra-ción de neumolisina (800 frente a 200 ng). Ade-más, la neumonía era menos grave si se utilizabauna toxina modificada con actividad hemolíticadisminuida, pero no era menor con la inyecciónde neumolisina con capacidad disminuida de ac-tivar el complemento20. En el mismo modelo deneumonía lobar en ratas, la inmunización conadyuvante de Freund y neumolisina, así como laestimulación sólo con adyuvante de Freund, re-dujeron la gravedad de la neumonía causada porinstilación de S. pneumoniae, sin influir en la in-cidencia de bacteriemia21. En otro modelo deneumonía murina, la infección por cepas de S.pneumoniae productoras de neumolisina, com-parada con la producida por cepas deficientes enneumolisina, producía una mayor lesión de la ba-rrera alveolocapilar y una mayor concentraciónde bacterias en pulmón, y contribuía al desarro-llo de bacteriemia. Además, la actividad citotóxi-ca y activadora del complemento de la neumoli-sina pudo contribuir a la lesión pulmonar aguday al desarrollo de la bacteriemia22. Otros autoreshan comprobado, además, que en este modelo

no existían inflamación ni crecimiento bacterianoen los pulmones si las cepas eran deficitarias enautolisina11.

Los modelos de neumonía experimental hanpuesto de manifiesto la compleja interacción en-tre la infección y la respuesta inflamatoria delhuésped, encaminada a controlarla. En un mo-delo de neumonía por L. pneumophila en coba-yas, desarrollado a través de la inhalación de ae-rosoles, se pudo estudiar la respuesta inmunitariacelular y su relación con la resolución de la neu-monía. En el lavado broncoalveolar, durante losprimeros 3 días se comprobó un crecimiento ex-ponencial de bacterias, tiempo a partir del cual lainflamación producida por polimorfonucleares li-mitó el aumento de bacterias, y se siguió de unaumento en el infiltrado por macrófagos, desa-pareciendo las bacterias de los pulmones a los11 días9. Así mismo, en un modelo de neumoníaneumocócica en ratones, se comprobó un au-mento importante de polimorfonucleares, res-pecto de los controles, siguiendo la inoculaciónintrabronquial23. Otros trabajos, en los que se hautilizado una neumonía experimental en perros,han puesto de manifiesto que la opsonización esnecesaria para un aclaramiento adecuado deneumococos del pulmón24.

Sin embargo, el proceso de resolución de laneumonía, tanto en modelos agudos como cróni-cos, resulta complejo. La resolución de la neu-monía bacteriana implica un equilibrio delicadoentre citocinas proinflammatorias y antiinflam-matorias, que influyen en la resolución de la en-fermedad a través de la respuesta inflamatoria yen la localización de ésta una vez que la infecciónestá controlada, respectivamente25. Por ello, laperturbación experimental de la respuesta infla-matoria puede tener tanto efectos beneficiososcomo deletéreos, por lo que es necesario tenercautela en la utilización de medidas immunoad-yuvantes para el tratamiento de la neumonía. Amodo de ejemplos, en un modelo de neumoníaexperimental murina por K. pneumoniae se hademostrado que la administración de G-CSF au-mentaba la mortalidad de la neumonía y la mul-tiplicación bacteriana a través de un efectodirecto sobre la producción del polisacárido cap-sular, que sobrepasan la acción reclutadora y es-timuladora de los leucocitos por el G-CSF26. Encambio, la administración de un anticuerpo mo-noclonal frente a la cápsula de Klebsiella reducíasignificativamente la multiplicación bacteriana yrevertía el aumento de mortalidad inducido por elG-CSF. Por otro lado, en un modelo de neumoníaneumocócica en ratas controles y cirróticas, laadministración de G-CSF disminuía la mortalidad

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MODELO DE NEUMONÍA

en el grupo de ratas controles pero no en las ci-rróticas27.

En otros aspectos, los modelos de neumoníahan contribuido a aclarar la fisiopatología de la hi-poxemia durante el proceso. En un modelo deneumonía neumocócica en perros, la hipoxemiase debía a la suma del defecto de ventilación porla ocupación del espacio aéreo y de la vasodila-tación en la zona del pulmón pobremente venti-lado28, con el efecto shunt consiguiente.

El modelo de infección crónica pulmonar porP. aeruginosa13,14 ha sido utilizado para imitar lainfección por estas bacterias en la fibrosis quísti-ca. Del mismo modo, el modelo de infección pul-monar crónica por H. influenzae presenta cam-bios histológicos similares a los encontrados enpacientes con EPOC15. Estos modelos han sidoútiles para estudiar aspectos relacionados con lavirulencia de las bacterias, la implicación de lasexoenzimas bacterianas en la producción de lalesión pulmonar, la posible utilidad de la vacuna-ción para restringir las exacerbaciones infeccio-sas, la actividad de las concentraciones subinhi-bitorias de antimicrobianos para reducir la lesiónpulmonar a través de la inhibición de la liberaciónde enzimas, y también se ha demostrado que losantiinflamatorios pueden ser efectivos para redu-cir la lesión pulmonar asociada a la inflamación12.

El modelo experimental en el tratamientode la neumonía

El modelo de neumonía experimental descritopor Esposito y Pennington fue utilizado por susautores para la evaluación de la actividad de di-versos antimicrobianos en la neumonía por H. in-fluenzae, comprobándose que todos los trata-mientos disminuían la mortalidad en el mismogrado respecto a los controles no tratados, peroque algunos antimicrobianos eran más activosque otros en el aclaramiento de las bacterias des-de el pulmón6. Desde entonces múltiples estudioshan evaluado la actividad de nuevos antimicrobia-nos o comparado otros ya existentes, para infec-ciones por bacterias frecuentemente productorasde neumonías, con o sin problemas de resisten-cias a antimicrobianos. Entre otros estudios, en laneumonía por H. influenzae se ha evaluado la uti-lidad de enoxacino, ofloxacino y ciprofloxacino encepas susceptibles y resistentes a ampicilina29,30,así como la de ketólidos en desarrollo inicial31.

En la neumonía experimental por P. aerugino-sa se han realizado, entre otros, estudios para va-lorar el tratamiento combinado de betalactámicosmás aminoglucósidos, con resultados en los quese comprueba una mayor eficacia de la combi-

nación32 o un efecto indiferente33. La adición deaerosoles de tobramicina a su administración in-tramuscular aumentó la erradicación bacterioló-gica y disminuyó los fenómenos inflamatorios encobayas34. En el modelo en cobayas, agudo ycrónico, se demostró la eficacia de determinadasfluoroquinolonas, sin que la adición de betalac-támicos o aminoglucósidos aumentara la efica-cia35, y en el modelo agudo en cobayas se obser-vó la eficacia de imipenem y tobramicina36. Enmodelos por otros bacilos gramnegativos no fer-mentadores, el modelo de neumonía por A. bau-mannii en ratones neutropénicos ha permitidocomprobar el efecto postantibiótico de imipenemin vivo37.

La neumonía experimental por S. pneumoniaese ha utilizado desde la emergencia de cepas re-sistentes a penicilina, cefalosporinas y macróli-dos, para la valoración de la actividad in vivo dediferentes antimicrobianos. Así, se ha podido de-mostrar la eficacia de la penicilina en ratas in-munocompetentes para cepas con CMI de2 �g/ml38, de amoxicilina a altas dosis frente acepas con CMI de hasta 4 �g/ml39, aumentán-dose la eficacia de amoxicilina al asociar ácidoclavulánico40. En estudios comparativos con ce-falosporinas, la amoxicilina a altas dosis ha sidomás eficaz que la cefotaxima con una cepa resis-tente a penicilina y cefotaxima (CMI 4 �g/ml)41,mientras que la penicilina a altas dosis ha sidoigual que cefotaxima y cefpiroma utilizando unacepa con CMI de penicilina de 2 �g/ml42. La cef-triaxona, en un modelo de ratón neutropénico, hasido más eficaz que amoxicilina para una cepacon CMI de amoxicilina de 2 �g/ml y sensible aceftriaxona, y que la cefotaxima para una ceparesistente a ambas cefalosporinas (CMI 4 �g/ml),lo que se ha relacionado con un mayor tiempopor encima de la CMI para la ceftriaxona43,44. Elmodelo en cobayas también ha comprobado queel meropenem es igual de eficaz que la amoxici-lina y la cefotaxima usando una cepa de neumo-coco con CMI de penicilina de 1 �g/ml45. Encuanto a tratamientos asociados, la combinaciónde gentamicina y amoxicilina fue más eficaz quela monoterapia con esta última en un modelo deratón neutropénico usando una cepa con CMI deamoxicilina de 4 �g/ml46. Por último, en un mo-delo de neumonía en ratones inmunocompeten-tes y neutropénicos usando diferentes cepas deneumococo, el trovafloxacino fue tan eficaz comoamoxicilina a altas dosis, salvo en cepas resis-tentes y tolerantes, en las que fue superior el tro-vafloxacino; sin embargo, sólo la amoxicilina fueeficaz con una cepa resistente a quinolonas47. Engeneral, todos estos estudios refieren la eficacia

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de las penicilinas a altas dosis, cuando la CMI noexcede los 2-4 �g/ml, con las diferencias deriva-das del tipo de animal, las dosis empleadas y eldiseño del estudio. En modelos de neumoníaneumocócica, la teicoplanina ha sido eficaz enratas inmunocompetentes y neutropénicas38, y lavancomicina en ratas inmunocompetentes42.

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A. PASCUAL: ¿Existe algún modelo experimental deneumonía asociada a ventilación mecánica? Y,en segundo lugar, en vuestro modelo con Aci-netobacter, ¿la tasa de curación espontánea eselevada?

J. PACHÓN: No lo conozco ni he leído sobre la exis-tencia de un modelo con ventilación mecánicaen la bibliografía que he revisado. En cuanto ala segunda pregunta, en el modelo en ratón noexiste curación espontánea; comienza la mor-

DISCUSIÓN

talidad a las 12 h y en el plazo de 72 h es del100%.

A. GIMÉNEZ: Si no he entendido mal, para estudiosde farmacocinética se utiliza la toma de mues-tras por la vía del plexo retroorbitario en el ratóny la punción cardíaca en el cobaya. Según lasnormativas catalanas, no se podrían emplearestas vías si los animales se tuvieran que recu-perar. ¿Vosotros recuperáis estos animales?

J. PACHÓN: No, el animal no se recupera. En elmodelo con ratón hay que sacrificarlo porquelas lesiones que se le han causado harían quesufriera al despertarse. En el cobaya, como seextrae una cantidad de sangre de entre 1,5 y2 ml, preferimos no utilizarlos posteriormenteporque se introduciría una variable distinta.

J. CANTÓ: ¿La elección del modelo de ratónC57BL/6 se debe a que habéis comprobadomejores resultados que con otras líneas de ani-males consanguíneos o incluso no consanguí-neos, o es simplemente una cuestión de dispo-nibilidad? Lo pregunto porque los servicios deexperimentación animal nos encontramos amenudo con el problema del empleo de un de-terminado modelo por parte de un investigadorsin que exista una estricta necesidad de quesea aquél el único modelo a utilizar. En estoscasos se puede complicar considerablementeel funcionamiento de estos servicios.

J. PACHÓN: La elección de este animal obedece ados razones. Por un lado, es el animal con elque aprendemos el modelo y, por otro, se tratade un animal de fácil disponibilidad para noso-tros. Su precio, que es ciertamente elevado, seha conseguido abaratar hasta un 30% graciasa la reciente inauguración de un centro de pro-ducción de animales de experimentación parala Universidad de Sevilla. Sin embargo, proba-blemente con otra cepa de ratón se pueda re-producir igualmente el modelo.

M. CUENCA-ESTRELLA: Una gran parte de la meto-dología que se utiliza en la pulmonía bacterianase emplea también para las aspergilosis pul-monares. La introducción del inóculo de Asper-gillus fumigatus se ha realizado también en elinterior de lentejas de agarosa para intentar cro-nificar la infección, aunque no he leído nada so-bre el empleo de mucina gástrica. ¿Cuál es lajustificación para utilizar mucina gástrica envuestro modelo experimental?

J. PACHÓN: En el modelo de ratón la mucina gás-trica acentúa la mortalidad del animal. Si con elinóculo bacteriano únicamente obteníamos unamortalidad de alrededor del 70%, con la muci-na gástrica, que se utiliza también en el modelode neumonía neumocócica y en modelos intra-

peritoneales de infección sistémica, se obtieneuna mortalidad del 100 %. La mucina pareceser que inicialmente inhibe la fagocitosis, perono cronifica el modelo ni es lesiva por sí misma.Se trata de una sustancia natural y así lo com-probamos en animales a los que inoculamosúnicamente mucina gástrica y observamos quese recuperaban, sin producir ningún tipo de le-sión pulmonar que pudiera explicar su efectosobre la mortalidad. Tampoco aumenta el cre-cimiento de la bacteria in vitro.

J. ARIZA: Sin ser, ni mucho menos, entendido enestos temas, tengo la impresión de que existeuna considerable dispersión de opiniones y re-sultados en este modelo experimental. Despuésde haber oído las exposiciones anteriores y latuya ahora, no sé si realmente los modelos setienen que asemejar el máximo al modelo hu-mano o no. Por un lado, podemos entender quesí, pero por otro, a veces se inducen situacionesextremas para que el modelo sea factible o paraanalizar aspectos concretos que están bastan-te alejados de lo que realmente ocurre en lapráctica clínica. Esta reflexión se puede aplicartambién a la farmacocinética de los antibióticos,dado que en modelos con ratón ésta no tienenada que ver con la farmacocinética humana.Por tanto, es todo una amalgama en la que creoque es casi imposible extraer conclusiones. Talvez convendría uniformizar toda la informaciónalgo confusa que deriva de la bibliografía coneste modelo, o plantearse la elección de otrosmodelos experimentales con menos problemasal respecto. Tal vez la farmacocinética humani-zada en estos ratones podría ser una alternati-va a tener en cuenta.

J. PACHÓN: Ya lo hemos comentado muchas ve-ces y tienes toda la razón en que la dispersiónde resultados es muy importante y a su vez dedifícil justificación. Si bien se trata de una limi-tación del modelo probablemente irresoluble,en mi opinión no invalida las conclusiones quese puedan extraer, ya que los factores que pue-den sesgar los resultados inciden en mayor omenor medida, pero de igual forma, sobre lafarmacocinética de los distintos antimicrobianosen un mismo animal.

V. AUSINA: Abundando en el tema y tratándose deun patógeno encapsulado como el neumococo,considero que un inóculo de 108-1010 aplicadodirectamente a parénquima pulmonar es uninóculo exagerado. ¿Se podría utilizar un inócu-lo menor o la vía de aerosol en este tipo de mo-delo?

J. PACHÓN: En otros modelos de neumonía conneumococo el inóculo puede ser algo inferior

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MODELO DE NEUMONÍA

pero, para cepas resistentes a penicilina, ade-más de un elevado inóculo se requiere utilizarratón neutropénico. Si no recuerdo mal, tam-bién se ha empleado el modelo con rata inmu-nocompetente.

A. PAHISSA: Incidiendo en el tema de la patogenia,hemos hallado que en ratas inmunocompeten-tes el neumococo era totalmente aclarado. Encierta ocasión Claude Carbon nos comentó quetrabajan con ratón neutropénico porque con ra-tón inmunocompetente no pueden reproducirlos efectos patógenos. ¿Sabes si este problemase ha descrito en otros patógenos y si existensustancias para intentar incrementar esta pato-genia?

J. PACHÓN: Todos los trabajos de neumonía neu-mocócica del grupo de Carbon se han realiza-do en animales neutropénicos. En infección porAcinetobacter también ocurre con tipo distintode ratón, en el que tuvieron que inducir neutro-penia para que fuera patógeno. Preferimos em-plear la mucina gástrica porcina para no indu-cir una neutropenia, dado que la mayoría deneumonías por Acinetobacter no ocurren enpacientes neutropénicos.

J. LIÑARES: ¿Utilizáis la cepa de Acinetobacterbaumannii especialmente por sus característi-cas de virulencia o bien cualquier cepa con lamucina gástrica es capaz de producir la neu-monía?

J. PACHÓN: En este momento estamos trabajandocon un modelo en cobaya para estudiar los an-timicrobianos que no se pueden utilizar en elratón y empleamos dos cepas diferentes de Aci-netobacter que producen igualmente neu-monía.

J. GAVALDÀ: El comentario de Javier Ariza es la crí-tica que, con una gran racionalidad, se hacehabitualmente a los modelos experimentales deenfermedades infecciosas. Un ejemplo claro dela disparidad de protocolos es el modelo deneumonía. A mi entender, creo que hay que di-ferenciar dos tipos de estudios: el estudio de

farmacodinamia y el estudio de eficacia tera-péutica. En el estudio de farmacodinamia seutiliza una gran diversidad de dosis, porque loque se pretende estudiar básicamente son lospatrones de eficacia de los diferentes antibióti-cos, o por qué un antibiótico es más eficaz queotro. En el estudio de la eficacia terapéuticacomparto contigo la opinión de que deberíanexistir unos requerimientos mínimos de farma-cocinética deseables: la concentración máximadel antibiótico debería ser la misma que en hu-manos a la dosis habitual utilizada y, además,sería recomendable que el intervalo de dosifi-cación se acercara al máximo a su relación conla semivida del fármaco. Por ejemplo, en nues-tro estudio de neumonía por neumococo alta-mente resistente en rata pudimos comprobar ladiferencia de eficacia entre vancomicina y be-talactámicos porque éstos se administrabancada 2-3 h y la vancomicina, por su semividaen la rata, se debía administrar cada 8 h. Éstesería uno de los puntos a tener en cuenta, so-bre todo cuando se comparan antibióticos dediferentes familias. Por otro lado y enlazandocon la pregunta de Vicenç Ausina sobre el temadel inóculo, se cree que todo es “aceptable” sila evolución y las características histológicas dela enfermedad en el animal se parecen al máxi-mo a lo que ocurre en humanos. Por tanto, esevidente que debemos utilizar inóculos más al-tos por lo que decíamos antes de que la inmu-nidad en los animales es mucho mayor y, si no,no habría manera de reproducir la infección enel animal. Para finalizar, me gustaría comentarque en el seno del grupo europeo de modelosexperimentales de infección existe una pro-puesta de intentar sentar unas bases o requisi-tos mínimos a cumplir los diferentes modelosanimales existentes, con el fin de que los estu-dios sean comparables entre sí y para que seanaceptados por las respectivas agencias del me-dicamento en la obtención de los registros denuevos fármacos.

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RESUMEN

El conocimiento de la fisiopatología, prevencióny tratamiento de las infecciones protésicas nece-sita del concurso de modelos animales de infec-ción en los que se puedan controlar las diversasvariables que influyen en la interacción múltipleentre el material extraño, el organismo infectante,el antimicrobiano y el ser humano. Estos modelosdeben completarse con estudios ex vivo que ana-licen el comportamiento del agente infectante enpresencia del cuerpo extraño, puesto que las ha-bituales correlaciones entre los parámetros far-macocinéticos y la eficacia de los antibióticos invivo no se mantienen cuando existe un cuerpo ex-traño. De todos los modelos, por su simpleza, bajocoste económico y reproducibilidad, el de la cáp-sula subcutánea ha sido el más utilizado. No obs-tante, la aplicabilidad de sus resultados a la clíni-ca sólo es factible si se emplean animales conmecanismos inmunológicos y de cicatrización se-mejantes a los humanos, si se tienen en cuentalas diferencias farmacocinéticas entre especies ysi la propensión a la infección es similar.

Palabras clave:Modelo experimental. Cuerpo extraño. Profilaxis.

Introducción

En las últimas décadas, el avance de la medi-cina ha comportado un uso cada vez más fre-cuente de materiales ajenos al organismo para lacolocación de todo tipo de prótesis mecánicas,plastias reconstructivas, catéteres y sondas, en-tre otros dispositivos no biológicos1. Esto ha sig-nificado recuperar la funcionalidad de diferentessistemas y órganos lesionados, pero ha generado

una no despreciable morbimortalidad asociada,debido principalmente a la aparición de compli-caciones infecciosas2,3.

Se calcula que entre un 0 y un 7% de las pró-tesis cardíacas, entre un 0,2 y un 0,4 % de lasprótesis totales de cadera, entre un 2 y un 24%de los shunts derivativos de líquido cefalorraquí-deo, entre un 4 y un 8 % de los catéteres intra-peritoneales y entre un 0,2 y un 10% de los ca-téteres intravasculares se infectan. La infección

FOREIGN BODY INFECTION MODEL

Animal models of foreign body infection are ne-cessary to study the in vivo interactions betweenprosthetic materials, microorganisms and anti-biotics.

The usual correlations between pharmacoki-netic parameters and the effect of antibiotics invivo seem not to hold when a foreign body is pre-sent. Since, the animal experimentation shouldbe completed with in vitro studies taking accountof the interactions between microorganisms andbiomaterials.

Af all models decribed, the tissue cage modelis the most useful for its reproducibility and loweconomic cost. However, to apply its results inhuman pathology needs that the immunologicmechanisms, healing characteristics and phar-macokinetics parameters of animals employedwere similar to humans.

Key words:Experimental model. Foreign body. Prophylaxis.

Modelo de infecciones por cuerpo extrañoJosep Anton Capdevilaa,*, Álvaro Pascualb y Antonio Sitges-Serrac

aServicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital Universitari de la Vall d’Hebron. Barcelona. bDepartamento de Microbiología.Facultad de Medicina. Sevilla. cDepartamento de Cirugía. Hospital del Mar. Barcelona.

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de la prótesis suele comportar la pérdida de sufunción mecánica y en ocasiones pone en peligrola integridad anatómica y la vida del paciente4,5.

Las infecciones debidas a contaminación delmaterial protésico tienen algunas característicascomunes: a) un bajo inóculo inicial de microor-ganismos6; b) una evolución clínica solapada7;c) la localización de la infección exclusivamenteen la zona afectada8, y d) la persistencia de la in-fección hasta la retirada del cuerpo extraño a pe-sar de un tratamiento antibiótico adecuado.

Estas características diferenciales y la necesi-dad de conocer la fisiopatología de las infeccio-nes de cuerpo extraño han motivado el desarro-llo de diversas líneas de investigacion sobrediferentes modelos experimentales de infección9.

Dado que no todas las prótesis, ni todos los di-ferentes materiales empleados en su construc-ción, presentan la misma propensión a infectar-se, y teniendo en cuenta las peculiaridadespropias de cada paciente con diferentes enfer-medades de base10,11, y las diversas localizacio-nes anatómicas de las protésis, es comprensibleque se hayan desarrollado múltiples modelos deinfección en el animal de experimentación9.

Como característica común y diferencial de losmodelos de infección por cuerpo extraño, se en-cuentra el hecho de que en los mismos existeuna nueva variable a estudio, como es la inter-acción mecánica y biológica que se produce en-tre el material protésico y el ser vivo. En otrosmodelos de infección se estudia la relación en-tre el microorganismo infectante y el animal. Sinembargo, cuando existe un cuerpo extraño in-fectado, hay que tener en cuenta cómo modificala presencia de este material ajeno, tanto el com-portamiento defensivo del hospedador como lavirulencia del agente infectante12,13. Los mode-los animales de infección por cuerpo extrañopermiten analizar los cambios fisiopatológicosproducidos como consecuencia de la presenciadel material ajeno al organismo y efectuar estu-dios de profilaxis y tratamiento de infecciones enpresencia de este material. Además, los estudiosin vitro de sensibilidad antibiótica, farmacociné-tica y farmacodinamia que apoyan el modelo ex-perimental deben realizarse teniendo en cuentalas modificaciones de las condiciones biológicashabituales debidas a la presencia del materialextraño.

En esta revisión se expondrán los modelos deinfección por cuerpo extraño que históricamentehan sido más relevantes, nos centraremos en lasaportaciones del modelo de la “cápsula subcutá-nea” (tissue cage) y, finalmente, se expondrá unmodelo de infección de catéter intravascular.

Modelos históricos de infección por cuerpoextraño

La historia de esta línea de investigación va pa-ralela a la introducción del material plástico enmedicina14, desde su uso inicial como sutura encirugía general, a la progresiva utilización más es-pecializada en cirugía vascular, cardíaca, ortopé-dica y neurocirugía.

Modelo de sutura

Éste es un modelo sencillo que simula la infec-ción de herida quirúrgica. Se ha aplicado con di-ferentes materiales de sutura, tanto en el ratón,como en el perro y el cobaya. Se basa en el con-cepto general de que el aumento de la propensióna la infección a causa de la presencia de un ma-terial extraño se debe a la reacción inflamatoriaprevia que causa este material15,16. Existen dife-rencias entre los diversos experimentos en cuantoal inóculo y el momento de producir la infección.

Este modelo ha contribuido a conocer mejorlos factores de riesgo y la prevención de la infec-ción de herida quirúrgica: las suturas monofila-mento se infectan menos que las trenzadas, lassuturas sintéticas no absorbibles (nailon o poli-propileno) favorecen menos la infección que losmateriales naturales no absorbibles (seda o algo-dón) y las suturas sintéticas absorbibles (ácidopoliglicólico) potencian menos la infección quelos materiales naturales absorbibles como el cat-gut. Los modelos de infección de herida quirúrgi-ca han sido, así mismo, muy útiles para el estu-dio de las mallas protésicas muy utilizadas encirugía general.

Modelo de injerto vascular

Es un modelo que requiere de una compleji-dad quirúrgica no despreciable. El perro es el ani-mal utilizado habitualmente en estos experimen-tos17, tanto por consideraciones anatómicascomo por su semejanza con los humanos encuanto a las características de cicatrización de losinjertos vasculares18. Otros animales propuestos,como el cerdo, el ternero y el mandril, presentanla característica diferencial con los humanos deque endotelizan la prótesis rápidamente. Por elcontrario, el perro tiene el inconveniente de pre-sentar frecuentemente bacteriemias que su sis-tema reticuloendotelial no aclara y, por tanto, unamayor facilidad para la infección espontánea delos implantes vasculares19.

Este modelo ha permitido analizar aspectoscomo las características de la cicatrización18, la

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influencia de la integridad de la falsa íntima en lapredisposición a la infección19, la influencia deltipo de material, del inóculo y del intervalo post-operatorio en el desarrollo de la infección20, el pa-pel de la colonización por vía hematógena19,21, di-versas complicaciones clínicas y problemasdiagnósticos22,23 y el papel de la profilaxis y de di-ferentes pautas antibióticas terapéuticas22.

Modelo de endocarditis protésica

Los modelos de endocarditis producidos a par-tir de la lesión valvular causada por un catéter se-rán objeto de otro artículo de esta monografía. Lasustitución valvular cardíaca por prótesis mecá-nicas o biológicas susceptibles de infectarse pre-cisa de modelos experimentales complejos.

Grogan et al24 desarrollaron en 1980 un mo-delo de endocarditis protésica tricúspide utili-zando el ternero como animal de experimenta-ción. En el modelo de endocarditis precoz, lainfección se produce en el mismo acto opera-torio, inyectando entre 102 y 103 unidades for-madoras de colonias (UFC)/ml de Staphyloccusaureus en el anillo de anclaje de la prótesis. Enel modelo tardío, se administra un inóculo su-perior a 107 UFC/ml por vía hematógena, lo-grándose un 100 % de infecciones. Éste es unmodelo caro y difícil de realizar, pero permiteestudiar la fisiopatología de la endocarditis pro-tésica, comparar la calidad de diferentes mate-riales, valorar pautas de tratamiento y profila-xis, a la vez que observar la interacción entre lasangre y la superficie protésica.

Modelo de rodilla protésica

Existen diferentes modelos difíciles de extra-polar en humanos, pero que en conjunto aportandatos sobre la conveniencia de ciertos materia-les, cementos antibióticos y otros tipos de profi-laxis25,26.

Modelo de infección de cuerpo extrañointraperitoneal

Este modelo consiste en insertar, dentro de lacavidad peritoneal de la rata, uno o varios frag-mentos de plástico, habitualmente catéteres desilicona de un diámetro de 0,9 cm y una longitudde 1,5 cm27. La infección se provoca instilandodentro de la cavidad peritoneal 1 ml de una sus-pensión salina que contiene Staphylococcusaureus, a los 10-15 min de la intervención. Se-guidamente, a varios intervalos de tiempo, losanimales son sometidos a repetidos lavados pe-

ritoneales bajo anestesia. El líquido aspirado escultivado cuantitativamente. Finalmente, el ani-mal es sacrificado y se realizan hemocultivos,cultivo del absceso peritoneal pericatéter y culti-vo cuantitativo del lavado del catéter tras su sus-pensión en 1 ml de suero salino y posterior agita-ción en vórtex durante 10 s.

La infectividad depende del inóculo. Con inó-culos bajos, la rata es capaz de eliminar la bacte-ria de la cavidad peritoneal al cabo de 72 h. Inó-culos de 5 × 108 UFC/ml de S. aureus causanuna elevada mortalidad, por lo que el inóculo es-tándar utilizado es de 5 × 106 UFC/ml.

Este modelo permite realizar experimentos deprofilaxis y tratamiento. En los estudios terapéu-ticos se comprueba de nuevo la persistenciade la infección en el cuerpo extraño a pesar deobtener una concentración de antibiótico en elfoco infeccioso superior en tres-cuatro veces laconcentración mínima inhibitoria (CMI) del mi-croorganismo. Se demuestra una vez más queno existe una correlación directa entre los pa-rámetros farmacocinéticos y el efecto in vivo dela meticilina y la gentamicina en las infeccio-nes por cuerpo extraño. La presencia del bio-film puede proteger a la bacteria de la acciónlos antibióticos28.

Modelo de la cápsula subcutánea

Es un modelo sencillo consistente en la im-plantación quirúrgica de un tubo de plástico enel tejido subcutáneo del animal29-31. Se han utili-zado cilindros de plexiglás (polimetilmetacrilato)o de Teflón (tetrafluoroetileno) con un diámetroexterno entre 10 y 12 mm, y una longitud aproxi-mada de 30 mm. Estos cilindros deben estar per-forados en toda su superficie por agujeros de1 mm de diámetro distribuidos de forma regular.La técnica quirúrgica es muy simple. Consiste enimplantar en el flanco del animal de experimen-tación (conejos, perros o ratas) el cilindro de plás-tico. Tras anestesiar al animal y rasurar la zona autilizar, se realiza una incisión con técnica esté-ril. Se diseca la grasa subcutánea creando unacavidad para alojar la cápsula. Una vez colocadoel cilindro, se sutura la piel. Se pueden implantaruno o varios cilindros por animal.

Como reacción inflamatoria a cuerpo extraño,el organismo secreta líquido intersticial que seacumula en el interior del cilindro32. La presen-cia de los agujeros permite realizar aspiracionesperiódicas de este líquido, analizar su compo-sición bioquímica y celular a lo largo del tiempo,producir infecciones instilando inóculos en suinterior y estudiar la farmacocinética tisular de

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MODELO DE INFECCIONES POR CUERPO EXTRAÑO

los antibióticos administrados por vía sistémica.Hay que tener la precaución de rasurar y esteri-lizar la piel que se va a puncionar para evitarcontaminaciones indeseadas del contenido dela cápsula.

Los experimentos deben iniciarse al cabo de2 semanas de la intervención para permitir la for-mación de un tejido de granulación estéril y laacumulación de exudado inflamatorio en el inte-rior de la cápsula.

Zimmerli et al9,29 han descrito la composicióndel líquido acumulado en el interior de la cápsu-la a lo largo del tiempo (desde 15 a 86 días). Paracompletar los estudios farmacocinéticos o paradisponer de una referencia plasmática se realizanpunciones cardíacas.

Aportaciones del modelo de la cápsulasubcutánea

Estudios de la fisiopatología de la reacción infla-matoria frente a un cuerpo extraño. Ya han sidocomentados.

Estudios de farmacocinética y distribución tisularde antibióticos aplicables para ensayos de profi-laxis y terapéutica33-38. Se ha estudiado el papelde la rifampicina, vancomicina, penicilinas isoxa-zólicas, cefalosporinas y otros antibióticos, comoprofilaxis y tratamiento de la infección protésicapor S. aureus y S. epidermidis. La evaluación delos resultados se realiza mediante cultivo cuanti-tativo del exudado aspirado del interior de la cáp-sula y la valoración de la infección “adherida” alplástico, mediante cultivo del material extrañotras su exéresis. El procesamiento de la cápsulaincluye su sonicado tras lavado y aspiración delcontenido, siendo opcional un tratamiento adi-cional con tripsina con la finalidad de obtener elmayor número posible de bacterias adheridas y/oincluidas en el tejido de granulación39. El análisisperiódico del líquido del interior de la cápsulapermite monitorizar la infección y las concentra-ciones antibióticas en el foco infeccioso. Estos ex-perimentos han permitido comprobar cómo la in-fección de la cápsula persiste a pesar de laesterilización de su contenido. Además, las bac-terias recuperadas tras el cultivo de la cápsula tu-vieron un aumento considerable de su concen-tración mínima bactericida (CMB).

Estudios del riesgo de colonización por vía hema-tógena de las prótesis extravasculares26. Estos ex-perimentos consisten en provocar una bacteriemiaal animal portador de una cápsula subcutánea yanalizar la posterior infección de la misma. Estos

estudios sugieren la utilidad de la profilaxis anti-biótica en pacientes con material protésico extra-vascular que van a ser sometidos a procedimien-tos invasivos con riesgo de bacteriemia.

Estudios de la biocompatibilidad y facilidad a lainfección de diferentes materiales40. Consiste encomparar el grado de inflamación y la propensióna la infección entre varias cápsulas fabricadascon materiales diferentes. Las cápsulas de cerá-mica producen una mayor inflamación que lasde Teflón, y son 10 veces más susceptibles a lainfección.

El modelo de infección de la cápsula subcutá-nea es muy sencillo, económico y de fácil aplica-bilidad. No obstante, presenta varios inconve-nientes a la hora de extrapolar los resultadosobtenidos a los humanos. En primer lugar, losmecanismos inflamatorios defensivos no soncompletamente iguales entre especies18. En estesentido, para experimentos que valoran la pre-disposición a la infección debido a la presenciade un cuerpo extraño, se prefiere utilizar el coba-ya12,13,25. Para experimentos de farmacocinéticaantibiótica este animal no es apropiado.

Además, este modelo no tiene en cuenta lasposibles interacciones mecánicas y biológicasque se producen cuando la prótesis está coloca-da en el interior del torrente sanguíneo o realizauna función dinámica.

Modelo de infección de catéter intravascular

La infección por catéter intravascular es unade las principales causas de infección nosoco-mial que va en aumento debido al mayor uso quese hace a diario de los catéteres tanto para finesdiagnósticos como terapéuticos41,42. La infecciónpor catéter comporta un considerable morbimor-talidad y un incremento del gasto sanitario nodespreciable. En España se calcula que una bac-teriemia por catéter representa un coste adicio-nal de medio millón de pesetas43.

La prevención de esta infección es el objetivo aalcanzar. En este sentido, existen una serie de nor-mas bien establecidas para el manejo de los caté-teres con la finalidad de minimizar el riesgo de in-fección44. Paralelamente, se han diseñado diversasestrategias en cuanto a la manufactura, diseño ycomposición de los catéteres que tratan de dificul-tar la colonización y posterior desarrollo de la in-fección45-48.

Los microorganismos anidan en la vaina de fi-brina que se forma en el extremo distal del caté-ter. Las bacterias alcanzan esta situación mayori-tariamente por progresión endoluminal a partir de

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contaminaciones iniciales de la conexión, o pormigración exoluminal pericatéter a partir de lapiel49-51. El conocimiento de esta fisiopatología esesencial a la hora de diseñar estrategias de diag-nóstico y prevención de la infección de catéter.

El tratamiento de la bacteriemia por catéter im-plicaba la retirada sistemática del cuerpo extrañoinfectado para curar la infección. No obstante, enlos últimos años se ha comprobado que no siem-pre es imprescindible retirar el catéter para curarla infección42,52. Este planteamiento conservadores de gran interés en los pacientes que precisanmantener la vía, como son los pacientes con nu-trición parenteral domiciliaria, los sometidos a he-modiálisis periódica o los pacientes oncohemato-lógicos.

El tratamiento de la sepsis por catéter mante-niendo el catéter tiene por objetivos tratar la bac-teriemia y esterilizar el catéter52,53. Basándose enlos conocimientos adquiridos sobre la dificultadde erradicar los microorganismos adheridos a lassuperficies de plástico28, el éxito en la esteriliza-ción del catéter dependerá de que seamos capa-ces de exponer el microorganismo causal a con-centraciones elevadas de antibiótico durante unperíodo prolongado de tiempo. Estos dos objeti-vos pueden conseguirse con el antibiotic-lock53.Esta forma de administrar el antibiótico consisteen llenar y cerrar el catéter con el fármaco de-seado por el período de tiempo en que el catéterno va a ser utilizado. Con esta estrategia se con-sigue una elevada eficacia local sin toxicidadessistémicas. No obstante, quedan varios puntospor aclarar, como: ¿qué papel tiene la heparinacomo fármaco adyuvante en la erradicación de lainfección?, ¿cuál es el mejor antibiótico a utilizar?,¿cuál debe ser la duración del antibiotic-lock?,¿pueden tratarse de esta manera todos los mi-croorganismos?, ¿es independiente la eficacia te-rapéutica de la composición química del catéter?,entre otros.

Éstos y otros interrogantes han motivado el de-sarrollo de un modelo experimental que sirva debanco de pruebas. En este sentido existen mo-delos ex vivo54 que permiten analizar algunoscomponentes de la infección de catéter, pero queno tienen en cuenta los mecanismos defensivosdel huésped ni el efecto del flujo vascular sobrela patogenia de esta infección.

Descripción de un modelo animal de infecciónde catéter

En la bibliografía existen escasos trabajos enlos que se haya utilizado un modelo animal desepsis por catéter. Además, los animales utiliza-

dos son de diferentes especies, los catéteres di-fieren en cuanto a su composición y los microor-ganismos utilizados son distintos54-56.

Sitges-Serra et al diseñaron un modelo de sep-sis por catéter en el conejo54,55. En este modelola infección se establece a partir de producir unacontaminación del interior de la conexión.

En nuestro laboratorio hemos desarrollado unmodelo similar de sepsis por catéter en el quela infección se consigue mediante el relleno delcatéter con un caldo de cultivo que contiene elinóculo bacteriano (mecanismo fisiopatológicoendoluminal). El modelo consiste en colocarmediante disección anatómica, un catéter desilastic en la vena yugular externa del conejo,cuyo extremo distal se aloja en la vena cava in-ferior.

1. Estandarización del modelo

Se utilizan conejos machos blancos Nueva Ze-landa con un peso aproximado entre 2 y 2,1 kg,a los que se coloca un catéter venoso central desilicona (Vygon 1,2 mm interio/2,00 mm exte-rior) por vía yugular.

a) Inserción del catéter

La técnica consiste en disecar la vena yugularderecha tras anestesia general (inyección i.m. de5 mg/kg de ketamina y 1 mg/kg de xilacina). Poruna pequeña incisión en la zona lateral del cue-llo se pone a plano la vena yugular común y seaísla de la circulación venosa mediante ligaduraproximal (seda 000). A través de una pequeña in-cisión se coloca el catéter, avanzando en direc-ción distal 8 cm hasta alojarse en la vena cavainferior. El catéter se fija a la vena yugular. Poste-riormente el catéter se tuneliza a través del tejidosubcutáneo del animal, exteriorizándolo en la re-gión dorsal. De este modo se consigue una me-jor fijación del catéter, lo que dificulta el accesodel animal al mismo. Durante todo el proceso deinserción del catéter, éste está cebado con suerofisiológico para evitar aspiraciones gaseosas y laformación de trombos. La técnica de insercióndel catéter se efectuará en un quirófano de ciru-gía experimental con la máxima asepsia, tenien-do especial cuidado en la esterilidad del catéter yen la desinfección de la piel en el punto de en-trada del catéter.

b) Producción de la sepsis por catéter

Inmediatamente tras la inserción el catéter seprocederá a su infección. La técnica consistirá en

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cebar el catéter con 0,5 ml de caldo Mueller-Hin-ton que contenga 108 UFC/ml de S. aureus. Estasolución se deja en contacto con el catéter du-rante 18 h, momento en el que se retira, se com-prueba la infección del catéter mediante la prác-tica de hemocultivos cuantitativos57 (transcatétery periféricos), y se inician las pautas terapéuticas.

2. Evaluación de los resultados

Para la evaluación de los resultados en estemodelo de sepsis por catéter y poder efectuarcomparaciones entre el grupo control y los diver-sos grupos terapéuticos realizamos las siguientestécnicas microbiológicas:

a) Hemocultivos cuantitativos (técnica deShöttmueller) pretratamiento57.

b) Hemocultivos cuantitativos (técnica deShöttmueller) presacrificio.

c) Cultivo de la superficie exoluminal del caté-ter (2 cm distales) sobre una placa de agar (téc-nica de Maki58). Se considera un resultado posi-tivo si el recuento de UFC es superior a 14.

d) Cultivo de la superficie endoluminal del ca-téter mediante cultivo cuantitativo del lavado delinterior del catéter con 2 ml de caldo de Mue-ller-Hinton (técnica de Liñares modificada50).

e) Cultivo cuantitativo global del catéter trassonicado del mismo en un baño con caldo deMueller-Hinton a 50 Hz durante 10 min (técnicade Sheretz modificada59).

Los resultados de las técnicas cuantitativas seexpresan como el logaritmo decimal del númerode UFC/ml. En la tabla I se exponen los resulta-dos obtenidos a las 18 y a las 48 h de la infec-ción. El modelo a las 18 h presenta una menormortalidad y, como el nivel de infección alcanza-do es similar al obtenido a las 48 h, hemos deci-

dido utilizar este modelo de infección a las 18 hpara nuestros estudios terapéuticos.

Este modelo de infección de catéter por S. au-reus ha permitido estudiar hasta la fecha algunode estos puntos: el papel de la heparina y suinteracción in vivo con los antibióticos en el tra-tamiento local del catéter infectado60, valorar laeficacia de diversas pautas terapéuticas admi-nistradas localmente mediante la técnica del an-tibiotic-lock y evaluar la aparición de resistenciascuando se administra rifampicina a dosis eleva-das (3.000 �g/ml) durante diversos intervalos detiempo61.

Ensayos in vitro predictores de la eficaciaantibiótica en las infecciones relacionadascon cuerpo extraño

La elección de un tratamiento antibiótico sebasa en su actividad in vitro (CMI) y en sus ca-racterísticas farmacocinéticas. En el tratamientode una infección protésica estos condicionantesno son suficientes, puesto que frecuentemente lainfección persiste a pesar de un tratamiento apro-piado durante un tiempo prolongado. Por tanto,es necesario realizar tests in vitro que prediganmejor la evolución del tratamiento antibiótico, te-niendo en cuenta lo que sucede habitualmenteen las infecciones de cuerpo extraño. En esta si-tuación, las bacterias se hallan en una fase esta-cionaria de crecimiento62, con lo que su sensibi-lidad frente a los antibióticos es menor, y ademásestán adheridas al plástico, y englobadas en unmagma de fibrina y tejido de granulación que di-ficulta la actividad de los antibióticos62,63. Los es-tafilococos pueden secretar además una sustan-cia mucoide, glicocálix o slime, que los envuelveobstaculizando aún más la acción de los antimi-crobianos. La simple determinación de la CMI no

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TABLA IRESULTADOS DE LA ESTANDARIZACIÓN DE UN MODELO IN VIVO DE INFECCIÓN

DE CATÉTER. INFECCIÓN ENDOLUMINAL CON 0,7 ml DE UNA SUSPENSIÓN DE S. AUREUS A 108 UFC/ml

Tiempoa Muertos/total Rodajeb HCC/HCPc Lavadod Sonicadoe

18 0/10 10/10 10/10 4,1 ± 1,2 4,5 ± 1,148 2/10 8/8 8/8 4,0 ± 1,5 4,1 ± 1,3UFC: unidades formadoras de colonias.aTiempo en horas desde la infección al sacrificio.bTécnica de Maki; número de positivos (> 100 UFC/ml)/número total.cNúmero de UFC/ml en el hemocultivo cuantitativo transcatéter (HCC) dividido por el número de UFC/mlen el hemocultivo cuantitativo periférico (HCP) superior a cuatro veces.dResultado expresado como media ± desviación estándar del logaritmo decimal del número total de UFCrecuperadas.

predice la evolución de la infección de un cuer-po extraño, donde las bacterias están en fase es-tacionaria y adheridas.

En este sentido, es interesante la aportación deRamírez de Arellano et al64 sobre la actividad delos antimicrobianos sobre biocapas de bacteriasadheridas a catéteres de plástico. El método con-siste, esencialmente, en la formación de bioca-pas de Staphyloccus epidermidis sobre catéteresde polivinilo. Para ello se desarrollan las biocapasen condiciones estáticas, incubando 50 seg-mentos de catéter en tubos que contienen 50 mlde caldo de Mueller-Hinton inoculado con S. epi-dermidis (105 UFC/ml). Los segmentos de caté-teres se incuban 6,24 y 48 h a 37 °C.

El número de bacterias adheridas durantecada período de incubación se determina lavan-do tres veces un segmento de catéter con tam-pón fosfato frío (phosphate buffer sodium [PBS])y estéril (pH = 7,2-7,4). Posteriormente se depo-sita cada segmento en un tubo que contiene 2 mde PBS, se sonica durante 1 min en un baño desonicación a 45 kHz (Ultrasons, Selecta), y seagita en vórtex durante 15 s. A continuación sediluye el contenido del tubo y se siembran 10 �len placa de agar de Mueller-Hinton para el re-cuento tras la incubación durante 24 h a 37 °C.

Simultáneamente, se determina la CMI de lascepas por el método de microdilución utilizandodos tipos de inóculos: bacterias adheridas a seg-mentos de cloruro de polivinilo (PVC) y bacteriasen suspensión. En el primer caso, el inóculo uti-lizado fueron catéteres de polivinilo sobre los quese había formado una biocapa. Transcurrido elperíodo de adherencia se lavan los segmentos depolivinilo dos veces en PBS frío y estéril, y se de-positan en los pocillos de la placa de microdilu-ción que previamente se han preparado con cal-do de Mueller-Hinton suplementado con cationesy diferentes diluciones de antimicrobianos. Para-lelamente se determina la CMI de los antimicro-bianos para las bacterias en suspensión siguien-do la normativa del National Committee forClinical Laboratory Standards (NCCLS). En estecaso se utiliza un inóculo bacteriano similar al nú-mero de bacterias que se adhieren a los seg-mentos de polivinilo. Se considera la CMI de labiocapa bacteriana como la menor concentra-ción de antimicrobiano que inhibe el crecimien-to visible macroscópicamente en el pocillo. Paradeterminar la CMB de la biocapa bacteriana, selavan dos veces con PBS los segmentos de caté-ter de los pocillos en los que no había crecimien-to visible, se sonica y se agita en vórtex cada unode los segmentos. Finalmente, se siembran 10 �len placa de agar de Mueller-Hinton para su re-

cuento. La CMB se define como la menor con-centración de antimicrobiano capaz de acabarcon el 99,9% del inóculo inicial.

Con esta metódica, Ramírez de Arellano et al64

comprueban que las biocapas bacterianas sobrepolivinilo son más resistentes a la actividad bac-tericida de los antimicrobianos, y cómo sólo de-terminadas asociaciones de antibióticos son ca-paces de esterilizar la superficie del biomaterial.La producción de slime no es el único mecanis-mo implicado61-65. Con una metodología similarse ha observado que la CMI de determinados an-timicrobianos (carbapenémicos) frente a bacilosgramnegativos se incrementa extraordinariamen-te en presencia de determinados plásticos (látexsiliconizado). Este fenómeno se debe a alteracio-nes en las proteínas de la membrana externabacteriana (porinas) inducidas por alguno de loscomponentes del biomaterial plástico aún por de-terminar66.

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E.M. TARGARONA: Como cirujano interesado en lainfección quirúrgica, me gustaría introducir dosprecisiones desde el punto de vista de la prác-tica clínica. Una se refiere a la clasificación delos modelos de infección por cuerpo extraño;habitualmente nosotros separamos claramentelas prótesis subcutáneas u óseas, sea una pró-tesis de rodilla, una placa, una malla para sus-titución de la pared abdominal, donde el pro-blema es la contaminación peroperatoria, de loque son los cuerpos extraños intravasculares,como puede ser un catéter, donde existe una fi-siopatología propia derivada de su manipula-ción para la perfusión parenteral. La segundaprecisión que me gustaría incluir hace referen-cia al creciente interés en los últimos años porla utilización de mallas sintéticas con el fin depaliar el problema de la infección quirúrgica.Esto ha conllevado la realización de numerososestudios para valorar tanto la integración tisularde estos biomateriales como la prevención deinfecciones, mediante la adición de diferentessoluciones, como por ejemplo de sales argénti-cas, a la constitución de la malla. Se trata de da-tos con directa aplicación clínica y que se ba-san en modelos experimentales que han sidode mucha utilidad y a su vez técnicamente muysencillos.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: ¿Cómo se consigue estan-darizar el inóculo adherido al catéter vascular?

J.A. CAPDEVILA: Se incuban pedazos de catétercon un caldo de cultivo y se dejan a diferentesintervalos de 16, 24 o 48 h. Nosotros lo efec-tuamos a las 24 h, posteriormente se lavan contampón fosfato y se sonica el catéter para obte-ner el inóculo de bacterias adheridas a éste. Eldía del experimento disponemos de esta infor-mación previa y sabemos el número de bacte-rias que tendremos adheridas al catéter. Unavez lavado el trozo de catéter obtenemos la CMI.

A. PASCUAL: Me gustaría resaltar la importanciaque tienen aquí los estudios in vitro, particular-mente si los comparamos con otros modelosexperimentales de infección. Si nos fijamos enlos estándares que tiene que cumplir cualquiermaterial que se va a utilizar en biomedicina, esdecir, la realización de estudios exhaustivos debiocompatibilidad, de citotoxicidad, etc., es, sinembargo, curiosa la inexistencia de pruebas deadherencia bacteriana o de pruebas de inte-racción con los mecanismos de defensa, a pe-sar de que la infección es la complicación másfrecuente y costosa del uso de estos materiales.A menudo la importancia del material emplea-

do se deja un poco en segundo plano, cuandolas diferencias entre un tipo de material y otroson importantes. En el mundo de la ortopedia,por ejemplo, las bacterias en general se adhie-ren mucho más al acero inoxidable que a cual-quier otra aleación de titanio u otro metal. En elplástico, en general, los bacilos gramnegativosse adhieren muchísimo más a un látex siliconi-zado que a un poliuretano o PVC. Incluso algu-nos materiales per se son tóxicos para la fun-ción del propio sistema inmune, como es elcaso del látex siliconizado o el acero inoxidableque alteran la función bactericida de los poli-morfonucleares. Y, finalmente, un aspecto no-vedoso que nos hemos encontrado en parte porcasualidad, es la existencia de algunas bacte-rias, concretamente Pseudomonas aeruginosa,que al estar en contacto con sondas urinariasde látex se hacen resistentes a determinadosantibióticos. No me refiero ya al aumento deCMB, sino que la CMI, concretamente de car-bapenémicos, aumenta 16 o 32 veces. Pareceser que la bacteria adquiere resistencia por unmecanismo intrínseco, concretamente median-te la desaparición de una proteína de mem-brana externa o la aparición de una nueva. Esdecir, que las bacterias, en contacto con unplástico, se hacen resistentes a los antibióticosporque ese plástico libera alguna sustancia, to-davía por identificar, y sobre la que estamos tra-bajando. Esto podría explicar parcialmente porqué es tan difícil curar con antibióticos deter-minadas infecciones asociadas a materiales o acuerpo extraño.

J. ARIZA: Creo que al discutir el tema de las bac-terias adherentes y de la dificultad de curaciónde las infecciones por cuerpos extraños, debe-mos considerar un triángulo de variables: a) ¿dequé cuerpo extraño estamos hablando? No eslo mismo curar una infección de prótesis, unainfección vascular o una infección de malla;b) ¿qué antibiótico utilizamos y cómo se com-portan los diferentes antibióticos ante estas si-tuaciones?, y c) ¿de qué microorganismos setrata?, no tanto porque va a requerir un nuevoantibiótico, sino porque el propio microorganis-mo tampoco se comporta de la misma forma. Apartir de estos puntos cabría añadir una seriede cuestiones: al hablar de bacterias adheren-tes, nos referimos exclusivamente a Staphylo-coccus aureus, ¿existe en la bibliografía in-formación respecto al comportamiento debacterias adherentes gramnegativas? He llega-do a la conclusión de que ante S. aureus, la ri-

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DISCUSIÓN

fampicina sería el único antibiótico a destacar,puesto que esa adherencia no modifica de for-ma importante su capacidad antibiótica; estecriterio, ¿se puede aplicar en bacilos gramne-gativos y quinolonas? Me gustaría obtener unarespuesta a todas estas preguntas, puesto queson las incógnitas que hay que resolver en lapráctica clínica del día a día. Para la resoluciónde las infecciones de cuerpos extraños los mé-dicos deberíamos tener criterios muy claros.Por otro lado, y como última reflexión, pareceque existe cierta disociación entre lo que sepublica respecto a la sensibilidad de los estafi-lococos a la rifampicina y lo que ocurre ennuestros hospitales. No sé si esto se debe a pro-blemas en el laboratorio al estudiar el compor-tamiento de la rifampicina in vitro, pero es unpunto que tampoco acabo de entender.

A. PASCUAL: Me encantaría poder contestar a to-das estas preguntas de Javier Ariza, pero pordesgracia nos movemos en un mundo extraor-dinariamente complejo. Sobre el tema de losbacilos gramnegativos, en estudios in vitro mu-chos se comportan igual que los estafilococos,formando biocapas que se hacen extraordina-riamente resistentes. En Pseudomonas estámuy bien establecido, se conoce y se sabe quees muy difícil de erradicar sólo con el uso de an-timicrobianos. El problema está en que, porcomplicarlo aún más, los biomateriales se com-portan de manera muy distinta, incluso en tér-minos de efectos de los antibióticos; es decir, laactividad de un antibiótico en una biocapa bac-teriana no va a ser igual en la superficie de PVCque en una superficie de poliuretano; por lomenos lo que nuestros estudios in vitro de-muestran es que hay determinados plásticos enque el antibiótico actúa de manera más eficaz,posiblemente por la propia constitución de labiocapa. Se trata, sin embargo, de estudios invitro, con todas las limitaciones que ello conlle-va. Es un mundo muy complejo en el que inter-vienen infinidad de factores que son complica-dos de analizar de una forma independiente. Esobvio que se requieren más modelos experi-mentales que nos permitan resolver tantas in-cógnitas. En cuanto a la rifampicina, y si te heentendido correctamente, no tenemos ningúntipo de problema en determinar su sensibilidadin vitro en nuestro laboratorio.

J.A. CAPDEVILA: Nosotros, en cuanto a la rifampi-cina, hemos hecho algunas biocapas. No tene-mos toda la batería hecha pero ya observamosque aumenta la CMB pero no tanto como ocu-rre en proporción con la vancomicina, pero loque sucede es que con rifampicina partimos de

unos niveles de sensibilidad muy bajos y con-seguimos unas concentraciones muy altas en elcatéter y, probablemente, esto sea muy favora-ble desde el punto de vista terapéutico, a pesarde que pueda aumentar un poco la CMB por elhecho de estar adheridas formando biocapas.Y, además, si realizamos el experimento man-teniendo 3 mg de rifampicina en el interior delcatéter durante 72 h, no aparece ninguna ceparesistente como ocurría a las 24 h. Probable-mente esto sea por la exposición continuada alantibiótico que acaba con la posible emergen-cia de mutaciones.

J.M. GATELL: Álvaro Pascual, cuando hablabas decepas que se vuelven resistentes en contactocon el material extraño, ¿te referías a un proble-ma físico de acceso del antibiótico por el slimeo por el glicocálix, o a cambios intrínsecos en lacomposición enzimática de la cepa?

A. PASCUAL: Clásicamente, todo lo que sabíamosde la actividad de los antibióticos en biocapasera que el antibiótico no era activo porque nollegaba, por la existencia de impermeabilidadde la biocapa, porque las bacterias se hallabanen estado latente y al no multiplicarse rápido al-gunos antibióticos, como los betalactámicos,por ejemplo, no podían actuar, etc. Pero ahorapodemos añadir un nuevo concepto: la existen-cia de algo que se libera del látex siliconizado,que convierte la bacteria en resistente; es decir,la CMI a carbapenémicos se incrementa. Estose observa tanto en presencia del biomaterialcomo en presencia de un medio de cultivo queha contenido fragmentos de biomaterial duran-te unas horas. Sabemos que es por expresiónde una nueva y eliminación de una de las pori-nas, proteína de membrana externa exacta-mente, de Pseudomona aeruginosa.

J.M. MIRÓ: De las conclusiones obtenidas me-diante vuestro modelo experimental, ¿habéisrealizado algún tipo de aproximación a la clíni-ca a la hora de intentar esterilizar los catéteresde diálisis, o basándose, sobre todo, en utilizarconcentraciones de antibióticos muy elevadaspor encima de las CMB de S. aureus?

J.A. CAPDEVILA: Somos un poco atípicos porquehemos empezado por la clínica y hemos aca-bado por el laboratorio. Ya hace tiempo que es-terilizamos los catéteres por S. epidermidis y porS. aureus. El problema de este último es máscomplejo por el hecho de la bacteriemia aso-ciada, que muchas veces nos obliga a retirar elcatéter de entrada. Pero, sobre todo, por S. epi-dermidis y por bacilos gramnegativos, los he-mos esterilizado con dosis altas de ciprofloxaci-no o amikacina, o bien con vancomicina frente

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a S. epidermidis. Estos resultados, ya publica-dos, han sido positivos en más del 90% de loscasos estudiados. Además, contrastan con re-sultados de series de pacientes que hemos re-visado de la bibliografía que siendo tratados deuna forma conservadora con antibióticos sisté-micos y en algunos casos con perfusión conti-nuada de antibióticos obtuvieron un fracaso del30%, entendiendo como tal la retirada precozdel catéter o bien que, una vez retirado, seconstatase su infección.

J.M. MIRÓ: En la práctica clínica ¿incluis siempreheparina?

J.A. CAPDEVILA: Sí, porque no nos atrevemos aquitarla, aunque según la bibliografía no es ne-cesario heparinizar un catéter que está cerrado,siempre y cuando tenga un calibre grande yesté en un vaso central, situación en la que elriesgo de trombosis es muy reducido. Además,es un problema de manejo, ya que es máscomplicado tener que preparar la mezcla de laheparina con la vancomicina que utilizar el an-tibiótico directamente.

A. GIMÉNEZ: Como responsable de estabulario,querría formular una pregunta sobre los crite-rios en la elección de vuestros modelos experi-mentales y, concretamente, respecto al génerodel animal de experimentación. En un mismomodelo he apreciado que un grupo de investi-gadores emplea machos, mientras que otro uti-liza hembras. Alguno de vosotros creo que hacomentado, incluso, la posibilidad de variacio-nes en los resultados con respecto al sexo.¿Qué criterio rige la elección del género envuestros modelos experimentales?

J. GAVALDÀ: No tengo conocimiento de que se ha-yan demostrado diferencias con el empleo deuno u otro género en un mismo modelo experi-mental.

J. PACHÓN: En el modelo de neumonía C57 BL6se utilizan ratones hembras porque el modelose estandarizó en este género, pero desconoz-co la existencia de diferencias con ratones ma-chos. En cobayas el género es indistinto y en ra-tas, aunque nosotros no tenemos experiencia,tampoco he oído hablar de diferencias.

P.J. CARDONA: En tuberculosis la elección del gé-nero es muy importante porque utilizamos mo-delos crónicos en los que los animales perma-

necen infectados durante meses. En esta situa-ción, se ha observado que los machos poseenmayor agresividad, lo que desencadena unamortalidad superior. Por este motivo, se utilizanpreferentemente hembras, a pesar de que loscambios hormonales de este género podríanser un factor limitante considerable que puedeafectar a la propia infección.

M. CUENCA-ESTRELLA: En micología, donde no exis-te prácticamente ningún modelo estandarizado,se dispone de publicaciones en las que se hanusado ambos géneros sin que se observen di-ferencias. Incluso se utiliza un modelo en rato-nes lactantes donde se mezclan ambos sexosen un mismo experimento.

C. CABELLOS: En meningitis se utilizan animaleshembras siguiendo el modelo descrito inicial-mente. La única explicación al respecto es quese trata de un modelo que necesita muchaanestesia porque los animales tienen que estardormidos durante períodos muy largos de tiem-po y parece ser que la cantidad de anestesiaque precisan las hembras es menor que la delos machos.

J. CANTÓ: Desde mi punto de vista si realmenteno hay diferencias y por razones éticas, pues-to que hasta el momento no podemos selec-cionar el género de los animales, quizá seríaaconsejable utilizar ambos; si hubiera diferen-cias, sería también aconsejable utilizar los dosgéneros para poder constatar y estudiar estasdiferencias.

J. BARBERÁN: Hemos utilizado ambos génerosmuchas veces por disponibilidad de uno u otroen el estabulario. De todas formas, preferimosel macho por dos motivos: porque a veces noshemos encontrado con algunas hembras pre-ñadas, y porque según nuestra experiencia elmacho es más dócil de manejar a la hora de in-yectar el antibiótico.

J.M. MIRÓ: En el modelo de endocarditis no creoque haya ninguna diferencia en utilizar machoso hembras, ni en la farmacocinética ni en el de-sarrollo de lo que es el modelo en sí. De todasmaneras, la impresión es que cada uno de no-sotros ha aprendido el modelo con uno u otrogénero, y así se ha ido perpetuando. Tal vez se-ría interesante investigar esta posible influenciade la anestesia en relación con el género.

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RESUMEN

La infección continúa siendo un grave proble-ma en todas las disciplinas clínicas. El desarrollode modelos experimentales de peritonitis ha re-sultado determinante en el progreso del conoci-miento de los mecanismos fisiopatológicos quetienen lugar en el peritoneo en presencia de unainfección intraabdominal, así como en el estudiode posibles tratamientos.

En la actualidad, diferentes autores orientansus estudios a la identificación y valoración delpapel que ejercen los diferentes mediadores li-berados por las células implicadas en la res-puesta peritoneal y sus posibles interacciones, asícomo en el desarrollo de sustancias destinadas ala regulación de la respuesta del huésped.

Los modelos de peritonitis más utilizados con-sisten en la realización de ligadura y perforación ce-cal, inoculación intraperitoneal de cápsulas de ge-latina con mezcla de heces o cultivos bacterianoso bien la implantación intraperitoneal de heces.Presentamos los aspectos técnicos para la realiza-ción de estos modelos cuya elección se basará enlos objetivos del estudio que se desee realizar.

Por su parte, la introducción de la cirugía la-paroscópica ha permitido revaluar la fisiopatolo-gía de la infección intraabdominal, al observaruna mejor respuesta peritoneal respecto a la ci-rugía abierta.

Palabras clave:Shock séptico. Absceso intraabdominal. Modelo ex-

perimental.


El descubrimiento de los antibióticos llevó amuchos a creer que la infección pasaría a formarparte de la historia de la medicina en lugar decontinuar siendo un grave problema. Una déca-

da después, la observación de resistencias a losantibióticos demostró la capacidad de adaptaciónde las bacterias. Otra vez la naturaleza enseñabaal hombre una importante lección de ecología quenunca debería olvidar. Más de 50 años despuésdel descubrimiento de los antibióticos, la infec-

INTRAABDOMINAL INFECTION MODEL

Infection is still a serious complication in all cli-nical disciplines. The development of experimen-tal peritonitis models has allowed to progress inthe knowledge of peritoneal pathophysiologicalevents during peritonitis and to study differenttreatments.

Actually, different authors have oriented theirstudies not only to the identification and evalua-tion of peritoneal cells-induced mediators roleand their interactions in the response to a intra-abdominal infection but also to the developmentof substances with ability to host response regu-lation.

The most used experimental peritonitis modelshave been the ligation with puncture of the coe-cum, intraperitoneal introduction of pooled fecesmixed with barium sulphate or bacterial culturein a gelatin capsule and the installation of freshfeces through an abdominal incision. We presentthe technical aspects of different models. Theaim of the study will determine its selection.

By another hand, the introduction of laparos-copic surgery has permited to reevaluate the in-traabdominal infection pathophysiology after theobservation of a better peritoneal response thatafter conventional surgery.

Key words:Sepsis syndrome. Intraabdominal sepsis. Experi-

mental model.

Modelo de infecciones intraabdominalesM. Carmen Balaguéa,*, Eduardo M.ª Targaronab

y Miguel Cainzosc

aServicio de Cirugía General. IDIBAPS-Hospital Clínic. Barcelona. bServicio de Cirugía General y Digestiva. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona. cServicio de Cirugía General y Digestiva.

Hospital General de Galicia. Santiago de Compostela. La Coruña.

103

*Correo electrónico: cbalagué@sendanet.es.

ción es todavía un grave problema en todas lasdisciplinas clínicas y continúa representando unade las principales causas de morbilidad y morta-lidad en pacientes con traumatismos graves1,2.

La experiencia clínica ha demostrado que apesar de la aparición de nuevos y mejores anti-bióticos, éstos no son la única solución en el tra-tamiento del shock séptico, pero la diversidad demicroorganismos implicados y los tratamientos,en muchas ocasiones individualizados, de los pa-cientes con sepsis, dificultan la realización de es-tudios controlados en el hombre. Esto hace ne-cesaria la utilización de modelos experimentalesque reproduzcan el curso clínico de la sepsis apartir de sus diferentes orígenes y permitan re-ducir el número de variables no controladas2.

Las interacciones existentes entre microorga-nismos y peritoneo han intrigado a multitud de in-vestigadores y la capacidad de defensa de lacavidad peritoneal frente a una infección ha sus-citado gran interés desde el siglo pasado, cuan-do se hizo evidente su capacidad de respuesta auna infección grave tanto en peritonitis clínicascomo experimentales3.

Los primeros estudios, realizados a finales delsiglo pasado, utilizaron la inoculación intraperito-neal de partículas de grafito y demostraron laexistencia de un mecanismo de absorción peri-toneal4,5. Inicialmente prevaleció la hipótesis deque las partículas eran absorbidas a través delcitoplasma de las células mesoteliales diafrag-máticas. Fue Florey6 quien demostró que las par-tículas no pasaban a través de las células meso-teliales sino entre ellas.

Desde principios de nuestro siglo se ha consi-derado que la correlación anatómica con el me-canismo de eliminación de las partículas le co-rresponde al sistema linfático localizado pordebajo del mesotelio diafragmático. Los movi-mientos inspiratorios y expiratorios del diafragmapermiten la apertura y cierre de los stomas (bre-

chas) situados entre las células mesoteliales y elconsecuente acceso desde la cavidad peritoneala las lagunas linfáticas. Allen7 demostró en susestudios experimentales en ratones que las par-tículas de grafito podían encontrarse en el con-ducto torácico a los 3-5 min de su inoculación in-traperitoneal, indicando la rapidez con la quealgunas partículas pueden ser absorbidas. Asímismo, Allen y Weatherford8 midieron el tamañode los stomas en rata mediante la utilización deesferas de poliestireno. Higgins9, en estudios ex-perimentales en perros, demostró que la exéresisdel epiplón mayor no influía en el paso de grafitoal conducto torácico, mientras que la neurecto-mía frénica, con la consecuente atrofia diafrag-mática, provocaba un incremento de la absorcióntranslinfática.

Steinberg10 utilizó inóculos bacterianos en susestudios experimentales en perros y tambiéncomprobó el paso de bacterias al conducto torá-cico a los 6-10 min después de su inoculación in-traperitoneal mientras que no se detectaban ensangre hasta pasados unos 30-40 min. Por otraparte, Cohn11 estudió los efectos de Staphylococ-cus aureus y Staphylococcus albus sobre la ca-pacidad de defensa de la cavidad peritoneal en elratón y concluyó que la mortalidad se correla-cionaba directamente con la proliferación bac-teriana intraperitoneal, que los organismos queproducían un retraso en la aparición de polimor-fonucleares en la cavidad peritoneal eran algomás virulentos y que el crecimiento intraperito-neal ocurría cuando se excedía una relación10:1 entre bacterias y fagocitos en cavidad pe-ritoneal. Así pues, otro factor importante era lacapacidad de respuesta celular local frente a lainfección. En la actualidad, un aspecto amplia-mente estudiado es el papel de los macrófagosintraperitoneales en el mecanismo de defensa delperitoneo frente a una infección3. Esto ha sido po-sible gracias al progresivo desarrollo de la biologíamolecular, que ha revelado una gran complejidadde respuestas celulares a un proceso séptico. Losmodelos experimentales se han hecho decisivosen llevar este conocimiento al progreso clínico1.

Descripción del modelo in vivo

Consideraciones generales

Antes de proceder a la descripción del mode-lo in vivo, es preciso tener en cuenta la posibili-dad de alternativas como los cultivos celulares, elanimal de experimentación que más puede ajus-tarse al estudio o el número de aquellos que se-rán necesarios (tabla I)1.

104


TABLA ICONSIDERACIONES GENERALES AL

PLANEAR UN ESTUDIO EXPERIMENTAL1. Modelos alternativos: cultivos celulares2. Características del animal a utilizar

(modelo de animal “pequeño” o “grande”)3. Características de las diferentes especies

para las reacciones de interés4. Tratamiento del dolor y anestesia5. Número de animales necesario para

obtener resultados científicamenterelevantes

La utilización de cultivos celulares permite re-ducir el número de factores no controlados. Sinembargo, no ofrecen la posibilidad de reflejar lascondiciones in vivo. Los cultivos celulares puedenutilizarse en la valoración del efecto (estimula-ción/inhibición) de una sustancia sobre una líneacelular como paso previo a los estudios en ani-males de experimentación1, pero las interaccio-nes entre órganos o la supervivencia no puedenestudiarse mediante modelos de cultivos celu-lares.

En cuanto a los modelos in vivo, es importantetener en cuenta que el estado nutricional, asícomo las reacciones a la anestesia y la manipu-lación del animal, son importantes moduladoresde su sistema de defensa. En consecuencia, esconveniente monitorizar la respuesta humoral ycelular del organismo una vez realizada la anes-tesia y antes del inicio del estudio12.

Selección del animal para el estudio

Un paso previo a la selección del animal con-siste en decidir si se utilizará un animal “grande”o “pequeño”. Los animales de pequeño tamañoson más económicos, manejables y ofrecen laposibilidad de poder utilizar un mayor número delos mismos en los grupos de estudio. Cuando elobjetivo es valorar la mortalidad y la dosis o com-binación de diferentes agentes, es preferible uti-lizar inicialmente animales pequeños y, poste-riormente, pasar a un animal grande si es difícilla extrapolación de la dosis. Durante los últimos40 años se ha obtenido una gran cantidad de in-formación genética e inmunológica del ratón apartir de los numerosos estudios experimentalesrealizados en estos animales. Los modelos de in-fección intraabdominal realizados en ratones sonde especial importancia cuando el objetivo prin-cipal del estudio es la medición de reacciones in-tercelulares y células inmunocompetentes1. Sinembargo, es frecuente que la monitorización deresultados obligue a la extracción de repetidasmuestras de sangre con la consecuente dificul-tad de trabajar con animales pequeños como elratón.

Los animales más utilizados en estudios de in-fección intraabdominal son la rata y el cerdo, querepresentan el mejor ejemplo de animales “pe-queños” y “grandes”, respectivamente. Además,existe mucha información genética tanto sobreratas como sobre cerdos, lo que favorece la pro-ducción comercial de sistemas de ensayos mo-noclonales y modificadores de la respuesta bio-lógica específica de cada especie que permitiránsu utilización en estudios en los que en el mo-

mento actual todavía se precisa la utilización delratón, con las limitaciones que implica trabajarcon un animal tan pequeño.

La rata es un buen animal de laboratorio paraestudios de infección intraabdominal. Su anato-mía y la respuesta a la peritonitis son muy simila-res a las reacciones observadas en humanos. Losórganos del sistema gastrointestinal, vascular ylinfático tienen un tamaño suficiente para llevar acabo procedimientos quirúrgicos y para la colo-cación de catéteres. En el momento actual es po-sible monitorizar adecuadamente una rata, loque resulta de gran importancia en estos estu-dios.

Anestesia

Otro aspecto a tener en cuenta es la posible in-terferencia de los procedimientos anestésicossobre los resultados del estudio diseñado. La fun-ción cardiovascular y respiratoria variarán duran-te el shock séptico, pero es preciso tener encuenta que estos cambios también dependeránde la profundidad de la anestesia. Este hechoserá más evidente en estudios con cerdos en losque se utilicen barbitúricos, cuyas interferenciascon la función cardíaca y respiratoria son conoci-das. Es posible controlar este problema median-te la monitorización de las concentraciones deanestésico o mediante la utilización de anesté-sicos cuya interferencia sea mínima (p. ej., keta-mina). Por ello, también resulta conveniente lamonitorización tras la anestesia y antes de iniciarel estudio12. En caso de utilizar el cerdo comoanimal de estudio, es preciso tener en cuenta laposibilidad de una reacción de estrés importanteo de una reacción hipertérmica letal debida a lautilización de halotano en la anestesia y que pue-de ser difícil de distinguir de una reacción agudaa la endotoxina o a microorganismos administra-dos para el estudio.

Nuestra pauta de anestesia en cirugía experi-mental en cerdo consiste en una premedica-ción con 10 mg/kg de azaperon por vía i.m.,60 min antes de iniciar la anestesia. La aneste-sia se induce con un bolo intravenoso de thio-pental a dosis de 20 mg/kg. Otros autores ad-ministran un bolo de ketamina a dosis de20 mg/kg por vía intramuscular13,14. En ese mo-mento se intuba al animal y se mantienen lascondiciones del ventilador con una FiO2 de 0,5,un volumen tidal que permita mantener unapCO2 de 40 ± 5 mmHg, y una frecuencia de12-14 respiraciones/min. Estas condiciones dela ventilación son comunes para diferentes es-tudios experimentales13,14. La anestesia se pue-

105

MODELO DE INFECCIONES INTRAABDOMINALES

de mantener con isoflurano inhalado a unaconcentración del 0,6-1 % y con una perfusióni.v. de 1 mg/h de bromuro de pancuronio queasegura la relajación muscular. Se mantieneuna perfusión de suero fisiológico al 0,9% y desuero glucosado al 5 % a dosis de 2 ml/kg/hcada una. Es importante mantener al animal auna temperatura central de 36,5-37,5 °C, si esnecesario mediante la utilización de focos obien con la administración de suero caliente.

Los estudios con animales pequeños permitenun manejo más fácil y no se precisa la infraes-tructura del animal grande. En el caso de la ratase puede utilizar como anestésico la inhalacióncontinua de éter2,15, la administración intraperi-toneal de pentobabital a una dosis de 15 mg16, obien la administración intramuscular de ketami-na a dosis de 50 mg/kg asociada con xilazina adosis de 10 mg/kg17.

Utilizamos, para los estudios experimentales,ratones swiss albino machos CD-1 (Charles River,Saint Aubin Les Elbeuf, Francia) de 6-8 semanasde edad y con un peso de 25-30 g. La anestesiase realizó mediante la inoculación intraperitonealde 0,05 ml de pentobarbital sódico al 5%.

Monitorización del animal

Para asegurar que estamos frente a un mode-lo de sepsis de origen abdominal se deben cum-plir unos criterios básicos1:

1. Posibilidad de aislar microorganismos en lasangre o en la cavidad peritoneal.

2. Uno o más signos objetivos de infección:fiebre, taquicardia, taquipnea, oliguria, letargo omuerte.

3. Alteraciones de los parámetros celulareso bioquímicos.

La valoración de estos criterios, así como larealización de las determinaciones del estudio,requieren una adecuada monitorización del ani-mal.

Para la obtención de muestras e infusión desustancias es suficiente la colocación de un ca-téter venoso. Es posible la cateterización de lavena cava superior a través de punción en venayugular18. Se han descrito un gran número demétodos de monitorización cardiovascular enratas, pero debe tenerse en cuenta que la utili-zación de estos sistemas en un animal de redu-cido volumen sanguíneo como la rata puede in-terferir en el estudio y hacer que el modelo seapoco preciso, por lo que es recomendable unamonitorización “global”. Con la colocación de

un catéter en la vena cava y en la aorta ascen-dente pueden medirse el gasto cardíaco (portécnicas de dilución o microesferas) y la presiónarterial. A partir de estos datos se podrán calcu-lar las resistencias vasculares19-21. Tambiénpuede estudiarse la linfa peritoneal mediante lacateterización del ductus torácico22, así como elconsumo de oxígeno23.

La monitorización del animal grande presen-ta dos aspectos; por una parte, la monitoriza-ción básica y, por otra, la monitorización de unórgano concreto o una función celular. La mo-nitorización básica puede realizarse medianteequipos clínicos estándar con pequeñas modifi-caciones o bien mediante equipos pediátricos,y consistirá en el soporte ventilatorio y en elcontrol de la función respiratoria mediante ga-sometrías, así como la colocación de un caté-ter de Swan-Ganz a través de la vena yugularexterna y de un catéter de presión arterial a tra-vés de la arteria femoral izquierda para el con-trol hemodinámico. Es necesario mantener unaperfusión continua de sueros (suero salino al0,9 % y suero glucosado al 5 %) a una veloci-dad de 20 ml/kg/h durante la intervención qui-rúrgica y de 10 ml/kg/h durante el período deobservación. Para el control de la diuresis esnecesario realizar un sondaje vesical. Puede serprecisa la realización de una cistotomía en elcaso del cerdo macho por la gran dificultad decolocación de una sonda vesical. La monitoriza-ción especial dependerá de los objetivos del es-tudio y, desde un punto de vista técnico, prácti-camente todos los signos vitales medibles enhumanos pueden controlarse en el cerdo.

Modelos in vivo de peritonitis

Un modelo animal de infección intraabdominalideal debería cumplir los siguientes requisitos:

1. Ser capaz de simular el proceso infecciosoobservado en el humano.

2. Ser fácil de reproducir.3. Producir una agresión séptica con poca va-

riabilidad entre los animales.

Se han descrito diferentes tipos de modelos deperitonitis. La elección de uno u otro se basará enlos objetivos del estudio diseñado:

1. Ligadura y perforación cecal.2. Inoculación intraperitoneal de monocultivo

bacteriano.3. Colocación intraabdominal de cápsulas de

gelatina con heces o cultivos bacterianos.

106


4. Implantación intraperitoneal de heces.5. Isquemia de un segmento intestinal.6. Modelo de absceso intraabdominal.

Por la legislación vigente, un cuadro de perito-nitis bacteriana prolongada en animales grandesdeberá incluir anestesia y soporte respiratoriomecánico (unidad de cuidados intensivos). Porello, la mayoría de modelos están diseñados paraobtener resultados de los objetivos planteadosdurante las primeras 12 h.

1. Modelo de ligadura y perforación cecal

Ryan et al24 propusieron inicialmente un mo-delo de peritonitis producido mediante la ligadu-ra y necrosis del ciego distal a la válvula ileocecalen la rata. Posteriormente, Chaudry et al25 com-binaron la ligadura con la punción del ciego,puesto que tras la ligadura aislada del ciego úni-camente observaron la formación de abscesossin mortalidad. Con la punción en el borde anti-mesentérico del ciego objetivaron un aumentosignificativo de la mortalidad, que dependía deltamaño o del número de punciones. Así pues,observaron que la realización de dos puncionesdaba lugar a una mortalidad del 94% a las 48 h,mientras que con la realización de una únicapunción se obtenía una mortalidad del 90% a los5 días. Éste es un modelo utilizado con bastantefrecuencia y muy reproducible. Con este modelose puede obtener tanto la fase hiper como hipo-dinámica de la sepsis.

Es frecuente su utilización en animal de expe-rimentación pequeño, sin embargo, es un mode-lo poco utilizado en el cerdo. Aunque no se co-nozca el tamaño del inóculo, el hecho de dejaruna cantidad controlable de heces por debajo dela ligadura y la realización de un orificio de igualtamaño puede dar lugar a una salida bastantecontrolada de heces a la cavidad peritoneal. De-ben tenerse en cuenta algunos detalles comoasegurar una cantidad de heces por debajo de laligadura y la ausencia de hemorragia en el lugarde la punción.

2. Modelo de inoculación intraperitonealde monocultivo bacteriano

Es un modelo muy utilizado para inducir peri-tonitis en la rata3,15, pero es más difícil produciruna mortalidad significativa y no reproduce elambiente polimicrobiano de la peritonitis26 conlos consecuentes cambios secundarios a inter-acciones simbióticas. En consecuencia, es pre-ferible un cultivo polimicrobiano. Rotstein y Kao27

demostraron en su modelo la importante sinergiaexistente entre Escherichia coli y Bacteroides fra-gilis.

Sin embargo, este modelo puede ser de uti-lidad en estudios en los que se pretende moni-torizar la respuesta a una contaminación intra-abdominal sin llegar a producir una peritonitis.Éste es el caso del estudio llevado a cabo pornuestro grupo. Para la valoración de la concen-tración de monocultivo bacteriano necesariopara inducir la situación que queríamos estudiarfue necesaria la realización de un preestudio.Con este fin se definió el parámetro “concen-tración máxima subletal 72 h” (CMS72) como laconcentración máxima de E. coli a la cual so-brevivían todos los ratones al cabo de 72 h.Para calcular este parámetro se administraroninóculos intraperitoneales de 1 ml de suspen-siones en suero fisiológico (NaCl al 0,9 %) deE. coli a concentraciones crecientes y se com-probó que la CMS72 era 1 ml × 0,5 × 104

unidades formadoras de colonias (UFC)/ml(tabla II).

Se utilizan suspensiones de E. coli a diferentesconcentraciones en función del estudio y del ani-mal utilizado. Existe una importante variabilidaden cuanto a las concentraciones de inóculos uti-lizados, por ello se recomienda valorar previa-mente la concentración idónea para el mismo,utilizando márgenes pautados por estudios pre-vios llevados a cabo por otros autores, lo que re-sulta más factible en animales pequeños. En elcerdo, suele utilizarse una inoculación intraperi-toneal de aproximadamente 2,5 × 109 UFC deE. coli.

107


TABLA IIVALORACIÓN DE LA DOSIS ADECUADA PARA EL ESTUDIO

Dosis infectiva Número Cultivo de líquido peritoneal Hemocultivo Mortalidad102 UFC/ML 10 − / +: 10/0 − / +: 10/0 0103 UFC/ML 10 − / +: 10/0 − / +: 10/0 0104 UFC/ML 10 − / +: 0/10 − / +: 4/60 0106 UFC/ML 10 − / +: 0/10 − / +: 0/10 4108 UFC/ML 10 − / +: 0/10 − / +: 0/10 10

3. Modelo de colocación de cápsulade gelatina con contenido fecal o bacteriano

A partir de 1974, se ha utilizado la colocaciónintraabdominal de cápsulas de gelatina que con-tienen heces o una mezcla de bacterias y sus-tancia adyuvante. Este modelo tiene la capacidadde semejar la formación de abscesos intraabdo-minales y dar lugar a una sepsis generalizada.

Mezcla de heces en cápsulas de gelatina. Existendiferentes posibilidades para la preparación delinóculo con que impregnar las cápsulas de gela-tina, pero todas ellas se basan en una mezcla deheces y sulfato de bario al 10 % a partir del mo-delo descrito por Weinstein et al28,29. En este mo-delo, el estudio del exudado durante la fase deperitonitis aguda presentó un predominio de gér-menes aerobios E. coli y enterococo, mientrasque los gérmenes anaerobios B. fragilis y fuso-bacterias predominaban durante la fase de abs-ceso.

Lang et al2 se basaron en el modelo de Weins-tein y diseñaron un inóculo preparado a partir dela mezcla de heces frescas recogidas de 100 ra-tas mantenidas con una dieta estándar. Las he-ces se mezclaron con un volumen equivalente deconcentrado de caldo de carne y el resultado sealmacenó a –60 °C. En el momento del estudio,el inóculo se mezclaba con 2 volúmenes de sue-ro salino y con sulfato de Bario al 10%. El prepa-rado resultante se colocaba en cápsulas de gela-tina. En este estudio los tests bacteriológicos delinóculo tuvieron una distribución de coloniasconstante (tabla III). El inóculo fue preparado encondiciones aeróbicas, con una relación aero-bios-anaerobios de 100:1.

Nichols et al30 modificaron la técnica deWeinstein y utilizaron mezcla de heces humanas

con sulfato de bario a causa de las diferenciasobservadas entre la flora fecal humana y la de larata. Los gérmenes predominantes en este estu-dio fueron E. coli, Streptococcus fecalis, B. fragi-lis y Clostridium perfringens.

Un detalle a tener en cuenta es que los testsbacteriológicos del inóculo presentarán diferen-cias en función de la dieta de los animales de losque se obtienen las heces para la preparación dela mezcla.

Colonias de bacterias en cápsulas de gelatina.Hansson et al31 utilizaron este modelo según ladescripción llevada a cabo por Onderdonk29.Para la preparación de las cápsulas se aislaroncepas de B. fragilis y de E. coli que crecieron enun medio de glucosa enriquecido (PYG) a 37 °Cy en condiciones anaerobias durante 24 y 6 h,respectivamente, hasta obtener 109 UFC de cadauna. Los cultivos fueron diluidos con PYG hastaobtener concentraciones de 2,5 × 107 de B. fra-gilis/ml y 1,3 × 107 de E. coli/ml. Se mezclaronvolúmenes iguales de ambas preparaciones y semezcló con un volumen igual de contenido coló-nico de rata esterilizado en el autoclave. Final-mente se añadió sulfato de bario al 10 %. La pre-paración se congeló a –80 °C hasta su colocaciónen cápsulas de gelatina en cantidades desde0,35 a 1,10 g.

Las cápsulas de gelatina se colocan en la cavi-dad abdominal del animal mediante la realiza-ción de una laparotomía media.

4. Modelo de implantación intraperitonealde heces

Rink et al32 utilizaron este modelo que consis-te en la implantación en la cavidad abdominal deheces frescas (1,25 g/kg) suspendidas en 2 mlde suero salino al 0,9% a través de una incisiónde la pared abdominal. Las heces se obtuvierondel ciego de una rata sometida a la misma dietaque las del estudio. No se utilizaron cápsulas degelatina ni sustancias adyuvantes. La mortalidadfue del 100% a las 24 h y los cultivos presenta-ban gérmenes aerobios y anaerobios.

5. Modelo de isquemia de un segmentointestinal

Algunos autores han basado sus modelos en lainducción de isquemia de un tramo intestinal.

Olofsson et al33 utilizaron un modelo en el quesometían a las ratas a una isquemia del ciego yde los 20-30 cm distales del íleo mediante la li-gadura selectiva de los vasos de la zona.

108


TABLA IIIBACTERIOLOGÍA DEL INÓCULO FECAL2

Microorganismo UFC/mlAerobios

Lactobacillus 108

Enterococcus 107

Escherichia coli 105

Proteus 105

Klebsiella 104

Pseudomonas 102

AnaerobiosBacteroides 106

Clostridium 102

UFC: unidades formadoras de colonias.

6. Modelo de absceso peritoneal

Resulta más difícil la elaboración de modelosexperimentales que semejen la situación de unabsceso intraabdominal localizado. En 1892Massart fue capaz de reproducir esta situaciónmediante la colocación intraabdominal de untubo de cristal abierto con cultivo bacteriano ensu interior. Guirao et al34 han desarrollado un mo-delo experimental de absceso intraabdominal enconejo. Para ello llevan a cabo la ligadura de los4 cm distales del apéndice que se introduce através de un orificio realizado en la base del epi-plón con el que se cubre el apéndice asegurán-dolo con puntos de sutura. Tras reintroducir elapéndice cubierto por el epiplón en la cavidadabdominal, proceden a la instilación de 30 ml desuero salino en la cavidad abdominal y al cierrede la pared con puntos sueltos de seda 3/0. Eltipo de microorganismos encontrados tras la ro-tura apendicular es similar a la flora en el hom-bre. Este modelo permite estudios metabólicos ynutricionales. Además, el tamaño del conejo per-mite la obtención de repetidas muestras de san-gre de forma más factible que en el caso de utili-zar un animal más pequeño.

Ventajas y limitaciones del modeloexperimental

Resulta difícil conseguir un modelo que cum-pla los requisitos mencionados en el apartado an-terior34. La mayoría de ellos, como la administra-ción de suspensiones de bacterias, la ligadura ypunción del ciego o la desvascularización de seg-mentos ileales, dan lugar a una infección agudacon una elevada mortalidad durante las primeras72 h y posterior desaparición de la peritonitis enlos animales que sobreviven. Estos modelos sonútiles para el estudio de efectos sistémicos de laperitonitis y la influencia de los antibióticos. Losmodelos diseñados para inducir una infecciónperitoneal moderada son más difíciles de conse-guir35.

Por otra parte, la administración intraabdomi-nal de heces presenta variaciones impredeciblesen la tasa de mortalidad por la falta de estandari-zación de las especies bacterianas que puedenencontrarse. También la ligadura y punción delciego, así como la devascularización de segmen-tos ileales, dan lugar a una infección intraabdo-minal de gravedad impredecible con variabilidadde la peritonitis inducida debido a las diferenciasindividuales entre los animales en cuanto al con-tenido bacteriano cecal36,37. Esto hace que estosmodelos sean fácilmente reproducibles desde el

punto de vista técnico pero no en cuanto a la ob-tención de resultados. Así mismo, la administra-ción de una suspensión de cultivos polimicrobia-nos a una dosis conocida permite controlar estassituaciones pero, como se ha mencionado, el re-sultado es una mortalidad precoz dependiente dela dosis. Un inconveniente de la inoculación me-diante punción con aguja en la cavidad perito-neal es que no se controla la localización de lapunta de la aguja y el inóculo puede ser inyecta-do en la pared abdominal, en el intestino o enotros órganos intraperitoneales (tabla IV).

Avances que ha supuesto el modeloen el conocimiento de la fisiopatologíade las infecciones intraabdominales

La utilización de modelos experimentales deperitonitis ha sido muy útil en el estudio de la fi-siopatología de las infecciones intraabdominales.

La caracterización de modelos de peritoni-tis ha permitido estudiar las fases iniciales enla evolución de una sepsis de origen abdomi-nal2,28,29,38-40.

Para definir los procesos implicados en la res-puesta del peritoneo a una infección, diferentesinvestigadores han examinado las característicasanatómicas y la capacidad de defensa del perito-neo (tabla V)3.

La superficie de la membrana peritoneal estácompuesta por una línea de células mesotelialessituadas sobre una lámina basal pobremente de-finida y consistente en una estroma submesote-lial con fibroblastos embebidos en una matriz co-lágena extracelular compuesta por colágeno tipoIV. A este nivel existen gran cantidad de capilaressanguíneos. El peritoneo que recubre la porciónmuscular del diafragma está interrumpido por ungran número de gaps (brechas, poros) intercelu-lares situados en el borde lateral de las célulasmesoteliales41. La ausencia en dicha localizaciónde membrana basal permite la comunicación di-recta de estos gaps con los lagos linfáticos quecirculan de forma paralela a la fibras muscularesdel diafragma y que drenarán a los conductos lin-fáticos a través de los ganglios linfáticos medias-tínicos. El tamaño de estos poros aumenta encaso de peritonitis, facilitando el paso de bacte-rias o productos de las mismas (p. ej., endotoxi-na), así como de mediadores inflamatorios11. Di-versos estudios experimentales han permitidoestudiar esta vía de eliminación desde la cavidadperitoneal. Olofsson et al42 observaron valores deendotoxina en el conducto torácico unas 400 ve-ces más elevadas que en la sangre arterial y en lavena porta. En estos estudios la endotoxemia sis-

109


témica fue paralela a la aparición de endotoxinaen el conducto torácico, lo que apoya la hipótesisde que la endotoxemia está preferentemente me-diada por el transporte linfático a partir de la ca-vidad peritoneal (fig. 1).

Otro sistema de defensa del peritoneo es elepiplón, que tiende a localizar la infección me-diante su adhesión a los lugares que presentaninflamación o perforación. Está muy bien irrigado

y contiene agregaciones celulares en su interior,conocidas con el nombre de milky spots, com-puestas principalmente por macrófagos, ademásde polimorfonucleares y linfocitos. Durante la in-flamación, su número y tamaño aumentan deforma significativa11. Este mecanismos justifica-ría el modelo de absceso intraperitoneal descritopor Guirao et al34.

Dunn et al3 observaron que los macrófagos y laabsorción translinfática representan la primera lí-nea de defensa de la cavidad peritoneal. Objeti-varon que el aclaramiento de bacterias de la ca-vidad peritoneal es extremadamente rápido, coneliminación de un mayor número de microorga-nismos que a través de la fagocitosis. Sin embar-go, también comprobaron que el sistema fagoci-tario quedaba saturado con dosis de bacteriasmenores que a través de la absorción translinfá-tica. Estos fagocitos iniciales se considera queson los macrófagos intraperitoneales, cuyo nú-mero se mantiene relativamente constante y queejercen esta función hasta la llegada de polimor-fonucleares. El aumento de polimorfonuclearesen la cavidad abdominal viene favorecido por laliberación de mediadores quimiotácticos (leuco-trienos y citocinas) a partir de los macrófagos ycélulas mesoteliales del peritoneo43 y por el au-mento de la permeabilidad inducido por la libe-ración de prostaglandinas con acción vasodilata-dora (PGE2 y PGI2). Todo parece apuntar a quela secreción de mediadores inflamatorios por los

110


TABLA IVVENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS DIFERENTES MODELOS DE PERITONITIS

Modelo Ventajas InconvenientesLigadura y perforación cecal Modelo sencillo Inóculo no conocido

Reproduce el ambiente Mayor variabilidad de la peritonitispolimicrobiano

Mortalidad precozInoculación intraperitoneal Menor variabilidad de la No reproduce el ambiente

de monocultivo bacteriano peritonitis polimicrobianoInóculo conocidoMenor mortalidad precoz

Implantación intraperitoneal Reproduce el ambiente Mayor dificultad de preparaciónde heces polimicrobiano No estandarización del contenido

bacterianoVariabilidad de la mortalidad

Cápsulas de gelatina con Menor mortalidad precoz Mayor dificultad de preparacióncultivos bacterianos Inóculo conocido

Reproduce el ambiente polimicrobiano

Isquemia de un segmento Reproduce el ambiente No estandarización del contenido intestinal polimicrobiano bacteriano

TABLA VMECANISMOS DE DEFENSA

DEL PERITONEOTipo DescripciónInnata Actividad antibacteriana del

líquido peritoneal, a través delcomplemento

Absorción bacteriana a través de los estomas diafragmáticos

Actividad fagocítica de los polimorfonucleares y losmacrófagos

Formación de abscesosCélulas natural killer

Específica Producción de IgAAcumulaciones leucocitarias en

el epiplón (milky spots)Linfocitos T memoria

Tomada de Heel11.

macrófagos conforma la respuesta inicial delhuésped y que esta activación tiene lugar predo-minantemente en la membrana peritoneal, sinexcluir el papel de los macrófagos del líquido pe-ritoneal43,44.

En la actualidad, diferentes autores orientansus estudios a la identificación y valoración delpapel que ejercen los diferentes mediadores li-berados como respuesta a una infección intraab-dominal y en los últimos años se han llevado acabo numerosos estudios con el objetivo de exa-minar la producción de citocinas en el ratón so-metido a una peritonitis. Seki et al45, en un mo-delo experimental en ratón, han comprobado elpapel crucial del interferón (IFN) gamma libera-do por las células natural killer (NK) del hígado yde la interleucina 10 (IL-10), liberada por los ma-crófagos peritoneales en la cascada de aconteci-mientos que tienen lugar como respuesta a unaperitonitis bacteriana.

Así mismo, también se valora el posible papeldel óxido nítrico (NO), implicado en numerososprocesos fisiológicos y fisiopatológicos y cuya pro-ducción está regulada en la mayoría de casos porla actividad de la enzima NO-sintetasa (NOS).Mediante estudios inmunoquímicos se ha objeti-vado que los macrófagos son los mayores res-ponsables de la expresión de la iNOS (isoformade la enzima NO-sintetasa) en respuesta a la ac-tivación por endotoxina o citocinas46, y su acciónestaría también relacionada con los mecanismosde defensa del huésped47-49. Diferentes estudiosexperimentales apoyan la actividad antimicrobia-na del NO y han objetivado que la inducción de

iNOS por parte de la endotoxina y citocinas proin-flamatorias (factor de necrosis tumoral [TNF],IL-1 e IL-6)50 es muy eficaz. McMicking et al51

observaron un deterioro de la respuesta a la in-fección con desarrollo de un shock endotóxico enratones con deficiencia en la liberación de iNOS.Sin embargo, se han observado considerables di-ferencias en la regulación de la expresión deiNOS y su actividad en diferentes especies, exis-tiendo cierto escepticismo en cuanto al papel dela iNOS en la defensa inmunitaria en el hombre.

Un aspecto importante a comentar y que hallevado a la realización de un gran número de es-tudios es el fenómeno de la translocación bacte-riana, entendida como el paso de bacterias loca-lizadas en el tracto gastrointestinal a través de lamucosa intestinal hacia ganglios linfáticos me-sentéricos y otros órganos. Si bien no es un mo-delo de peritonitis, sí que puede venir favorecidapor ésta y puede mantener la situación de sepsis,además de producirse en otros cuadros clínicoso bien dar lugar a una peritonitis primaria en el ci-rrótico. Se han llevado a cabo diversos estudiosexperimentales con el objetivo de caracterizareste fenómeno, a menudo con resultados con-tradictorios52-56.

Se ha constatado este hecho cuando se pro-duce un síndrome compartimental abdominalcon compromiso del flujo esplácnico, como ocu-rre en pacientes quirúrgicos graves, en trauma-tismos graves o en quemados, así como tambiénen cuadros de peritonitis. Deitch et al57, en unmodelo experimental en ratón, objetivaron que laincidencia de translocación bacteriana estaba di-

111


Endotoxemia sistémica

Conducto torácico

Sistema lacunarlinfático/diafragma

Endotoxemia sistémica

Hígado (células de Kupffer)

Vena porta

Paso directo desdeel peritoneo a lamicrocirculación

Fig. 1. Posibles rutas de transporte de la endotoxina desde el peritoneo a la circulación sistémica.

rectamente relacionada con la presencia de en-dotoxina intraperitoneal y que este fenómeno eradependiente de la dosis. Por su parte, la reab-sorción sistémica de esta endotoxina contribuyea la persistencia del cuadro según los estudiosrealizados por el grupo de Wilmore, en los queevidenciaron un incremento de la permeabili-dad intestinal en presencia de endotoxina circu-lante58.

Si bien no está todavía bien establecida la re-levancia de la translocación bacteriana en la pa-togenia de la peritonitis espontánea; diferentesautores han objetivado una mayor frecuencia detranslocación bacteriana en animales cirróticosque desarrollan peritonitis bacteriana espontánearespecto a los animales con líquido ascítico esté-ril59,60. Sin embargo, todavía son necesarios másestudios que confirmen esta asociación.

Se ha estudiado el papel del estado inmunita-rio en la translocación bacteriana. Berg et al61

han objetivado que la inoculación de fármacosinmunosupresores favorece la translocación bac-teriana a los ganglios linfáticos mesentéricos,bazo, hígado y riñón en un modelo experimentalen ratón. Simmons et al62 han valorado la impor-tancia de la inmunidad mediada por células y enestudios experimentales en ratones; la estimula-ción de las células T con IL-2 daba lugar a unasignificativa reducción de la incidencia de trans-locación bacteriana a los ganglios linfáticos me-sentéricos.

Avances que ha supuesto el modeloen la profilaxis y el tratamientode las infecciones intraabdominales

Los estudios realizados por Weinstein et al en197428,29 permitieron objetivar una evolución bi-fásica de la infección consistente en una fase ini-cial de peritonitis dependiente de los gérmenesaerobios y una segunda fase de absceso a ex-pensas de gérmenes anaerobios. Los mismosautores63 demostraron algo que otros autores hanconfirmado posteriormente: el hecho de que losantibióticos frente a gérmenes coliformes aero-bios reducían la mortalidad en la fase de perito-nitis, mientras que los antibióticos anaerobicidasdisminuían la formación de abscesos de los su-pervivientes pero no la mortalidad. Aun existien-do esta distinción entre ambas fases, en estudiosmás recientes64 se objetivó, sin embargo, que esnecesaria la combinación de aerobios y anaero-bios para que tenga lugar la formación de absce-sos intraabdominales. Gracias a estos estudiossabemos que es preciso cubrir gérmenes aero-bios y anaerobios si se desea que el tratamiento

antibiótico de una infección intraabdominal seaefectivo.

Los diferentes modelos de peritonitis anterior-mente mencionados han sido utilizados para eva-luar diferentes regímenes antibióticos16,65. Alm-dahl et al66 demostraron la importancia delsoporte con sueroterapia en un modelo experi-mental de peritonitis en ratas en las que la admi-nistración de nutrición parenteral o suero gluco-salino disminuía significativamente la mortalidaddel 100 al 50%. Así mismo, cuando administra-ban por vía intravenosa una pauta de antibiotera-pia combinada con tinidazol y cefotaxima redu-cía la mortalidad al 15 %, que fue casi nulacuando se asoció una nutrición parenteral.

Trabajos recientes se han centrado en el de-sarrollo de sustancias destinadas a la regulaciónde la respuesta del huésped. Las citocinas pue-den ser bloqueadas por pretratamiento con an-ticuerpos neutralizadores específicos. Estudiosiniciales en los que se han utilizado anti-TNF su-girieron que protegían a ratones y conejos frentea los efectos letales de lipopolisacáridos (LPS) ybacilos gramnegativos. Por contra, el papel clíni-co de la terapia anti-TNF en presencia de un focoséptico continuado continúa sin aclararse.

En muchos de los estudios experimentales pu-blicados sobre los efectos beneficiosos del trata-miento con la antiendotoxina, anti-TNF, e IL-1ra,esta terapéutica se instauró inmediatamente an-tes o, como máximo, dentro de las 2 h de la ad-ministración de una dosis de LPS y el tiempo dela terapia fue crítico. No parece existir beneficiosi se suministra después de desarrollarse todo elsíndrome del shock séptico. El síndrome clínicodel shock séptico es raramente el resultado de laliberación de una sola dosis masiva de endotoxi-na bacteriana. Los pacientes con sepsis poseenun foco continuo de infección desde el cual se li-beran de forma intermitente endotoxina y bacte-ria. La terapia con antiendotoxina parece actuarprotegiendo contra el efecto de subsiguientesepisodios de endotoxemia y bacteriemia antesque influir directamente en las condiciones delpaciente en el momento de la administración delanticuerpo.

Una de las complicaciones más frecuentestras la realización de cirugía sobre un abdomencon peritonitis consiste en la infección de la heri-da quirúrgica. La profilaxis antibiótica ha reduci-do de forma importante su incidencia y diferentesestudios clínicos y experimentales han permitidovalorar los posibles factores decisivos en la efica-cia de dicha profilaxis como son la farmacociné-tica, el momento de administración o los valoresen tejidos del antibiótico utilizado. Algunos auto-

112


res han valorado el papel de la administración tó-pica de antibióticos con el fin de contrarrestar laposibilidad de concentraciones infraterapéuticasde los antibióticos sistémicos, pero los resultadosno han sido concluyentes, probablemente en re-lación con diferencias en la cantidad de conta-minación bacteriana de la herida o la presión uti-lizada para la irrigación. Badía et al67 valoraron elpapel de la irrigación de la herida con suero fisio-lógico como tratamiento adyuvante a la profilaxisantibiótica en cirugía contaminada y objetivaronque el factor más determinante para la infecciónde la herida fue el número de bacterias presen-tes en los márgenes de la herida al final de la ci-rugía y que la irrigación que utilizaban conseguíauna importante reducción del número de bacte-rias presentes en la pared abdominal con unadisminución significativa del número de infeccio-nes de la herida.

En cuanto a la posible influencia de la translo-cación bacteriana en el desarrollo de peritonitisbacterianas espontáneas en cirróticos, Casafontet al60 han observado una mayor prevalencia detranslocación bacteriana en ratas cirróticas conmalnutrición, lo que favorecía el desarrollo deuna peritonitis bacteriana espontánea. Si estoshallazgos se confirman en pacientes cirróticos, lamejoría de su estado nutricional podría disminuir,según los autores, la translocación bacteriana y,como resultado, dar lugar a una significativa re-ducción del riesgo de complicaciones infeccio-sas, especialmente la peritonitis bacteriana es-pontánea.

Nuevos planteamientos en la eralaparoscópica

La aplicación de la laparoscopia en cirugía ab-dominal ha permitido comprobar que esta técni-ca ofrece una serie de ventajas clínicas que con-fluyen en la rápida recuperación del paciente.Puesto que la recuperación postoperatoria delpaciente viene determinada por el grado de agre-sión inducido, la observación de una mejor re-cuperación postoperatoria en los pacientes so-metidos a cirugía laparoscópica ha permitidoestablecer la hipótesis de que esta técnica con-lleva un menor grado de agresión. Diferentes es-tudios han confirmado esta hipótesis a partir delestudio de la respuesta inflamatoria a través de lamedición de las concentraciones de citoci-nas68-73.

Una de las ventajas clínicas observadas en lospacientes sometidos a cirugía laparoscópica esuna menor incidencia de complicaciones infec-ciosas, como se desprende del análisis de series

amplias de pacientes intervenidos por laparosco-pia. También se ha observado que la utilizaciónde la cirugía laparoscópica en pacientes con unaperitonitis establecida no incrementa la morbidi-dad postoperatoria74,75 y un reciente metaanálisisha confirmado que la apendicectomía laparoscó-pica se acompaña de un significativo descensode las complicaciones infecciosas respecto a lacirugía abierta. Por su parte, Miserez76 y Lau77

objetivaron una morbilidad similar y un menor re-querimiento de analgesia en los grupos de pa-cientes sometidos a cirugía laparoscópica frentea laparotomía como tratamiento del ulcus pépti-co perforado. Estos hechos permiten suponerque la cirugía laparoscópica no comporta efectosindeseables en un ambiente séptico.

Diversos estudios experimentales han estudia-do la respuesta a la infección intraabdominal trascirugía laparoscópica respecto a la cirugía abier-ta. Dos hechos relevantes que distinguen la ciru-gía laparoscópica de la convencional son la ob-tención de un espacio de trabajo mediante larealización de un neumoperitoneo y la utilizaciónde CO2 para obtenerlo. Varios estudios han valo-rado el efecto del CO2 sobre una infección intra-abdominal establecida. Jacobi et al78, en un mo-delo de peritonitis en rata, no objetivaron unincremento de la bacteriemia y de la formaciónintraperitoneal de abscesos tras laparoscopia encomparación con la laparotomía.

Nuestro grupo analizó la respuesta precoz a lacontaminación peritoneal basándonos en la hi-pótesis de que la menor agresión quirúrgica y lamayor preservación de la integridad del peritoneodurante la cirugía laparoscópica respecto a la ci-rugía abierta conllevaría una mejor respuesta ini-cial a la infección peritoneal79. Esta hipótesis seconfirmó al valorar los resultados obtenidos en losgrupos a los que se indujo una contaminaciónabdominal, ya que los grupos de animales some-tidos a una laparotomía presentaron un recuentode UFC/ml peritoneal significativamente superior,así como también un mayor porcentaje de he-mocultivos positivos, tanto a las 24 h como a las72 h respecto a los grupos laparoscópicos. Al es-tudiar la respuesta inflamatoria en estos grupostambién observamos un aumento significativo delas concentraciones de citocinas en los grupossometidos a cirugía abierta, tanto locales comosistémicas.

También se ha valorado el posible efecto lesi-vo de la presión intraabdominal elevada, y aun-que Eleftheriadis et al80 demostraron en un es-tudio experimental con ratas que la presiónintraabdominal elevada (15 mmHg) daba lugar auna isquemia intestinal, con producción de radi-

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cales libres de oxígeno e incremento de la trans-locación bacteriana, otros autores no han objeti-vado diferencias en la bacteriemia y la difusiónhematógena de endotoxinas entre ambas técni-cas aplicadas a modelos experimentales de peri-tonitis78,81,82. El nivel de presión intraabdominalutilizado puede justificar las diferencias obtenidaspor Eleftheriadis. Se puede sugerir que una pre-sión intraabdominal excesiva dé lugar a altera-ciones de la circulación esplácnica y sistémicaque justifiquen los hallazgos de Eleftheriadis,pero no es la situación habitual en la práctica clí-nica.

Por otra parte, tras la realización de una inter-vención quirúrgica existe un grado de inmuno-depresión proporcional a la agresión provocada yque puede valorarse a través del estudio de algu-nos de sus componentes. Diversos autores83,84

han estudiado la actividad de los macrófagos y delos linfocitos T, y han observado que tras la ciru-gía laparoscópica existe una mayor preservaciónde la capacidad fagocítica y de presentación delantígeno por parte del macrófago respecto a la ci-rugía abierta. En el caso de una contaminaciónintraabdominal, el déficit de capacidad fagocita-ria producido favorecerá la proliferación bacte-riana.

Bessler et al85 estudiaron la función inmunita-ria dependiente de los linfocitos T a través de lamedición de la hipersensibilidad retardada, ob-servando una función inmunitaria mejor preser-vada tras la cirugía laparoscópica.

Por otra parte, algunos autores consideran unposible efecto bacteriostático del CO2 a partir deestudios en los que se objetivó un enlenteci-miento del crecimiento de las bacterias someti-das a una atmósfera de CO2.

Otros autores consideran que la ausencia delaire ambiente durante la laparoscopia ejerceríaun papel protector contra la infección intraabdo-minal.

Evrard et al86 valoraron la posible influencia delCO2 en la inmunidad celular tanto sistémicacomo peritoneal. Partiendo de la base de que ladisminución del pH tiene efectos adversos sobrela viabilidad de los linfocitos T y que el pH está engran parte regulado por la presión parcial de CO2,estudiaron los efectos del neumoperitoneo conCO2 sobre los linfocitos peritoneales sin objetivardiferencias en la viabilidad de los mismos antes ydespués del neumoperitoneo. Todo ello podríajustificarse por un incremento en la producciónlocal de bicarbonato.

Miner y Levine87 no encontraron un efecto in-hibitorio sobre el crecimiento bacteriano de lascondiciones atmosféricas existentes durante la la-

paroscopia. En cambio, Collet88, en un estudioexperimental realizado en el cerdo, demostró queel aclaramiento intraabdominal de E. coli tras suinstilación era superior tras la insuflación de CO2

respecto a la laparotomía. Así mismo, Champaultet al89 observaron un enlentecimiento del creci-miento bacteriano cuando sometieron coloniasde E. coli y S. aureus a una atmósfera de CO2.

En conclusión, la cirugía laparoscópica permi-te mantener una mejor respuesta a la infecciónintraabdominal como consecuencia de un con-junto de factores entre los que destaca la preser-vación de la integridad funcional peritoneal, asícomo de la función inmunitaria y de la respuestainflamatoria90.

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J.M. MIRÓ: A raíz de los resultados presentados,una conclusión sería que a menor agresividad,como es el caso de la laparoscopia, menor res-puesta inflamatoria y por tanto esto favoreceque haya menos infección intraabdominal en elmodelo experimental, contrariamente a lo queocurriría con la laparotomía, que produce mu-cha más agresividad quirúrgica y mucha mayorrespuesta inflamatoria.

M.C. BALAGUÉ: Sí, tanto los modelos experimenta-les como clínicos han constatado que la res-puesta inflamatoria es menor con la laparosco-pia. Aunque también hay que tener en cuentaotros factores. Se ha observado que medianteeste tipo de abordaje quirúrgico también estámás preservada la inmunidad. Concretamenteen casos de peritonitis se ha constatado unamejor capacidad fagocitaria de los macrófagostras cirugía laparoscópica que tras cirugía abier-ta. Además, la menor lesión y desecación a ni-vel de la cavidad abdominal producida por estatécnica permiten una mejor preservación de losmecanismos locales de defensa y, en conse-cuencia, una mayor efectividad en la elimina-ción de bacterias a nivel peritoneal.

P.J. CARDONA: Sin embargo, las concentracionesde TNF y de IL-1 no varían significativamente.

M.C. BALAGUÉ: Sí que se observó cierto incre-mento superior de IL-1 con la laparotomía res-

pecto a la laparoscopia. Sin embargo, los resul-tados más evidentes se obtienen con IL-6 y conproteína C reactiva. Aunque otros autores handemostrado una mayor elevación del TNF enpacientes intervenidos por laparotomía, nues-tros datos al respecto fueron muy variables y nopudimos llegar a unas conclusiones claras.

J.M. GATELL: Si se atribuye una mayor tasa de in-fecciones a una respuesta inflamatoria más im-portante, ¿existe algún estudio con laparotomíaque compare la respuesta al inóculo con la res-puesta al inóculo junto con fármacos antiinfla-matorios?

M.C. BALAGUÉ: En la revisión bibliográfica sobre eltema, no he encontrado ningún modelo con ad-ministración de antiinflamatarios. Sin embargo,se dispone de estudios que valoran la eficaciaterapéutica de sustancias anti-TNF y de anta-gonista o anticuerpos frente al receptor de laIL-1, con las cuales se ha observado una dis-minución de la respuesta a la infección. Sin em-bargo, desde el punto de vista terapéutico estosestudios tenían poco valor, puesto que las sus-tancias debían administrarse inmediatamenteantes de la infección o de forma simultánea,mientras que con su empleo posterior ya noeran efectivas.

J.M. MIRÓ: Muchos de nosotros somos clínicos omicrobiólogos y, por tanto, un objetivo para no-

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117


DISCUSIÓN

sotros sería disponer de un modelo para la pre-vención o el tratamiento de las infeccionesintraabdominales. Basándoos en vuestra expe-riencia, ¿cuál de los seis modelos descritoscrees que reúne las mejores condiciones parapoder evaluar la eficacia del tratamiento de lainfección intraabdominal?

M.C. BALAGUÉ: Creo que la utilización de las cáp-sulas de gelatina con suspensiones de Escheri-chia coli y Bacteroides fragilis es la que reúnelas mejores condiciones. Considero que es elmodelo que más se aproxima a la situación real,fácilmente controlable y con mayor uniformidaden cuanto a la obtención de resultados, a dife-rencia de otros modelos muy empleados comoel de la ligadura y perforación cecal en los cua-les no se controla el inóculo.

J. PACHÓN: En el modelo de la cirugía laparoscópi-ca, la presión del gas que se introduce, ¿modifi-ca la bacteriemia o la evolución de la infección?

M.C. BALAGUÉ: Nosotros no observamos cam-bios. Algunos autores, como Eleftheriadis han

descrito que presiones intraabdominales ele-vadas, de unos 15 mmHg en ratas, producíanuna mayor absorción translinfática y un mayorporcentaje de hemocultivos positivos. Sin em-bargo, otros grupos como el de Jacobi, tam-bién en rata y con presiones intraabdominalesmás bajas, por debajo de 10 mmHg. no obser-varon incrementos en la absorción intraperito-neal. Este último modelo se ajusta más a loque nosotros utilizamos en clínica, en lo que apresiones intraabdominales se refiere. De to-das formas, los estudios experimentales lleva-dos a cabo hasta la fecha obtienen resultadoscontradictorios, en parte por la utilización dediferentes modelos de infección (con mayor omenor agresividad) o diferentes presiones in-traabdominales. En la clínica diaria, todavía nohay resultados definitivos sobre el efecto delpneumoperitoneo en pacientes con peritonitisgraves y/o shock séptico. En estos casos, pro-bablemente deberemos recurrir a utilizar bajaspresiones.

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RESUMEN

En las últimas décadas se ha producido un au-mento en la prevalencia de las infecciones fúngi-cas que ha conllevado el desarrollo de todos loscampos de la micología médica, incluidos losmodelos experimentales de infecciones fúngicas.Hasta hace unos años, sólo existían modelospara realizar muestreos con antifúngicos, estu-dios de supervivencia o determinación de con-centraciones plasmáticas de fármacos, pero enla última década se han desarrollado varios mo-delos discriminatorios que intentan reproducir lainfección fúngica como ocurre en humanos, yque analizan diferentes parámetros que influyenen la secuencia de infección. En este artículo sedescriben algunos de estos modelos de infec-ción fúngica. En primer lugar, un modelo de can-didiasis diseminada en ratones, tras colonizaciónsostenida del tracto gastrointestinal e inmuno-depresión de los animales. A continuación, unmodelo de aspergilosis invasora tras inoculaciónrespiratoria e inmunodepresión. Por último, sedescriben brevemente otros modelos. Así mismose incluyen también sus ventajas, limitaciones yposibles aplicaciones.

Palabras clave:Patogenia fúngica. Candidiasis sistémica experi-

mental. Aspergilosis pulmonar.


La micología médica posee una historia relati-vamente corta. Puede aceptarse que esta espe-cialidad de la microbiología se inició a finales delsiglo XIX. De esta fecha datan las primeras des-cripciones de los principales agentes etiológicosde micosis, tanto en humanos como en animales

(dermatofitosis, aspergilosis, candidiasis, cripto-cocosis, histoplasmosis, etc.). No obstante, no hasido hasta las últimas décadas cuando se ha ob-servado que las infecciones fúngicas han aumen-tado en número y en gravedad, lo que ha conlle-vado un mayor desarrollo de la micología médica1.Este incremento de las micosis se ha producidoen paralelo al del número de enfermos inmuno-

FUNGAL INFECTIONS ANIMAL MODEL

During last decades there has been a persis-tent rise in the prevalence of mycotic diseasesafflicting humans that have led to a significant ex-pansion of our knowledge of the medical myco-logy. Experimental models of fungal infections arean integral part of these progresses. A few yearsago, animal models of infection evaluated the ef-ficacy antifungal agents, survival rate or plasma-tic levels of antifungal agents. During last yearshave been developed discriminative models thatare designed to mimic the infection in humans.In these models, multiple parameters of efficacyare measured to ascertain the initiation and pro-gress of fungal infections. Herein we describedtwo discriminative models of fungal infection.Firstly, a mice model of sustained gastrointestinalcolonization by Candida albicans and dissemina-ted infection after immunosuppression. Likewise,a model of invasive aspergillosis in immunosup-pressed mice is also summarized. Finally, othermodels of fungal infection are briefly described.Advantages, limitations and applications are alsoincluded.

Key words:Fungal pathogenesis. Experimental sistemic candi-

diasis. Pulmonary aspergillosis.

Modelos animales de infecciones fúngicasManuel Cuenca-Estrellaa, Juan Luis Rodríguez-Tudelaa,* y Joan Gavaldàb

aUnidad de Micología. Centro Nacional de Microbiología.Instituto de Salud Carlos III. Madrid. bServicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital General Vall d’Hebron. Barcelona.

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deprimidos, pacientes que por sus característicasy por las prácticas diagnósticas y terapéuticas alas que se ven sometidos, han proporcionado labase para que se produzcan cambios ecológicosy epidemiológicos que están desplazando a lospatógenos fúngicos tradicionales2,3.

Esta breve historia de la micología médica ayu-da a entender las razones por las que apenas exis-tieron avances científicos en este campo hasta losaños sesenta, y por qué, desde entonces, los pro-gresos han sido constantes. En estos años se des-cubrieron los primeros antifúngicos con utilidad te-rapéutica (5-fluorocitosina y algunas moléculaspoliénicas), y tras ellos han ido surgiendo los queactualmente se utilizan en la práctica clínica diaria(azoles, anfotericina B, antifúngicos lipídicos, etc.).También se han conseguido pruebas diagnósticaseficaces y en los últimos años se dispone de téc-nicas de tipificación subespecífica4,5.

Obviamente, los modelos de infección fúngicaen animales se han visto influidos por el desarro-llo de la micología médica. Desde 1960 hasta1985 se describieron más de 1.000 modelos ani-males que valoraban diferentes aspectos sobre eluso de antimicrobianos en los cuadros infeccio-sos. De todos ellos, una veintena estaban dise-ñados para el estudio de la infección fúngica y delos antifúngicos y, además, se desarrollaron in-tentando reproducir las infecciones fúngicas pri-marias y las infecciones de la piel y las mucosas6.

El aumento en la prevalencia de las infeccio-nes fúngicas diseminadas en pacientes inmuno-deprimidos, junto con la aparición de fármacosantifúngicos útiles para el tratamiento de estas in-fecciones, han conllevado que en la última déca-da se hayan publicado varias decenas de mode-los experimentales de infección fúngica7-9.

En la actualidad, existen modelos de variadosdiseños y utilidades. La complejidad de los mis-mos, junto con la brevedad de estas líneas, obli-gan a describir con detalle únicamente los queaportan más información y que, por tanto, pue-den tener una mayor utilidad. Son los denomina-dos modelos discriminatorios, que intentan re-producir la infección fúngica como ocurre enhumanos, y que analizan multitud de parámetrospara obtener la mayor información posible (fac-tores de virulencia, farmacocinética, farmaco-dinamia, etc.)9. No obstante, en micología no sehan desarrollado modelos que puedan conside-rarse de referencia. No existe acuerdo sobre quéespecies animales deben emplearse. Tampoco loexiste sobre la edad, el género, el régimen inmu-nosupresor y el inóculo.

Aun así, en los últimos años se han publicadonumerosos trabajos que han desarrollado algunos

modelos animales de infección fúngica. A éstos vaa referirse el presente artículo. En primer lugar, sedescribirá un modelo de colonización gastrointes-tinal por Candida albicans, con diseminación sis-témica. En segundo término, un modelo de infec-ción invasora por Aspergillus fumigatus, trascolonización previa del tracto respiratorio, y comotercer y último punto, se resumirán brevementeotros modelos de infección fúngica de probadautilidad.

Modelos de infecciones fúngicas

Modelo de candidiasis sistémica

En los primeros modelos experimentales quese desarrollaron intentando reproducir las infec-ciones diseminadas por C. albicans, las levadu-ras se inoculaban por vía intravenosa7. Pero losmodelos de infección deben imitar lo más posi-ble las vías de contagio y diseminación que utili-zan los agentes infecciosos en el ser humano.Así, desde que se conoce que la mayoría de lasinfecciones por C. albicans tienen un origen en-dógeno, se han desarrollado nuevos modelos decandidiasis profunda o diseminada. C. albicans yotras especies de Candida forman parte de la flo-ra comensal del tracto gastrointestinal humano.Desde esta localización pueden diseminarsecausando infecciones profundas en enfermos in-munodeprimidos o con otros factores desenca-denantes4. De esta forma, los modelos de candi-diasis diseminada que se emplean actualmentese basan en la colonización sostenida del tractogastrointestinal de los animales de experimenta-ción, en la inmunosupresión de los mismos y enla valoración de la infección diseminada.

1. Descripción del modelo

Animales de experimentación. Se han desarrolla-do modelos de este tipo en varias especies deanimales (ratón, rata, conejo, etc.), aunque en lamayoría de ellos se utilizan ratones Swiss libresde patógenos específicos. No existe acuerdosobre el peso, el género o la edad de los mis-mos10-15.

C. albicans no es constituyente habitual de laflora intestinal del ratón, y además, el tracto gas-trointestinal de los ratones adultos sanos no sue-le colonizarse con facilidad16,17. Por ello, estosmodelos se diseñan con ratones neonatos o rato-nes adultos que son tratados con antibióticos deamplio espectro y fármacos inmunodepresorespara facilitar la colonización por levaduras o in-cluso, se usan ratones inmunodeprimidos me-

120


diante manipulación genética (BALB/c, CD2F1,etc.). Los ratones neonatos se utilizan por su fa-cilidad para ser colonizados, dada la inmadurezde su sistema inmunológico y la escasez de suflora intestinal7,10-15,18.

No obstante, si se quiere reproducir fielmentela secuencia de esta infección en humanos, lacolonización sostenida debe conseguirse antesde que los ratones estén inmunodeprimidos. Eneste sentido, se han desarrollado varios modelosque intentan conseguir la colonización gastroin-testinal sostenida sin emplear ratones inmuno-deprimidos ni fármacos inmunosupresores. En-tre éstos destacan los que añaden el inóculo alpienso de los ratones19, los que suplementan elagua con hidratos de carbono20 y los que utilizandosis bajas de antibióticos de amplio espec-tro21,22. Las estrategias son muy variadas, pero entodos se busca la colonización gastrointestinalsostenida por C. albicans, tras la cual, se los ra-tones son tratados con inmunosupresores.

En la Unidad de Micología del Centro Nacionalde Microbiología del Instituto de Salud Carlos IIIse ha estandarizado un modelo murino de colo-nización gastrointestinal sostenida por C. albicansen ratones adultos sanos (Swiss/CD-1). Para con-seguir la colonización se emplea agua estéril su-plementada con glucosa (50 g/l) y tetraciclina(1 g/l).

Inoculación de los animales. Dependiendo de laestrategia empleada para conseguir la coloniza-ción gastrointestinal, la inoculación debe pla-nearse de una u otra manera. En los modelosdescritos, los ratones son tratados con antibióti-cos o hidratos de carbono de 3 a 15 días antes deser inoculados20. En el modelo con glucosa y te-traciclina, el agua de los ratones se suplementa48 h antes el inóculo.

El inóculo empleado debe ser elevado, entre1 × 106 y 5 × 108 unidades formadoras de co-lonias (UFC)/ml10-15. Se ha observado que coninóculos más bajos no se obtienen buenos re-sultados en la colonización gastrointestinal. Cadaratón es inoculado intragástricamente con0,1-0,2 ml, mediante agujas especiales de pun-ta roma para alimentación animal.

Valoración de la colonización gastrointestinal porC. albicans. La colonización gastrointestinal sevalora mediante cultivos de heces de ratones ele-gidos al azar. Puede aceptarse que se ha conse-guido la colonización sostenida cuando se obtie-nen coprocultivos uniformemente positivos paraC. albicans, durante 10-14 días, y con valores decolonización de 102-106 UFC/g de heces.

En algunos modelos se ha analizado la in-fluencia de las levaduras y los suplementos sobrela flora gastrointestinal del ratón. En el caso de latetraciclina, ésta origina descensos tanto en la flo-ra aerobia y anaerobia facultativa como en la ana-erobia estricta, aunque existen datos que indicanque sus efectos se producen, principalmente,por la inhibición de la flora anaerobia facultati-va21. En la figura 1 se representan las alteracio-nes en la flora intestinal por especies bacterianas,además de la colonización por C. albicans.

Con la utilización de hidratos de carbono se ob-serva que C. albicans puede pasar a fase micelialcon mayor facilidad, lo que conlleva un mayor gra-do de penetración en la mucosa gastrointestinal20.Ambas consecuencias, el descenso de la florabacteriana y la penetración en la mucosa gastroin-testinal, pueden explicar la colonización sostenida.

Inmunosupresión. Una vez que se ha documen-tado una colonización gastrointestinal sostenida,se debe pasar a la inmunosupresión de los rato-nes, con el fin de que las levaduras se diseminendesde el tracto gastrointestinal. Se han utilizadodiferentes regímenes con un solo inmunosupre-sor o con combinaciones. Las combinaciones defármacos citostáticos y de corticoides son las queobtienen inmunodepresiones más profundas(menos del 10% de los valores normales de leu-cocitos)23,24.

Las dosis de inmunodepresión pueden pautar-se cada 24, 48 o 72 h. La vía de administraciónsuele ser mediante inyecciones intraperitonealeso intravenosas. En el modelo estandarizado en laUnidad de Micología del Centro Nacional de Mi-crobiología se emplean ciclofosfamida (150 mg/kgde peso) y metilprednisolona (65 mg/kg de peso)cada 72 h, por vía intraperitoneal. Con esta pau-ta se consigue una profunda inmunosupresión ala séptima u octava dosis.

Los descensos en el número de leucocitospueden determinarse mediante recuentos celu-lares de la sangre periférica de ratones seleccio-nados, realizados en un hematocitómetro.

Evaluación de la diseminación. En el ratón, lacandidiasis diseminada ocasiona inmovilidad,pérdida de peso y erección pilosa; también pue-den aparecer síntomas oculares y cerebelosos.Cuando se observa alguno de estos signos entrelos ratones inoculados, los animales se sacrificanmediante dislocación cervical. En el caso de quese esté valorando la respuesta a un tratamientoantifúngico, se observa la evolución de los ani-males, y se sacrifican aquellos en los que apare-ce fallo terapéutico.

121

MODELOS ANIMALES DE INFECCIONES FÚNGICAS

Es importante tener en cuenta que los fárma-cos inmunodepresores pueden producir sínto-mas como inmovilidad y pérdida de peso. Porello, se debe incluir en el experimento un grupocontrol sin inocular, pero al que se le aplican es-tos fármacos.

Los ratones sacrificados con sospecha de can-didiasis diseminada se diseccionan en condicio-nes asépticas. Se toman muestras de varios ór-ganos, generalmente hígado, riñones y bazo,aunque pueden incluirse otros como pulmones,corazón y cerebro. Se hacen cultivos cuantitati-vos de las muestras viscerales, anotando los re-sultados en UFC por g de órganos.

Se pueden realizar siembras en medios paracultivo de bacterias, con la intención de analizarsi las levaduras se diseminaron en compañía deflora intestinal, ya que la presencia de bacteriasen las vísceras puede influir negativamente en lasfuturas aplicaciones del modelo de infección fún-gica.

En la tabla I se observan los resultados obteni-dos con el modelo empleado en la Unidad de Mi-cología del Centro Nacional de Microbiología.Descritos brevemente, se obtuvo la colonizacióngastrointestinal sostenida en el 100 % de los ra-tones inoculados (se utilizaron seis aislamientosclínicos de C. albicans), y la diseminación se ob-servó en el 60% de los animales.

Un aspecto interesante a la hora de evaluar ladiseminación es la realización de estudios histo-lógicos. Los exámenes anatomopatológicos de losórganos infectados aportan una valiosa informa-ción. Se ha observado que la unión gastroesofá-gica (UGE) es el lugar en el que se produce unmayor nivel de colonización. En el cuerpo del es-tómago, en el duodeno y en el yeyuno-íleon la co-lonización es mucho menor7. En la UGE se ob-servan levaduras en fase micelial, que puedenllegar a penetrar hasta la submucosa. La evolu-ción de la lesión suele conllevar profundas úlce-ras necróticas, desde donde se produce la dise-

122


10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Semana 6Inicial

Flora anaerobiaStreptococcus spp.Staphylococcus spp.EnterobacteriaceaeOtros microorganismosCandida albicans

ID

Fig. 1. Alteraciones en la flora intestinal de los ratones, a lo largo de las semanas de duración del modelo de candido-sis diseminada de la Unidad de Micología del Centro Nacional de Microbiología. El gráfico también representa la co-lonización por C. albicans; ID: día en que se comienza el régimen inmunodepresor. Los resultados se expresan enUFC/g de heces � log10.

minación, generalmente por vía hematógena,aunque en algunos casos puede seguir el siste-ma linfático o simplemente provocar fístulas e in-fectar las vísceras por continuidad25. En los mo-delos que emplean suplementos dietéticos dehidratos de carbono se ha observado un mayornúmero de levaduras en fase micelial, penetran-do y ulcerando la mucosa gástrica20. Esto puedeexplicar los porcentajes de diseminación tan ele-vados que se obtienen en estos modelos. El usode antibióticos de amplio espectro ayuda a la co-lonización gastrointestinal, pero parece ser sóloun coadyuvante de la diseminación, ya que nodebe olvidarse que, siendo la UGE el lugar en elque se produce una mayor colonización, ulcera-ción y diseminación, la flora bacteriana es muyescasa en esta zona del tracto intestinal.

También aportan información los estudios his-tológicos de los órganos infectados. En ellos sue-len observarse microabscesos con necrosis cen-tral, y abundantes levaduras e hifas infiltrando lostejidos y produciendo necrosis celular7. La res-puesta inmunitaria no se conoce con exactitud,pero parece estar mediada por la colaboración devarios factores. Linfocitos T, macrófagos, neutró-filos y monocitos participan en ella, y varias cito-cinas, factores de necrosis tumoral y el factorestimulante de colonias de granulocitos-macró-fagos parecen modularla2-4. En animales inmu-nodeprimidos la respuesta, obviamente, varía.Los citostáticos, como la ciclofosfamida, lesionancélulas en división, como las de la médula ósea ylas de la mucosa gastrointestinal. La lesión sobreesta última contribuye a la diseminación hema-tógena de las candidiasis de origen endógeno.Los corticoides afectan a la respuesta inmunita-

ria celular. Así, en los tejidos de ratones inmuno-deprimidos la respuesta inmunitaria es escasa,por lo que se producen los microabscesos y la in-filtración necrosante.

2. Ventajas y limitaciones del modelo

Con anterioridad se destacó que los modelosanimales deben intentar imitar la secuencia deinfección como ocurre en el ser humano. Losmodelos que inoculan intragástricamente las le-vaduras, y después causan la inmunodepresiónde los animales reproducen con bastante fideli-dad la candidiasis sistémica de origen endógenode los pacientes inmunodeprimidos. Por ello, losexperimentos que se planean en estos modelosaportan una información que puede ser aplicadapara el estudio de esta infección en humanos. Enla tabla II y en el apartado de “Aplicaciones delmodelo” se resumen las principales aplicacionesde estos modelos, y los avances que han su-puesto para el estudio de esta infección fúngica.

Los modelos que inoculan las levaduras por víaintravenosa no reproducen la vía de infección delas candidiasis sistémica de origen endógeno. Noobstante, se emplean en estudios de superviven-cia que analizan la virulencia o la respuesta al tra-tamiento o a la profilaxis con un antifúngico. Losresultados obtenidos en estos trabajos deben in-terpretarse con rigor, y no deben aceptarse confacilidad extrapolaciones al ser humano, ya quela fisiopatología de esta infección no ha sido re-producida en el modelo.

Por otra parte, los modelos que utilizan la co-lonización gastrointestinal presentan algunas li-mitaciones que deben valorarse a la hora de pla-

123


TABLA IRESUMEN DE LOS RESULTADOS DEL MODELO DE CANDIDOSIS DISEMINADA DE LA UNIDAD DE MICOLOGÍA DEL CENTRO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA

GruposDía de inicio inmunosupresión Día de la muertea Diseminación

Ratones Concentración Ratones Concentración Ratones con Concentracióncolonizadosb en hecesc colonizadosb en hecesc diseminaciónb en órganosc

Controles 0/10 0 0/10 0 0/10 0Agua estérild 8/30 2,91 ± 0,31 24/30 4,80 ± 0,28 3/30 2,73 ± 0,67Tetraciclina 30/30 5,28 ± 0,18 30/30 7,08 ± 0,31 18/30 4,14 ± 1,31

y glucosae

aDía de la muerte hace referencia al día en que los ratones fueron sacrificados por presentar síntomasde candidiasis diseminada, o si no la presentaron, al día final del experimento.bLos datos indican ratones número de ratones infectados/número total de ratones por grupo.cLos datos se expresan en media ± desviación típica de las UFC/g de heces × log10.dAgua estéril se refiere a los ratones que estaban inoculados pero que no fueron tratados con glucosay tetraciclina; eratones que fueron tratados con glucosa y tetraciclina.

near su desarrollo. En primer lugar, la necesidadde inducir en los ratones una inmunodepresióntan intensa obliga a trabajar con material estéril.La estabulación y el mantenimiento de los ani-males deben incluir pienso irradiado, agua esté-ril, sistemas de filtración del aire y otras precau-ciones. Todo lo anterior complica el desarrollo delmodelo, por lo que se requieren estabularios do-tados para la utilización de este tipo de animales,y un personal con formación especializada.

Este tipo de modelos se ha desarrollado princi-palmente con C. albicans, y en algunas ocasionescon Candida tropicalis26,27. Con esta última se hanobtenido peores resultados en la colonización gas-trointestinal y en la diseminación. Con otras espe-cies de Candida apenas existen datos publicados.No obstante, las candidiasis sistémicas causadaspor Candida parapsilosis, Candida krusei y otrasespecies de levaduras no parecen tener un origengastrointestinal, sino que su vía de infección sueleser la colonización de catéteres y sondas de los en-fermos28. Con estos datos, no parece que tengasentido el desarrollo de modelos de colonizacióngastrointestinal con estas especies de levaduras, yparece más razonable plantear el desarrollo de unmodelo de los denominados ex vivo.

La necesidad de obtener una colonización sos-tenida, y tras ello causar una profunda inmuno-depresión, hacen que la duración de los experi-mentos sea prolongada (6-8 semanas). De estaforma, las levaduras que diseminan desde eltracto gastrointestinal, alcanzan diferentes vísce-ras, se producen abscesos y numerosas levadu-ras se disponen en fase micelial. Con lo anterior

se intenta reproducir lo que ocurre en los enfer-mos inmunodeprimidos, pero tiene como conse-cuencia cierta inexactitud a la hora de valorar ladiseminación. En la evaluación de la infecciónsistémica suele utilizarse el cultivo de las víscerasafectadas, expresándose los datos en UFC/g teji-dos. Sin embargo, los cultivos sólo reflejan la pre-sencia de levaduras en los tejidos, sin tener encuenta si están en fase micelial o celular. La fasemicelial de las levaduras se ha relacionado consu virulencia, ya que colabora en la invasión tisu-lar y en la resistencia a los mecanismos de de-fensa del huésped4,29. Todo lo anterior tiene unatrascendencia especial cuando este modelo seutiliza en la valoración de la profilaxis o en el tra-tamiento de la infección. La reducción en el nú-mero de UFC/g de tejido se interpreta como quela profilaxis o el tratamiento antifúngico analizadoen el modelo tiene utilidad. Sin embargo, no sue-le tenerse en cuenta si en los tejidos siguen exis-tiendo lesiones con levaduras en fase micelial. Lareducción en el número de UFC puede ser unmagnífico índice de eficacia en algunos casos,pero en otros pueden existir lesiones con orga-nismos miceliales, cuyo cultivo rinde un escasonúmero de UFC, pero que está causando una in-fección grave que no responde al tratamiento.Actualmente no existe una solución satisfactoriapara este problema, aunque algunos especialis-tas proponen la utilización de técnicas que inten-ten determinar antígenos de la fase micelial30,métodos de biología molecular (PCR)31,32, tincio-nes histológicas o estudios de imagen para seguirla evolución de las lesiones viscerales29.

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TABLA IIPOSIBLES APLICACIONES DEL MODELO DE CANDIDIASIS DISEMINADA

Aplicaciones Características de las que existen datos publicadosEstudio de factores de virulencia Adhesinas

Aspartil proteasasPropiedades hidrofóbicasFase micelial

Estudio de factores favorecedores Alteraciones de la flora bacterianaLesiones en la mucosa gastrointestinal

Análisis de la respuesta inmunitaria Respuesta inmunitaria celularInmunomoduladoresPosibilidad de estudiar ratones con alteraciones genéticas

Valoración de moléculas antifúngicas Estudios farmacocinéticosModelos profilácticosModelos terapéuticosCorrelación in vitro-in vivoModelos con nuevas moléculasEstudios de sinergismo

3. Aplicaciones del modelo

En la tabla II se resumen las aplicaciones yavances que ha supuesto el modelo de coloniza-ción gastrointestinal y posterior diseminación, enel conocimiento de la candidiasis sistémica.

Estos modelos ofrecen la posibilidad de explo-rar la fisiopatología de la infección. C. albicans co-loniza el tracto gastrointestinal de los humanosdurante los primeros años de vida. Además, seha aislado en alimentos, en objetos personales yen el medio hospitalario, por lo que son frecuen-tes las recolonizaciones. Las candidiasis sistémi-cas aparecen en enfermos con inmunodepresióny con factores que favorecen la diseminación.Entre estos últimos destacan tratamientos anti-bióticos que dañan la flora bacteriana gastroin-testinal y las alteraciones de la mucosa digestiva.En definitiva, se produce un sobrecrecimiento delevaduras en la mucosa, se facilita su disemina-ción y la respuesta inmunitaria que podría con-trolar la infección se encuentra alterada4,7,29.

En estos modelos, se han estudiado los facto-res que pueden influir en la secuencia de lainfección. Se conoce que existen factores de vi-rulencia de las levaduras como adhesinas (ma-nanos)30, proteinasas y aspartil proteasas29, lapresencia de propiedades hidrofóbicas o la ten-dencia a entrar en fase micelial que favorecen laadhesión e invasión de la mucosa gastrointesti-nal20. En los modelos pueden incluirse cepas quetengan alterados alguno de los factores y propie-dades anteriores, y de esa forma se puede anali-zar su capacidad de producir una infección dise-minada33,34. También se ha comprobado cómolas alteraciones de la flora bacteriana tanto aero-bia como anaerobia, y la lesión que pueden cau-sar los fármacos citostáticos sobre la mucosaayudan a la colonización y diseminación16,17,21-23.Así mismo, se han analizado los distintos factoresque intervienen en la respuesta inmunitaria paracontrolar la infección. Actualmente no se conocecon exactitud esta respuesta, pero se acepta queestá constituida por un complejo mecanismo deinteracciones humorales y celulares, en el que loslinfocitos T desempeñan un papel primordial29.Existen modelos que utilizan ratones inmuno-deprimidos mediante manipulación genética(knock-out, transgénicos, etc.), en los que se es-tán analizando qué componentes de la inmuni-dad son los principales en el control de la candi-diasis sistémica endógena7,18.

Sin embargo, estos modelos han sido utiliza-dos con más profusión en los estudios que anali-zan la profilaxis y los tratamientos antifúngicos.Se han desarrollado distintos modelos para eva-

luar la eficacia de antifúngicos mediante análisisde supervivencia, medición de concentracionesfarmacológicas o descenso de UFC en los teji-dos7,9,33. Aunque en muchos de ellos se ha em-pleado la infección parenteral, es el modelo decolonización gastrointestinal, inmunosupresión ydiseminación el que ofrece la posibilidad de exa-minar los diferentes parámetros que influyen enel desarrollo de la infección, y posteriormente, enla respuesta al tratamiento y en el control de lamisma. En ellos se debe pautar el tratamiento an-tifúngico o la profilaxis intentando reproducir la si-tuación de los enfermos inmunodeprimidos. Porejemplo, un modelo profiláctico debería diseñar-se con una pauta de antifúngicos que cubrieratodo el período de tiempo en el que los animalesse encuentran inmunodeprimidos.

Se han desarrollado diferentes estudios en losque se evalúan diferentes pautas profilácticas oterapéuticas10,14,34-36. También se pueden reali-zar valoraciones de nuevas moléculas (polienoslipídicos, equinocandinas, sordarinas, nuevosazoles, etc.)4,37. En la actualidad, este modelo esuno de los mejores métodos de los que se dispo-ne para realizar estudios de correlación in vitro-invivo. Así, se han llevado a cabo estudios inocu-lando aislamientos con resistencia in vitro al flu-conazol o a la anfotericina B35. También se hananalizado aislamientos secuenciales de enfermosen tratamiento antifúngico prolongado (infecta-dos por el virus de la inmunodeficiencia humana[VIH] con candidosis orofaríngea), que han idodesarrollando resistencia in vitro al antifúngico.Con estos aislamientos se ha valorado si existeuna alteración en la virulencia de las cepas y surespuesta al tratamiento con antifúngicos ante losque presentaban resistencia in vitro36. Tambiénpueden diseñarse modelos en los que se trate alos ratones con dos moléculas antifúngicas, valo-rando el sinergismo de las mismas.

Modelo de aspergilosis invasora

En los últimos años se han desarrollado mode-los animales que pretenden analizar la secuenciade infección de la aspergilosis invasora. Ante-riormente, únicamente existían modelos experi-mentales de aspergilosis que se utilizaban paramuestreos de antifúngicos, y modelos monopa-ramétricos que medían concentraciones de fár-macos en fluidos orgánicos o descensos en lasUFC tisulares tras el tratamiento antifúngico8,9. Enellos se inoculaban los animales, generalmenteratones (inmunodeprimidos o no), con una dosisletal del hongo, para en una segunda fase anali-zar la virulencia de las cepas o la invasión tisular.

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Sin embargo, estos modelos aportan unainformación limitada, por lo que se han desarro-llado modelos discriminatorios que examinan di-ferentes parámetros que influyen en la infec-ción38-40. Estos modelos intentan reproducir unaaspergilosis invasora. Su diseño ha sido posiblegracias a un mayor conocimiento epidemiológicode la aspergilosis38. A. fumigatus coloniza el trac-to respiratorio superior del ser humano mediantela inhalación de esporas del hongo. Es un orga-nismo ubicuo, que se encuentra en cualquiermedio. La secuencia de infección es muy varia-ble, pero brevemente puede afirmarse que se de-sarrolla en enfermos colonizados que reciben untratamiento inmunodepresor, y en pacientes in-munodeprimidos que se colonizan en el mediohospitalario5. Se han descrito varios modelos queintentan reproducir la secuencia mencionada. Acontinuación se describe, en líneas generales, lametodología que debe emplearse para desarro-llar un modelo discriminatorio de aspergilosis in-vasora.

1. Descripción del modelo

Animales de experimentación. Pueden emplear-se varios tipos de animales. Se han publicadomodelos con ratones, ratas, cobayas, conejos,pavos, vacas, monos, pollos y patos. La mayoríade los modelos publicados utilizan ratones Swiss,aunque no existe acuerdo sobre su edad y gé-nero. Algunos autores señalan que la utilizaciónde conejos o ratas facilita la inoculación por sumayor tamaño. Se deben utilizar animales libresde patógenos específicos. También existe la po-sibilidad de desarrollar el modelo en animales in-munodeprimidos mediante manipulación genéti-ca (ratones atímicos, ratones C5-deficientes,C57BL/6, BALB/c, CD2F1, etc.)8,38.

Inoculación de los animales. Para reproducir lavía de infección más habitual de la aspergilosis in-vasora los animales tienen que ser inoculados porel tracto respiratorio. El método más empleado esla inoculación intranasal, aunque se han descritootras vías de infección. En la inoculación intrana-sal, los animales deben anestesiarse previamen-te mediante la inhalación de éter dietílico. Trasesto, se les aplican 25-50 �l de una suspensiónde suero salino con un 0,01% de Tween 80 quecontiene esporas de A. fumigatus. La cantidad deesporas con que cada animal es inoculado varíasegún las publicaciones (5 × 102–5 × 104), aun-que los mayores porcentajes de infección e inva-sión se consiguen con los inóculos más eleva-dos39,40.

El tamaño de los animales parece que influye di-rectamente sobre la cantidad de inóculo necesa-rio; así, la inoculación intranasal suele utilizarseen modelos desarrollados en ratones38. Su prin-cipal limitación es la falta de exactitud a la horade evaluar qué cantidad de esporas alcanzan lospulmones de los animales. Por ello, se han desa-rrollado otros métodos, como la inoculación in-tralaríngea y la punción transtraqueal. Son siste-mas algo más cruentos que el intranasal, por loque el porcentaje de mortalidad postinoculaciónes más elevado. Con estos dos últimos métodosla cantidad de inóculo es menor y, para facilitarla técnica, suelen emplearse animales de mayortamaño que el de los ratones, siendo los conejosy las ratas los más utilizados.

Inmunodepresión. Los regímenes de inmunosu-presión que se describen en estos modelos sontambién muy variados, y no existe una pauta es-tandarizada. La vía de administración puede serla intraperitoneal o la intravenosa. En general, losanimales empiezan a inmunodeprimirse con ci-tostáticos 3 días antes de la inoculación, y a algu-nos modelos se les añaden corticoides. Las dosisde inmunosupresores son variables. A modo deindicación cabe citar que en el caso de la ciclo-fosfamida se emplean dosis de 150-200 mg/kgde peso, con metilprednisolona de 65-130 mg/kgde peso y con acetato de hidrocortisona de112,5-200 mg/kg de peso. Otra posibilidad es lade inmunodeprimir a los animales sólo con corti-coides intentando reproducir la secuencia de laaspergilosis de los enfermos que reciben cortico-terapia prolongada40.

En la tabla III se resume el régimen de inmu-nosupresión del modelo de aspergilosis invasoracon el que se trabaja en la Unidad de Micologíadel Centro Nacional de Microbiología del Institu-to de Salud Carlos III.

Evaluación de la invasión tisular. La valoración dela invasión tisular puede realizarse mediante elrecuento de UFC en tejidos, los exámenes histo-lógicos o la determinación de la antigenemia deA. fumigatus38. Con esto último se intenta rela-cionar la extensión de la enfermedad con dife-rencias en las concentraciones plasmáticas deantígenos fúngicos.

En los animales de experimentación, la asper-gilosis invasora produce inmovilidad, letargo ydisnea40. Cuando se observen estos síntomas, losanimales deben sacrificarse, salvo que se estéevaluando la respuesta a un antifúngico, en cuyocaso se sacrificará a los animales en los que el fa-llo terapéutico sea evidente.

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Es importante tener en cuenta que los fárma-cos inmunodepresores pueden producir sínto-mas como inmovilidad y pérdida de peso. Porello, se debe incluir en el experimento un grupocontrol sin inocular, pero al que se le aplican es-tos fármacos.

Una vez diseccionados los animales en condi-ciones asépticas se extraen los órganos que sedesea analizar. Los pulmones y el cerebro son losórganos que deben examinarse indefectiblemen-te, aunque también pueden incluirse en el análi-sis los riñones, el hígado, el corazón y el bazo.

El recuento de UFC/g en los tejidos se realizamediante cultivos cuantitativos de muestras tisu-lares. Este método es el que más difusión ha te-nido en los modelos de aspergilosis. Pero comose ha señalado en el apartado anterior de “Mo-delo de candidiasis diseminada”, la invasióntisular por hongos conlleva habitualmente la apa-rición de hifas, lo que no puede valorarse me-diante los cultivos de órganos. Por ello, deben in-cluirse exámenes histológicos, que aportan unamayor información sobre la verdadera afectaciónde los órganos. En éstos, puede incluirse la de-terminación de antígenos en los tejidos supues-tamente afectados38,41. Se conocen más de100 antígenos de A. fumigatus, pero reciente-mente se ha demostrado que las concentracio-nes de quitina se relacionan directamente con lamasa fúngica que invade los tejidos39. Determi-naciones serológicas de este antígeno, o técnicasinmunohistoquímicas, pueden convertirse en losmétodos más adecuados para valorar la infec-ción y la respuesta a un tratamiento dado41.También se han propuesto métodos de detec-ción de ADN en los tejidos y en el suero38. Susensibilidad es muy elevada, pero con bajos va-lores predictivos. Es posible que si se desarrollantécnicas cuantitativas, la detección del ADN ten-ga un gran futuro.

No obstante, los métodos de análisis de la an-tigenemia de A. fumigatus que más se han de-

sarrollado son los que detectan hidratos de car-bono del hongo, principalmente galactomana-nos41. Estas técnicas ofrecen la posibilidad dedesarrollar estudios en los que se valora la ex-tensión de la infección. Se emplean técnicas deELISA que determinan las concentraciones deantígeno circulante, y pueden correlacionarsecon la invasión tisular y la respuesta al trata-miento38.

2. Ventajas y limitaciones del modelo

Los modelos que utilizan la inoculación intra-venosa y valoran la supervivencia de los anima-les o las UFC/g de tejido aportan datos sobre larespuesta al tratamiento o a la profilaxis, pero de-ben tomarse con prudencia, ya que no reprodu-cen la secuencia de infección en humanos9. Losmodelos que intentan reproducir la aspergilosisinvasora imitando esta secuencia ofrecen la po-sibilidad de obtener una información de gran va-lor a la hora de comprender la fisiopatología deesta infección.

La inoculación a través del tracto respiratoriopropicia que la invasión tisular se desarrolle deforma similar que en los enfermos inmunodepri-midos. Así, los parámetros que se analicen en elmodelo pueden tener una utilidad práctica indu-dable. Además, es posible valorar los factores devirulencia y la respuesta inmunitaria del organis-mo, constituyendo un magnífico índice de corre-lación in vitro-in vivo8,38.

No obstante, los modelos de aspergilosis inva-sora desarrollados de esta forma presentan algu-nas limitaciones. Es esencial que sean realizadospor personal experimentado, y que el estabulariodisponga del material y de las condiciones nece-sarias para trabajar con ratones libres de patóge-nos y en los que se va a inducir una inmuno-depresión intensa. Por ello, estos modelos nopueden ser mantenidos por muchos laboratoriosde micología.

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TABLA IIIPAUTA DE INMUNOSUPRESIÓN DEL MODELO DE ASPERGILOSIS INVASORA EMPLEADO

POR LA UNIDAD DE MICOLOGÍA DEL CENTRO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍADía del experimento* Fármaco inmunodepresor Dosis Vía de administración

−3 Ciclofosfamida 150 mg/kg Intraperitoneal−1 Ciclofosfamida + metilprednisolona 150 mg/kg Intraperitoneal

75 mg/kg Intraperitoneal3 Ciclofosfamida 150 mg/kg Intraperitoneal6 Ciclofosfamida 150 mg/kg Intraperitoneal9 Ciclofosfamida 150 mg/kg Intraperitoneal

*El día 0 es el día de la inoculación.

Otras limitaciones están relacionadas con lacomplejidad de la cadena de infección de la as-pergilosis5,41. Los modelos que inoculan una grancantidad de esporas del hongo a través del trac-to respiratorio ocasionan en los animales una as-pergilosis hiperaguda. Sin embargo, la aspergilo-sis es una enfermedad que se produce por laexposición repetida a pequeños inóculos de es-poras, a una infiltración lenta de los tejidos y auna invasión de los mismos cuando existe inmu-nodepresión. Se han desarrollado modelos queintentan inocular un reducido número de coni-dias, y que éstas se mantengan durante semanasen los pulmones, con la intención de desarrollarlesiones inflamatorias crónicas. En este sentidoexisten modelos con ratones transgénicos en losque se consigue desarrollar una aspergilosis ino-culando 50 esporas42, y un modelo en el que elhongo es inoculado en el interior de pequeñasesferas de agarosa, consiguiéndose que perma-nezca 6 semanas en los pulmones de los anima-les, para en una segunda fase inmunodeprimir-los e inducir una aspergilosis invasora43. Otros delos aspectos que influyen en el desarrollo de lasaspergilosis invasora en humanos, y que es difí-cil explorar con los modelos discriminatorios, sonlas diferencias de virulencia entre las cepas. Así,con la utilización de inóculos tan elevados esarriesgado diseñar estudios que investiguen si

son cepas de origen endógeno o ambientales lasque predominan en las aspergilosis pulmonaresinvasoras, si existen cepas colonizadoras y cepaspatógenas o si pueden existir aspergilosis invaso-ras producidas por varias cepas38. Estas cuestio-nes no están aún resueltas en humanos, entreotras razones por la falta de técnicas de tipifica-ción subespecífica totalmente estandarizadas41,pero parece obvio que los modelos discriminato-rios que se han desarrollado hasta el momentono exploran estos acontecimientos.

3. Aplicaciones del modelo

Los modelos de aspergilosis invasora tienenvarias aplicaciones. En la tabla IV se resumen lasposibles utilidades de este modelo.

La reproducción en animales de la aspergilo-sis invasora puede emplearse para avanzar enel conocimiento de la fisiopatología de la infec-ción. En primer lugar, tiene aplicaciones en losestudios que intentan descubrir factores de vi-rulencia de este hongo. Se conocen varios fac-tores de virulencia de A. fumigatus, algunos delos cuales se han investigado en modelos concepas mutantes. Entre ellos destacan adhesi-nas, pigmentos, moléculas tóxicas (gliotoxina,hemolisina, etc.) y enzimas (proteasa alcalina,fosfolipasa, etc.)5,38-41.

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TABLA IVPOSIBLES APLICACIONES DEL MODELO DE ASPERGILOSIS INVASORA

Aplicaciones Características sobre las que existen datos publicadosEstudio de factores de virulencia Adhesinas

PigmentosMoléculas tóxicas (gliotoxina, hemolisina)EnzimasFase micelial

Análisis de la respuesta inmunitaria Respuesta inmunitaria celularMacrófagos alveolares y respuesta inmunitaria

inespecíficaRespuesta inmunitaria humoralPosibilidad de estudiar ratones con alteraciones

genéticasMoléculas inmunosupresoras del propio hongo

Valoración de moléculas antifúngicas Estudios farmacocinéticosModelos profilácticosModelos terapéuticosCorrelación in vitro-in vivoModelos con nuevas moléculasEstudios de sinergismo

Aplicación con otras especies fúngicas Aspergillus spp.Fusarium spp.Scedosporium spp., etc.

También se puede analizar la respuesta inmu-nitaria del organismo, que se encuentra formadapor complejas interacciones entre la respuestainmuniatria específica y la inespecífica. Las célu-las ciliadas bronquiales, los macrófagos alveola-res y los linfocitos T parecen tener un papel pre-dominante en esta respuesta inmunitaria. Existenestudios en los que consiguió inmunizar anima-les mediante la inoculación de dosis subletalesde conidias; no obstante, no se desconoce la im-portancia de las inmunoglobulinas en la res-puesta inmunitaria frente a la aspergilosis, aun-que estudios como el anterior apoyan que lainmunoterapia puede ser un acercamiento a con-siderar en pacientes con alto riesgo de aspergi-losis38-44.

Las alteraciones que producen distintos fár-macos inmunosupresores en esta respuesta in-munitaria también son valorables con estos mo-delos. Así mismo, pueden analizarse moléculasinmunodepresoras de origen fúngico, las cualesparecen inhibir la fagocitosis41.

Las aplicaciones del modelo de más difusiónson las que se refieren a la evaluación de molé-culas antifúngicas8. Con la adición de un anti-fúngico en dosis profilácticas o terapéuticas almodelo de aspergilosis invasora puede valorarsesi se controla o no la infección. Así, puede anali-zarse la respuesta al tratamiento de cepas resis-tentes in vitro, constituyendo un buen índice decorrelación entre el laboratorio y la práctica clíni-ca45,46. También pueden valorarse nuevas molé-culas antifúngicas. Entre éstas destacan las pre-sentaciones lipídicas de anfotericina B, nuevosazoles como el voriconazol y el Sch 565-92, o lasequinocandinas47-50. Pueden incluirse tambiénestudios de sinergismo. Así mismo, la inmunote-rapia y la adición al tratamiento de factores esti-mulantes de colonias han sido analizadas en al-gunos modelos, denotando que pueden ser deutilidad en el futuro38.

Por último, el modelo puede emplearse conotras especies fúngicas que pueden tener unasecuencia de infección parecida, como Fusariumspp., Scedosporium spp. y, obviamente, otras es-pecies de Aspergillus51.

Otros modelos de infección fúngica

1. Modelos de vaginitis por Candida

Los primeros modelos de vaginitis por C. albi-cans datan de 1960. Fue uno de los escasos mo-delos animales de infección fúngica que se de-sarrollaron antes de los años ochenta. Existenmuchos trabajos publicados con modelos de va-

ginitis por levaduras, pero puede considerarseque existen dos estandarizados, uno con ratoneshembra y otro con ratas. En ambos se inocula lalevadura con hisopos52.

En estos modelos se ha comprobado la in-fluencia de numerosos factores sobre la inciden-cia de la vaginitis. Así, las alteraciones del cicloestrogénico, el uso de antibióticos de amplio es-pectro, la corticoterapia, los déficit de hierro o ladiabetes se han relacionado con la vaginitis porCandida. También se ha analizado el uso de an-tifúngicos tópicos y sistémicos, y de antisépticoslocales, por lo que han tenido un papel destaca-do en el proceso de estandarización del trata-miento de esta infección. Se han desarrollado, asu vez, modelos con otras especies de levadurasdistintas de C. albicans, con los que se ha obser-vado que sólo C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kru-sei y C. glabrata son capaces de producir infec-ciones vaginales. Actualmente, estos modelos sesiguen empleando por su sencillez y accesibili-dad, y se utilizan fundamentalmente para la va-loración de nuevas moléculas antifúngicas y defactores de virulencia de Candida spp.52-54.

2. Modelos ex vivo

Estos modelos se emplean para estudiar la ad-herencia de los agentes infecciosos a determina-dos cuerpos extraños, y para determinar la difu-sión del antifúngico al lugar de la infección. Laestrategia más frecuente es instalar un dispositi-vo en el tejido subcutáneo, por lo que se empleananimales grandes (conejos Nueva Zelanda, pe-rros o cerdos). El dispositivo puede ser un caté-ter al que se le aplica el inóculo, o un cuerpo ex-traño hueco en cuyo interior hay líquido quepuede incluir un agente infeccioso9,55.

Las aplicaciones de estos modelos se encami-nan a estudios de adherencia de levaduras yhongos miceliales que colonizan dispositivosvasculares, causando posteriormente una infec-ción diseminada (C. parapsilosis, C. glabrata,Dipodascus capitatus, etc.). También tienen uti-lidad en estudios farmacocinéticos y farmacodi-námicos que analicen la difusión del antifúngicohasta dispositivos huecos de fibrina y otros mate-riales porosos, y la actividad fungicida del mismo.

3. Modelos de criptococosis

Hasta la aparición del síndrome de inmunode-ficiencia adquirida (sida), la criptococosis era unainfección poco frecuente, que se había implicadoen la etiología de micosis pulmonares crónicas,tanto en enfermos inmunocompetentes como en

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inmunodeprimidos. Así mismo, las criptococosisdiseminada con meningitis se había descrito enenfermos con graves alteraciones del sistema in-munitario. A finales de los años sesenta se publi-caron los primeros modelos de criptococosis56.

Desde la aparición del sida la situación hacambiado notablemente, lo que ha influido sobreel desarrollo de los modelos de criptococosis. Así,se han diseñado varios modelos, mayoritaria-mente en ratones o en ratas, que intentan anali-zar la secuencia de infección en los enfermos in-munodeprimidos. La vía de inoculación puedeser la intranasal, la parenteral o la punción per-craneal. Se han descrito modelos tanto con ani-males inmunodeprimidos como sanos. Estosmodelos se han empleado en estudios que valo-raban factores de virulencia, como grosor de lacápsula, morfología de la colonia, pigmentación,proteasas y susceptibilidad a los antifúngicos.También han servido para apoyar la búsquedade tratamientos útiles, como el que hoy día seconsidera de elección, la anfotericina B más5-fluorocitosina. Así mismo, tienen utilidad en elanálisis de nuevas moléculas antifúngicas57,58.

4. Modelos de neumocistosis

En 1966 se realizaron los primeros experimen-tos con animales y Pneumocystis carinii59. Noobstante, su baja prevalencia en aquellos años yla necesidad de trabajar con cultivos celulares hi-cieron que los modelos con este microorganismoapenas se desarrollasen. Pero con el aumento ensu prevalencia que ocasionó la aparición del sida,empezaron a desarrollarse modelos de neumo-cistosis, además de otras líneas de investigaciónque demostraron que este agente era un hongo60.

Los modelos actuales inoculan el hongo por víaintranasal o transtraqueal. Con la primera, algu-nos autores destacan la necesidad de un inócu-lo alto y de una inmunodepresión intensa paraque aparezca la infección. Los modelos se handesarrollado con ratones, ratas, conejos y huro-nes. Los animales son tratados con corticoides,administrando la primera dosis unos días antesde la inoculación. También se han empleado ra-tones atímicos y con otras inmunodepresiones.Recientemente se ha publicado que los conejosson muy susceptibles a la neumocistosis, y queno necesitan inmunodepresión para desarrollarla infección61.

Existen modelos que se diseñan con la inten-ción de analizar la progresión de la enfermedaden respuesta al tratamiento, sin necesidad de sa-crificar a los animales. Plantean la toma de mues-tras respiratorias, y su examen, lo que resulta

muy difícil en animales de pequeño tamaño. Porello, se han desarrollado modelos de esta infec-ción en caballos, cerdos y primates que han de-mostrado ser muy susceptibles a la neumocis-tosis62.

No obstante, la mayoría de los modelos queanalizan factores de virulencia, respuesta al tra-tamiento o profilaxis están diseñados con ratonesatímicos o con ratas sanas tratadas con corticoi-des, modelos con los que se obtienen buenos re-sultados a la hora de reproducir la infección61-62.

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J. GAVALDÀ: Si al hablar de los modelos de infec-ción bacteriana ya se habían planteado muchasdudas y habían surgido algunas discusiones,creo que ahora con modelos de infección fún-gica la situación es todavía más extrema. Pode-mos partir, por ejemplo, del modelo de aspergi-losis que se parece bastante a lo que sucede enel enfermo sometido a un trasplante, con inmu-

nosupresión con corticoides y una infección in-vasora con una mortalidad del 100% en 10 o15 días. Pero si a la hora de evaluar los resulta-dos en el modelo de infección bacteriana nosbasamos en el cultivo cuantitativo, para el tipode infecciones que discutimos ahora esto nosirve. Ni los estudios histológicos, ni las técnicasde imagen en animal pequeño, ni escáneres de

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132


DISCUSIÓN

alta resolución nos permiten solucionar el pro-blema, por la limitaciones que suponen. Proba-blemente en todos estos estudios creo que elúnico punto final de evaluación que puedehaber es el aumento de supervivencia o la cu-ración final. En segundo lugar, me gustaría aña-dir que en el tema de la aspergilosis experi-mental, cuando se habla de diferentes tipos deinmunosupresión, creo que hay que diferenciarentre inmunosupresión por corticoides y neu-tropenia. Se trata de dos enfermedades dife-rentes y, por tanto, de dos modelos totalmentediferentes y que, probablemente, todos los es-tudios que se hacen y se hagan en el futuro tie-nen que contemplar el trabajar con los dos mo-delos por separado sin intentar extrapolar losresultados de uno a otro.

M. CUENCA-ESTRELLA: No tiene nada que ver unmodelo con otro. Con el modelo de aspergilo-sis tenemos menos experiencia; hemos reali-zado experimentos muy preliminares y la ino-culación intranasal nos ha funcionado bien,aunque no hemos hecho ninguna valoraciónhistólogica ni de otro tipo, porque estamosplanteando utilizar un modelo parecido a laaspergilosis pero para otros patógenos fún-gicos. Con Candida sí tenemos experiencia ycreo que no tiene nada que ver en muchosaspectos con los hongos miceliales, y ademásno son dos infecciones comparables. Comohas comentado, los modelos que, con reso-nancia magnética nuclear, evalúan la fase mi-celial en los tejidos y constatan cómo va dis-minuyendo, están fuera del alcance de lamayoría de laboratorios. Por ello, actualmentese está empezando a plantear para el modelode la aspergilosis la medición de la quitina.Ésta parece ser que está relacionada con lacantidad de hifas que produce una determi-nada cepa de Aspergillus. De hecho, han apa-recido algunas publicaciones del laboratoriode Aspergillus del Instituto Pasteur, en las queel descenso de quitina sería una constataciónde que el animal estudiado está respondiendoal tratamiento.

M. DOMINGO: Por si os puede servir como mode-lo, la especie aviar y el pollo doméstico, en con-creto, ha demostrado ser altamente susceptiblea la aspergilosis sin necesidad de inmunode-presión previa. En la incubadora y entre el pri-mer y tercer días de vida adquieren por vía aé-rea la infección en masa, y desencadenanespectaculares modelos de aspergilosis con en-trada por vía sanguínea y visualización histoló-gica de hifas en los vasos, en la circulación, in-vasión pulmonar masiva, etc.

M. CUENCA-ESTRELLA: Sobre modelos de aspergi-losis hay muy poco publicado, nada estandari-zado y, fundamentalmente, casi todo el mundoempezó a hacerlo en ratones, probablementepor razones logísticas, mientras que en la ac-tualidad se está ensayando también en ratas yconejos. Aunque no he leído nada sobre estemodelo en especie aviar y por esta vía, es uncomentario a tener en cuenta.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: Bajo mi punto de vistaestá claro que necesitamos un modelo de in-munodepresión, puesto que es la patología quetenemos en humanos, lo que limita que se pue-da emplear un modelo con aves sin inmunosu-presión. El otro problema comentado y tremen-damente grave, incluso con Candida, es elrecuento de UFC, por ejemplo; en el modelo delabceso en muslo de ratón, si bien se observaque el absceso es mucho más grande en elmuslo no tratado que en el tratado, después decultivar ambos muslos se pueden obtener lasmismas UFC por g de tejido. Por tanto, no haymanera de interpretar los resultados, a menosque, como hace el grupo de investigación deGlaxo, y lo tiene más o menos a punto, se em-pleen sofisticadas técnicas de imagen. Pero seencarece de tal manera el modelo que lo haceinviable para la mayoría de grupos de investiga-ción. Con respecto a esos problemas, los mo-delos de patogenia que ha estudiado Jean PaulLatge con Aspergillus con dos genes interrum-pidos, se ha demostrado que no son útiles. In-cluso con dos genes interrumpidos A. fumiga-tus mata igual que sin ellos. De ahí se puedededucir lo difícil que va a ser trabajar con estemicroorganismo y que probablemente, como seha mencionado anteriormente para la medidade la eficacia terapéutica, la supervivencia, seala salida más corta o la más fácil.

J. PACHÓN: Has comentado que evaluáis la sinto-matología de los animales durante el experi-mento, aunque creo que alguna de las sinto-matologías son difíciles de valorar. ¿El sacrificiose hace en tiempos preestablecidos o en fun-ción de dicha sintomatología?

M. CUENCA-ESTRELLA: Cuando el ratón está afecta-do por candidiasis sistémica es facilísimo iden-tificar su sintomatología típica: el animal ha per-dido peso, está prácticamente inmóvil, tiene elpelo erizado y se diferencia claramente de loscontroles sanos y de los controles inmunode-primidos, aunque el propio régimen inmunode-presor produce pérdida de peso y algún otrosíntoma. Resulta difícil llegar a la sexta dosis deinmunodepresión, que sabemos que provocaun nivel de polimorfonucleares por debajo del

133


10%. En estas circunstancias y con esta sinto-matología todos los ratones son sacrificados,salvo que se vaya a valorar la posible respuestaterapéutica. Muy pocos animales con esta sin-tomatología no presentan candidiasis disemi-nada. El resto de animales sin sintomatologíadespués de la sexta dosis de inmunodepresiónse mantienen durante 15-20 días hasta el finaldel experimento, cuando se sacrifican y seanalizan todas sus vísceras. Durante esos15-20 días se mantienen dosis de inmunode-presión con valores de polimorfonucleares infe-riores al 10%, con lo que conseguimos un mo-delo de inmunodepresión crónica con unacandidiasis que se convierte en subcrónica yque es bastante difícil de evaluar. Pero hastaeste momento estamos contentos porque el60% de los ratones tienen candidiasis disemi-nada y en muy pocas ocasiones presentan in-fecciones bacterianas asociadas.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: La verdad es que sabe-mos muy poco del modelo. Estamos apren-diendo todavía y tenemos más dudas que res-puestas. Creo que debemos trabajar todavíamucho, porque se trata de un modelo muy pe-sado, y habrá que definir claramente, sobretodo para valorar la eficacia terapéutica, cuálesson las variables finales.

A. PAHISSA: Como ya se ha matizado anterior-mente, es importante destacar y separar dosgrandes grupos de aspergilosis que son muy di-ferentes entre sí: la del trasplantado o inmuno-deprimido y la del paciente neutropénico. Apartir de ahí, realmente lo que interesa desde el

área de medicina es obtener conclusiones deltipo de aspergilosis que más nos preocupa enla práctica clínica: es decir, de la aspergilosis enpaciente inmunodeprimido, porque sabemosque mata casi a la totalidad de los enfermos. Nonos interesa, por tanto, la colonización aspergi-lar de un amplio grupo de personas sino la as-pergilosis de comportamiento hiperagudo y deelevada mortalidad. Por ello somos partidariosdel empleo del modelo por instilación transtra-queal que nos permite obtener una aspergilosisrealmente masiva, que es la situación real, y esla responsable de la muerte de los pacientes.A partir de ahí, podremos estudiar diferentesposibilidades terapéuticas y alcanzar conclu-siones prácticas para las verdaderas aspergilo-sis que nos preocupan en los hospitales.

M. CUENCA-ESTRELLA: Tengo mis dudas de si real-mente la aspergilosis hiperaguda inducida porel inóculo en el ratón se asemeja fisiopatológi-camente a lo que ocurre en humanos. Las últi-mas publicaciones al respecto sugieren otrasposibilidades de interpretación. Parece ser queen los pacientes que desarrollan una aspergilo-sis invasora, anteriormente se podría haber pro-ducido una infección crónica que sería la res-ponsable de las lesiones en el tejido pulmonar.Siguiendo esta interpretación, se está intentan-do desarrollar modelos experimentales en losque se pueda inocular muy poca cantidad deconídeas, incluso 50 conídeas, repetidas veces,hasta conseguir una lesión pulmonar; tras ello,se inmunodeprime al animal para desarrollar laaspergilosis invasora.

134


RESUMEN

La infección por Mycobacterium tuberculosispuede provocar la enfermedad tuberculosa du-rante toda la vida del huésped en un 10% de losinfectados. Si bien los mecanismos que ocasio-nan la aparición de la enfermedad en el huéspedno han sido todavía dilucidados, los diferentesmodelos experimentales han proporcionado unagran información sobre la importancia de los ma-crófagos, el desarrollo de la inmunidad específi-ca y la memoria inmune que permiten controlara la infección. Los modelos experimentales tam-bién han permitido profundizar en el estudio delos mecanismos patogénicos en caso de reinfec-ción o reactivación, así como en estudios de vi-rulencia. De igual manera, estos modelos hansido imprescindibles en el diseño de pautas deprofilaxis y de tratamiento, para abordar uno delos problemas más importantes que plantea eltratamiento antibiótico en esta enfermedad: lapresencia de bacilos persistentes en las lesiones.De entre todos los modelos descritos, la utiliza-ción del modelo murino de tuberculosis es el queha proporcionado un mayor conocimiento, tantoen la inmunopatología como en la profilaxis y eltratamiento de la misma.

Palabras clave:Tuberculosis experimental. Fisiopatología. Trata-

miento.

Introducción

Cada año fallecen más personas a causa de latuberculosis que debido a ninguna otra enferme-dad infecciosa. Actualmente la mortalidad anualse sitúa en los 3.000.000 de personas, y se diag-nostican 8.000.000 de casos nuevos cada año.Se ha estimado que un tercio de la población

mundial (aproximadamente 2.000.000.000 depersonas) están infectadas, entre las cuales un10% desarrollará la enfermedad. Esta situaciónindujo en 1993 a la Organización Mundial de laSalud (OMS) a reconocer que la tuberculosis erauna “emergencia sanitaria global”, siendo la pri-mera ocasión en que una enfermedad se ha ca-lificado de esta manera1. El hecho que la inci-

TUBERCULOSIS EXPERIMENTAL MODEL

Infection by Mycobacterium tuberculosis caninduce tuberculous disease among 10 % of in-fected hosts. So far, mechanisms concerned inthe development of the disease has not been yetelucidated, but experimental models have beenproviding useful information about the importan-ce of macrophages, development of specific im-munity and memory immunity that allow hosts tocontrol the infection. Experimental models haveallowed to study deepest pathogenic mecha-nisms of reinfection, reactivation, and in studiesabout virulence. Actually, these models havebeen absolutely necessary in figure out one of theparamount problems that represents the antibio-tic treatment of this disease: the presence of per-sistent bacilli in lesions. Among all, the murinemodel of tuberculosis has been the one that hasprovide the deepest knowledge both in immuno-pathology and in profilaxis and treatment of tu-berculosis.

Key words:Experimental tuberculosis. Pathogenesis. Therapy.

Modelos de tuberculosis experimentalPere-Joan Cardonaa,c,*, Vicenç Ausinaa,c y Joan Caylàa,b

aServei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona. bServei d’Epidemiologia. Institut Municipal de la Salut. Barcelona. cUnidad de Investigación en Tuberculosis de Barcelona.

135


dencia en España sea la más alta (después dePortugal) de los países desarrollados, con unaincidencia estimada anual de 45 casos por100.000 habitantes2, y que en España exista latasa más elevada de síndrome de inmunodefi-ciencia adquirida (sida) de los países desarrolla-dos, con el riesgo correspondiente de la apariciónde cepas multirresistentes3, hacen de nuestroentorno un área en la que el control de esta en-fermedad constituye una prioridad absoluta.

Historia natural de la tuberculosis humana

En la mayoría de los casos, la tuberculosis hu-mana es el resultado de la inhalación de las go-tas de Flügge que contienen M. tuberculosis yque se establecen en los alvéolos pulmonaresdonde son fagocitados por los macrófagos alveo-lares. El macrófago infectado puede destruir elbacilo, en el caso que esté previamente activadode manera inespecífica; en caso contrario, el ba-cilo es capaz de multiplicarse en el interior de losfagosomas y destruir posteriormente al macrófa-go. Los macrófagos infectados secretan dife-rentes citocinas para atraer a los neutrófilos y anuevos macrófagos, que fagocitan a los bacilospresentes en el medio extracelular, así como paragenerar un foco inflamatorio. Mientras tanto, losbacilos se van diseminando hacia los nódulos lin-fáticos regionales y los vasos sanguíneos.

Como consecuencia de la infección primariapor M. tuberculosis se produce una diseminaciónsistémica bacilar, por un lado y, por otro, la for-mación de un “complejo primario” compuestopor una linfadenopatía hiliar, donde se origina larespuesta inmune específica y el foco infecciosoparenquimatoso (foco de Ghon) en el que se ori-gina una lesión granulomatosa estructurada poruna necrosis caseosa central, rodeada de ma-crófagos y células epitelioides, y externamentepor linfocitos T. A medida que la lesión evolucio-na, aparecen células multinucleadas de Lang-hans en el interior del granuloma.

La repuesta inmunitaria específica consta notan sólo de la proliferación de linfocitos específi-cos T CD4 que activan a los macrófagos y lostransforman en células epitelioides, capaces dedestruir a los bacilos, sino también por el estímu-lo de una hipersensibilidad retardada de tipo IV,puesta de manifiesto con la prueba de la tuber-culina.

En el 95 % de los casos, el “complejo prima-rio” suele resolverse, pero en un 5% puede ori-ginar una enfermedad primaria, ocasionandocuadros patológicos de diferente gravedad, des-de pleuritis a tuberculosis miliar. En otro 5% de

los infectados, puede originarse una enfermedadposprimaria durante toda la vida del huésped, apartir de la reactivación de focos infecciosos lo-calizados en zonas anatómicas especialmentesusceptibles (como el ápice pulmonar), estable-cidos durante la diseminación hematógena inicialy que habían permanecido en un estado persis-tente. En países en los que existe un alto riesgode infección, este proceso puede originarse me-diante reinfección.

En la enfermedad posprimaria, la respuestainmunitaria y la formación de granulomas son si-milares a las observadas en la enfermedad pri-maria, con la diferencia de que la formación detejido necrótico caseoso es mucho más impor-tante, generando unas lesiones denominadas tu-berculomas4 que no permiten la diseminaciónlinfática o sanguínea de los bacilos. El tejido ca-seoso es desfavorable para la multiplicación delos bacilos; por ello, para desencadenar la enfer-medad en estas lesiones debe producirse el fe-nómeno de liquefacción del tejido caseoso, quese ha asociado al fenómeno de hipersensibilidadretardada5. El tejido liquefactado permite el cre-cimiento masivo de la población bacilar extrace-lular, provocando el incremento de la lesión y, enel pulmón, la erosión bronquial que induce la ca-vitación6. Las lesiones cavitadas reciben un granaporte de oxígeno que permite que se incremen-te más la población bacilar7. Así pues, es posibleestablecer una relación entre la concentraciónbacilar y la presencia de infección o enfermedaden un huésped (fig. 1).

Modelos animales de experimentaciónen tuberculosis

Aproximación histórica

En el estudio de la tuberculosis, se ha trabaja-do mayoritariamente en tres especies animales:el conejo, el cobaya y el ratón. El conejo es el ani-mal en el que la tuberculosis se asemeja más a laevolución humana, puesto que es el único en elque se produce cavitación de las lesiones8,9. Loscobayas desarrollan una hipersensibilidad retar-dada muy intensa, y son más sensibles a M. tu-berculosis que los humanos o los conejos9, lo queocasiona, como en niños y en pacientes inmuno-deprimidos, una enfermedad diseminada por víahematógena, si bien no desarrollan lesiones ca-vitadas10. Los ratones presentan un grado de re-sistencia a M. tuberculosis similar al de los hu-manos, pero desarrollan una hipersensibilidadretardada de baja intensidad y sus lesiones nopresentan necrosis ni cavitación11.

136


Los estudios iniciales sobre patología de la tu-berculosis realizados por Robert Koch se llevarona cabo en diferentes mamíferos. Posteriormente,el estudio de la tuberculosis se centró práctica-mente en las experiencias del grupo de Max Lu-rie, utilizando cepas de M. tuberculosis y de M.bovis con diferentes grados de virulencia, y doscepas de conejos (resistente y sensible)12,13. Es-tos estudios pusieron de manifiesto la importan-cia del macrófago y de la necrosis intragranulo-matosa en el control de la infección por M.tuberculosis.

El año 1952, Middlebrook14 publicó el diseñode un equipo para inducir infecciones por aero-sol, proporcionando inóculos constantes y alta-

mente reproducibles a los animales (fig. 2). Eldiseño de este aparato fue de una gran impor-tancia, puesto que, previamente, la utilización deaerosoles para provocar la infección había provo-cado muchos problemas de estandarización.A partir de este momento, los investigadores dis-pusieron de un instrumento eficaz para crear mo-delos de infección por la ruta que más imitaba lascondiciones de infección en el huésped humano,si bien el peligro potencial, para el personal ma-nipulador, de la creación de aerosoles en el labo-ratorio, ha hecho decantar a muchos grupos porla vía de inoculación intravenosa.

La alta sensibilidad del cobaya a M. tuberculo-sis ha provocado que este animal se haya utiliza-

137

MODELOS DE TUBERCULOSIS EXPERIMENTALLo

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primariaTuberculosis posprimaria

Enfermedad

Infección

Tiempo (en años de evolución)

Fig. 1. Representación gráfica de la historia natural de la tuberculosis humana. Relación entre la histopatología y laconcentración bacilífera en los tejidos. A: el bacilo entra en contacto con un macrófago alveolar; B: el bacilo se divideen el interior del macrófago al mismo tiempo que se atraen al foco infeccioso macrófagos y neutrófilos; C: adquisiciónde una inmunidad específica con la llegada de linfocitos capaces de activar a los macrófagos alveolares, inicio de lanecrosis caseosa; D: formación de un granuloma caseoso; E: resolución del foco infeccioso mediante la esclerosis delgranuloma; F: evolución hacia enfermedad, formación del tuberculoma a partir de una reinfección o de una reactiva-ción (en esta figura se representa una célula de Langhans); G: liquefacción del granuloma e incremento masivo de lapoblación bacilar; G: cavitación. La línea continua representa la evolución de la infección; las dos discontinuas repre-sentan la enfermedad primaria y la posprimaria que se resuelven; la línea de puntos representa la enfermedad que nose resuelve y finaliza con la muerte del huésped.

do profusamente en laboratorios asistencialespara establecer la presencia de M. tuberculosisen las muestras patológicas antes de la apariciónde medios de cultivo eficaces para el aislamientode los bacilos15. También en este animal se rea-lizaron los primeros estudios para establecer lacapacidad virulenta de diferentes cepas de M. tu-berculosis16, teniendo además una especial rele-vancia en la valoración de la eficacia de las dife-rentes vacunas para la tuberculosis17.

Entre los años 1960 y 1970 se empezaron arealizar los estudios clásicos sobre inmunidad enel ratón, animal en el que se estableció el con-cepto de “macrófago activado”18. A partir de en-tonces el estudio experimental de los mecanis-mos inmunológicos de las infecciones en generalse empezó a realizar en este animal y los estudiosen tuberculosis se centraron en el ratón en detri-mento del cobaya, del que en realidad se dispo-ne de muy poca información acerca de su siste-ma inmunológico. A partir de los años ochenta,los estudios inmunológicos experimentaron ungran auge con la aparición de las técnicas de bio-logía molecular, la disposición de anticuerposmonoclonales, y de ratones transgénicos, pro-

porcionando una gran información sobre la redcitocínica en la inmunopatología de la tuberculo-sis en el ratón19, de manera que los estudios eneste animal han desplazado prácticamente a losdel cobaya y del conejo.

Descripción detallada del modelode tuberculosis murina

A continuación se detallará el modelo de in-fección por aerosol y por inoculación intravenosaen el ratón, puesto que son los modelos más uti-lizados.

Se utilizan ratones hembra de 6 a 8 semanasde edad, libres de patógenos específicos (spf),del tipo C57Bl/6. La cepas de M. tuberculosis secultivan en medio Proskauer-Beck, hasta unafase media logarítmica, y se conservan en alícuo-tas de 1 ml a − 70 °C hasta su utilización, valo-rándose su concentración mediante el cultivo dediluciones seriadas en agar Middlebrook 7H11 a37 °C con un 5 % de CO2. Los ratones se infec-tan por exposición a un aerosol durante 45 min,mediante su ubicación en un aparato de infec-ción tipo Middlebrook (Glas-col Inc., Terre Hau-

138


Válvulade control

Válvulade control

Medidorde

corriente

Main air

Unidad nebulizador-VenturiCámara

Filtro Hepa

Compresor

Lámpara UV

Tambor rejado

Deflector

Filtro Hepa

Bombade vacío

Incinerador

Fig. 2. Esquema de una máquina de Middlebrook. Diagrama del sistema de exposición por inhalación de Glas-Col.Esta máquina dispone de un tambor rejado donde se ubican hasta 125 ratones, un compresor de aire para generarel aerosol en el tubo de Venturi y un sistema de ventilación activado por una bomba de vacío, que permiten dosificarel inóculo. Así mismo este dispositivo tiene tres sistemas de seguridad: 1) filtros Hepa de entrada y salida de aire;2) lámparas ultravioleta en la tapa superior de la máquina que se activan posteriormente a la finalización de la gene-ración del aerosol para evitar contaminar al técnico que manipula la máquina al abrirla, y 3) por último, un incinera-dor a la salida del aire para destruir cualquier partícula en caso de fallo de los filtros Hepa.

te, IN), donde hay instalada una unidad de Ven-turi en la que se dispone un volumen de 10 ml deagua destilada que contiene 107 unidades for-madoras de colonias (UFC), lo que proporcionaun inóculo aproximado de 10-50 bacilos viablesen los pulmones de cada animal. En el caso deutilizarse la infección intravenosa, se inoculan0,2 ml de suero fisiológico que contiene 105 UFC.

Para monitorizar la evolución de la infección(fig. 3), se sacrifican los animales, en grupos decuatro, introduciéndolos en una cámara de CO.Las muestras se trituran mediante un homoge-neizador de vidrio. El número de bacilos viablesse determina incubando diluciones seriadas dehomogeneizados de pulmón y bazo en agarMiddlebrook 7H11 a 37 °C con un 5 % de CO2.Para el estudio de la presencia de ARNm de di-ferentes citocinas, se homogeneiza un lóbulo pul-monar en un medio con inhibidores de ARNsas(Ultraspect) y se conserva a −70 °C hasta proce-

der a la extracción del ARNm mediante una téc-nica clásica utilizando alcohol isopropílico y clo-roformo. Para el estudio histológico, se instila unasolución de formalina en phosphate buffer so-dium (PBS) salino en un lóbulo pulmonar y, pos-teriormente, se incluye en parafina para ser teñi-do por las técnicas de hematoxilina-eosina yZiehl-Neelsen.

Si bien parece claro que el modelo que mejorreproduce la infección es el de la inoculación poraerosol, este modelo es realizado por un númeromuy reducido de laboratorios debido a la necesi-dad de disponer de un estabulario de alta seguri-dad para evitar el riesgo potencial que supone lacreación de aerosoles por M. tuberculosis. La di-ferencia entre la inoculación por aerosol o por víaintravenosa es notable. North et al20 objetivaronque en el primer caso la infección es mucho másagresiva para los animales, ocasionando unamortalidad precoz a partir del día 100 postinocu-

139

MODELOS DE TUBERCULOSIS EXPERIMENTAL

7

6

5

4

3

2

1

Log

baci

los/

tejid

o

0 20 40 60 80 100 120 20 40 60 80 100 120

Tiempo (en días)

Pulmón Bazo

Intravenoso

Aerosol

Fig. 3. Evolución de la infección por M. tuberculosis en el ratón, inoculando intravenosamente 105 bacilos viables o20 bacilos viables mediante un aerosol.

lación, mientras que en el segundo caso, los ani-males no morían, al menos hasta el día 200 pos-tinoculación. Los autores señalaban que en lainoculación por aerosol había mucha más afec-tación del parénquima pulmonar, hecho queimplicaría un mayor compromiso respiratorio.Nuestro grupo21 ha corroborado este extremo,observando que en el modelo de inoculación poraerosol las lesiones granulomatosas son signifi-cativamente mayores a las del modelo por inocu-lación intravenosa, y que esto se debería a que laadquisición de la inmunidad y del control de lainfección es más tardía en el modelo de la inocu-lación por aerosol, en contraposición al de ino-culación por vía intravenosa, en el que la con-centración de bacilos inicial es tan importante enel bazo (104 UFC; fig. 3) que estimula la inmuni-dad específica rápidamente.

Ventajas y limitaciones de tuberculosismurina

La utilización del modelo de tuberculosis expe-rimental en el ratón posee numerosas ventajas:

1. La gran similitud con la especie humana encuanto a resistencia ante M. tuberculosis.

2. El gran conocimiento de su sistema inmu-nológico y la gran disponibilidad en reactivos o ra-tones transgénicos defectivos en diferentes mo-léculas implicadas en la patogenia.

3. La posibilidad de poder infectar a un grannúmero de animales al mismo tiempo, en casode utilizar una máquina de tipo Middlebrook,cuya capacidad es de 125 ratones, 25 cobayas o5 conejos, disminuyendo el error de la utilizaciónde varias tandas de inoculación.

4. La economía de espacio y mantenimiento.Por razones de seguridad ambiental, este mode-lo de infección debe llevarse a cabo en un labo-ratorio equipado con un sistema de ventilaciónen depresión; el problema del espacio es muchomás importante en el caso de utilizar animalescomo el cobaya o el conejo.

En cuanto a las desventajas del modelo cabedestacar la ausencia de necrosis intragranulo-matosa y la generación de una hipersensibilidadretardada débil.

En general, cabe señalar que, independiente-mente de la especie animal que se utilice, la rea-lización de los modelos de tuberculosis experi-mental se ha de llevar a cabo en instalaciones deseguridad tipo 3, es decir, equipadas con un equi-po de ventilación en depresión y con filtros de altaeficacia, y en las que se han de tomar medidas

estrictas de esterilización de alimentos y de todoel material fungible utilizado en su interior, y deprotección física del personal para evitar cualquierriesgo de contaminación ambiental por M. tuber-culosis. En el caso de utilizar el modelo de infec-ción por aerosol, hay que añadir el peligro poten-cial de la máquina de Middlebrook que si bienlleva tres sistemas de seguridad incorporadospara evitar la contaminación ambiental (fig. 2), setiene que añadir un cuarto sistema: la ubicaciónde la máquina en un compartimento aislado den-tro del laboratorio, para poder tomar precaucionesen caso de observar cualquier anormalidad en lossistemas de seguridad existentes, lo que evitaría,consiguientemente, cualquier riesgo de exposi-ción accidental del personal técnico.

Avances que han supuesto los modelosde tuberculosis en el conocimiento dela fisiopatología de este proceso infeccioso

La complejidad de la inmunopatología de la tu-berculosis ha hecho y hace imprescindible la in-vestigación de esta enfermedad mediante el usode modelos experimentales en animales.

Los estudios de Lurie, en los que se han utili-zado dos cepas de conejos con diferente gradode sensibilidad a la infección por M. tuberculosis(cepa sensible y cepa resistente), demostraronque la diferencia entre ambas cepas se debía algrado de resistencia innata de los macrófagosque, en el caso de los conejos resistentes, provo-caba una destrucción del inóculo inicial de M. tu-berculosis 20 veces más elevada que en los sen-sibles13. Posteriormente, utilizando la informaciónproporcionada por este modelo, Dannenberg9 haestablecido cinco fases, desde un punto de vistaanatomopatológico, en este proceso infeccioso,destacando la importancia de la activación de losmacrófagos por los linfocitos específicos y de lahipersensibilidad retardada (DTH) en la histopa-tología de la infección (fig. 4):

I. Inicio: el macrófago alveolar fagocita al ba-cilo y lo destruye en caso de estar previamenteactivado.

II. Simbiosis: en el caso de que el macrófagono pueda destruir al bacilo, éste se multiplica ensu interior y se libera cuando este macrófago sedestruye. A continuación, los bacilos son fagoci-tados por otros macrófagos alveolares o por mo-nocitos inactivados, formándose un tubérculo pri-mario y estableciéndose una relación simbióticaen que ni los bacilos destruyen a los macrófagosni éstos a los bacilos. En esta fase se objetiva uncrecimiento logarítmico de los bacilos.

140


141


III

III IVa

IVb

V

Fig. 4. Patogenia de la tuberculosis pulmonar experimental en conejos según Dannenberg (1994). I: fagocitosis delbacilo; II: simbiosis; III: necrosis caseosa inicial; IV: interacción entre destrucción de tejidos y activación de macrófa-gos, en los conejos resistentes (IVa) y sensibles (IVb); V: liquefacción y formación de cavidades. Los macrófagos acti-vados están coloreados en gris, mientras que los destruidos se representan con una línea discontinua.

III. Necrosis caseosa inicial: esta fase se iniciacuando el crecimiento bacilar logarítmico se in-terrumpe, y coincide con el inicio de la necrosiscaseosa y la aparición de la DTH que provoca ladestrucción de los macrófagos no activados quecontienen bacilos. Todavía no existe una res-puesta inmunitaria, puesto que no hay macrófa-gos activados.

IV. Interacción entre destrucción de tejidos yactivación de macrófagos: en esta fase se objeti-va que los conejos resistentes (fase IVa) desarro-llan una importante inmunidad celular que acti-va a los macrófagos, permitiéndoles destruir losbacilos que fagocitan, observándose una mayo-ría de macrófagos activados y poca necrosis enlas lesiones granulomatosas. En el caso de los co-nejos sensibles (fase IVb) se objetivan una menoractivación de los macrófagos y una mayor necro-sis, debido a que presentan poca inmunidad ce-lular y que en ellos sólo es efectivo el proceso deDTH.

V. Liquefacción y formación de cavidades: laliquefacción del tejido necrótico induce la prolife-ración extracelular de los bacilos, el aumento delas lesiones y la formación de cavidades.

La alta sensibilidad de los cobayas a la infec-ción por M. tuberculosis y la facilidad de la dise-minación hematógena de las infecciones hanservido para estudiar el fenómeno de formaciónde lesiones metastásicas, junto con el de su re-activación y el de la naturaleza local de la inmu-nidad celular. Ho et al22 constataron que infec-tando a cobayas mediante un aerosol, el inóculoinicial ocasionaba un cierto número de lesionesprimarias en el pulmón. Este número de lesionesse incrementaba a la tercera semana postinocu-lación como consecuencia de la aparición de unnuevo tipo de lesiones incipientes, metastásicas,secundarias a la diseminación hematógena. Alrealizar el seguimiento de la concentración deUFC en ambos tipos de lesiones, se constató queno seguían la misma evolución, puesto que mien-tras en las lesiones primarias la concentración deUFC se había controlado, en las metastásicas se-guía incrementándose. Así pues, los bacilos quese establecían durante la bacilemia se multipli-caban en los focos metastásicos hasta conseguiruna concentración determinada de antígenoscon la que poder estimular la inmunidad y acti-var a los macrófagos en cada foco infectivo.

Posteriormente, en este mismo modelo Smithet al23 demostraron en un estudio comparativoque las cepas de M. tuberculosis menos virulen-tas no tenían capacidad para ocasionar lesionessecundarias metastásicas. Pudieron demostrar la

teoría de que los bacilos con baja capacidad vi-rulenta generan la enfermedad en el foco inicialde infección, razonamiento que contradecía laopinión generalizada que establecía que la tu-berculosis pulmonar se originaba exclusivamen-te a partir de la reactivación de focos metastási-cos, si bien este tipo de evolución se generaría enentornos con un gran riesgo de infección, pues-to que harían falta muchas infecciones para queel foco generador de la enfermedad se situara enuna localización susceptible al desarrollo de untuberculoma, como el ápice pulmonar.

El modelo de tuberculosis murina ha permiti-do explorar y obtener una visión más clara de lainmunopatogenia de esta infección24. Este grupode investigadores considera que hay dos fases:una protectora y una de control (fig. 5):

I. Fase protectora: los linfocitos T CD4 vírge-nes reconocen a los epítopos de proteínas secre-tadas/exportadas por los bacilos que se multipli-can en el interior del fagosoma del macrófagoinfectado, unidas a moléculas del complejo ma-yor de histocompatibilidad (CMH) de clase II. Es-tos linfocitos se transforman en linfocitos de tipoTh1 bajo la influencia de la interleucina 12 (IL-12)secretada por los macrófagos infectados. Los lin-focitos Th1 se caracterizan por secretar un patróndeterminado de citocinas como el factor de ne-crosis tumoral alfa (TNF-�), que permite la lle-gada de más macrófagos al foco infeccioso, y elinterferón gamma (IFN-�) que activa a los ma-crófagos infectados y permite la destrucción delos bacilos. En esta fase también participan loslinfocitos T ��, que ayudan a la activación de losmacrófagos mediante la secreción de IFN-� y ala proliferación de los linfocitos Th1 mediante lasíntesis de IL-2. Así mismo, mediante la secre-ción de IL-12, el macrófago estimula las célulasnatural killer (NK), que también sintetizan IFN-�.

II. Fase de control: a medida que la infecciónprogresa, los linfocitos Th1 específicos empiezana desaparecer (tienen una vida media corta) yaparecen células de larga duración, cuya misiónsería evitar la diseminación mediante el reconoci-miento de focos nuevos. De esta manera, los lin-focitos T efectores de la hipersensibilidad retar-dada (DTH), al reconocer una amplia gama deantígenos micobacterianos, provocan respuestasgranulomatosas. Otros linfocitos T CD4 tienenfunciones citolíticas, y son capaces de destruirmacrófagos muy infectados; también se ha de-mostrado la presencia de linfocitos T CD8, quedestruirían a células no fagocíticas (como las cé-lulas endoteliales) infectadas mediante la presen-tación de antígenos asociados a moléculas del

142


CMH de clase I. Así mismo, se ha demostrado lapresencia de linfocitos T CD4 de memoria capa-ces de iniciar rápidamente la activación de losmacrófagos infectados en caso de reinfección.

En la respuesta inmunitaria ante M. tuberculo-sis también se ha podido demostrar que se pro-duce una alternancia en el subtipo de linfocito Tque responde ante la infección por M. tuberculo-sis, de manera que, posteriormente a la apariciónde los linfocitos Th1, capaces de activar a los ma-crófagos infectados mediante el IFN-�, y quecoincide con el período de control de la infección,aparece un segundo tipo de linfocito efector: elTh225 (fig. 6). Este subtipo se caracteriza por se-cretar IL-4 y estaría sensibilizado por antígenos delos bacilos “destruidos” que se han acumuladocomo consecuencia de la destrucción del 90 %de la concentración bacilífera (fig. 3) ocasionadapor la activación de los macrófagos infectados. Laemergencia del subtipo Th2 antagoniza con elTh1, bloqueando la destrucción de bacilos y ayu-dando a establecer una infección crónica24.

Avances que ha supuesto el modeloexperimental en la profilaxis y el tratamientode las infecciones

El tratamiento de la tuberculosis humana hade resolver dos problemas principales: a) la apa-rición de mutantes naturales a los antibióticos en-tre la población bacilífera extracelular de las le-siones cavitadas, que tiene una alta velocidad decrecimiento, y b) la recaída de la infección comoconsecuencia de la presencia de bacilos persis-tentes en las lesiones que requieren un trata-miento de larga duración.

Si bien en el modelo de tuberculosis murina nohay necrosis ni cavitación de las lesiones y, portanto, carece de la gran población extracelularexistente en las lesiones humanas, sí que pre-senta una población intracelular equivalente yuna población bacilar persistente, factores muyimportantes en el diseño de pautas útiles paradestruir los bacilos persistentes. De hecho, el mo-delo de tuberculosis murina ha tenido una granimportancia en el diseño de la pauta de trata-

143


Linfocito T CD4Efector de DTH

Linfocito T CD4Citolítico

Linfocito T CD4Citolítico (?)

Linfocito T CD4de memoria

γ / δ

Fase de control

Fase protectora

IL-12

IL-12

IL-2

IFN-γ

IFN-γ

IFN-γ

Fig. 5. Respuesta protectora en el modelo de tuberculosis murina según Orme.

miento de corta duración actual (de 6 meses),realizándose la mayoría de experimentos en esteperíodo, induciendo principalmente la infecciónmediante inoculación intravenosa e iniciando eltratamiento a los 10 días posteriores al inóculo26.Entre estos experimentos dos deben considerar-se claves en el desarrollo de esta terapia:

1. McCune et al27 observaron que la curaciónde la tuberculosis murina experimental era posi-ble después de 3 meses de tratamiento con iso-niacida y pirazinamida. Estos resultados no ha-bían sido conseguidos nunca previamente porninguna de las combinaciones de fármacos exis-tentes. Inicialmente estos resultados no fueronconsiderados importantes porque después de3 meses sin tratamiento un tercio de los anima-les presentó una recaída, lo que demostraba lapersistencia de bacilos en estado persistente enlos animales aparentemente “negativos”.

2. El segundo experimento clave fue realizadopor Grumbach y Rist28 en 1967, cuando se em-pezó a disponer de la rifampicina. En este expe-rimento, todos los animales tratados con la com-binación isoniacida (25 mg/kg) más rifampicina(25 mg/kg) tuvieron cultivos negativos a los 4 me-ses de tratamiento. Esta combinación represen-taba una revolución, puesto que era posible con-seguir la negativización de los cultivos en un100% de los animales, mientras que con la com-binación estándar de isoniacida-estreptomicinasólo el 80% de los animales conseguía la negati-vización de los cultivos en un período de 18 me-ses de tratamiento26.

A partir de entonces se realizaron numerososexperimentos en los que se consideraron dife-rentes combinaciones y dosis con rifampicina enlas pautas de tratamiento; se concluyó que no seobservaban recaídas en tratamientos con isonia-

144


Sec

reci

ón d

e IF

N-γ

en

ng/m

l

Sec

reci

ón d

e IL

-4 e

n ng

/ml

Tiempo postinfección en días

150

100

50

0

100

80

60

40

20

10 20 30 40 50 60

Fig. 6. Evolución de los linfocitos Th1 y Th2 en el modelo de tuberculosis murina. Producción de IL-4 e IFN-� en lin-focitos T CD4 del bazo de ratones infectados por M. tuberculosis, cepa Erdman y estimulados posteriormente in vitrocon antígenos secretados por los bacilos (Orme, 1993).

cida y rifampicina durante 9 meses, si bien noera necesario mantener la isoniacida durante losmeses 6-9, ya que se observaba que la rifampi-cina era un fármaco muy eficaz en la destrucciónde los bacilos persistentes, mientras que la iso-niacida no lo era26.

Posteriormente se reconsideró el papel de lapirazinamida. Al principio se observó que au-mentaba la eficacia de la combinación isoniaci-da-estreptomicina29, aunque la adición de lapirazinamida después del tratamiento con iso-niacida y rifampicina durante 3 meses no au-mentaba la eficacia de esta combinación, inclu-so no incrementaba la eficacia del tratamientocon rifampicina sola30. Se puso así de manifiestola baja actividad de la isoniacida sobre la pobla-ción bacilífera persistente y que la actividad de lapirazinamida frente a esta población no era lo su-ficientemente aparente durante la fase de conti-nuación del tratamiento.

Así pues, a partir de los experimentos en elmodelo murino y también in vitro se consideraque un enfermo con tuberculosis tiene lesionesen las cuales hay cuatro tipos de poblaciones ba-cilíferas26,31 (fig. 7):

A. Población extracelular. Es la más importan-te, se divide activamente en las lesiones cavitariasconsiguiendo a menudo concentraciones de 107 a109 y contiene un número significativo de bacteriasresistentes a cualquier antibiótico por separado.

B. Población intracelular localizada en el inte-rior de los fagosomas acidificados de los macró-fagos y extracelular situada en las paredes de lacavidad necrótica, donde persiste la inflamacióny se mantiene un pH ácido. Se localiza un nú-mero reducido de bacilos (102-105 UFC/g).

C. Población extracelular a pH neutro situadaen el interior de la cavidad necrótica, en el ca-seum, y la población intracelular de los fagoso-mas no acidificados. La magnitud de la concen-tración bacilar es similar a la B.

En las poblaciones B y C el crecimiento es len-to y esporádico, y depende de cambios en el me-dio ambiente (p. ej., en la presión de oxígeno)que permite cortos accesos de crecimiento.

D. Población de bacilos persistentes, con muybaja actividad metabólica, y difíciles de eliminarmediante fármacos.

Las poblaciones B, C y D son las que obligan aprolongar el tratamiento26.

En cuanto a la profilaxis de la tuberculosis enpacientes infectados, a partir de los años ochen-ta se empezaron a realizar estudios en modelosexperimentales para encontrar alternativas a lapauta de isoniacida, debido al peligro de lesiónhepático y a la aparición de cepas resistentes. Elgrupo de Grosset diseñó un modelo experimen-tal basado en el hecho que los individuos infec-tados tienen una población de M. tuberculosisrelativamente limitada y que no se multiplica ac-

145


Alta

Baja

Velocidadde

crecimiento

Bacilos encrecimiento

continuo

Bacilos persistentes

INH, RIF

PZA, INH, RIF

pH ácido pH neutro

RIF, INH

Crecedores esporádicos

(Modificado de Mitchinson DA.Chest 1979 y Grosset. J Clin ChestMed 1980)

A

D

B C

Fig. 7. Representación de las poblaciones bacilíferas presentes en las lesiones tuberculosas y los fármacos que sonactivos contra las mismas. En negrita el fármaco más activo en cada caso. INH: isoniazida; PZA: pirazinamida; RIF: ri-fampicina.

tivamente. Para mimetizar estas condiciones va-cunaban a los animales con M. bovis BCG y unmes más tarde infectaban a los animales intra-venosamente con una concentración reducidade M. tuberculosis (103 UFC), iniciando el trata-miento a los 14 días posteriores32. En estos es-tudios se comprobó que la profilaxis de 2 mesescon rifampicina más pirazinamida o de 3 me-ses con rifampicina sola era tan eficaz como laprofilaxis con isoniacida durante 6 meses, ba-sándose en la capacidad para esterilizar el bazode los animales infectados. Es de destacar queno será hasta 10 años más tarde que ensayosclínicos en humanos comprobarán la eficacia deestas pautas33.

Hoy día, el modelo de tuberculosis murina seestá utilizando ampliamente en la búsqueda denuevos fármacos activos contra M. tuberculosis.Entre éstos se ha demostrado la eficacia de lasnuevas rifamicinas (rifabutina o rifapentina) y lasnuevas quinolonas (ofloxacino, esparfloxacino olevofloxacino). Por otro lado, se están empezan-do a ensayar combinaciones de antibióticos lipo-somados en ratones tuberculosos, que parecentener una eficacia similar a la de los tratamientostradicionales, con dosis más bajas y pautas inter-mitentes.

Conviene, pues, impulsar los modelos de tu-berculosis experimental a fin de aliviar, lo antesposible, la pesada carga que representa la tuber-culosis en el mundo.

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J.M. GATELL: Si no es un secreto de investigación,¿cómo conseguís inducir la necrosis en vuestromodelo de tuberculosis? Por otro lado, para es-tudiar la respuesta serológica, ¿qué ventajasofrece el modelo animal sobre el propio hombre?

P.J. CARDONA: En primer lugar, esta necrosis in-tragranulomatosa es el fruto de una larga y ex-haustiva investigación bibliográfica y de una hi-pótesis generada por un grupo inglés en el queaseguraba que la presencia de necrosis intra-granulomatosa se debía a un fenómeno deShartzman o necrosis hemorrágica. El hecho deinocular localmente lipopolisacárido o TNF, enun tejido con altas concentraciones de TNF,como el granulomatoso generado por infecciónpor M. tuberculosis, provocaría una necrosishemorrágica. Inducimos la necrosis integral alinocular intranasalmente lipopolisacárido de Es-cherichia coli. Respondiendo a tu segunda pre-

gunta, en el animal existe la ventaja de poderreproducir diferentes situaciones como inducirinfección, reinfección, reactivación y podemostratar las lesiones, de manera que nos permiteanalizar qué tipo de respuesta se genera encada caso y, por tanto, diferenciar entre infec-ción y enfermedad. Incluso nos permite es-tudiar lo que ocurre después del tratamiento,la existencia de falsos positivos, falsos negati-vos, etc.

J.M. MIRÓ: Este modelo experimental de tuber-culosis, ¿es un modelo de tuberculosis pulmo-nar o es un modelo diseminado con meningitistuberculosa?

P.J. CARDONA: Es simplemente una tuberculosispulmonar, aunque también se produce una di-seminación renal, hepática, esplénica, etc.,como sucede en la tuberculosis pulmonar hu-mana. Pero no hay afectación de meninges.

28. Grumbach F, Rist N. Activité antituberculeuseexperimentale de la rifampicine, dérivé de la rifamy-cine SV. Rev Tuberc Pneum 1967; 31: 749-762.

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147


DISCUSIÓN

RESUMEN

La osteomielitis humana todavía presenta im-portantes problemas de diagnóstico y tratamien-to. La heterogeneidad de la enfermedad y el grannúmero de variables que influye sobre la misma(microorganismo causal, localización y extensiónde la infección, edad del paciente, condición delhuésped, grado de necrosis, entre otras) difi-cultan su estudio. Los ensayos clínicos con oste-omielitis bien clasificadas y estratificadas sondifíciles de llevar a cabo y generalmente sólo in-cluyen un reducido número de casos. Para con-trolar esta gran cantidad de factores, se handesarrollado modelos animales de confianza si-milares a la infección humana, y que permiten elestudio de la patogenia, el diagnóstico y el trata-miento de la osteomielitis. En este trabajo se rea-liza un breve resumen de los modelos animaleshistóricos y actuales, y se describen con detallelos que nuestro grupo de trabajo ha creado conEscherichia coli, Pseudomonas aeruginosa yStaphylococcus aureus, así como los ensayos te-rapéuticos realizados en los mismos con cefota-xima, ceftazidima, piperacilina, imipenem/cilas-tatina, clindamicina y un factor estimulante decolonias de granulocitos.

Palabras clave:Osteomielitis experimental. Osteomielitis crónica. Pa-

tología.


A pesar de los avances conseguidos en las últi-mas décadas en el tratamiento de las enfermeda-des infecciosas, las tasas de curación que se ob-tienen en la osteomielitis, en particular en suforma crónica, continúan estando por debajo de

la media alcanzada en otros procesos, ya que nose logra esterilizar el hueso en más del 70% de lasocasiones1,2. A esto contribuyen el retraso en sudetección y la falta de unos regímenes terapéuti-cos óptimos. No obstante, se ha progresado nota-blemente en su tratamiento, lo que ha mejoradoel pronóstico. Las nuevas técnicas de imagen

OSTEOMYELITIS EXPERIMENTAL MODEL

Human osteomyelitis still presents importantproblems to evaluate and treatment. The hetero-geneity of the disease and the high number of va-riables with influence (causal organism, site andextent of involvement, age of the patient, condi-tion of the host, degree of necrosis, etc.) compli-cate the study. Clinical trials with osteomyelitis co-rrectly classified and stratified are difficult todesing and usually including a small number ofpatients. To control these multiple factors, it havebeen developed reliable animal models which ap-proach to the human infection, and to allow thestudy of pathogenesis, diagnosis and treatment ofosteomyelitis. In this article we have made a briefreview of the historical and current models andwe describe in detail the models created by ourgroup with Escherichia coli, Pseudomonas aeru-ginosa and Staphylococcus aureus and thetherapeutic trials carried out with cefotaxime, cef-tazidime, piperacillin, imipenem/cilastatin, clin-damycin and a granulocyte colony-stimulatingfactor.

Key words:Experimental osteomyelitis. Chronic osteomyelitis.

Pathology.

Modelos experimentales de osteomielitisManuel Gomis*, José Barberána y Javier Arizab

Servicio de Enfermedades Infecciosas. Hospital del Aire. Madrid. aServicio de Enfermedades Infeccciosas. Hospital Gómez Ulla.Madrid. Departamento de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. bServicio de Enfermedades Infecciosas.

Ciudad Sanitaria de Bellvitge. L’Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

149


como la gammagrafía ósea, la tomografía compu-tarizada o la resonancia magnética han aportadomayor precocidad, sensibilidad y especificidad enel diagnóstico, y el amplio arsenal terapéutico delque hoy día se dispone ha demostrado su eficaciaen muchos casos3-5. Se han realizado numerososensayos clínicos, algunos de escaso rigor científi-co y muy pocos de tipo comparativo. A ello hancontribuido la heterogeneidad de la enfermedad(etiología, patogenia, localización, forma evolutiva,etc.) y la variabilidad existente en otros muchosaspectos (criterios de inclusión y exclusión, defi-nición de aguda o crónica, técnicas de diagnósti-co, pautas de los antimicrobianos, indicacionesquirúrgicas y criterios de respuesta clínica y mi-crobiana), que dificultan enormemente el diseñode los estudios por la incapacidad de conseguirgrandes grupos homogéneos que permitan obte-ner conclusiones definitivas.

Los modelos de osteomielitis en el animal deexperimentación permiten obtener una cantidadde individuos, con las distintas variables de la in-fección unificadas, lo suficientemente ampliacomo para intentar acercarse a la realidad de losproblemas que plantea la infección del hueso.

La historia de la osteomielitis experimental enanimales se inicia en el año 1884, cuando Rodetconsigue desarrollar en el hueso de conejos, prin-cipalmente en las metáfisis del fémur y de la ti-bia, lesiones similares a las de la infección óseahumana, tras inyectarles por vía intravenosa mi-crococcus, aunque en el experimento murieronprematuramente bastantes animales por sepsis6.Diez años más tarde, Lexer repite el experimentousando pequeñas cantidades atenuadas deStaphylococcus spp. para evitar la muerte de losconejos en los primeros días y la aparición de ar-tritis, obteniendo cambios patológicos en el hue-so, pero sin lograr una infección progresiva7. Pos-teriormente, hubo una serie de intentos fallidosllevados a cabo por Starr en 1922, Haldeman en1934 y Thompson y Dubos en 1938, quienesinoculando Staphylococcus aureus por vía intra-venosa o de forma local en el hueso de conejos,sólo observaron lesiones supurativas en la zonade la administración del microorganismo8-10.

En 1941, Scheman et al, en otro modelo en co-nejos, son los primeros autores que consiguenuna osteomielitis crónica progresiva en el animalde experimentación. Para ello, previamente a lainoculación de S. aureus por vía intravenosa o deforma directa en el hueso, introdujeron 0,3-0,4 mlde una sustancia esclerosante denominadamorrhuate sodium al 5%, con el fin de crear unatrombosis vascular. El objetivo se alcanzó en lamayoría de los animales que recibieron la carga

bacteriana localmente y sobrevivieron más de2-4 semanas. La administración por separado dela sustancia esclerosante y de S. aureus no fuesuficiente para inducir la infección. Un porcenta-je muy elevado de animales a los que se les in-yectó el inóculo por vía intravenosa murieron enpocos días con abscesos hepáticos, esplénicos yrenales, y ocasionalmente óseos11. Este mismomodelo fue reproducido en 1966 por Stevens12,pero ni este autor ni los creadores del mismo lle-garon a tener conciencia de la trascendencia quesu invento iba a tener en años posteriores.

La valoración adecuada y el desarrollo definiti-vo llegó con la experiencia de Norden y Kennedyen 1970, quienes perfeccionaron el modelo deScheman estableciendo una osteomielitis cróni-ca de manifestaciones histopatológicas y radio-gráficas similares a la humana. El trabajo fue rea-lizado en conejos blancos Nueva Zelanda, a losque a través de una aguja insertada de formapercutánea en la cara lateral de la metáfisis de latibia, hasta alcanzar la cavidad medular, se les in-yectaba 0,1 ml de morrhuate sodium al 5%, se-guido de la misma cantidad de una suspensiónbacteriana de S. aureus resistente a la penicilinay de suero fisiológico para asegurar la entrada delos anteriores compuestos dentro de la médula.Los estudios histopatológicos demostraron lesio-nes características de osteomielitis con trayectosfistulosos y exudado purulento, y recuperaron elmicroorganismo en más del 90 % de los casoscon un recuento medio de 105 unidades forma-doras de colonias (UFC)/ml. Así mismo, estable-cieron grupos de animales con concentracionesvariables del inóculo, demostrando una relaciónentre la dosis y el efecto. En los hemocultivos rea-lizados, la frecuencia de las bacteriemias dismi-nuía conforme se distanciaban en el tiempo de lainoculación. Los estudios radiográficos fueronaparentes entre las 2 y las 3 semanas despuésde la inyección de la carga bacteriana. El mismoprocedimiento fue realizado con Proteus mirabi-lis alcanzando el éxito en un porcentaje más re-ducido de animales13.

Andriole et al desarrollaron otro modelo de os-teomielitis estafilocócica similar al de Norden yKennedy, con la diferencia de que la inoculaciónse hacía mediante la apertura de un agujero enla cortical de la tibia con la ayuda de un microta-ladro. Además, en una serie de animales intro-dujeron una aguja de acero en el canal medulary en otra produjeron una fractura. En la primera,la infección se observó en todos los casos, y sóloen el 88% de la segunda14.

La participación cada vez más frecuente dePseudomonas aeruginosa en la osteomielitis hu-

150


mana ha llevado a crear modelos experimentalescon este microorganismo. Hubo un primer inten-to por parte de Van Wingerden et al15, pero fue-ron Norden y Keleti los que lo establecieron de-finitivamente en 1980 con la misma técnicaanteriormente descrita. La infección fue másleve, menos destructiva y con menor formaciónde involucro y extensión fuera del hueso que conS. aureus. El microorganismo se recuperó en el90% de los animales16. Este modelo fue modifi-cado por Mader y Wilson en 1986: el morrhuatesodium se introdujo 2 días antes de la inocula-ción y previamente al momento de hacer la mis-ma, y se elevó la concentración de P. aerugino-sa, con lo que la consecución de la osteomielitisfue más rápida y progresiva17.

Johansson et al aprovecharon las anteriorestécnicas para desarrollar un modelo con Bacte-roides fragilis. En él se utilizó una esponja de al-cohol de polivinilo impregnada con el microorga-nismo, que se colocó en la cavidad medular através de un agujero realizado con un microtala-dro, donde con anterioridad se había colocadomorrhuate sodium18.

La utilización de ratas como animal de experi-mentación en la osteomielitis ha sido posterior. Elprimer modelo es el descrito por Zak et al en ra-tas Wistar en 1982. Utilizaron S. aureus y siguie-ron las directrices de Norden y Kennedy con la di-ferencia exclusiva del empleo de un microtaladropara hacer la inoculación y el cierre del mismocon cera ósea. A los 14 días de inyectar la sus-pensión bacteriana fueron evidentes los micro-abscesos y los fragmentos de hueso necrosadorodeados de una infiltración de neutrófilos, aun-que era rara la presencia de secuestros y neofor-mación ósea. En las ratas sacrificadas despuésdel primer mes de la inoculación se comprobó laproducción de una osteomielitis crónica similar ala humana con secuestros, formación de huesoreactivo y un infiltrado crónico con macrófagos19.Rising et al realizaron un modelo parecido en ra-tas Sprague-Dawley, pero haciendo la inoculacióncon una aguja percutánea20. En un segundo tra-bajo emplearon como sustancia esclerosante áci-do araquidónico y demostraron que era tan eficazcomo el morrhate sodium para el desarrollo de laosteomielitis con la ventaja de usar dosis meno-res. Su mecanismo de acción es similar, aunquees probable que las prostaglandinas sintetizadasa partir de él sean las responsables de la res-puesta inflamatoria y de la reabsorción ósea21.

En los últimos años han aparecido algunos tra-bajos en los que se ha logrado la osteomielitis sinutilizar ninguna sustancia esclerosante, cuandoparecía necesaria en anteriores estudios. Así lo

han demostrado Nelson et al en un modelo en ra-tas con P. aeruginosa, donde indujeron la infec-ción en el 90-95 % de los animales22 y másrecientemente Gisby et al en otro modelo conS. aureus23.

Otros animales como perros24,25, cobayas26 ypollos27 también han servido de modelos paraesta infección.

Descripción del modelo

Nuestro grupo de trabajo, ante el incrementode las osteomielitis por bacilos gramnegativoscomo consecuencia de los cambios epidemioló-gicos ocurridos por diversos factores en los últi-mos tiempos (empleo de técnicas quirúrgicasmás agresivas, la adicción a drogas intravenosas,la hemodiálisis las inmunodeficiencias, los trau-matismos asociados a accidentes de tráfico, etc.),desarrolló un modelo de osteomielitis en ratasWistar con varias bacterias de esta característicatintorial, basado en las experiencias previas deZak et al. Posteriormente creamos otro con S. au-reus, siguiendo idénticos procedimientos. Unavez que estos modelos fueron validados, procedi-mos a la valoración de distintos antimicrobianos.

Creación del modelo con bacilosgramnegativos

Material y métodos

Microorganismos. Se escogió una cepa de Es-cherichia coli y otra de P. aeruginosa, ambas deprocedencia clínica. El microorganismo se man-tuvo en incubación en agar Müller-Hinton a35 °C la noche anterior al día de la inoculación.El inóculo se preparó el mismo día de su utiliza-ción, comparando la densidad óptica con la es-cala de McFarland, para obtener una concentra-ción bacteriana de 107 UFC/0,05 ml de E. coli y108 UFC/0,05 ml de P. aeruginosa.

Animales. Se emplearon dos lotes de 30 ratasWistar homogéneas en género, edad y peso, quefueron divididos en cuatro sublotes de 7-8 ani-males. Un lote se inoculó con E. coli y otro conP. aeruginosa.

Preanestesia y anestesia. Treinta minutos antesde la anestesia se administraron a los animales0,6-1 ml (3-5 mg) de clorpromazina por vía in-tramuscular.

La anestesia se realizó por vía intraperitonealcon tiopental sódico, a la dosis de 50 mg/kg depeso. Para su administración se preparó una di-

151

MODELOS EXPERIMENTALES DE OSTEOMIELITIS

lución 1/60 de un vial de 1 ml, conteniendo 1 gde tiopental sódico con agua destilada. La dilu-ción contenía 16,6 mg/ml. Cuando esta aneste-sia no fue suficiente, se suministró éter etílico porinhalación mediante una campana de plástico,conteniendo algodones empapados en la sus-tancia, aproximándola a la cabeza del animalpara facilitar su respiración.

Técnica de inoculación. La pata trasera izquierdase afeitó y se limpió con alcohol de 70°. A conti-nuación se colocó el animal en un campo quirúr-gico estéril. Se practicó una incisión longitudinalmedial, en bloque, en el tercio superior de la tibia(tuberosidad), hasta la cresta tibial, rechazandoplanos musculares, aponeurosis y periostio. Conun microtaladro de dentista, que contenía una bro-ca de 1 mm, se practicó un agujero en la cara in-terna metafisaria hasta alcanzar la cavidad medu-lar. En él se insertó una aguja de 0,8 mm, a travésde la cual se inyectaron 0,05 ml de sulfato de ba-rio estéril diluido al 10% en suero fisiológico (queactúa como sustancia esclerosante), seguido de0,05 ml de la suspensión bacteriana y de 0,05 mlde suero fisiológico para asegurar la entrada de losanteriores elementos. Después, la aguja se retiró,el agujero fue obturado con cera ósea estéril y laherida cerrada en un solo plano con seda. Acto se-guido el animal fue devuelto a su jaula.

Obtención y procesamiento de las muestras.A los 7, 14, 28 y 56 días tras la inoculación, sesacrificaron dos sublotes de ratas, cada uno co-rrespondiente a un microoganismo, utilizandouna sobredosis de tiopental sódico intraperito-neal. Se desarticularon y aislaron las tibias ino-culadas, y se lavaron externamente con alcoholde 70°. Un tercio de las huesos se introdujo enrecipientes individuales con formaldehído al10 % para su procesamiento histopatológico. Elresto del material, tras ser triturado en un morte-ro estéril de acero inoxidable, se colocó tambiénen recipientes individuales con 5 ml de caldo deMüller-Hinton a 4 °C, para su transporte y poste-rior estudio microbiano.

Procedimiento histopatológico. Las muestras ob-tenidas, previamente fijadas en formaldehído al10 %, fueron decalcificadas con ácido nítrico al7%. Posteriormente se procesaron según el mé-todo habitual de inclusión en parafina. Se realiza-ron las siguientes tinciones: hematoxilina-eosina,reticulina de Wilder, PAS y tricrómico de Masson.

Procedimiento microbiano. Las tibias trituradasse incubaron en estufa de cultivo a 35 °C duran-

te 24 h. A continuación se hicieron diluciones se-riadas en suero fisiológico. De cada una de ellasse tomaron 0,025 ml con micropipeta y se sem-braron en placas de Petri con agar Müller-Hintonpara P. aeruginosa y agar MacConkey para E.coli, incubándose 24 h a 37 °C en estufa de cul-tivo. Finalmente se procedió a la lectura de lasplacas e identificación del microorganismo portécnicas habituales.

Lotes accesorios. En 8 ratas accesorias no inclui-das en los lotes anteriores, se provocaron lesio-nes por el taladro, y en otras ocho se hizo lo mis-mo inyectándose a continuación la sustanciaesclerosante (sulfato de bario estéril al 10 % ensuero fisiológico). Las ratas fueron sacrificadas engrupos de dos para su estudio histopatológico, alas 24 h, y a los 3, 7 y 14 días.

Resultados

Mortalidad. Seis ratas (20 %) murieron en las48 h que siguieron a la inoculación de P. aerugi-nosa. Las 24 ratas que sobrevivieron quedarondivididas en cuatro sublotes de 6 animales.

Cinco ratas (16,6%) murieron en las 72 h pos-teriores a la inoculación de E. coli. Las 25 restan-tes quedaron divididas en tres sublotes de seis yuno de siete.

Resultados microbianos. Éstos fueron homogé-neos, recuperándose el agente causal en todoslos casos, con discretos incrementos en el nú-mero de UFC/g (tabla I).

Resultados histopatológicos. El estudio histopato-lógico demostró la aparición de lesiones osteomie-líticas evidentes a partir del día 14 en el caso de P.aeruginosa e incluso antes con E. coli. Había ne-crosis óseas rodeadas e infiltradas por polimorfo-nucleares, células plasmáticas y más hacia la pe-riferia, sobre todo a partir del día 28, se observaronosteocitos y aposición de hueso, tendiendo haciala formación de lesión granulomatosa de cuerpoextraño. Macroscópicamente eran evidentes la os-teólisis y las deformaciones (tablas II y III).

En ocho de las ratas no incluidas en los ante-riores lotes se estudiaron los efectos provocadospor la broca y el taladro, encontrándose lesioneslocalizadas, sin secuestros y con escasa reacciónleucocitaria y fibrosa, y sin reactivación osteo-blástica marcada. En otras 8 ratas tampoco in-cluidas, a las que se inyectó sulfato de bario, seencontraron lesiones esclerosas medulares ydestructivas trabeculares sin reacción osteoblás-tica ni fibrosa.

152


Creación del modelo con S. aureus

Material y métodos

Microorganismos. Se escogió una cepa de S. au-reus sensible a la meticilina, procedente de unaislado clínico de un paciente con osteomielitis.El inóculo, que contenía una concentración de3 × 108 UFC/ml, se preparó de igual forma que elmodelo anterior.

Animales. Se emplearon 50 ratas Wistar homo-géneas en cuanto a género, edad y peso, quefueron divididos en seis grupos. Los cuatro pri-meros de 10 animales y los otros dos de cinco.

Preanestesia y anestesia. Igual al modelo con ba-cilos gramnegativos.

Técnica de inoculación. Igual al modelo con ba-cilos gramnegativos. Los animales del grupo 6 no

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TABLA IRESULTADOS MICROBIANOS DEL MODELO CON BACILOS GRAMNEGATIVOS

Media Log UFC/gMicroorganismo Día del sacrificio Número de muestras ± desviación típicaP. aeruginosa 7 4 7,559 ± 0,129

14 4 7,911 ± 0,09428 4 8,022 ± 0,04356 4 8,201 ± 0,063

E. coli 7 4 7,570 ± 0,08614 4 7,872 ± 0,06628 4 7,967 ± 0,05756 4 8,269 ± 0,056

TABLA IIRESULTADOS HISTOPATOLÓGICOS CON P. AERUGINOSA

Día de sacrificio Macroscopia Microscopia7 Sin alteraciones Sin alteraciones

14 Lesión osteolítica Necrosis supurativa óseaDeformación ósea

28 Lesión osteolítica Necrosis supurativa ósea con secuestros óseosDeformación ósea

56 Lesión esclerosa Lesión crónica esclerosaDeformación ósea Lesión granulomatosa de cuerpo extraño

TABLA IIIRESULTADOS HISTOPATOLÓGICOS CON E. COLI

Día de sacrificio Macroscopia Microscopia7 Lesión osteolítica Necrosis supurativa ósea

Deformación ósea

14 Lesión osteolítica Necrosis supurativa óseaDeformación ósea

28 Lesión osteolítica Necrosis supurativa ósea con secuestros óseosDeformación ósea

56 Lesión osteolítica Lesión crónica esclerosaDeformación ósea

recibieron la suspensión bacteriana, ni los delgrupo 5, sulfato de bario.

Obtención y procesamiento de las muestras. Loscuatro primeros grupos se sacrificaron a los 7, 14,28 y 56 días, respectivamente, tras la inoculacióny el los grupos 5 y 6 a las 2 semanas. La obten-ción y procesamiento de las muestras fue igual almodelo anterior con P. aeruginosa. La mitad delos huesos de los cuatro primeros grupos y todoslos de grupo 6 fueron para estudio histopatológi-co. El resto del material lo fue para el microbiano.

Procedimiento histopatológico y microbiano.Igual al modelo con P. aeruginosa.

Procedimiento estadístico. Los datos obtenidosse han tratado con el programa SPSS para Win-

dows. En la descripción estadística se utilizó lamediana, moda, máximo, mínimo y rango, y enla comparación de grupos el test de la U deMann-Whitney. Se consideró significativo un va-lor de p < 0,05.

Resultados

Resultados clínicos. En los días siguientes a lainoculación las ratas tuvieron un comportamien-to normal. En 12 se observó un aumento de latemperatura corporal al tacto que más tarde de-sapareció y en 14 había signos inflamatorios lo-cales y abscesos de partes blandas en la extre-midad manipulada.

Resultados histológicos. En las tibias de los cuatroprimeros grupos existían lesiones líticas con los tí-picos nidus formados por una zona central de ne-crosis, donde en ocasiones se veían cocos gram-positivos, rodeada por capas de un infiltrado decélulas inflamatorias (polimorfonucleares, linfoci-tos y células plasmáticas) y más periféricamentede una reacción fibrohistiocitaria. Las tibias delgrupo 6 sólo presentaban lesiones fibrosas seme-jantes a un granuloma de cuerpo extraño.

Resultados microbianos. En todas las tibias de losdiferentes grupos que recibieron inóculo bacte-riano, excepto una del grupo 3, se recuperaronestafilococos. En la tabla IV se reflejan las cifrasen UFC/ml y en UFC/g de hueso, en la tabla V laestadística descriptiva y en la tabla VI los resulta-dos de la comparación entre los grupos aplican-do el test de la U de Mann-Whitney.

Modelo con E. coli. Tratamientocon cefotaxima28

Material y métodos

Microorganismos. Se empleó una cepa de E. colicon la que se llevó a cabo una suspensión bac-teriana de 107 UFC/0,05 ml. La concentraciónmínima inhibitoria para cefotaxima fue de0,25 �g/ml. En la preparación del inóculo se si-guieron las mismas normas que en la creacióndel modelo.

Animales. Se utilizaron 48 ratas Wistar homogé-neas en cuanto a género, edad y peso, con lasque se establecieron cuatro grupos:

CNT-1: grupo control sin tratamiento. Las ratasse sacrificaron 56 días después de la inoculación.Contenía 11 ratas.

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TABLA IVRESULTADOS MICROBIOLÓGICOS

DEL MODELO CON S. AUREUSUFC/ml UFC/g de hueso

Grupo 1Tibia 1 3 × 103 4,7 × 103

Tibia 2 1 × 105 1,6 × 105

Tibia 3 4,2 × 105 4,6 × 105

Tibia 4 7,5 × 105 1,05 × 106

Tibia 5 12,8 × 106 1,5 × 107

Grupo 2Tibia 1 16,1 × 104 1,9 × 105

Tibia 2 3,6 × 102 5,2 × 102

Tibia 3 4,8 × 102 7 × 102

Tibia 4 3 × 104 6,5 × 104

Tibia 5 7,75 × 104 1,05 × 105

Grupo 3Tibia 1 2,7 × 103 3,3 × 103

Tibia 2 6,8 × 104 8,5 × 104

Tibia 3 3,3 × 104 4,2 × 104

Tibia 4 − −Tibia 5 9,9 × 104 1,6 × 105

Grupo 4Tibia 1 5 × 104 7 × 104

Tibia 2 3 × 103 3,6 × 103

Tibia 3 9,3 × 104 1,2 × 105

Tibia 4 1,9 × 104 3,1 × 104

Tibia 5 3,7 × 104 5 × 104

Grupo 5Tibia 1 7,2 × 104 8,4 × 104

Tibia 2 8 × 104 9 × 104

Tibia 3 6,6 × 102 9 × 102

Tibia 4 3,9 × 102 4,5 × 102

Tibia 5 5,4 × 103 6,3 × 103

CTX-1: grupo de tratamiento corto (14 días),en el que la antibioterapia se inició 14 díasdespués de la inoculación. Las ratas se sacrifi-caron 28 después de finalizar el tratamiento(56 días después de la inoculación). Contenía13 ratas.

CNT-2: grupo control sin tratamiento. Las ratasse sacrificaron 70 días después de la inoculación.Contenía 11 ratas.

CTX-2: grupo de tratamiento largo (28 días). Eltratamiento se inició 14 días después de la ino-culación. Las ratas se sacrificaron 28 días des-pués de acabar la antibioterapia (70 días des-pués de la inoculación). Contenía 13 ratas.

Antibioterapia. La dosis de cefotaxima fue de100 mg/12 h administrada por vía subcutánea.Se calculó a partir de una dosis estándar en os-teomielitis humana del adulto, establecida enmg/kg de peso/día. Esta cantidad se corrigió mul-tiplicando por un factor 6 (corrección peso/su-perficie del animal), conociendo la cantidad a ad-ministrar en mg/kg de peso/día/rata.

Preanestesia y anestesia. Igual que en la creacióndel modelo.

Técnica de inoculación. Igual que en la creacióndel modelo.

Obtención y procesamiento de las muestras. Igualque en la creación del modelo: 5 tibias de los gru-pos de control y seis de los de tratamiento se des-tinaron para estudio histopatológico. Para el pro-cesamiento microbiano se emplearon 6 tibias delos grupos de control y siete de los de tratamiento.

Procedimiento histopatológico y microbiano.Igual que en la creación del modelo.

Valoración estadística. Las diferencias entre las me-dias se compararon por medio de la t de Student.

Resultados

Mortalidad. Cinco ratas (10%) murieron antes dela fecha del inicio del tratamiento, dentro de las

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TABLA VESTADÍSTICA DESCRIPTIVA DEL MODELO CON S. AUREUSMediana Mínimo Moda Máximo Rango

Grupo 1UFC/ml 420.000 3.000 3.000 12.800.000 12.797.000UFC/g 460.000 4.700 4.700 15.000.000 14.995.300

Grupo 2UFC/ml 30.000 360 360 161.000 160.640UFC/g 65.000 520 520 190.000 189.480

Grupo 3UFC/ml 50.500 2.700 2.700 99.000 96.300UFC/g 63.500 3.300 3.300 160.000 156.700

Grupo 4UFC/ml 37.000 3.000 3.000 93.000 90.000UFC/g 50.000 3.600 3.600 120.000 116.400

Grupo 5UFC/ml 5.400 390 390 80.000 79.610UFC/g 84.000 450 450 90.000 89.550

TABLA VIRESULTADOS DE LA COMPARACIÓN ENTRE GRUPOS EN EL MODELO

CON S. AUREUS. TEST DE LA U DE MANN-WHITNEYGrupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

Grupo 1 p = 0,0758 p = 0,0864 p = 0,0937Grupo 2 p = 0,6242 p = 0,7540 p = 0,9168Grupo 3 p = 0,8065

72 h que siguieron a la inoculación. En 2 ratas seatribuyó a efectos de la anestesia y en tres a sep-sis por E. coli.

Resultados microbiológicos

1. Tratamiento cortoEn los animales tratados durante 14 días se

obtuvo la esterilización del hueso en 2 de7 (28,5 %), observándose en el resto pequeñasreducciones en el número de UFC/g, con res-pecto al grupo control CNT-1. Las diferencias en-tre las medias de CNT-1 y CTX-1 no fueron signi-ficativas (tabla VII).

2. Tratamiento largoEn los animales tratados 28 días se obtuvo

la esterilización en 6 de 7 casos (85,7 %). Elúnico recuento bacteriano positivo fue significa-tivamente menor que los observados en el gru-po control. La diferencia de las medias entre losgrupos CNT-2 y CTX-2 fue inferior a 0,05 (ta-bla VII).

3. Grupos controlEl microorganismo se recuperó en todas las

muestras óseas.

4. Estudio de la concentración mínimainhibitoria

La concentración mínima inhibitoria (CMI) delmicroorganismo ensayado para cefotaxima pre-via al tratamiento fue de 0,25 �g/ml. Las CMI delos microorganismos aislados en las tibias de losanimales tratados y en los controles oscilaron en-tre 0,25 y 1 �g/ml.

Resultados histopatológicos

1. Tratamiento cortoTodos los animales (n = 6) presentaron necro-

sis focal en la metáfisis, con destrucción ósea yacúmulos de hueso compacto neoformado. Lacelularidad que rodeaba el área de necrosis co-rrespondía a osteocitos, células plasmáticas y fi-broblastos en neoformación capilar intensa. En lanecrosis ósea existía gran infiltración de polimor-fonucleares.

2. Tratamiento largoEl 83% de los animales (n = 5) no presentaron

alteraciones microscópicas de actividad osteo-mielítica. En un animal, la lesión estaba consti-tuida por una reacción inflamatoria crónica, congran predominio de fibroblastos y neoformaciónósea.

3. Grupos de controlEn todos los animales se observó lesión lítica

macroscópica. Con microscopia óptica se objeti-vó necrosis destructiva supurada con secuestrosóseos.

Efectos adversos

Durante el tratamiento con cefotaxima no seobservaron efectos secundarios.

Modelo con P. aeruginosa y otrosantibióticos

Siguiendo la misma metodología previamenteexplicada, durante estos años hemos investigado

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TABLA VIIRESULTADOS MICROBIANOS (UFC/g) DEL MODELO CON E. COLI.

TRATAMIENTO CON CEFOTAXIMARata CNT-1 CTX-1 CNT-2 CTX-2

1 6,47 × 106 4 × 104 6,24 × 107 0,12 × 102

2 8,83 × 105 1,52 × 105 108 03 2,40 × 107 1,6 × 105 7,75 × 107 04 5,47 × 106 0 6 × 107 05 − 1,8 × 105 2 × 108 06 − 2,4 × 105 − 07 − 0 − 0mx 6,716 3,6604 7,9527 0,154� 0,5145 2,3260 0,3408 0,3776Sm 0,2970 0,9496 0,1740 0,1541

CNT-1: grupo control sin tratamiento; CTX-1: grupo de tratamiento corto (14 días); CNT-2: grupo control sintratamiento; CTX-2: grupo de tratamiento largo (28 días).Diferencias entre las medias: CNT-1 y CTX-1: p > 0,05; CNT-2 y CTX-2: p < 0,05; CTX-1 y CTX-2: p < 0,05.

el comportamiento de ceftazidima, piperacilina eimipenem/cilastatina frente a P. aeruginosa.

Ceftazidima29

Este antibiótico se administró a la dosis de100 mg/12 h por vía subcutánea. Para el mode-lo se utilizó un cepa de procedencia clínica, conuna CMI de 2 �g/ml. Se establecieron tres gru-pos de 15 ratas cada uno: uno de control al queno se administró el antibiótico (se sacrificó20 días después de la inoculación) y dos detratamiento, uno corto de 14 días (inicio a los14 días de la inoculación y sacrificio 28 despuésde finalizar la administración del antibiótico) yotro largo de 28 (inicio a los 14 días de la inocu-lación y sacrificio 28 después de finalizar la ad-ministración del antibiótico). En los animales tra-tados 14 días se obtuvo la esterilización en el43% (3 de 7), y en los que recibieron ceftazidi-ma durante 28 días en el 57% (4 de 7). En am-bos casos, cuando la negativización de los culti-vos no fue posible, se observaron pequeñasreducciones de UFC/g con respecto al grupocontrol. No hubo diferencias significativas entrelos dos grupos de tratamiento, pero sí que se ha-llaron con respecto al de control (p < 0,05). Entodos los animales de los grupos de control se re-cuperaron los microorganismos. La CMI inicial de2 �g/ml, se mantuvo en los microorganismos quese aislaron en los huesos. En las ratas tratadas14 días se evidenciaron necrosis focal con des-trucción ósea y acumulaciones de hueso com-pacto neoformado. La celularidad que rodeaba elárea de necrosis correspondía a osteocitos, célu-las plasmáticas y fibroblastos con neoformacióncapilar intensa. En las del grupo de tratamientoprolongado, en 5 de 7 casos no se observaron le-siones microscópicas ni macroscópicas de acti-vidad osteomielítica. En las dos restantes se en-contró una reacción inflamatoria crónica conpredominio de fibroblastos y neoformación ósea.En todos los animales del grupo de control se ob-servó una lesión osteolítica macroscópica, y en lamicroscopia óptica necrosis destructiva supura-da con secuestros óseos. No se apreciaron efec-tos adversos.

Piperacilina30

Se administró 2 semanas después de lainoculación, por vía subcutánea a razón de126 mg/kg/día, repartida en tres dosis, durante28 días. Se establecieron dos grupos: uno decontrol (10 ratas) y otro de tratamiento (15 ratas)que se sacrificaron 70 días después de la inocu-

lación. En ningún animal se logró esterilizar elhueso, pero sí se objetivó una reducción signifi-cativa de las UFC/g de hueso respecto al grupocontrol (p < 0,001). En las tibias de las ratas tra-tadas no se observaron signos macroscópicos nimicroscópicos de osteomielitis activa.

Imipenem/cilastatina31

El antibiótico se administró a la dosis de40 mg/kg/8 h por vía subcutánea. La CMI de lacepa de P. aeruginosa seleccionada para imipe-nem/cilastatina fue de 1 �g/ml. Se crearon dosgrupos de control de 8 ratas cada uno, con sa-crificios a los 28 y 40 días, respectivamente, des-pués de la inoculación, y otros dos de tratamien-to durante 10 días, que se inició a los 15 de lainoculación. El primer grupo de tratamiento esta-ba formado por 10 ratas, sacrificadas al día si-guiente de finalizar la administración del antibió-tico. El segundo grupo de tratamiento estabacompuesto por 14 ratas, cuyo sacrificio se de-moró hasta haber pasado 15 días después determinar el tratamiento. No se consiguió la este-rilización en ninguna rata, excepto en una del se-gundo grupo de tratamiento, pero se logró unareducción significativa de las UFC/g con respec-to a los grupos de control. Las CMI de los micro-organismos que se recuperaron en los huesos semantuvieron iguales a las iniciales.

Modelo con S. aureus y dosis terapéuticasy subterapéuticas de clindamicina32

Se empleó una cepa de S. aureus, sensible ala meticilina, procedente de un aislamiento clíni-co. Se establecieron tres grupos, uno de controlsin tratamiento (6 ratas) y otros dos con clinda-micina de 7 y 8 ratas. El antibiótico fue adminis-trado a la razón de 70 y 90 mg/kg/día, respecti-vamente, en tres dosis, durante 28 días, por víasubcutánea. En los dos grupos de tratamientohubo una disminución significativa de las UFC/mlrespecto al control, pero no se detectaron dife-rencias entre los mismos.

Modelo con S. aureus y factor estimulantede cononias de granulocitos más dosissubterpéuticas de clindamicina33

Se crearon tres grupos: a) control con 27 ratassin tratamiento; b) tratadas con clindamicina(35 mg/kg b.i.d., subcutánea), y c) tratadas conclindamicina (35 mg/kg b.i.d., subcutánea) másfactor estimulante de colonias de granulocitos(25 �g/kg b.i.d., subcutáneo). El tratamiento se

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inició 14 días después de la inoculación y se pro-longó durante 28 días. El sacrificio se efectuó alas 2 semanas de terminar la terapia. Con el fac-tor estimulante de colonias asociado a clindami-na se produjo una reducción de las UFC/ml cua-tro veces mayor que sin él, aunque no fuesuficiente para alcanzar una significación esta-dística.

DISCUSIÓN

La elección de la rata Wistar en vez del conejopara desarrollar nuestro modelo se debió a queeste animal se maneja con mayor facilidad, re-sulta más económico y no presenta de forma tanmanifiesta los efectos secundarios (diarreas ines-pecíficas o idiopáticas o por colitis seudomem-branosa) del empleo de antimicrobianos duranteperíodos prolongados. Preferimos el empleo deun microtaladro para hacer un agujero en la cor-tical ósea a la aguja percutánea, para facilitar lainoculación y por la garantía que nos ofrecía deque ésta fuera correcta.

Con estos trabajos hemos conseguido crearmodelos fiables de osteomielitis crónica con ba-cilos gramnegativos (E. coli y P. aeruginosa) y S.aureus, en los que los signos de la infección óseaeran evidentes a partir del día 14 de la inocu-lación. Posteriormente nos han servido paravalorar la respuesta a varios antimicrobianos.También comprobamos el efecto que tiene la ino-culación exclusivamente del sulfato de bario (le-siones esclerosas medulares y destrucción detrabéculas, sin reacción osteoblástica ni fibrosa),así como los provocados por la broca y el taladro(lesiones localizadas con escasa reacción leuco-citaria y fibrosa). En el modelo estafilocócico, lo-gramos desarrollar la osteomielitis sin necesidadde sustancia esclerosante, como se venía cre-yendo hasta no hace mucho tiempo.

Naturalmente, somos plenamente conscientesde las limitaciones que estos estudios tienen enreferencia a la osteomielitis humana, que de for-ma sucinta son las siguientes: a) el uso de unasustancia esclerosante extraña; b) la utilizacióndel microtaladro que parece favorecer la síntesisde prostaglandinas en el hueso y, por tanto, la in-fección, y c) la administración de inóculos muchomás altos de los que se precisan para que tengalugar una osteomielitis humana.

En el capítulo terapéutico, hemos demostradola utilidad de antibióticos como cefotaxima, cef-tazidima, piperacilina e imipenem/cilastatina enel tratamiento de la osteomielitis experimental,que posteriormente ha sido corroborada en la clí-nica. Más recientemente, hemos comprobado el

efecto beneficioso en la osteomielitis de un factorestimulante de colonias de granulocitos junto adosis subterapéuticas de clindamicina.

En definitiva, contamos en la actualidad conun modelo de osteomieltis crónica fiable, fácil dedesarrollar y económico, que permitirá continuaren el futuro la labor de investigación, que duran-te una década llevamos realizando.

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J.M. GATELL: ¿Cuántos días después de la inocu-lación comienza el tratamiento?

J. BARBERÁN: El tratamiento se inicia a las 2 se-manas después de la inoculación.

J.A. CAPDEVILA: Después de practicar el agujerocon el taladro, ¿el inóculo se deposita dentro dela cavidad médular del hueso, o bien se encla-va la aguja en el hueso?

J. BARBERÁN: Primero realizamos el agujero con elmicrotaladro; a continuación retiramos el mi-crotaladro e introducimos la aguja en la cavidadlibre medular, donde se inyecta el inóculo.

J.A. CAPDEVILA: Si el líquido inoculado queda libredentro de la cavidad medular, con vuestro mo-delo ¿no crees que realmente inducís una oste-omielitis difusa?

J. BARBERÁN: Procurando no perforar con el mi-crotaladro la otra parte de la cortical de la tibiade la rata, el líquido queda libre dentro de la ca-vidad medular. Al quedar el inóculo en cavidadmedular, se induce una osteomielitis extensa,pero a pesar de ello y como se ha podido com-probar con las imágenes que hemos presenta-do, no se ven afectadas ni toda la cavidad nitoda la cortical del hueso, sino que la osteomie-litis queda localizada en el punto de inocula-ción.

J. GAVALDÀ: Una recomendación técnica que ospodría servir para evitar los problemas de ho-mogeneización de los huesos es congelar loshuesos a − 80 °C con nitrógeno líquido y des-pués, con un mortero o martillo neumático, se

28. Gomis M, Herranz A, Aparicio P, Fe A, Alonso MJ,Prieto J et al. An experimental model of chronicosteomyelitis caused by Escherichia coli treatedwith cefotaxime. J Antimicrob Chemother 1990;26 (Supl A): 15-21.

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European Congress of Chemotherapy and 7th Bien-nal Conference on Antiinfective Agents and Che-motherapy, 10-13 de mayo de 1998.

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DISCUSIÓN

tritura el hueso congelado y se obtiene un pol-vo muy bien homogeneizado. Por último, megustaría saber tu opinión sobre la posibilidad decuración de la osteomielitis con estos modelos.Todos sabemos que en la osteomielitis crónicacon abcesos de Brodie, sin cirugía, la curaciónes muy difícil; en cambio, con estos modelos deosteomielitis, algunos tratamientos consiguen lacuración.

J. BARBERÁN: El problema del tratamiento de laosteomielitis no es que el antibiótico no llegue alhueso. Como todos sabemos el hueso es un ór-gano totalmente difundido y no tiene ningunabarrera anatómica que impida el acceso del an-tibiótico. Sin embargo, el problema del trata-miento de la osteomielitis, sobre todo la cronifi-cada, es que se forma un macroacceso queactúa en forma de secuestro y éste dificulta queel antibiótico acceda al agente infeccioso. En elmodelo experimental en rata, el abceso o el ni-dus que inducimos es microscópico, se trata deun microabceso, y por ello el antibiótico accedefácilmente a él. La valoración se realiza poste-riormente a través del estudio histopatológico ypor el recuento de unidades formadoras de co-lonias y, a pesar del tratamiento, no siempre ob-tenemos la erradicación de la infección.

J. GAVALDÀ: ¿En algún momento alguien se haplanteado dejar más tiempo entre la infección yel inicio del tratamiento, a fin de los abcesos ad-quieran un tamaño superior y ello dificulte tra-tamiento antibiótico?

J. BARBERÁN: No sé exactamente lo que ocurriríasi iniciásemos el tratamiento más tarde. Lo co-menzamos después de la segunda semana dela inoculación basándonos en la diferenciación,más o menos aceptada, entre osteomielitis agu-da y crónica, que se establece cuando el pro-ceso infeccioso perdura más de 2 semanas.Con este modelo constatamos que en el grupocontrol la infección perdura. Cuando realizamossacrificios a los 7, 14, 28 y 56 días de trata-miento, se observa al principio el nidus carac-terístico, como una infección necrosante supu-rativa aguda y, después, evoluciona con unareacción inflamatoria periférica, probablemen-te como intento de controlar la infección porparte del sistema inmunitario del animal.

J. ARIZA: De todas formas y desde un punto devista clínico, vuestro modelo se parece más auna osteomielitis aguda que a la propia osteo-mielitis crónica. Ante una osteomielitis agudahematógena, generalmente por Staphylococcusaureus, de entrada será necesario plantear untratamiento prolongado, de al menos 3-4 se-manas, con antibióticos. La cuestión está en sa-

ber si estas osteomielitis hematógenas puedencurarse sólo con antibióticos o, además, es ne-cesario el desbridamiento quirúrgico. En cam-bio, la osteomielitis crónica, según el criterioclínico clásico, implica la cirugía como un re-quisito casi imprescindible para alcanzar la cu-ración. El tratamiento antibiótico prolongadoaplicado en vuestro modelo experimental al-canza la curación, mientras que no cura si di-cho tratamiento no es prolongado. Por este mo-tivo, e independientemente de que sirva paraevaluar eficacia de antibióticos, creo que el mo-delo acaba asemejándose más a la osteomieli-tis hematógena. Finalmente, me gustaría quecomentaras cómo analizáis vuestros resultadosal compararlos con los publicados en la biblio-grafía. Es decir, de las experiencias de Nordenque son las más conocidas, una de las cosasque siempre me ha llamado la atención es quelos resultados como, por ejemplo, en la osteo-mielitis estafilocócica con cloxacilina, eran re-lativamente deficientes y, en cambio, los resul-tados eran buenos cuando hablamos declindamicina y rifampicina. Esto nos devuelveotra vez a una conversación anterior sobre laimportancia de las bacterias adherentes en in-fección ósea, independientemente de que hayao no cuerpo extraño. Y, después, en la infecciónpor gramnegativos según los experimentos deNorden, los betalactámicos han sido relativa-mente cuestionados y, de alguna forma, las qui-nolonas se comportarían como antibióticos muysuperiores en la infección por Pseudomonasaureuginosa. A partir de estos resultados y delos comentarios de Joan Gavaldà, creo que elmodelo no acaba de simular el concepto clíni-co que tenemos de osteomielitis crónica.

J. BARBERÁN: A todo hay que ponerle un límitedesde el punto de vista conceptual: la mayoríade autores aceptan los 14 días como el puntode inflexión de una osteomielitis aguda a unaosteomielitis crónica. Pero dentro de las cróni-cas pueden existir también diferencias muy evi-dentes. El caso extremo serían las osteomielitisde años de evolución en pacientes con heridasde guerra y que se caracterizan por continuasupuración. Siendo una osteomielitis crónicatambién, es recidivante y poco se parece a lacrónica de un mes de evolución. La afectacióndel hueso es total, existe una pandiafisitis, conclara imagen radiológica de secuestro. En estassituaciones se requiere limpieza quirúrgica delhueso y tratamiento con antibióticos. Pero la os-teomielitis crónica más frecuente en la actuali-dad y en la que deberíamos centrar los esfuer-zos para su tratamiento es la posquirúrgica o la

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postraumática, que suele diagnosticarse concierto retraso a pesar de disponer de tomogra-fía computarizada o resonancia magnética. Es-tas osteomielitis se curan con desbridamientoquirúrgico y antibioterapia prolongada. En se-gundo lugar, el modelo que hemos presentadono es ni mucho menos parecido a la osteomie-litis hematógena: existe una inoculación en la ti-bia, es una osteomielitis contigua, remeda a lafractura abierta, a la posquirúrgica, a la pos-traumática, a la infección de partes blandas,etc., pero no hay diseminación hematógena dela infección, y si se deja evolucionar durantemás de 14 días, entraríamos en el concepto decronicidad. Por tanto, convendría diferenciarentre las osteomielitis agudas, las crónicas demás de 14 días y, finalmente, aquellas con po-sibilidades muy limitadas de tratamiento y quesuelen acabar en amputación. Dentro de estecontexto, nos interesa el segundo tipo, la osteo-mielitis que tarda un poco en diagnosticarse yque la podemos curar con tratamiento quirúrgi-co y con tratamiento médico. Por último, y enreferencia con los trabajos de Norden, podríacontestarte que es un autor que ha estudiadoprácticamente todos los antibióticos y que tan-to con quinolonas como con betalactámicos haobtenido buenos resultados. Nosotros emplea-mos las mismas técnicas de valoración, con laúnica diferencia de que lo estudiamos en cone-jo y que la inoculación la realizamos con agujapercutánea.

J. ARIZA: Mis comentarios venían a colación de queno estoy tan convencido sobre la posición de losbetalactámicos en osteomielitis complicadas. Losmodelos previos de Norden iban en esta direc-ción, al dudar de la eficacia de cloxacilina comoagente estafilocócico idóneo. Y en el caso de lasinfecciones por gramnegativos, sobre todo lasmás difíciles como Pseudomanas, atribuían unaclara superioridad a las quinolonas respecto a laterapéutica exclusiva con betalactámicos. Estoenlazaba con el tema de las bacterias adheren-tes, porque los antibióticos betalactámicos se in-fluyen muchísimo en su alteración de la concen-tración mínima bactericida (MBC) cuando estánen fase frente a las bacterias; al menos conS. aureus esto está claro, y no sé si también ocu-rre en bacilos gramnegativos.

J. BARBERÁN: Está claro que la osteomielitis esuna infección por bacterias adherentes. Pero, apesar de ello, y desde una óptica estrictamente

clínica, está claro y demostrado que los beta-lactámicos son antibióticos muy eficaces. Lasquinolonas no lo son menos, pero tal vez hanaportado una mayor comodidad de empleo.Hoy día utilizamos fundamentalmente quinolo-nas en el tratamiento de la osteomielitis porquese pueden administrar por vía oral, o bien ini-cialmente por vía intravenosa y posteriormenteoral como tratamiento extrahospitalario. Los be-talactámicos, por vía i.v., obligan a realizar eltratamiento durante un mes o seis semanas conel paciente ingresado. En cuanto al tema del sli-me, con dosis subterapéuticas de clindamicinaintentamos comprobar si se producía una dis-minución de las colonias. Existen datos previosde Mader quien, utilizando dosis subinhibito-rias, no subterapéuticas, de clindamicina haconseguido inhibir las adherencias bacterianas.El trabajo se complementa con imágenes demicroscopia electrónica en las que se observanlos efectos antiadherentes de la clindamicina,con desaparición de S. aureus del hueso.

F. GUDIOL: En mi opinión la división de las osteo-mielitis en agudas y crónicas es una fuente deconflicto. Probablemente las únicas osteomieli-tis agudas son las hematógenas, quizás en elniño, que deben ser tratadas con rapidez e ini-ciar un tratamiento precoz a veces con datosclínicos mínimos. Por ello, creo que sería reco-mendable evitar los términos osteomielitis agu-da y crónica. Es más esclarecedora la clasifica-ción por mecanismo patogénico: hematógenas,postraumática, por contigüidad, etc.

J. BARBERÁN: A modo de resumen, creo que la cla-sificación entre aguda y crónica tiene bá-sicamente interés desde el punto de vista depronóstico. Una osteomielitis aguda, por el me-canismo patogénico que sea, requerirá exclusi-vamente tratamiento antimicrobiano, mientrasque una osteomielitis crónica, del mecanismoque sea, va a necesitar desbridamiento quirúrgi-co más tratamiento antimicrobiano. Por otrolado, existen numerosas clasificaciones de osteo-mielitis, aparte de agudas y crónicas, atendien-do a Van Vogel, por contigüidad, hematógenas,las de Cierny según la afectación del hueso, se-gún los microorganismos que la causan, etc.

J.M. GATELL: A fin de simular la osteomielitis he-matógena, ¿a nadie se le ha ocurrido inyectarpor vía intravenosa sulfato de bario y después elestafilococo?

J. BARBERÁN: No, que yo sepa.

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RESUMEN

El estabulario con modelos infecciosos debeorganizarse para evitar infecciones a personas yanimales, y su diseminación hacia el exterior dela instalación. La estructura general más utiliza-da de una instalación de seguridad de grado 3 esun edificio con tres niveles, con tratamiento deaire filtrado en el nivel superior, zonas de trabajoen el nivel intermedio y tratamiento de residuosen planta inferior. Debe prestarse especial aten-ción al recubrimiento resistente de superficies, alas conducciones y al sellado de juntas para lo-grar la hermeticidad. Las vías de entrada y salidade material y de animales deben garantizar la es-tanqueidad, mediante esclusas (airlocks) o auto-claves. El acceso de personal debe ser restringi-do, a través de vestuarios y duchas obligatorias,al menos de salida. Los circuitos de agua, aire,vapor, gases y vacío deben disponer de válvulasantirretorno y filtros que impidan la contamina-ción de la red general, y los desagües han de te-ner sifones que garanticen su estanqueidad. Losrestos sólidos y líquidos requieren su esteriliza-ción antes de su eliminación al exterior de la ins-talación. Por lo que respecta a los restos de losanimales, la incineración es el tratamiento deelección. El edificio ha de tener ambiente regula-do, con mantenimiento de gradientes de presiónadecuados. Los materiales utilizados para alber-gar los animales deben resistir la desinfección. Lautilización de modelos de patología infecciosa enun animalario genera un riesgo de infección. Lasexigencias planteadas dependen del grado depeligrosidad del microorganismo y de la especieanimal a utilizar.

Palabras clave:Animales de laboratorio. Recomendaciones de se-

guridad. Gnotobiología.

HOW TO ORGANIZE THE ANIMALFACILITIES IN EXPERIMENTALINFECTIOUS DISEASES MODELS

Animal facilities for research in infectious disea-ses are organised in order to avoid risk of infec-tion to person and animals, and dissemination ofmicroorganisms outdoors. The usual design of afacility in biosecurity level 3 is an upper floor withtreatment and filtering of air, work area in themiddle, and treatment of waste on the lower level.Attention has to be paid to special covering ofwalls, and to sealing of junctions, to achieve con-tainment. Entry and way out of materials and ani-mals of the building has to be done by airlock orautoclave, to maintain containment. Personal ac-cess has to be controlled, and done throughrooms for change of dress, equipped with sho-wers at least obligatory when going out of the fa-cility. Air, water, and gas conductions should beequipped with an anti-return valve to avoid con-tamination of the general circuit. Solid and liquidwaste must be sterilised before disposal to theoutside of the building. Incineration is the bestchoice for disposal of animal carcasses. The buil-ding has to regulate ambient conditions such astemperature, air humidity, illumination and ex-change of air. Pressure gradients between roomshave to be maintained. The equipment for animalmust be of materials resistant to disinfection andautoclaving. Animal infectious models generate arisk of infection for humans. The needs to preventthe risk depend on the characteristics of the mi-croorganism itself and the animal species to beused.

Key words:Laboratory animals. Biosafety guidelines. Gnotobio-

logy.

Cómo debe organizarse un estabulariocon modelos de patología infecciosa

Mariano Domingoa,*, Jordi Cantób y Joan Pujolsc

aDepartament de Patologia i Producció Animals y 2Servei d’Estabulari. Universitat Autònoma de Barcelona. cUnitat de Sanitat Animal. IRTA. Barcelona.

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Introducción

El estabulario con modelos de patología infec-ciosa debe organizarse para lograr tres objetivosesenciales: a) evitar las infecciones desde el ani-mal del modelo experimental hacia las personasen contacto (zoonosis); b) impedir la disemina-ción de infecciones (infecciones cruzadas) entrelos grupos de animales experimentales, y c) evi-tar la diseminación de los agentes infecciosos ha-cia el exterior de la instalación. Estos objetivosson alcanzables mediante la aplicación de diver-sos grados de seguridad biológica, o bioseguri-dad, definida como el manejo seguro de agentesinfecciosos de alto riesgo. La bioseguridad en unestabulario con modelos de patología infecciosarequiere instalaciones y procedimientos suple-mentarios a los existentes en los estabularios demantenimiento y producción. La bioseguridad seconsigue con sistemas de aislamiento hermético,gradientes de presión, filtración de aire, trata-miento de desechos y efluentes, y procedimien-tos adecuados (fig. 1). A continuación se descri-ben las características de las instalaciones y losprocedimientos propios de un estabulario conmodelos de patología infecciosa, así como los cri-terios generales sobre peligrosidad de los agen-tes infecciosos y medidas de contención.

Características de un centro para trabajarcon modelos experimentales en patologíainfecciosa

Un centro destinado a desarrollar estudios queutilicen animales como modelos experimentalesen patología infecciosa debe cumplir con los mis-

mos requisitos propios de cualquier otro centroen el que se realice experimentación animal y,además, con los específicamente derivados delas medidas de seguridad que este tipo de estu-dios requiere.

El diseño del centro, la distribución de espa-cios, la situación y circuitos de conexión entre losmismos, y la definición de las característicasconstructivas, así como del equipamiento nece-sario, debe ser fruto de un trabajo coordinado en-tre el equipo de investigadores que van a utilizarel centro y el de profesionales de la arquitecturay la ingeniería, a ser posible con experiencia en laconstrucción de este tipo de instalaciones.

Existen distintas publicaciones que pueden serutilizadas para obtener información sobre las ca-racterísticas básicas que debe poseer un anima-lario de contención.

El esquema general para investigar con ani-males infectados experimentalmente es el de unacaja dentro de otra caja, con el objetivo de impe-dir cualquier posible diseminación de los micro-organismos con los que se trabaja. El diseño ac-tualmente más utilizado es el de un edificio contres niveles: el superior alberga todos los sistemasde tratamiento (climatización y filtración absolu-ta) del aire impulsado y extraído de todo el cen-tro; en el intermedio se sitúan las distintas zonasde trabajo (estabulación de animales y laborato-rios), así como los sistemas de acceso (vestuariosy duchas) para el personal, y la planta inferior sedestina a la zona de tratamiento (descontamina-ción y esterilización) de los efluentes líquidos ydesechos sólidos que así lo requieran, así comoa local técnico para el control del conjunto de ins-talaciones.

Diseño y construcción de un estabulariopara modelos infecciosos

Con el fin de disponer de unas instalacionesduraderas y reducir al mínimo tanto el manteni-miento como las posibles averías y las actua-ciones correctivas que estas conllevan, es im-prescindible utilizar en la construcción de estoscentros materiales de primera calidad. Así mis-mo, deben situarse fuera de las áreas de trabajo(en la planta técnica) todas aquellas instalacionesy equipos que deban estar sujetos a manteni-miento y posibles reparaciones. Cuando esto nosea posible, debe optarse por la solución de de-jar accesibles (no empotradas) las instalacionesy conducciones que deben estar situadas obliga-toriamente dentro de los locales de experimenta-ción o de mantenimiento de animales. Todas lassuperficies (techos, paredes y suelos) deben es-

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Personal

Duchas

Contención

Manejo adecuado

Zona experimentación

Esterilización

Efluentes Fi

ltro

s

Air

e

Fig. 1. Procedimientos generales de contención bioló-gica.

tar recubiertas con materiales lisos y no porosos,resistentes al agua y a los productos químicos(desinfectantes) relativamente agresivos, que so-porten sin deteriorarse el esfuerzo que implicarála circulación de materiales pesados o la presen-cia de animales. El recubrimiento de las superfi-cies debe realizarse con estructuras monolíticaso con un mínimo número de juntas, debidamen-te selladas. La aplicación de compuestos vinílicoso de resinas epoxi proporciona excelentes resul-tados en estos aspectos. Los ángulos entre pare-des, techos y suelos deben ser redondeados paraevitar rincones difíciles de limpiar y desinfectar.Deben sellarse todas las posibles juntas entre pa-redes y marcos de las puertas o alrededor de lasconducciones que atraviesen las paredes. Lasconducciones que deban circular por el interiorde las salas se instalarán lo suficientemente se-paradas de la pared a la que estén sujetas, demodo que se facilite su limpieza y desinfección.Así mismo, se evitarán en lo posible los recorridoshorizontales (más propensos a acumular polvo)priorizando los recorridos verticales. Las puertas,de dimensiones adecuadas a los materiales oanimales que deberán transitar por las mismas,deben seguir el mismo esquema de garantizaruna estanqueidad absoluta de los locales que asílo requieran respecto a las zonas contiguas. Pue-den disponer de mirillas que permitan inspeccio-nar el interior sin necesidad de acceder a la sala.Conviene que las puertas de acceso general alcentro y a las zonas de seguridad estén equipa-das con sistemas de limitación de apertura, me-diante tarjetas o cerraduras conectadas a siste-mas eléctricos codificados. El acceso a las zonasde mayor control, tanto para personas como paraanimales o materiales, debe efectuarse a travésde una zona de transición, esclusa o airlock, queimpida el contacto directo de estas salas con losespacios circundantes. El acceso del personaldebe disponer de vestuarios, con taquillas dife-renciadas para la ropa de calle y la de trabajo,equipados con duchas de utilización obligatoria,por lo menos al salir de las zonas controladas ha-cia el exterior. Los circuitos de agua, aire, vapor,gases y vacío deben disponer de válvulas antirre-torno y filtros que impidan la contaminación de lared general; los desagües deben dotarse de sifo-nes de seguridad y de tapas roscadas o con blo-queo, que garanticen su estanqueidad cuandono están en uso o se procede a esterilizar una ha-bitación. Deben estudiarse detenidamente lossistemas de comunicación interna y con el exte-rior, tanto por razones de seguridad como paraevitar la circulación innecesaria del personal en-tre las distintas áreas.

Eliminación de residuos sólidos y líquidos

En un estabulario de enfermedades infeccio-sas se generan restos sólidos y líquidos que re-quieren su esterilización antes de su eliminaciónal exterior de la instalación. El diseño general esel de un autoclave de doble puerta, intercaladoen la frontera de la zona de contención con lazona externa a la instalación. La especie animalutilizada en el modelo experimental implica solu-ciones diferentes a la esterilización de restos só-lidos y líquidos. Así, en el caso de animales pe-queños, los excrementos, los restos de alimentoy la cama pueden ser autoclavados, y eliminadoscomo residuos urbanos. En cambio, si se trata deespecies mayores, como rumiantes pequeños ocerdos, la orina y los excrementos son recogidospor desagües a colectores para la esterilizaciónpor calor o mediante ciclos de acidificación-alca-linización.

Por lo que respecta a los restos de los anima-les, la incineración es el sistema de tratamientode elección. En el caso de no disponer de inci-nerador en la instalación, se puede optar por elautoclavado de los restos, siempre garantizandoque la temperatura de esterilización se alcanzaen el interior de los cadáveres, y no sólo superfi-cialmente.

Zonas para estabulación de animales

Los espacios destinados a albergar animalesse pueden subdividir en zonas de cuarentena, deestabulación general y de estabulación especia-lizada para los animales infectados. Su diseño serealizará en función de las especies a estabular,que pueden mantenerse en régimen de semili-bertad (especies grandes) o en jaulas, que, a suvez, pueden proporcionar un segundo nivel deaislamiento, ya sea mediante la utilización de cu-biertas filtrantes o manteniéndolas dentro de ca-binas de seguridad o de aisladores. En cualquiercaso, las salas de estabulación de animales de-ben proporcionar un nivel suficiente de aisla-miento entre las distintas especies y líneas de tra-bajo.

Zonas de cuarentena

Resultan imprescindibles para aislar preventi-vamente los animales que se introducen en lainstalación antes de proceder a su estabulaciónen las áreas experimentales. La duración de lacuarentena (que puede oscilar entre una o dossemanas para roedores y un período no inferior alos 2 meses para primates no humanos) ha de

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CÓMO DEBE ORGANIZARSE UN ESTABULARIO CON MODELOS DE PATOLOGÍA INFECCIOSA

permitir garantizar, mediante el desarrollo de téc-nicas de control y diagnóstico adecuadas a cadaespecie, que los animales no sufren o no son por-tadores de ninguna enfermedad que pudieraafectar a otros animales ya estabulados o interfe-rir con los estudios en los que van a participar. Elperíodo de cuarentena resulta también necesariopara permitir que los animales se recuperen delestrés y desequilibrio fisiológico que siemprecomporta un transporte, así como que se habi-túen a las nuevas condiciones de estabulación,alimentación y manejo.

Zonas de trabajo

El edificio debe incorporar también las zonasde trabajo (laboratorios, quirófanos, sala de au-topsias) necesarias para desarrollar las distintastécnicas que los procedimientos experimentalespuedan requerir. La zona de autopsias debecomunicar con el horno crematorio u otro sis-tema establecido para la esterilización y elimi-nación de los cadáveres y muestras contami-nadas. El diseño de estas zonas ha de cuidarde forma especial la posible generación y circu-lación de aerosoles. Conviene disponer tambiénde una cámara frigorífica o congelador de di-mensiones adecuadas para el mantenimientotemporal de los cadáveres y residuos que pos-teriormente han de eliminarse.

Zonas de almacén

El centro debe disponer de una serie de zonasde almacenamiento de productos y materialesdebidamente distribuidas y con capacidad sufi-ciente tanto para mantener en zonas separadaslos productos que así lo requieran, como para ga-rantizar unos niveles de almacenaje de produc-tos fungibles, que permitan una cierta autonomíaen caso de fallo en los suministros.

Condiciones ambientales de las salaspara animales

Los alojamientos para animales han de serconfortables, higiénicos y de dimensiones sufi-cientes. Además, deben disponer de sistemas deregulación del ambiente, como renovación delaire y mantenimiento de los gradientes de pre-sión adecuados, control de la temperatura y hu-medad relativa, iluminación, nivel de ruidos, etc.,que garanticen el bienestar de las especies allímantenidas. En general, la normativa sobre ma-nejo de animales es aplicable también a los ani-males de experimentación. Sobre los animales

domésticos existe una gran cantidad de docu-mentación de las necesidades de espacio por es-pecie en las granjas de producción.

Ventilación

La ventilación de los locales de alojamientode los animales debe proporcionar un nivel su-ficiente de renovación del ambiente, que en ca-sos de alta ocupación significa renovar (sin re-circulación) el aire 20 veces por hora. El aireimpulsado debe ser previamente acondicionadopara facilitar el mantenimiento de una tempera-tura y humedad relativa acorde a los reque-rimientos de comodidad de cada especie, evi-tando las fluctuaciones importantes en estosparámetros. Las instalaciones con sistema deventilación artificial deben garantizar un nivelsuficiente de renovaciones de aire en las jaulas.Los flujos de aire no deben resultar molestospara los animales y han de estar distribuidos demanera que garanticen una correcta ventilaciónde todo el local, evitando zonas muertas. Tantoel aire de impulsión (para evitar la vehiculaciónde posibles patógenos del exterior) como el deextracción (para evitar la contaminación deotros locales anexos o del ambiente) deben serfiltrados a través de filtros absolutos (HEPA)que generalmente se duplican por razones deseguridad. La ventilación debe asegurar la dis-minución de la formación de aerosoles e impe-dir las infecciones cruzadas.

En instalaciones cerradas y con un sistema deventilación artificial, es necesario disponer de unsistema de emergencia para asegurar la ventila-ción.

El balance entre impulsión y extracción permi-tirá establecer los gradientes de presiones dife-renciales entre las distintas zonas, entre las zonasy los pasillos y con el exterior del edificio, demodo que se prevenga la circulación de aire des-de las zonas de mayor riesgo hacia las de menorcontaminación.

Ruido

El ruido es un factor estresante, y puede tenerefectos negativos sobre la fertilidad, prolificidad(abortos), canibalismo, abandono de camadas,etc. El control sonoro ha de garantizar que losanimales no se verán afectados por los ruidos de-rivados del funcionamiento de los distintos equi-pos, así como por los generados por otros ani-males que se mantengan en zonas próximas. Lainstalación ha de estar diseñada de forma que elalojamiento de los animales esté alejado de la

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zona de máquinas. Si no es así, es necesario ais-lar acústicamente la zona de estabulación (parano superar 85 db en el interior de las salas conanimales más sensibles). Es recomendable re-ducir la intensidad de alarmas, timbres, ruidos depuertas, teléfonos, etc.

Iluminación

Los parámetros a tener en cuenta en referen-cia a la iluminación son su intensidad, el espec-tro y el fotoperíodo. La intensidad de la luz en elárea ocupada por los animales (mínimo 15 lux enel área ocupada por animales y de 5 lux en elcaso de aves domésticas), los períodos de ilumi-nación y oscuridad, así como los cambios de ilu-minación deben cumplir con las necesidades delos animales. La intensidad muestra variacionesen las jaulas o cubículos colocadas en estanteríassegún el tipo de jaula, tipo de cubierta y nivel queocupa. Estas variaciones deben reducirse al mí-nimo. Se ha de seleccionar el fotoperíodo másadecuado para cada especie, manteniéndoloconstante. Para ello, es necesario evitar la en-trada de luz no controlada. La iluminación artifi-cial no debe ser superior a 16 h de duración y noha de producir parpadeo perceptible.

Temperatura

La temperatura ambiental tiene efectos impre-visibles sobre los resultados experimentales.

Las temperaturas fuera del rango confortablemodifican los requerimientos en animales reciénnacidos, y afectan la fertilidad, la producción deleche, la toxicidad de algunos productos, las va-riables hemáticas y plasmáticas, el consumo dealimento y agua, el peso de algunos órganos, y lasusceptibilidad a infecciones. Es necesario pres-tar atención a la diferencia de temperatura quese produce entre el exterior y el interior de la jau-la, especialmente en las jaulas con rejillas filtran-tes (diferencias de hasta 5 °C).

Humedad

La humedad puede producir efectos adversostanto a niveles bajos como elevados, efectos quepueden agravarse según sea la temperatura am-biente. La humedad afecta la formación de aero-soles y polvo, la producción de amoníaco, laviabilidad de microorganismos, y modifica la ac-tividad mucociliar. Los valores obtenidos en el in-terior de la sala pueden variar según el nivel de lajaula y según el tipo de lecho, la frecuencia de re-cambio, y la utilización de rejillas filtrantes.

Partículas en el aire

La concentración y tiempo de permanenciadependen de una gran cantidad de factores.

Presentan un factor de riesgo e irritación paralos animales y el personal. Las partículas de ori-gen externo se controlan con filtros. Las de origeninterno mediante la disposición adecuada de losconductos de impulsión y retorno de la ventila-ción, el número de renovaciones/h, la velocidaddel aire, la humedad y la temperatura.

También contribuyen el diseño de la jaula, eltipo de cubierta, el tipo de cama, la periodicidadde limpieza, el tipo de dieta, la población animalpor jaula (nivel de actividad) y la especie animal.

Suelos y jaulas

Si los animales descansan sobre el suelo, éstedebe ser fácilmente lavable, no deslizante y seco.Ha de disponer de zonas apropiadas para el des-canso confortable.

Los suelos enrejillados, en eslats o perforados,deben ser adecuados para la especie y el tama-ño de los animales alojados. Los suelos con es-lats deben estar levantados y las piezas no debe-rían poder salirse, para evitar accidentes.

Las jaulas han de ser adecuadas para cada es-pecie, situación fisiológica y edad.

En la elección de la jaula han de tenerse encuenta los requerimientos de superficie y altura,y de capacidad de comederos o tolvas, y bebe-deros, según especie y número de animales a al-bergar. Han de presentar facilidad de acceso, yhan de estar diseñadas para disminuir el riesgode contaminación de la dieta y del agua. Han deser resistentes, para no ser deterioradas por elanimal, y resistir los desinfectantes y la esteriliza-ción en el autoclave.

Además, no han de presentar riesgo de lesión,ni para el animal, ni para el personal que las ma-nipula y limpia.

Tratamiento del agua de bebidade los animales

Con el fin de garantizar que no se introduciráncontaminaciones a través del agua de bebida delos animales, se pueden recurrir a distintos siste-mas de tratamiento de la misma. Además deproceder a su descalcificación (si las condicionesde dureza del agua así lo aconsejan) con el fin deevitar problemas en las conducciones, se puedegarantizar una correcta calidad microbiológica dela misma a través de sistemas físicos, químicos ode combinación de ambos. Los sistemas físicos

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recurren a la filtración, al tratamiento térmico o ala irradiación con rayos ultravioletas. Los quími-cos utilizan la cloración y la acidificación (pH 2,5)del agua de bebida. Como posible ventaja de losprocedimientos químicos cabe destacar su efec-to residual, de gran utilidad en aquellos casos enque se utilizan sistemas de bebida automatizada,con recorridos largos a través de conductos enque el agua fluye con un bajo caudal.

Condiciones de ambiente en salasde roedores

A modo de resumen, se indican las condicio-nes ambientales aceptables en las salas de roe-dores: temperatura 13-18 °C, valores críticos pordebajo de 10 °C y por encima de 25 °C, y evitarcambios bruscos. Ausencia de NH3. Microbismoinferior a 2.000 unidades formadoras de colonias(UFC)/�l o incluso nulo en condiciones de aisla-miento especial. Humedad del 60-70%. La velo-cidad del aire no debe superar los 0,15 cm/s. Ni-vel de ruidos mínimo.

Desinfección

Los procesos de limpieza, desinfección y este-rilización resultan de crucial interés en cualquierinstalación para animales de laboratorio, incre-mentándose su necesidad en aquellos casos enque se trabaja con infecciones experimentales.Definir un buen programa en este sentido re-quiere un elaborado estudio en distintos aspec-tos. Además de los ya considerados al hablar delas características constructivas, debe ser objetode consideración la elección de los materiales uti-lizados para albergar los animales. En el caso delas especies pequeñas, las jaulas utilizadas de-berán ser de materiales que resistan la desinfec-ción química y la esterilización por autoclavado.Existen actualmente productos que garantizanunas buenas prestaciones en estos aspectos, ge-neralmente jaulas de makrolón resistente a altastemperaturas. Los complementos (rejas, taponesde los biberones, comederos, etc.) deberán serde acero inoxidable. Las estructuras necesariaspara enjaular o estabular las especies más gran-des, así como las estanterías donde se sitúan lasjaulas de conejos y roedores, también deben serde acero inoxidable, y disponer de la posibilidadde ser desmontadas fácilmente en subunidadesque, por sus dimensiones, permitan su transpor-te y esterilización en autoclave. La decisión delprotocolo de limpieza y desinfección debe seracorde con los diseños experimentales que sedesarrollen y su mayor o menor factor de riesgo.

Existen en el mercado multitud de productos ytécnicas que deben ser evaluadas con el conse-jo del fabricante tanto en su selección como en elposterior proceso de aplicación. Debe tenersebien presente que las condiciones de aplicaciónresultan críticas para la obtención del nivel de efi-cacia requerido. La cantidad de material cargadoen un autoclave y su distribución dentro del mis-mo pueden hacer que un mismo programa deesterilización (tiempo-temperatura) resulte más omenos eficaz. La existencia de partículas en unsistema de tratamiento por rayos ultravioletaspuede rebajar considerablemente las prestacio-nes del mismo. En los casos de desinfección quí-mica, la dureza del agua empleada, el pH y latemperatura de uso de la solución, el tiempo decontacto, las características del material a tratar,la concentración del producto activo, y su an-tigüedad desde la fecha de preparación, sonfactores que van a condicionar su eficacia. Asímismo, deben tenerse presentes las posibles in-terferencias, durante su aplicación o por efectosresiduales, con los animales de experimentación.Existen publicaciones especializadas que orien-tan sobre las mejores aplicaciones en función delas necesidades del centro, pero de forma gene-ral en la tabla I se resumen las principales apli-caciones.

Equipamientos adicionales

Además de los ya mencionados anteriormen-te, un centro de estas características debe dispo-ner obligadamente de un sistema de generaciónde energía eléctrica autónomo, con puesta enmarcha automática en caso de fallo del suminis-tro eléctrico normal. Este generador debe tenerpotencia y capacidad de autonomía suficientepara garantizar el correcto funcionamiento de to-dos aquellos sistemas de ventilación, acondicio-namiento ambiental, iluminación y equipos bá-sicos para garantizar la supervivencia de losanimales mantenidos y la continuidad de todosaquellos procesos que establecen la barrera decontención entre el centro y el ambiente exterior.Estos equipos deben ser sometidos periódica-mente a pruebas de correcto funcionamiento quegaranticen su operatividad cuando, ocasional-mente, puedan resultar necesarios. Debe prever-se también una zona específicamente diseñadapara equipos de limpieza, desinfección y esterili-zación de materiales, y productos que así lo re-quieran, incluyendo las jaulas y complementosutilizados en la estabulación de los animales.Tanto por razones de seguridad dadas las carac-terísticas del centro, como por razones éticas

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debido a los animales albergados, conviene dis-poner de un sistema de alarmas que detectecualquier fallo que pueda repercutir en la integri-dad de sistema de barreras o en la supervivenciade los animales. Estos sistemas de alarma no de-ben resultar estresantes para las especies man-tenidas y deben ser detectables desde el exterior,comunicando con un servicio permanente de se-guridad.

Seguridad biológica y riesgo de transmisiónde agentes infecciosos a las personas

La utilización de modelos de patología in-fecciosa en un animalario genera un riesgo de

infección hacia los manipuladores y experimen-tadores en contacto con esos animales. Las exi-gencias planteadas en cada caso vienen deter-minadas, fundamentalmente, por el grado depeligrosidad (hacia la especie humana, pero tam-bién en general hacia las especies animales) delagente infeccioso en cuestión, y por la especieanimal a utilizar en el modelo infeccioso. Con elpropósito de valorar el riesgo que comporta el tra-bajo con agentes infecciosos, tanto sea en un la-boratorio como en un estabulario, se han esta-blecido clasificaciones de riesgo biológico paralos diferentes microorganismos. De este modo,los requerimientos mínimos necesarios o reco-mendables para la protección de las personas en

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TABLA IPRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LOS DESINFECTANTES MÁS USADOS

Hipoclorito sódicoEnérgico agente oxidante, activo contra la

mayoría de microorganismos, perocorrosivo para los metales. Se utilizageneralmente a la concentración de 1-5 g/l(1.000-5.000 ppm) de cloro activo. Enpresencia de materia orgánica se aumentala concentración hasta los 10 g/l(10.000 ppm) de cloro libre

FormaldehídoSuele comercializarse a una concentración

de 370 g/l (37%) en la solución conocidacomo formol. Aplicado a la concentraciónde 50 g/l (5%) de ingrediente activo,constituye un buen desinfectante líquidoeficaz para los virus de la hepatitis B o deEbola-Marburg. Su vaporización omicronebulización (6 ml de formol/m3 delocal) o la despolimerización (10,79 ml deparaformaldehído/m3 de local) proporcionaun excelente método para desinfectarsalas y edificios. Su actuación, querequiere unas condiciones ambientalesde temperatura no inferior a los 21 °C y de humedad relativa superior al 70%,debe mantenerse durante un tiempo de8 h, transcurridas las cuales se procedea su eliminación mediante ventilación delespacio con aire limpio o neutralizaciónmediante carbonato de amonio

Compuestos fenólicosAunque menos eficaces frente a virus que

los hipocloritos, existen productoseficaces frente a virus, ricketsias, hongosy bacterias vegetativas, siendo pocoactivos frente a formas esporuladas

IodóforosSu acción es parecida a la de los hipocloritos.

Debido a su neutralización por la presenciade materia orgánica, deben aplicarse sobresuperficies limpias, con soluciones quecontengan 0,075 g/l (75 ppm) de yodoactivo. Diluidos en alcohol etílico al 50%,a la concentración de 1.600 ppm de yodoactivo, se utilizan para el lavado de manoso como esporicidas. A concentraciones de0,45 g/l (450 ppm) son eficaces frente alos virus de la fiebre de Lassa y deEbola-Marburg

Ácido peracéticoSe trata de un producto muy potente que

puede considerarse un esterilizante, lo quele ha convertido en una de las principalesopciones en la tecnología gnotobiológica,a pesar de su alta corrosividad frente a losmetales y gomas, así como su fuerte olory su rápida degradación una vez preparadala dilución de uso

AlcoholesLos alcoholes etílicos e isopropílicos, a

concentraciones del 70-85%, son utilizadospara desinfección rápida de superficies

Compuestos de amonio cuaternarioDetergentes catiónicos muy eficaces para la

desinfección de superficies. Se fijan a lasproteínas, por lo que pierden eficacia porcontacto con materia orgánica. Carecende actividad esporicida o virucida (virushidrofílicos), pero sus características deolor débil, ausencia de corrosividad,estabilidad de las soluciones y bajatoxicidad han favorecido su implantación

contacto, y que han de cumplir las instalacionesen las que se realiza el trabajo en cuestión,dependen del grado en que esté clasificado elagente infeccioso correspondiente. La normativaeuropea ha sido recogida en el Real Decreto664/1997, que establece la peligrosidad de losagentes infecciosos y los grados de contenciónnecesarios para el trabajo con los mismos. Estedecreto establece una clasificación de los agen-tes infecciosos en cuatro niveles de riesgo, des-de grado 1 a grado 4, de menor a mayor peligro-sidad. Las características de los agentes incluidosen cada uno de los niveles de riesgo se resumenen la tabla II. Ha de tenerse en cuenta que estaclasificación se ha realizado considerando los po-sibles efectos de los agentes infecciosos sobresujetos sanos y, por tanto, no se han tenido encuenta características particulares de la persona,como enfermedades previas, medicación, tras-tornos inmunitarios, embarazo o lactancia. Lasprincipales bacterias, virus, hongos, parásitos ypriones que han de manipularse en contención

de nivel 3 se recogen en la tabla III. Como com-plemento de esta clasificación de peligrosidad delos agentes infecciosos, el Real Decreto 664/1997regula además las principales características quehan de cumplir las instalaciones que alberguen omanipulen agentes infecciosos (tabla IV). Los ni-veles de contención de la instalación, con valoresprogresivos de 1 a 4, se corresponden con los ni-veles de peligrosidad fijados para los microor-ganismos respectivos. El grado de protecciónadecuado de experimentadores y cuidadores, in-cluso en instalaciones diseñadas de forma ópti-ma, sólo puede alcanzarse a través de procedi-mientos de trabajo correctos, específicos deltrabajo con animales infectados. En la tabla V seincluyen algunas de las recomendaciones queafectan al personal en contacto con animales in-fectados.

El riesgo de contagio desde los animales infec-tados hacia las personas puede ser por contactodirecto, a través de secreciones (en especial sa-liva, heces y orina), o por vía aerógena en aero-soles. A su vez, los traumatismos (mordeduras,arañazos), aparte de las lesiones en sí mismas,son vía de inoculación parenteral de agentes in-fecciosos. La diseminación de agentes infeccio-sos en aerosoles a partir de los animales infecta-dos obliga a medidas de contención específicasen los alojamientos de animales. En el caso deanimales de pequeño tamaño, la contenciónpuede realizarse en aisladores herméticos, consistemas de filtración absoluta a la salida del cir-cuito. Sin embargo, en el caso de animales detamaño mediano (p. ej., animales domésticoscomo el perro, el cerdo o la oveja), la contenciónsólo es posible desde el cubículo experimentalhacia el exterior (sistemas de filtro a la salida delsistema de ventilación). Es estos casos, el expe-rimentador ha de protegerse individualmente(mascarillas, etc.) antes de penetrar en el cubí-culo. Es interesante señalar que algunos de losagentes infecciosos de peligrosidad 3 (tabla III)no se transmiten a través del aire. Este hechosimplifica enormemente la experimentación conestos agentes, pues si bien ésta tiene que seguirrealizándose en instalaciones con nivel de con-tención 3, los animales y las muestras de ellos re-cogidas no tienen obligatoriamente que manejar-se en cabinas de seguridad biológica, aisladoreso sistemas similares.

Requerimientos legalesde la experimentación animal

La protección de los seres vivos vertebradosutilizados con fines experimentales, científicos o

170


TABLA IIGRADOS DE PELIGROSIDAD DE LOS

AGENTES INFECCIOSOS, EN FUNCIÓNDEL RIESGO QUE IMPLICA LA INFECCIÓN

PARA EL SER HUMANOGrado 1Resulta poco probable que cause una

enfermedad en la especie humana

Grado 2Puede causar enfermedad en la especie

humana, y la exposición al mismo puedeconstituir un peligro, pero es pocoprobable que se extienda a la colectividad,y por lo general existe profilaxis y/otratamiento eficaz

Grado 3Puede causar enfermedad grave en la

especie humana, y por tanto la exposicióncomporta un serio peligro para la salud.Existe riesgo de que se propague a lacolectividad, si bien por lo general haytratamiento y/o profilaxis eficaz

Grado 4Puede causar enfermedad grave en la

especie humana, y por tanto la exposicióncomporta un serio peligro para la salud.La probabilidad de que se propague en lacolectividad es alta, no existiendo por logeneral una profilaxis o un tratamientoeficaces

educativos está regulada en el ámbito del Con-sejo de Europa por el Convenio Europeo firma-do en 1986 y en el marco de la Unión Europeapor la Directiva 86/609/CEE. En el ámbito esta-tal se recoge la aplicación de estas normativasen el Real Decreto 223/1988 que, a su vez, es-tablece las competencias de las distintas Co-munidades Autónomas en la regulación y con-trol de la experimentación animal. En Cataluña,el marco jurídico ya existente sobre protecciónanimal (Ley 3/1988) se complementa con la le-gislación específica sobre protección de los ani-males utilizados para experimentación y otrasfinalidades científicas: Ley 5/1995 y Decreto214/1997. Así pues, la utilización de seres vivosvertebrados como modelos experimentales enpatología infecciosa debe realizarse de acuerdocon lo establecido en esta legislación, en losdistintos aspectos que a continuación se resu-men:

¿Cuándo se pueden desarrollar procedimientosque impliquen el uso de animales?

Sólo en aquellos casos en los que no exista unprocedimiento alternativo, factible y validado quepermita obtener unos resultados equivalentes sinusar animales.

¿Quién puede diseñar y realizarprocedimientos experimentales con animales?

Solamente aquellas personas debidamenteacreditadas como personal investigador y experi-mentador, sobre la base de su nivel de formacióny experiencia.

¿Dónde se pueden llevar a caboprocedimientos experimentales con animales?

Únicamente en centros debidamente registra-dos, lo que garantiza que disponen de instalacio-nes y personal adecuados para estos fines.

171


TABLA IIIPRINCIPALES AGENTES INFECCIOSOS CLASIFICADOS EN EL NIVEL DE RIESGO 3, CON

INDICACIÓN (*) DE AQUELLOS CUYA TRANSMISIÓN NO SE REALIZA POR VÍA AERÓGENA

BacteriasBacillus anthracisBrucella abortusBrucella canisBrucella melitensisBrucella suisChlamydia psitacci (cepas aviares)Coxiella burnetii*Escherichia coli (cepas verocitotóxicas)Francisella tularensis (tipo A)Mycobacterium africanumMycobacterium bovis*Mycobacterium microti Mycobacterium tuberculosis*Mycobacterium ulceransPseudomonas malleiPseudomonas pseudomallei*Rickettsias*Salmonella typhi*Shigella dysenteriae (tipo 1)Yersinia pestis

HongosBlastomyces dermatitidisCoccidioides immitisHistoplasma capsulatumParacoccidioides brasiliensis

Virus Coriomeningitis linfocítica (cepas

neurotrópicas)*Hepatitis C

Encefalitis B japonesaFiebre amarilla*Hepatitis B*Hepatitis DHerpesvirus simiae (virus B)*Virus de la inmunodeficiencia humana

(VIH)*Virus de la inmunodeficiencia de simios

(VIS)*Virus de la leucemia de células T (VLCT)*Rabia*Hepatitis E

Parásitos*Echinococcus granulosus*Echinococcus multilocularis*Leishmania brasiliensis*Leishmania donovani*Plasmodium falciparum*Taenia solium*Trypanosoma brucei rhodesienseTrypanosoma cruzi

Encefalopatías espongiformestransmisibles

*Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob*Síndrome de

Gerstmann-Sträussler-Scheinker*Encefalopatía espongiforme bovina

(EEB)*Otras TSE de origen animal afines

172


TABLA IVMEDIDAS DE CONTENCIÓN A OBSERVAR PARA LOS DIFERENTES GRADOS

DE PELIGROSIDAD DE LOS AGENTES INFECCIOSOS Niveles de contención

Medidas de contención 2 3 41. La zona de trabajo se encontrará

separada de toda actividad quese desarrolle en el mismoedificio

2. El aire introducido y extraídode la instalación se filtrarámediante filtros HEPA

3. Acceso controlado de personal

4. La instalación debera poderprecintarse (por zonas o ensu totalidad) para permitir sudesinfección

5. Procedimientos de desinfecciónespecificados

6. La instalación se mantieneglobalmente en presiónnegativa respecto a la presiónatmosférica

7. Control eficiente de vectores(p. ej., roedores e insectos)

8. Superficies impermeablesal agua y de fácil limpieza

9. Superficies resistentes a ácidos,álcalis, disolventes ydesinfectantes

10. Almacenamiento de seguridadpara agentes biológicos

11. Ventana o dispositivo deobservación equivalente paravisualizar a los ocupantes delas zonas de trabajo

12. Instalación con equipamientopropio

13. El material infectado, incluidoslos animales, deberá manejarseen cabinas de seguridadbiológica o aisladoresapropiados

14. Incinerador para la destrucciónde cadáveres de animales

No

No

Aconsejable

No

Sí

No

Aconsejable

Sí, parasuperficiesde trabajo

Aconsejable

Sí

Aconsejable

No

Cuandoproceda

Aconsejable

Aconsejable

Sí, para el airede salida

Sí

Aconsejable

Sí

Aconsejable

Sí

Sí, parasuperficies detrabajo y suelos

Sí

Sí

Aconsejable

Aconsejable

Sí, parainfecciones quese propaguenpor el aire

Sí

Sí

Sí, para el aire deentrada y desalida

Sí, con exclusade aire

Sí

Sí

Sí

Sí

Sí, para superficiesde trabajo ysuelos, paredesy techo

Sí

Sí, almacenamientoseguro

Sí

Sí

Sí

Sí, en la mismainstalación

¿Cuál es el proceso a seguir para desarrollarun procedimiento experimental?

El investigador ha de presentar un protocolodetallado del estudio, que debe ser previamenteaprobado por el comité ético en experimentaciónanimal del centro y notificado a la Administración.En determinados supuestos se requiere tambiénla autorización previa de la Administración.

¿Qué aspectos principales debe supervisareste comité ético?

La idoneidad del procedimiento en función delos objetivos del estudio, la utilización del menornúmero posible de animales que permita obtenerconclusiones válidas, la inexistencia de métodosalternativos a la utilización de animales, la ido-neidad del modelo experimental seleccionado, elcorrecto tratamiento y cuidado de los animales,la aplicación de todas aquellas técnicas que per-mitan reducir o eliminar el sufrimiento, dolor yestrés de los animales, la utilización de métodoseutanásicos adecuados y humanitarios, la ade-cuada formación del personal que intervenga enel estudio y que el mismo se desarrolle de acuer-do con el protocolo aprobado.

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of hazard (4.ª ed.). U.S. Public Health Service AdHoc Committe on the safe shipment and handlingof etiologic agents. Washington DC: U.S. Depart-ment of Health Education and Welfare, 1974.

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Barbeito MS et al. Recommended biocontainment fea-tures for research and diagnostic facilities where

173


TABLA VPROCEDIMIENTOS Y RELATIVOS AL

PERSONAL EN ANIMALARIOS CON NIVELDE BIOSEGURIDAD 3

Acceso a las salas de inoculación restringidoo limitado a personal informado del riesgode infección. No se permite el acceso apersonas con mayor riesgo de infectarse

Colocación de signos de peligrosidadbiológica bien visibles a la entrada de loshabitáculos de animales en el caso de quese requiera equipo de protección accesorio(máscara, etc.), con la indicaciónrespectiva

Lavado de manos al manipular animales,al quitarse los guantes, y al abandonar lainstalación

Prohibición de comer, beber, y fumar, y dealmacenar alimentos en los habitáculosde animales

Evitar la formación de aerosoles en cualquiermanipulación

Descontaminación de las superficies detrabajo si se derrama material infeccioso

El personal sigue programas de vacunaciónapropiados, y se le practican pruebas dediagnóstico de forma rutinaria frente a lasenfermedades a las que está expuesto.Así mismo, se recogen muestras de suerodel personal, que se analizan y seconservan de forma histórica

Existe un manual de bioseguridad, puestoen conocimiento del personal, que recibeinstrucción periódica y actualizaciónessobre procedimientos, al menosanualmente

Se adoptarán precauciones especiales almanipular instrumentos contaminadospunzantes o cortantes (agujas, hojas debisturí, etc.), que serán colocadas encontenedores especiales para serautoclavados antes de su eliminación

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J.M. MIRÓ: La mayor parte de modelos experi-mentales que se han comentado hoy, con bac-terias y hongos, se situarían en un nivel inferioral que has centrado tu presentación. Creo quesólo el modelo del grupo de Pere-Joan Cardo-na, con micobacterias, correspondería al nivel3. ¿Podrías comentar brevemente las medidascorrespondientes al nivel 2?

M. DOMINGO: En el nivel de contención 2 se re-quieren las medidas de un laboratorio conven-cional, es decir, se restringe un poco la entradade personal, siendo aconsejable que haya un ac-ceso controlado pero sin ser absolutamente obli-gatorio. Es lógico que si se trabaja con modelosinfecciosos sería mucho más conveniente ase-gurar este acceso restringido. No se requiere ais-lamiento especial, no hace falta filtrar el aire desalida, ni poder precintar la instalación para po-sibles escapes de algún agente infeccioso y nose necesita tener presión negativa. La ventilaciónpuede ser la habitual de un centro de investiga-ción, con un sistema estándar de aire acondi-cionado. Las poyatas, lógicamente, deben tenerlas superficies tratadas para poder trabajar enellas y poder desinfectarlas, pero no se requierenada especial en suelos, paredes y techos.

J. GAVALDÀ: Por un lado me parece fantástico quela normativa no obligue a un nivel de seguridad

especial para los grupos que trabajamos conmodelos de infección en animales, porque, a ve-ces, nos encontramos con ciertas trabas parapoder trabajar con una cierta “comodidad”. Es-tamos convencidos que la mayoría de modelosexperimentales de infección no comportan nin-gún riesgo para el resto de procedimientos, perogeneralmente es difícil convencer a los otros in-vestigadores. Finalmente, me gustaría comentarque el grado de seguridad dentro de un mismonivel 2 variará en función del patógeno con elque se trabaje; por ejemplo, si trabajas con unmodelo de endocarditis por Staphylococcus au-reus resistente a la meticilina (SARM), se debentomar medidas de aislamiento de contacto por-que uno puede convertirse en portador, al igualque si se trabaja con neumonía por neumococoaltamente resistente.

M. DOMINGO: Respecto a la primera observación,si se está trabajando con un grupo de nivel 3,se debe trabajar lógicamente de forma inde-pendiente. Lo que es absurdo es obligar a quemodelos que estén en nivel 2, deban entrar enuna instalación de nivel 3, porque no tiene nin-guna lógica y va a complicar de forma grave lamanera de trabajar, además de crear cierto sín-drome diario de resistencia de entrar en lasinstalaciones antes de empezar a trabajar. Cen-

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World Health Organization (WHO). Laboratory biosafetymanual (2.ª ed.). Ginebra: WHO, 1993.

174


DISCUSIÓN

trándonos en el nivel 2, convencer a las perso-nas de alrededor de que un tipo de agente in-feccioso no va a ser problemático para sus ex-perimentos dependerá fundamentalmente delas barreras de contención que podamos argu-mentar y mostrar a la otra persona o grupo. Detodas maneras, eso no siempre es fácil porqueno todo el mundo entiende las dudas de unamisma manera. El entendimiento siempre esmás fácil, en mi opinión, entre investigadoresque entre un grupo de investigación y la autori-dad administrativa o la autoridad laboral. Lomejor es aislar totalmente, no compatibilizar yevitar zonas comunes de trabajo para determi-nados procedimientos, siempre que ello sea po-sible. La normativa establece que se haga unavaloración de riesgo en cada caso y que, frutode esta valoración, se tomen las medidas másoportunas.

J. GAVALDÀ: Si centramos la discusión en el nivel2, tú sugieres separar los diferentes procedi-mientos, ante lo cual yo no estoy nada deacuerdo. Es decir, si tenemos que rentabilizarnuestros espacios de estabulario y ademásqueremos trabajar con comodidad y eficacia, loideal es disponer de espacio y evitar separacio-nes excesivas del animalario. Mi experiencia esque trabajar con endocarditis, osteomielitis, pe-ritonitis, etc., no comporta ningún riesgo paragrupos próximos que no trabajen con infeccio-nes; sin embargo, siempre que se plantea eltema dentro de un mismo nivel 2, acaban obli-gándonos a separar el estabulario y el laborato-rio, lo que al final conduce a espacios muy re-ducidos, con una incomodidad absoluta y sinningún sentido.

M. DOMINGO: Tal vez las cosas podrían mejorar sieste tipo de decisiones se acordaran de formacolegiada y con una discusión independiente alos dos grupos enfrentados por ese problema. Lanormativa considera la posible constitución deuna comisión, dependiente de la empresa, quedebe realizar este tipo de valoraciones de riesgoantes de tomarse medidas. En cualquier caso,aconsejo explicarlo a los respectivos directoresde vuestros estabularios, que son en este mo-mento los que pueden tomar decisiones sobresi podéis trabajar con vuestros modelos dentro,al lado o fuera de determinadas instalaciones.

J.L. RODRÍGUEZ TUDELA: Para el establecimientodel nivel de seguridad es importantísimo tener

en cuenta también cómo se transmite el micro-organismo con el que se trabaja, si lo hace poraire o por otra vía. Las precauciones, por ejem-plo, con S. aureus, deben ser muy diferentesque con otros microorganismos. Y, como se hacomentado, a pesar de la importancia que pue-da tener la normativa, siempre debe prevalecerel sentido común. En los laboratorios de micro-biología y de modelos de infección se manipu-lan grandes cultivos de microorganismos algu-nos de los cuales hay que considerar con otronivel de seguridad; es el caso de Legionella oCryptococcus neoformans que, por ejemplo, noson contemplados en el decreto.

J. CANTÓ: Creo que se debe abandonar la creen-cia de que los que trabajan con determinadosmodelos experimentales sean unos “apesta-dos”, aunque sea con modelos de patología in-fecciosa. La posible solución al problema que seha planteado anteriormente y si no se quierecrear una comisión, sería el nombramiento,como establece la ley, de una persona respon-sable de estos temas para todo el centro. Así seevita la polémica y el enfrentamiento entre lospropios grupos de investigación implicados. Elresponsable, basándose en criterios científicosy a través de la dirección del centro, será quiendeba comunicar a los grupos cuáles tienen queutilizar un espacio, compartido o no con otros in-vestigadores. De todas maneras y en determi-nadas situaciones, existen además problemasde falta de espacio para poder compartimentarlos laboratorios. Esto puede ser independientede que se trabaje con patología infecciosa o no,y la justificación reside en que determinadosgrupos de investigación agradecerían tener supequeña zona de experimentación a fin de faci-litar el control de los experimentos, no por el ries-go de infección, en este caso, sino por la con-ciencia de los miembros del grupo en evitarruidos, lo que repercute en un menor estréspara los animales y se traduce en la obtenciónde mejores o más fiables resultados en los ex-perimentos. A nivel sanitario la solución la brin-dan las cabinas o unidades autónomas de aisla-miento, también conocidas como armarios, quepermiten compartimentar una sala en 3 o 4 depequeñas, sin hacer obras, y que ofrecen ga-rantías, incluso, de filtración sanitaria, si es quees éste el riesgo, para que distintos grupos pue-dan compartir un mismo espacio.

175


Algunos comentarios que considero que cabría destacar de las diferentes presentaciones y discusio-nes de la mesa redonda de hoy, a modo de muy breve conclusión, son los siguientes:

– Se debe destacar la importancia del empleo de bioensayos o ensayos biológicos para determinar lasconcentraciones de antibióticos y la ventaja que esto puede tener para los antibióticos con metabolitos.

– Cada vez adquieren más importancia los modelos humanizados, con la compleja base matemáticaque requieren, a pesar de que todavía hace falta una demostración formal de su validez.

– En el modelo de endocarditis, incluso tratándose de uno de los modelos más clásicos, persisten to-davía dudas y discusiones sobre cuándo se debe iniciar el tratamiento y sobre el momento más adecua-do del sacrificio del animal.

– En el modelo de meningitis, por un lado cabe destacar la corroboración con los animales de los da-tos sobre el empleo de la dexametasona administrada previa o simultáneamente al tratamiento antibióti-co, a partir de los datos ya publicados por el mismo grupo en patología humana; por otro lado, destacaque el empleo de antiinflamatorios no debe ser una práctica rutinaria dado que, por ejemplo, con van-comicina se ha observado que no funciona bien al menos en el modelo animal.

– En el modelo de neumonía se ha generado cierta discusión sobre la manera de inocular el neumo-coco, si por inhalación o depositando directamente los microorganismos en el tejido pulmonar.

– Una de las cosas que ha llamado más la atención en los modelos de infección por cuerpo extraño hasido la capacidad de desarrollar resistencias reales de los microorganismos por el hecho de contactar condeterminados cuerpos extraños, aparte de los problemas del slime o del glicocálix que puedan impedirel acceso físico del agente patógeno.

– También se ha comentado en una de las discusiones la inexistencia de diferencias demostradas parala mayoría de los modelos por emplear animales de uno u otro género. La recomendación ha sido em-plear ambos géneros, lo que probablemente facilita el trabajo a los que se encargan de la cría.

– El estudio del componente inflamatorio a través de los modelos de infecciones intraabdominales ad-quiere cada vez más importancia, sobre todo en los modelos de cirugía laparoscópica. Al igual que hasucedido con la meningitis, quizás en un futuro habrá que plantearse analizar la asociación de antiinfla-matorios al tratamiento antibiótico; de hecho, ya existen datos en este sentido en peritonitis espontáneadel cirrótico.

– En los modelos experimentales de infecciones fúngicas, lo más llamativo es que casi nada parece es-tar estandarizado y que queda mucho trabajo por delante en la estandarización tanto del propio modelocomo de la forma de valorar los resultados.

– A pesar de todos los problemas comentados con el modelo de tuberculosis pulmonar, quizá lo im-portante es disponer del modelo como tal, y conseguir que sea reproducible. Con las modificaciones in-troducidas al modelo se constata que es muy parecido a la tuberculosis pulmonar del humano, lo quepermite utilizarlo para el análisis de nuevos fármacos.

– El modelo de osteomielitis es el modelo clásico conocido por todos, aunque en la actualidad puedegenerar algunas discusiones en cuanto a su definición.

– Finalmente, en la última intervención de hoy, se han presentado las bases de cómo organizar los ni-veles de seguridad o de aislamiento de los laboratorios que trabajan con modelos experimentales de pa-tología infecciosa.

José M.ª GatellServicio de Enfermedades Infecciosas.

IDIBAPS*-Hospital Clínic Universitari de Barcelona.Correo electrónico: [email protected]

A modo de conclusión

177

*IDIPAPS = Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer.

CENTROS CON MODELOS EXPERIMENTALES DE PATOLOGÍA INFECCIOSA QUE HAN PARTICIPADO

EN ESTA MONOGRAFÍA

179

Centro Responsables Modelos experimentales

Centro Nacionalde Microbiología.Instituto de Salud Carlos III

Unidad de MicologíaCtra. Majadahonda-Pozuelo km. 228220 Majadahonda

Ciutat Sanitària Universitàriade Bellvitge

Servicio de EnfermedadesInfecciosas

Laboratorio de InfecciónExperimental

Pavelló de Govern. Lab. 4131Feixa Llarga, s/n08907 L’Hospitalet de Llobregat

Facultad de Medicina.Universidad Complutensede Madrid

Departamento de Microbiología I28040 Madrid

IDIBAPS-Hospital ClínicUniversitari de Barcelona

Villarroel, 17008036 BarcelonaLaboratorio Experimental

de Cirugía General (Escalera 6, 1.ª planta)

J.L. Rodríguez-Tudela, M. Cuenca-Estrella, E. MelladoTel. 91-509-79-61Fax: [email protected]

C. Cabellos, F. Gudiol,J.M. Maiques, P.F. Viladrich,A. Montero, X. ArizaTel. 93-403-58-03Fax: [email protected]@csub.scs.es

J. Prieto, M.L. Gómez-Lus, F. FuentesTel. y fax: [email protected]

M.C. Balagué Tel. 93-227-55-89cbalagué@sendanet.es

• Candidosis diseminada• Aspergilosis invasora

• Meningitis neumocócicaen conejos

• Meningitis por P.aeruginosa en cobayas

• Neumonía por A. baumaniien ratones

• Neumonía en ratones• Sepsis intraperitoneal en

ratones• Lesión en muslo de ratón

neutropénico

• Alteraciones estructuralesdel peritoneo diafragmáticosegún diferencias depresión intraabdominal.Influencia sobre laabsorción translinfática enpresencia de peritonitis

(Continúa)

180


RELACIÓN DE LOS CENTROS Y RESPONSABLES CON MODELOS EXPERIMENTALES DE PATOLOGÍA INFECCIOSA QUE HAN PARTICIPADO EN ESTA MONOGRAFÍA (Cont.)

Centro Responsables Modelos experimentales

Laboratorio Experimental deEnfermedades Infecciosasy Microbiología(Escalera 9, 4.ª planta)

Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau

Servicio de Cirugía GeneralLaboratorio de InflamaciónPare Claret, 16708025 Barcelona

Hospital de la Vall d’HebronServei de Malalties InfecciosesLaboratori de Recerca en

Malalties InfecciosesPg. Vall d’Hebron, 119-12908035 Barcelona

Hospital Gómez UllaUnidad de Enfermedades

InfecciosasCrta. Ejército, s/n28047 Madrid

Hospital Universitari GermansTrias i Pujol

Unitat de TuberculosisExperimental

Carretera del Canyet, s/n08916 Badalona

Hospitales UniversitariosVirgen del Rocío

Laboratorio de ModelosExperimentales

Servicio de EnfermedadesInfecciosas

Avda. Manuel Siurot, s/n41013 Sevilla

J.M. Miró, F. Marco, J.M. Gatell, M.T. Jiménez de AntaTel. 93-227-55-86Fax: [email protected]@medicina.ub.es

E.M. Targarona, J. Vila,M. TríasTel. 93-291-91-47Fax [email protected]@hsp.santpau.es

A. Pahissa, J. Gavaldà, J.A. Capdevila, P. LópezTel. 93-489-40-33 Fax: [email protected]@[email protected]

M. Gomis, J. BarberánTel. 91-422-80-00Fax: [email protected]@sefh.es

P.J. Cardona, V. AusinaTel. 93-497-88-95Fax: [email protected]

J. Pachón Pichardo, A. García CurielTel. 95-424-82-65Fax: [email protected]

IDIBAPS: Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer.

• Endocarditis infecciosa:modelos de profilaxis ytratamiento

• Farmacocinéticahumanizada

• Mecanismos precoces derespuesta peritoneal porcontaminaciónintraoperatoria experimentaldurante la cirugíalaparoscópica comparadacon la cirugía abierta

• Endocarditis• Neumonía• Sepsis por catéter• Peritonitis• Aspergilosis pulmonar

invasiva• Farmacocinética humanizada

• Osteomielitis crónica

• Tuberculosis experimental

• Endocarditis infecciosa• Neumonía en ratones y

cobayas

Absceso intraabdominal, 107,109,112Actividad in vitro, 12Animales de laboratorio, 170,166-168 Aspergilosis pulmonar, 125-129Candidiasis sistémica experimental, 120-125Cuerpo extraño, 92Curva de letalidad, 15Efecto postantibiótico, 27, 28Endocarditis experimental, 48, 51– profilaxis, 51-52– tratamiento, 52-58Farmacocinética, 29, 33Farmacocinética animal, 38, 39– humana, 37– humanizada, 36, 40-43Farmacodinamia, 24, 25, 33Fisiopatología de la neumonía, 85-86 Gnotobiología, 163Infecciones intraabdominales, modelo experimental,

105-109

Infecciones por cuerpos extraños, modeloexperimental, 92-95

– profilaxis, 93Meningitis experimental, 72-75– patología, 75-76– tratamiento, 76-77Neumonía, modelo experimental, 82-85– tratamiento, 86-87Osteomielitis crónica, 154-157– experimental, 149-151– patología, 152, 154Patogenia fúngica, 125, 128Recomendaciones de seguridad, 172Shock séptico, modelo experimental, 105, 112Sinergia, 17, 18Tuberculosis experimental, 138-140– fisiopatología, 136, 140-143– tratamiento, 143-145

Índice de materias

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1. El hospital de día y su repercusión en tera-péutica (1985).

2. Problemas que se plantean en el tratamientode infecciones graves por S. aureus (1986).

3. Contribución del biólogo a la farmacología enEspaña (1987).

4. Un glosario para farmacólogos (1987).5. Aspectos biológicos de los síndromes depre-

sivos (1988).6. Bases del tratamiento de las intoxicaciones

agudas (1988).7. Investigación básica y medicina clínica

(1988).8. Tratamiento de datos en farmacología (1989).9. Perspectivas terapéuticas en la esclerosis

múltiple (1989).10. Biotecnología de aplicación farmacéutica

(1991).11. Metodología del ensayo clínico (1991).12. Periodismo científico. Un simposio interna-

cional (1991).13. El ensayo clínico como tarea cooperativa

(1992).

14. Terapéutica y calidad de vida (1993).15. Investigación sobre cáncer en España: de

la biología molecular a la clínica (1994).16. El tratamiento del dolor: del laboratorio a la

clínica (1994).17. Farmacología de los canales iónicos (1995).18. Bases de datos en farmacología y terapéuti-

ca (1996).19. Fármacos y conducción de vehículos

(1996).20. Traducción y lenguaje en medicina (1997).21. Medicina y medios de comunicación. Tra-

ducción al español de una serie publicadaen la revista The Lancet (1997).

22. Problemas y controversias en torno al ensa-yo clínico (1998).

23. Glosario de investigación clínica y epidemio-lógica (1998).

24. Transducción de señales como diana far-macológica (1999).

25. Investigación médico-farmacéutica en aten-ción primaria. Una visión a través de las pu-blicaciones de la REAP (1999).

Monografías Dr. Antonio Esteve publicadas

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MONOGRAFÍAS DR. ANTONIO ESTEVE MODELOS EXPERIMENTALES DE ... · la puerta de entrada, la...

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