A los lectores

El programa de monografas cientficas es una faceta de la vasta labor de laOrganizacin de los Estados Americanos, a cargo del Departamento de AsuntosCientficos y Tecnolgicos de la Secretara General de dicha organizacin, a cuyofinanciamiento contribuye en forma importante el Programa Regional de Desa-rrollo Cientfico y Tecnolgico.

Concebido por los Jefes de Estado Americanos en su Reunin celebrada enPunta del Este, Uruguay, en 1967, y cristalizado en las deliberaciones y manda-tos de la Quinta Reunin del Consejo Interamericano Cultural, llevada a cabo enMaracay, Venezuela, en 1968, el Programa Regional de Desarrollo Cientfico yTecnolgico es la expresin de las aspiraciones preconizadas por los Jefes de Es-tado Americanos en el sentido de poner la ciencia y la tecnologa al servicio de lospueblos latinoamericanos.

Demostrando gran visin, dichos dignatarios reconocieron que la ciencia y latecnologa estn transformando la estructura econmica y social de muchas na-ciones y que, en esta hora, por ser instrumento indispensable de progreso enAmrica Latina, necesitan un impulso sin precedentes.

El Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico es un comple-mento de los esfuerzos nacionales de los pases latinoamericanos y se orienta ha-cia la adopcin de medidas que permitan el fomento de la investigacin, la ense-anza y la difusin de la ciencia y la tecnologa; la formacin y perfeccionamientode personal cientfico; el intercambio de informaciones, y la transferencia y adap-tacin a los pases latinoamericanos del conocimiento y las tecnologas generadasen otras regiones.

En el cumplimiento de estas premisas fundamentales, el programa de mono-grafas representa una contribucin directa a la enseanza de las ciencias en ni-veles educativos que abarcan importantsimos sectores de la poblacin y, al mis-mo tiempo, propugna la difusin del saber cientfico.

La coleccin de monografas cientficas consta de cuatro series, en espaol yen portugus, sobre temas de fsica, qumica, biologa y matemtica. Desde suscomienzos, estas obras se destinaron a profesores y alumnos de ciencias de losprimeros aos de la universidad; de stos se tiene testimonio de su buena acogi-da.

El Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico de la SecretaraGeneral de la Organizacin de los Estados Americanos agradece a los doctoresRodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone, autores de esta monografa,y a quienes tengan el inters y buena voluntad de contribuir a su divulgacin.

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INDICE

Prlogo .............................................................................................................

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INTRODUCCION ............................................................ ...............................

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CAPITULO 1Definiciones y reas de aplicacin ..........................................................

4Definiciones ..............................................................................................

4Areas de Aplicacin ..................................................................................

6Smbolos y unidades ................................................................................

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CAPITULO 2Aspectos generales de los procesos de fermentacin ..............................

8Efectores internos y externos ..................................................................

8Esquema de un proceso industrial ..........................................................

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CAPITULO 3Seleccin, mantenimiento y mejoramiento de microorganismos deinters industrial .....................................................................................

13Seleccin ...................................................................................................

13Mantenimiento o conservacin de los cultivos .......................................

15Mejoramiento de microorganismos industriales ....................................

18Obtencin de nuevas cepas por ingeniera gentica ...............................

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CAPITULO 4Medios de fermentacin ...........................................................................

31Requerimientos nutricionales .................................................................

31Disponibilidad de los componentes .........................................................

33Materias primas fundamentales .............................................................

34Formulacin .............................................................................................

35Optimizacin ............................................................................................

37Esterilizacin ............................................................................................

37

CAPITULO 5Crecimiento microbiano ...........................................................................

43Estequiometra de crecimiento ................................................................

43Cintica de crecimiento ...........................................................................

49Consumo de sustrato ...............................................................................

50Mantenimiento celular ............................................................................

51Requerimiento de oxgeno .......................................................................

51Efecto de pH y la temperatura sobre el crecimiento ...............................

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CAPITULO 6Formacin de producto ............................................................................

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CAPITULO 7Sistemas de cultivo y aspectos generales de bioreactores .....................

60Sistemas de cultivo ...................................................................................

60Cultivo continuo .......................................................................................

61Batch alimentado .....................................................................................

64Batch .........................................................................................................

67Bioreactores ..............................................................................................

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CAPITULO 8Produccin de levadura de purificacin ..................................................

73Introduccin .............................................................................................

73Cepas y medios de mantenimiento empleados .......................................

73Requerimientos nutricionales .................................................................

74Cintica de crecimiento y rendimientos ..................................................

75Produccin comercial ...............................................................................

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CAPITULO 9Produccin de Penicilina .........................................................................

82Introduccin .............................................................................................

82Cepas, medios de mantenimiento e inculos ..........................................

82Requerimientos nutricionales y especficos ............................................

84Parmetros de produccin .......................................................................

85Tecnologa del proceso .............................................................................

87Economa del proceso ...............................................................................

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CAPITULO 10Tratamiento de efluentes ........................................................................

92Aspectos fundamentales ..........................................................................

93Diferencias entre tratamientos biolgicos de efluentes y procesos defermentacin.............................................................................................. 97Mtodos de tratamiento ...........................................................................

99Metodologa para la determinacin de la calidad de un efluente ..........

100Estrategia general para encarar el problema de los efluentes ..............

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CAPITULO 11Posibilidades futuras ...............................................................................

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PROLOGO

El ttulo `Microbiologa Industrial" puede tener connotaciones un poco ambi-guas, especialmente en medios acadmicos. Hay, lamentablemente, en todo elmundo universitario, una tendencia a separar dicotmicamente entre "ciencia pura" y "aplicaciones". De esto resulta por un lado la Ciencia, y por el otro las apli-caciones, sobre todo las industriales, presentadas como una serie de "recetas" ba-sadas en empirismos.

Esta estructura conceptual es errnea, y ms an, nociva. Nada ms errneoque ignorar que las aplicaciones industriales requieren, para ser competitivas enel mundo actual, estar basadas en slidos conocimientos. La solucin de los problemas reales que generan el diseo y operacin ptima de una moderna plantaindustrial basada en un proceso biolgico, requiere lo ms moderno del geniocientfico.

En ese sentido, esta monografa puede ser considerada una reivindicacin delo que debe ser la Microbiologa Industrial. Tras ese ttulo, que ha sido en el pasa-do mal interpretado y a veces despreciado, se esconde el desarrollo de una serie detemas que bien podran ubicarse bajo ttulos ms de moda y de ms "apeal", comobiotecnologa, ingeniera. bioqumica, etc. Se trata de las bases de la tecnologaque en todo el mundo se est. desarrollando y traduciendo en logros industriales.La secuencia. de los captulos indica., en realidad, el camino a seguir para el dise-o de un proceso industrial biolgico: desde la seleccin y mantenimiento de mi-croorganismos, incluyendo referencias a. microorganismos recombinantes y a losprincipios bsicos de los medios de fermentacin. Se tratan luego los principios deestequiometra y cintica. microbiana, y se analiza los tipos de biorreactores dispo-nibles. El trabajo termina con la presentacin de tres ejemplos detallados de pro-cesos microbiolgicos: levadura, penicilina y tratamiento de efluentes.

Todo esto est presentado en una forma accesible, a pesar de reflejar en mu-chos aspectos los ltimos avances en el conocimiento de los sistemas de produc-cin bio-industriales.

El Dr. R. Ertola es, sin lugar a dudas, la persona que ms impacto ha tenidoen el desarrollo de la. ingeniera bioqumica en la Argentina, y los Dres. Mignone

conocimiento en el tenia, y una. reivindicacin de lo que debe ser entendido por Mi-crobiologa Industrial.

Prof. Jos MerchukBen Gurion University

Beer Sheva, Israel

sciint1y Yantorno que fueron sus alumnos, son sus dignos sucesores: su esfuerzo manco-

INTRODUCCION

Los microorganismos pueden ser considerados en trminos generales con doscriterios que son antagnicos. Uno corresponde a las actividades tiles que tie-nen algunos para obtener bienes o servicios y otro completamente distinto corres-ponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que estn generalmente asociadosa la produccin de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y quetambin se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materialesdiversos.

La Microbiologa Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividadestiles de los microorganismos.

El trmino microorganismo se aplica en esta monografa, con el mismo crite-rio que el utilizado por Palleroni, o sea a organismos tales como bacterias, hongosy levaduras, es decir procariotes y eucariotes con inclusin de algas microscpi-cas, pero que no comprende a los virus. Aunque existen aplicaciones industrialesde los virus como es el caso de la produccin de algunas vacunas esos procesosquedan excludos de esta monografa.

Las aplicaciones de los microorganismos datan de tiempo inmemorial. Elhombre hizo uso de ellos sin saber que stos existan desde que invent o descu-bri al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era cono-cida antes del 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existaya verdadera produccin en 1700 a.C.; el vinagre se produca desde antes de esafecha y el vino es tambin muy antiguo, ya que existe evidencia de su produccinantes del 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente el pan se conoce desde 4000a.C. aproximadamente.

Se puede afirmar que hasta comienzos del siglo XX existe muy poco o ningncontrol de los procedimientos utilizados para la elaboracin de esos productos oalimentos. En un anlisis cronolgico se pueden fijar 4 grandes etapas en el de-sarrollo de la Microbiologa Industrial: 1) hasta 1900; 2) 1900-1945; 3) 1945-1979y 4) 1979 hasta el presente, y considerar el comienzo del siglo como el inicio decierto control en los procesos de utilizacin de cultivos puros.

A partir de 1900 comienza la etapa de produccin de una serie de productosnuevos que se suman a los conocidos desde la ms remota antigedad, y que sonla levadura de cerveza, glicerol, cido lctico, acetona butanol y etanol.

Hasta el 1945 poco se esperaba del futuro de la Microbiologa Industrial, yaque solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos, y ade-ms varios de esos productos podan obtenerse por otras vas, ya ms convenien-tes por razones econmicas, como etanol, cido lctico o acetona butanol.

Con el advenimiento de la penicilina en 1945 y la necesidad de su produc-cin, se produce un impacto formidable sobre los procedimientos microbiolgicos,ya que se plantea el desafo de la produccin en gran escala en condiciones demucho mayor control y con necesidad de operaciones ms complejas para la sepa-racin y purificacin de los productos. Como consecuencia de los avances logrados

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en esos desarrollos se produce en pocos aos la aparicin de un gran nmero denuevos productos, como otros antibiticos, aminocidos, esteroides, enzimas, bio-masa aplicada a la alimentacin animal y humana (protenas unicelulares), nu-cletidos, etc.

A partir de 1979 la Microbiologa Industrial recibe un nuevo y notable impul-so que se suma al anterior cuando se concretan a nivel de procedimientos prcti-cos las posibilidades que ofrece la ingeniera gentica, disciplina surgida comoconsecuencia del avance de la Biologa Molecular. Este nuevo impulso posibilitala produccin industrial, basada en la utilizacin de microorganismos recombi-nantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa va como la insuli-na, hormona de crecimiento, interfern y otras de muy reciente aparicin en elmercado de productos relacionados con el rea de la salud.

Con la evolucin cronolgica comentada se fue tambin produciendo una evo-lucin en los conceptos involucrados, ya que con el avance de los conocimientos ysobre todo con la necesidad de resolver problemas de produccin vinculados aprocesos cada vez ms complejos, se fue haciendo necesaria la participacin deingenieros y bioqumicos adems de los microbilogos, y se fue produciendo tam-bin la integracin de conocimientos provenientes de varias disciplinas. Se fueprofundizando, por ejemplo, el estudio de los microorganismos de inters indus-trial, no slo en sus aspectos microbiolgicos, sino tambin en relacin a los re-querimientos surgidos de las aplicaciones industriales de los mismos. Se fue asdiferenciando la metodologa general empleada en la seleccin, mantenimiento ymejoramiento de los microorganismos, ya que estos aspectos deban orientarse alos productos de inters y al aumento de la productividad de las cepas emplea-das. Lo mismo sucedi con los requerimientos :de los medios de produccin quedeben incluir consideraciones econmicas adems de las microbiolgicas. En losaspectos tecnolgicos se produjeron tambin evoluciones necesarias, ya que delas cubas clsicas de fermentacin construdas de materiales diversos y con pocainstrumentacin se pas a biorreactores de acero inoxidable muy instrumenta-dos.

El desarrollo de los procesos en los reactores y la interaccin microorganis-mo-medio que en los mismos requiri aportes fundamentales de la Bioqumica yFisiologa Microbiana, como el conocimiento de las rutas metablicas, cinticaenzimtica, mecanismos de regulacin y estudios acerca de la influencia del me-dio ambiente sobre la productividad del proceso. Con respecto a la Tecnologa seincorporaron conocimientos fundamentales de fenmenos de transporte comotransferencia de materia, calor y cantidad de movimiento y criterios de cambiode escala.

Por otra parte, y como consecuencia de la contribucin de otras disciplinasbsicas como la Qumica, se fueron incorporando tambin conceptos de termodi-nmica y estequiometra que se integraron con los de la cintica enzimtica paraser aplicados al crecimiento microbiano y a la formacin de productos. Con todosesos conceptos emanados de la Microbiologa, Qumica, Bioqumica y Tecnologa,se constituyeron las bases de la Microbiologa Industrial actual.

La presente monografa considera esencialmente las bases de la Microbiolo-ga Industrial sin entrar en los aspectos ingenieriles, es decir trata de aquellostemas que corresponden al microorganismo como su seleccin, mantenimiento ymejoramiento, el diseo y formulacin de los medios, estequiometra y cinticadel crecimiento microbiano y de formacin de producto y modos de operacin delos reactores. Finalmente y como ejemplo de aplicacin se consideran dos indus-trias tpicas y el tratamiento de efluentes.

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La Microbiologa Industrial abarca, como ya dijimos, todos aquellos procesosque se realizan con microorganismos, y aunque conceptualmente pueden conside-rarse tambin procesos de fermentacin a los que se realizan con microorganis-mos sin crecimiento, ya sea en suspensin o inmovilizados, esta monografa estlimitada nicamente a los procesos con clulas en crecimiento, que son por otraparte los ms importantes.

En Microbiologa Industrial se utilizan los trminos fermentacin y fermen-taciones industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologas basados en eluso de microorganismos. El trmino "fermentacin", que deriva del latn fermen-tar (hervir), inicialmente reservado a la actividad microbiana anaerobia, se fueaplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente tambin a aqullos que uti-lizan clulas animales y vegetales. En la actualidad se est haciendo muy gene-ral y se corre el peligro de no poder aplicarlo con precisin a un determinado tipode proceso biolgico. Nosotros preferimos conservar el trmino ya que est am-pliamente divulgado, y por otra parte muy arraigado en todo el mundo. Es porello que los procesos de la Microbiologa Industrial o las fermentaciones indus-triales, o los procesos de fermentacin, son o pueden considerarse como sinni-mos, y es en ese sentido que sern empleados en esta monografa.

Con respecto a los smbolos y unidades empleados, que estn consideradosespecialmente en el captulo 1, se decidi emplear aquellos que son los ms acep-tados por la mayora de los especialistas.

Es importante destacar que para la comprensin de los temas tratados es ne-cesario que el lector tenga conocimientos generales de Microbiologa, Qumica yBioqumica, adems de cierto nivel de conocimiento matemtico. Es muy conve-niente, por ejemplo, que el lector haya ledo previamente las monografas de lasseries biolgicas, como as tambin algunas correspondencias a temas de Qumi-ca y Matemticas ya publicados por la OEA. Finalmente y con objeto de facilitaral lector la posibilidad de ampliar los conocimientos sobre los temas tratados, seincluyen en cada captulo algunas lecturas recomendadas.

Lecturas recomendadas:1.

`Microorganismos". I.M. Gutirrez-Vzquez. Monografa N 6. Serie de Biologa. Pro-grama Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico. Departamento Asuntos Cient-ficos. Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos. 1968.

2.

"Principios generales de Microbiologa". N.J. Palletoni. Monografa N 7. Serie de Bio-loga. Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico Departamento deAsuntos Cientficos. Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos.1970.

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Captulo 1

DEFINICIONES Y AREAS DE APLICACION

DefinicionesLa Microbiologa Industrial puede definirse diciendo que es la parte de la Mi-

crobiologa que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos.Desde otro punto de vista puede decirse tambin que los procesos de la Microbio-loga Industrial constituyen aquellos procesos industriales catalticos basados enel uso de microorganismos.

Con el notable impulso de la Biotecnologa producido en los ltimos aos y lainclusin y difusin de otros trminos como biotecnologa de avanzada, biotecno-loga moderna, biotecnologa de punta, biotecnologa recombinante o tecnologadel DNA recombinante, biotecnologa e ingeniera gentica, biotecnologa y mi-crobiologa industrial, y hasta biotecnologa negativa, etc., se ha complicado lacomunicacin entre los distintos especialistas y la interpretacin adecuada de lostrminos empleados. Para poder clarificar esos trminos pensamos que es conve-niente definir y delimitar los campos de la Biotecnologa y de algunas disciplinasque la integran.

La Biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que comprende la apli-cacin de los principios cientficos y de la Ingeniera al procesamiento de mate-riales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. Los agentes biolgi-cos pueden ser clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas. Se entiendepor bienes a cualquier producto industrial relacionado con alimentos, bebidas,productos medicinales, etc., y por servicios a aquellos vinculados a la purificacinde aguas y tratamiento de efluentes. Esta definicin que es la ms conocida yaceptada por la mayor parte de los paises fue propuesta por la Organizacin parala Cooperacin Econmica y el Desarrollo (OECD).

La Microbiologa Industrial se ocupa de produccin de bienes y servicios conclulas microbianas. Por lo tanto la Microbiloga Industrial representa una parte,seguramente la ms importante, de la Biotecnologa.

La Ingeniera gentica comprende una serie de tcnicas que permiten obte-ner un organismo recombinante, o sea portador de un gen extrao proveniente deotras clulas, sean stas microbianas, vegetales o animales. Es una disciplina derivada de la Biologa molecular que est incluida en la Biotecnologa como herra-mienta fundamental para la obtencin de microorganismos especficos a ser utili-zados en la produccin de bienes y servicios. El trmino tecnologa del DNA re-combinante puede considerarse sinnimo de Ingeniera gentica.

Consideramos que los trminos biotecnologa de avanzada, biotecnologa mo-derna, no son adecuados. Cualquier tecnologa o biotecnologa avanza y se mo-derniza. Si los trminos se aplican a procesos con cepas de Ingeniera genticanicamente o a transplante de embriones o a micropropagacin vegetal por culti-vos de tejidos o a produccin de especies vegetales mejoradas por cultivos de teji-dos o a produccin de especies vegetales mejoradas por cultivos de anteras, cte.,pueden confundirse mucho los conceptos cuando con toda justicia podemos in-cluir tambin en la biotecnologa de avanzada las nuevas tecnologas de produc-cin de alcohol, ya que son ms modernas o de avanzada con respecto a las ante-riores. Si se desea hacer una diferencia, tal vez sera conveniente referirse a la

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Tabla 1. Areas de aplicacin y ejemplos de productos obtenidos por microor-ganismos.

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Biotecnologa tradicional o convencional para denominar a los procesos conocidoscon anterioridad al advenimiento de la Ingeniera gentica, y no convencional alos posteriores.

Areas de aplicacinLas reas de aplicacin de la Microbiologa industrial son muy variadas y de

ellas surge ha importancia y el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.Las reas principales son: salud, alimentos, produccin vegetal y animal, in-

sumos industriales, minera y servicios.En primer lugar se debe destacar la importancia de la Microbiologa Indus-

trial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamen-talmente por su aplicacin en la produccin de compuestos de actividad farmaco-lgica y vacunas.

En la industria de alimentos es tambin significativa la aplicacin de la Mi-crobiologa Industrial en la produccin de bebidas, enzimas, saborizantes, pro-ductos lcteos, etc.

La produccin agropecuaria se ve tambin favorecida en sus aspectos de pro-duccin vegetal y animal por un conjunto variado de procesos microbiolgicos quese han enriquecido notablemente en los ltimos aos (como ha sucedido con otrasreas) con la utilizacin de tcnicas de ingeniera gentica.

El rea de aplicacin en minera est relacionada con la biolixiviacin o seacon la aplicacin de microorganismos en la extraccin de metales de minerales debaja ley.

Finalmente el rea de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicacinde microorganismos en la purificacin de efluentes, aspecto fundamental para elmantenimiento de la calidad de vida.

Varios ejemplos de productos y microorganismos empleados en las distintasreas de aplicacin de la Microbiologa Industrial se pueden observar enla Tabla 1.

Smbolos y unidadesEs conveniente emplear smbolos y unidades correspondientes al sistema in-

ternacional, pero es importante que sean aquellos que son utilizados por la mayo-ra de los investigadores y profesionales relacionados. La Seccin de Biotecnolo-ga de la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada estudi el problema yencomend a una serie de expertos de varios pases la confeccin de una lista desmbolos y unidades utilizadas. La lista fue sometida a la crtica de numerososespecialistas y fue finalmente publicada en ingls como gua general sobre sm-bolos y unidades en Biotecnologa. Una traduccin castellana adaptada a la no-menclatura en espaol fue tambin preparada y publicada posteriormente.

En la tabla 2 se dan algunos smbolos y unidades, expresados en el sistemainternacional (SI) y tambin en unidades comunes en Microbiologa Industrial, yque son las que utilizamos en esta monografa. Corresponde ahora, despus deconsiderar los aspectos generales de los procesos fermentativos, tratar aquellosesenciales que corresponden a los microorganismos de inters industrial.

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Tabla 2. Algunos smbolos y unidades empleadas en Microbiologa Industrial.Descripcin y/o definicin Smbolo

Unidad S.I *

Unidades comunes

Lecturas recomendadas:1.

Biotechnology. International Trends And Perspectives. A. Bull, G. Holt and M. Lilly.OECD. Paris, 1982.

2.

Lista de Stntbolos con Unidades recomendadas para su entpleo en Biotecnologta. Tra-duccin castellana, R. Ertola. Rev. Latinoam. Ing. Qufm. Vol. 16, N 2, 5-12 (1986), deloriginal ingls Pure and Appl. Chem. Vol. 54 N 9, p. 1743-1745, (1982).

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Captulo 2

ASPECTOS GENERALESDE LOS PROCESOS DE FERMENTACION

Un proceso de fermentacin tpico es esencialmente un proceso que se lleva acabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante elcual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo va au-mentando en su concentracin en el transcurso del proceso al mismo tiempo queel medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia delas actividades catablicas y anablicas. Los dos fenmenos crecimiento y forma-cin de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultneamenteo no segn los casos.

Efectores internos y externosEl comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de

la interaccin que se produce entre el microorganismo y el medio ambiente en elreactor, y que en rigor es el resultado de los llamaos efectores intra y extra celu-lares.

Los efectores internos estn representados por la dotacin gentica intrnse-ca del organismo considerado y por sus mecanismos de regulacin metablica.Estos ltimos pueden ser modificados por alteraciones del medio ambiente o msprecisamente por los efectores externos mientras que la existencia de un gen de-pende de la especie del microorganismo considerado. Un gen est o no est, slosu expresin puede modificarse. Con el fin de mejorarla productividad de un pro-ceso de fermentacin las cepas empleadas pueden someterse a tratamiento fsicoo qumico de mutacin que al alterar algn sector del genoma logran aumentarla produccin de un metabolito aunque tambin pueden disminuirla o incluso su-primirla.

Tambin se puede dotar a un microorganismo de una capacidad genticanueva cuando se efecta la insercin de sectores del genoma de una especie enun microorganismo, hacindose ste capaz de producir metabolitos que desde elpunto de vista gentico de su especie no podra hacerlo. La obtencin de mutan-tes por el uso de agentes mutagnicos o por algn otro mecanismo bioqumico yla construccin de cepas nuevas por ingeniera gentica constituyen los recursosde la gentica microbiana, para mejorar la productividad de un microorganismodado o para dotarlo de una capacidad productiva nueva. Es decir que los efecto-res internos pueden modificarse para lograr la optimizacin de un proceso fer-mentativo. Todos estos aspectos sern considerados especialmente en el captulosiguiente, que corresponde al mejoramiento de los microorganismos de inters in-dustrial.

El comportamiento o expresin fenotpica, o sea lo que realmente se observacomo respuesta del microorganismo al medio ambiente en el reactor es, adems,el resultado de la influencia de las variables de naturaleza fsica y qumica queconstituyen los efectores externos.

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Los efectores externos de naturaleza fsica estn vinculados con las condicio-nes de operacin que se utilizan en los reactores y son por ejemplo la temperatu-ra, la agitacin, aireacin, etc; es decir, estn constituidos por las variables demanipulacin fsica que se fijan o se programan en el curso del proceso de pro-duccin.

La modificacin de algunos de los efectores fsicos como por ejemplo la tem-peratura, tiene un efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es ade-cuado puede disminuir o an impedir la formacin de un metabolito determina-do. Adems la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de al-gunos microorganismos, lo que significa que al modificarse el valor de un efectorpuede cambiar los requerimientos de otro.

Los efectores externos de naturaleza qumica estn representados por la pre-sencia de los componentes de los medios de fermentacin, adems del 0 2 quepuede considerarse un nutriente ms. Los componentes de los medios debencumplir con todos los requerimientos nutricionales y adems con los requeri-mientos especficos que son indispensables para la formacin de productos. Losaspectos fundamentales de los medios, como su diseo y formulacin, sern tra-tados en el captulo 4.

Los reactores estn tambin estrechamente vinculados al manejo o manipu-lacin de los efectores externos, ya que adems de la regulacin de las variablesfsicas permiten segn el modo de operarlos fijar o regular la alimentacin decomponentes de los medios que, como ya se dijo, constituyen los efectores qumi-cos. Tal es el caso cuando se operan los reactores en "batch" o en forma disconti-nua, (todos los componentes son colocados desde un comienzo en el medio de pro-duccin) o cuando se opera el reactor en "batch alimentado" donde la alimenta-cin de los componentes se realiza en forma controlada durante el proceso. Final-mente cuando se opera el reactor en continuo, se alimenta medio completo a unadeterminada velocidad al mismo tiempo que se deja salir con la misma velocidadmedio fermentado, lo que permite tratar a la velocidad de crecimiento especficocomo variable independiente. Estos aspectos sern desarrollados especialmenteen el captulo 7.

La influencia de los efectores internos y externos sobre el comportamiento deuna clula microbiana se puede representar esquemticamente como lo muestrala Fig. 1.

Figura 1. Influencia de los efectores internos y externos sobre la expresin celular.

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Para comprender con claridad estos conceptos es conveniente citar algunosejemplos demostrativos. Supongamos una cepa de un microorganismo (B. subti-lis) que genticamente est en condiciones de efectuar la biosntesis de una enzi-ma (a-amilasa) y que es colocada en un medio de cultivo adecuado y en condicio-nes de operacin ptimas para la produccin de esa enzima. Por medio adecuadose entiende una fuente de carbono como el almidn o dextrina, adems de fuenteorgnica de nitrgeno, y otras sales minerales. Por condiciones de operacin pti-mas se consideran la temperatura de 30-37 C, agitacin, pH inicial 6.5-7.0. Su-pongamos tambin que el proceso es de tipo "batch". Si en la composicin del me-dio utilizamos glucosa, por ejemplo, difcilmente tendremos un rendimiento nor-mal de a-amilasa mientras exista glucosa en el medio, debido a la influencia ne-gativa de sta, ya que la misma acta como represor catablico de la biosntesisde la enzima. Este es un ejemplo negativo de un efector externo (glucosa) que nopermite la expresin del gen de la cepa. No solamente la glucosa tiene este efectosino en general cualquier otra fuente de carbono que sea de consumo rpido.

Si en cambio se opera el reactor como "batch" alimentado, con alimentacinprogramada de glucosa, la influencia negativa de ese efector externo desaparece,porque su concentracin se mantiene en lmites muy bajos.

Otro efector externo de naturaleza qumica que inhibe la biosntesis de otrosproductos como muchos antibiticos es el anin fosfato. Por eso la produccin in-dustrial de esos compuestos debe hacerse de manera tal que existan concentra-ciones limitantes de fosfato inorgnico. Si ste esta en concentraciones de 0.3 a300 mM generalmente se producen crecimientos celulares altos pero concentra-ciones superiores a 10 mM suprimen la sntesis de muchos antibiticos.

La presencia de azcares asimilables superiores a 0.16 g l -1 produce invaria-blemente formacin de alcohol en proceso de crecimiento de levadura de panifica-cin (Saccharomyces cerevisiae) an en presencia de exceso de oxgeno. Es el denominado efecto Crabtree. Es por ello que la produccin de levadura se debe lle-var a cabo con sistemas de "batch" alimentado con alimentacin programada deazcares para maximizar la formacin de biomasa e impedir la formacin de al-cohol. Es otro ejemplo de la influencia de un efector externo o de naturaleza qu-mica sobre la actividad metablica de un microorganismo.

Para investigar adecuadamente la influencia de los efectores externos qumi-cos, es necesario el empleo de sistemas continuos, aspecto que ser tratado en elcaptulo 7.

Esquema de un proceso industrialEn la Fig. 2 se presenta un esquema general de un proceso de fermentacin.

Como puede verse existen 4 etapas bien diferenciadas, a saber: 1) Propagacin decultivos, lo que se realiza en el laboratorio y que comienza generalmente en untubo de ensayo que contiene un repique reciente del microorganismo o un tuboliofilizado o congelado donde se conserva la cepa de inters o de una colonia delmicroorganismo previamente seleccionada. Este material microbiolgico seleccio-nado constituye el punto de partida con el cual se debe aumentar la cantidad delmismo mediante sucesivos pasajes en frascos de volmenes crecientes que songeneralmente operados en agitadores de vaivn o rotatorios en cmaras de culti-vo. 2) Fermentacin: con el material obtenido anteriormente, se siembra el tan-que de inoculo que puede tener un volumen de 50, 500 1000 1 segn la escalaindustrial posterior. Del tanque de inoculo se pasa posteriormente al fermenta-dor industrial cuyo volumen, que vara de acuerdo al producto a obtener y a su

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Figura 2. Esquema general de un proceso de fermentacin.

concentracin, est comprendido comnmente entre 10,000 y 100,000 l. En algu-nos casos especiales, como en la produccin de protena unicelular, los tanques defermentacin pueden llegar hasta 1,000,000 l. Un proceso esencial ligado a laproduccin es la preparacin y esterilizacin de los medios que se lleva a cabotambin en esta etapa (previamente a la inoculacin) ya sea en el tanque deinculo o en el reactor industrial. 3) Operaciones y proceso de separacin y purifi-cin de los productos; estas etapas comprenden en forma general y sucesivamen-te: a) separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin, o decantacin; b) se-paraciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; c) puri-ficacin por extraccin lquido-lquido, o extraccin a dos fases acuosas, o croma-tografa de afinidad, y finalmente d) aislamiento del producto. 4) Tratamiento deefluentes: si bien no tiene una relacin directa con el producto, que es la razn deser de la industria de fermentacin, representa una etapa imprescindible porquees fundamental controlar la calidad del efluente que sale de la fbrica y que esenviado generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un ro o al mar.

Es importante tener en cuenta que todas las etapas de un proceso de fermen-tacin deben estar ntimamente ligadas e integradas ya que es indispensable queel proceso sea optimizado globalmente. Cada etapa debe considerar la importan-cia e influencia de los procesos y operaciones anteriores y tambin de los siguien-tes para poder cumplir con ese concepto de integracin. La calidad de una cepade microorganismo debe estar supeditada a su real capacidad de produccin en elfermentador. Pero adems es necesario que esa cepa, altamente productora, noproduzca, por ejemplo, dificultades en la etapa de separacin y purificacin comoes el caso de cepas de Penicillium chrysogenum que no pueden utilizarse porqueproducen pigmentos que encarecen las etapas de purificacin. Lo mismo sucedecon el uso de medios, basados en subproductos como el suero de queso, que pue-

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den dar buenos rendimientos de un producto pero que representan un inconve-niente en la etapa de purificacin.

Adems, el reactor y las condicioines de operacin deben ser tales que asegu-ren la productividad mxima del proceso y la calidad del producto, que en algu-nos casos depende de las condiciones de operacin empleadas como sucede con al-gunos preparados enzimticos cuya composicin es regulada segn como se opereen la etapa de la fermentacin y en la correspondiente a la separacin y purifica-cin.

Lecturas recomendadas:1.

A. Fiechter - Physical and chemical Parameters of Microbial Growth. Advances in Bio-chemical Engineering Vol. 30, 7-60. Springer-Verlag, 1984.

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Captulo 3

SELECCION, MANTENIMIENTO Y MEJORAMIENTODE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

SeleccinDebido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el

microorganismo utilizado, en la eleccin del mismo se deberan tener en cuentaciertos criterios generales que se indican a continuacin:1.

La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.2

Su velocidad de crecimiento debera ser alta.3.

La cepa debe estar libre de contaminantes, includos fagos.4.

Sus requerimientos nutricionales deberan ser satisfechos a partir de mediosde cultivo de costo reducido.

5.

Debe -ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida desus caractersticas particulares.

6.

Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.7.

Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimientoy de fcil extraccin del medio de cultivo.Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por

aislamiento a partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. A nivelindustrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de organismos, mu-chos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas clsicas de mutacin ode ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la indus-tria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos ca-sos se dispone de organismos modificados genticamente para llevar a cabo reac-ciones especficas de biosntesis, degradacin o biocatlisis, los cuales estn pro-tegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aisla-dos o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios.

Existen en el mundo un gran nmero de colecciones depositarias de cultivos.Entre la diversidad de colecciones se destacan: "American Type Culture Collec-tion", USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mohos,protozoos, virus y lneas celulares; "Colletion Nationale de Cultures de Microor-ganismes" del Institut Pasteur, Francia; "Northern Regional Research Labora-tory" (NRRL), de Peoria, USA, y "National Collection of Type Cultures", Londres,Inglaterra.

Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo,plantas y desechos, la eleccin del material de partida puede hacerse teniendo encuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de in-ters. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se podran encontrar orga-nismos adaptados a la degradacin de estos productos qumicos; o en larvas deinsectos muertos agentes causales de la muerte.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de latcnica elegida para el mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamientodirecto, o b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.

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Una vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento deuna cepa de inters, la misma deber ser caracterizada. En este procedimiento sedebe tener en cuenta que la composicin qumica del material a partir del cual seva a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del momento en que es to-mada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando deevitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters.

a) Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utilizapara el aislamiento permita la mxima expresin del material gentico del orga-nismo. Si se busca por ejemplo un organismo con accin antimicrobiana, se puedecrecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia del o los organis-mos contra los cuales se requiere la accin antimicrobiana, observndose la pro-duccin del inhibidor por las zonas de inhibicin de crecimiento.

Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como ami-nocidos y necletidos se utiliza la estimulacin del desarrollo de bacterias aux-trofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios slidos.En este caso se debe tener una "rplica" de la caja a ensayar. Una vez obtenido elcrecimiento en la primer caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las co-lonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar contenien-do una suspensin del organismo auxtrofo al producto buscado. Despus de unperodo de incubacin se observa crecimiento en forma de halo alrededor de lascolonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placarplica.

b) Enriquecimiento del cultivo: esta tcnica consiste en incrementar en unapoblacin mixta el nmero de organismos de inters en relacin al resto. De estaforma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadaspara el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratosespe-cficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, elcual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subculti-vos peridicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inters sea el do-minante de la poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio slido.Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad especficade crecimiento (u).

La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor deu comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de lapoblacin ser el que posea el mayor valor de u para las condiciones de cultivoempleadas. Sin embargo no necesaria-mente sera mas til un organismo de ums alto; puede ser deseable uno conmayor afinidad por el sustrato. El pro-blema de seleccin puede ser superadoempleando el sistema de cultivo conti-nuo, tema que se trata en el captulo 7,donde la fuerza de seleccin se mantienea un nivel constante y el organismo do-minante ser seleccionado por su afini-dad por el sustrato, ms que por su umxima

En la Fig. 3 se muestra un modelode competicin entre dos organismos ca-paces de crecer en un cultivo continuoenriquecido.

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En cultivo continuo el valor de um est determinado por la concentracin desustrato y es igual en estado estacionario a la velocidad de dilucin (D). A valoresde u = D < uz se tiene que uA > uB y por lo tanto el organismo A podr ser selec-cionado a pesar de que umA < umB (uz = valor de u a partir del cual uB > uA).

Mantenimiento o conservacin de los cultivosLos objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los si-

guientes aspectos: a) preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de nin-guna de sus propiedades bioqumicas; b) preservar los niveles de su productividad inicial; c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facili-dad. Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo depreservacin.

En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de lapoblacin con la cual se va a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas).En este sentido, tanto en la conservacin como en el desarrollo del cultivo, ya seael que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las mismas tcnicas me-todolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de inculosse deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas delas caractersticas de la cepa empleada.

No hay mtodos de mantenimiento en procesos industriales que sean comu-nes a todas las industrias, emplendose en algunos casos mtodos especficos se-cretos.

El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin deun mtodo de preservacin. La identidad del cultivo puede conocerse en base asus caractersticas de crecimiento en uno o ms medios especficos, tomando enconsideracin propiedades macro y microscpicas exhibidas, o en base a una eva-luacin ms exhaustiva empleando muchos ensayos bioqumicos, biolgicos, in-munolgicos y genticos.

En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibi-lidad de determinar en cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la.mayora de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables uobservables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones fermentativas, pro-piedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la determi-nacin cuantitativa del recuento de colonias antes y despus del proceso de man-tenimiento brindan la informacin necesaria para la correcta evaluacin de latcnica de conservacin a elegir.

Los mtodos de preservacin o mantenimiento ms importantes son los si-guientes:

SubcultivosEs un mtodo comn de conservacin, que consiste en el repique peridico

del cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia vara con elmicroorganismo, debiendo considerarse el medio adecuado para cada especie.Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante lapsos que osci-lan entre 15 das y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios: a) incre-mento de la posibilidad de mutacin con cada transferencia, con prdida de lascaractersticas del organismo; b) riesgo de contaminacin; c) alteraciones en elmedio de cultivo, durante la estada en fro, en la cual se produce una desecacingradual del mismo.

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Mantenimiento bajo capa de aceiteEs una tcnica simple y efectiva para prolongar la conservacin de muchos

organismos y consiste en cubrir completamente el cultivo despus de su desarrro-llo en medio slido, con una capa de aceite mineral o vaselina estril. Los cultivosen esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o an mejor en hela-dera por perodos de varios aos. Algunos autores sostienen que en estas condi-ciones los microorganismos pueden continuar reproducindose, con posibilidadesde aparicin de mutantes; sin embargo se acepta que estas alteraciones no se ob-servan hasta los tres aos de mantenimiento.

CongelacinDebido a que la actividad metablica de una clula se reduce considerable-

mente por mantenimiento a muy baja temperatura, la congelacin es una tcnicade eleccin, ya sea para cortos o largos perodos de tiempo. A esto ha contribuidotambin la mayor disponibilidad de nitrgeno lquido (-196 C) y el mejoramientode los equipos de refrigeracin. La tcnica involucra el crecimiento del cultivohasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son msresistentes a los daos por congelacin y descongelacin, que las de fase exponen-cial. Tambin es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congela-cin, debido a que, cuando parte de las clulas se lisan se liberaran sustanciascrioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas sobrevivientes.

Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agentecrioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. Elms empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como dimetilsulfxido,glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de malta, han si-do tambin empleados.

La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico) y selladaantes de colocarla bajo nitrgeno lquido. Uno de los problemas de esta tcnica serefiere a la velocidad de congelacin.

Muchos estudios son coincidentes en sealar que una velocidad de congela-cin lenta y una rpida descongelacin rinden los mayores nmeros de clulasviables. Se encontr que dependiendo de la naturaleza de las clulas, existe unavelocidad de congelacin ptima en cada caso para obtener una mxima sobrevi-da. Como criterio general se puede decir que, lo ms ampliamente usado es el en-friamiento a 1 C min -1 (ya que una rpida congelacin causa ruptura de mem-branas) hasta -20 C y luego un rpido descenso.

En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70C, ya que a temperaturas ms altas ocurren algunas recristalizaciones, las cua-les si son intracelulares son letales para las clulas.

En caso de nitrgeno lquido, la conservacin podra prolongarse por aos,asegurando una buena provisin del mismo y disponiendo de equipos con siste-mas de alarma en caso de fluctuaciones de temperatura.

Cultivos en tierraLa tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios das

para inducir esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la mis-ma se manifiesta, la tierra es secada (desecador) y el cultivo mantenido de estaforma en una atmsfera seca o en refrigerador. El mtodo ha sido utilizado am-pliamente con hongos y actinomycetes, los cuales han sido mantenidos en estas

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condiciones varios aos. Tambin se puede utilizar tierra para la conservacindirecta de suspensiones de esporos.

Preservacin en celulosaEl empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condi-

ciones de ausencia de agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conser-var cepas. La tcnica consiste en embeber tiras de papel de filtro con una suspen-sin densa de organismos en suero, glutamato de sodio u otro agente, las mismasson posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vaco. De es-ta forma se han logrado conservar cepas de Streptomyres y Salmonella por pero-dos de hasta 2 aos a temperatura ambiente.

LiofilizacinLa liofilizacin est considerada como el mtodo ms adecuado para la pre-

servacin de microorganismos. La tcnica involucra el congelamiento de un culti-vo seguido por un secado bajo vaco, lo cual resulta en la sublimacin de agua dela suspensin celular. La ventaja es que la mayora de los organismos sobrevivenal secado y el cultivo es fcilmente mantenido an a temperatura ambiente sinprdida significativa de viabilidad.

La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la mayora de las bacte-rias, encontrndose que las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-nega-tivas cuando se las liofiliza y mantiene en condiciones similares. Tambin se em-plea en la conservacin de esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas le-vaduras. Sin embargo, no es adecuada para clulas animales, algas y hongos enfase de micelio.

La tcnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las c-lulas son usualmente ms resistentes) resuspendiendo las clulas con un mediocrioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotasde suspensin celular son transferidas a una ampolla, la cual es congelada aaproximadamente -40 C y deshidratada mediante una sublimacin en vaco. Es-te debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado contina has-ta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada ba-jo vaco. Se debe evitar la formacin de radicales libres que se producen por expo-sicin de las clulas al oxgeno, ya que estn asociados con prdida de viabilidad;de all la importancia de mantener el vaco.

El medio empleado en la liofilizacin es un factor importante en el proceso.Entre los agentes recomendados estn la leche descremada en concentracionesdel 10 al 20%; suero equino, mezclas de suero, glucosa y extrato de levadura; sue-ro fetal bovino, etc. En algunos casos el efecto protector de la leche descremadaes mejorado por el agregado de solutos tales como cido ascrbico o tiourea.

La sacarosa se ha empleado para reemplazar la leche descremada, y paramejorar su performance se le adiciona glutamato de sodio y bacto casitone u otrocomponente nitrogenado.

Normalmente la liofilizacin produce daos en las clulas, siendo los mismosen algunas casos reversibles, por lo cual stas necesitan un tiempo de recupera-cin que es variable en funcin del tipo de dao producido.

En la reconstitucin de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobrevidade los microorganismos si en lugar de agua destilada se agrega caldo nutritivo oel mismo medio que se us para el crecimiento inicial de las clulas; de esta for-ma al mantenerse elevada la presin osmtica durante la rehidratacin se lograque la misma proceda en forma lenta.

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Se encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacintiene una fase de retardo extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea parael crecimiento un medio de igual composicin que el que da ptimo desarrollo pe-ro disminuyendo su concentracin original entre un 25 y un 50%.

En general no es posible determinar para cada grupo de organismos el mto-do de conservacin ideal, por lo que se trata de emplear el ms adecuado. De to-dos, la liofilizacin es el ms utilizado, aunque algunos organismos muestran altas tasas de mortandad. En este caso la alternativa es la congelacin, a pesar deque las cepas mantenidas de esta forma son difciles de transportar.

Mejoramiento de microorganismos industrialesEn general los organismos aislados de la naturaleza productores de metaboli-

tos de inters industrial producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tantose hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor renta-bilidad de los procesos.

Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del mediode cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capaci-dad de sntesis mxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra po-sibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa.

Como ya se dijo, la productividad potencial de un organismo es controladapor su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendi-mientos. Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivopara lograr nuevamente la mxima productividad. Por lo tanto los programas dedesarrollo involucran una continua modificacin gentica del microorganismo,seguida por una readaptacin del medio de cultivo a los nuevos requerimientos,mejoras de las condiciones de operacin y tambin de los procesos de extraccin ypurificacin.

La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede realizar por 1)Seleccin natural de variantes, 2) Mutacin inducida, y 3) Recombinacin genti-ca.

1. Seleccin naturalSe debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea proba-

bilidad de que ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que enuna gran masa celular la poblacin sea heterognea. Esta distribucin puede pre-sentar problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienenmenores niveles de produccin que la poblacin parental. Estos cambios definiti-vos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotpicas que dependende las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las clulas de la po-blacin que expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las variacionespermitidas por su genotipo. En las mutaciones espontneas el elemento respon-sable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor muta-gnico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadstica-mente medible (tasa de mutacin).

La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10 -6 a 10 -9 mutacionespor genoma y por generacin. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7 se de-bern estudiar un gran nmero de organismos (> 10 7 ) en la bsqueda del tipodeseado.

En la seleccin de variantes naturales, una prctica que todava es utilizadase refiere a la observacin de las caractersticas morfolgicas de las colonias, lascuales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor produc-tividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados.

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Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de eva-luacin del producto. En estos casos es ms adecuado realizar las experiencias enerlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano deobra, los resultados de ensayos en tubos o pequeos frascos son menos confiables.

A veces es posible el diseo de un procedimiento simple de "screening" selec-tivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, clulas no mutadas quemueren en un plaqueo por seleccin de mutantes resistentes a drogas, metales,etc. En estas condiciones se aslan mutantes con un esfuerzo mnimo an de po-

blaciones donde la tasa de mutacin es menor a 1 x 106 .Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas

por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal co-mo la luz ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el menciona-do los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mu-tacin.

2. Mutacin inducida.El procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente determinado

implica dos etapas, el tratamiento de la poblacin con el mutgeno elegido y lue-go el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y seleccin.

Empricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento dedistintos "espectros" de mutantes.

La eleccin de un agente mutagnico depende en general de consideracionesprcticas. En algunos de los casos es ms conveniente el empleo de ms de unoen lugar del uso masivo de uno solo. La tcnica a emplear puede producir una al-ta tasa de mutacin o puede favorecer la separacin de un nmero reducido de ti-pos deseables de un gran nmero de productores mediocres.

Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debera utilizar la carac-terstica mejorada del mismo como factor de seleccin. El incremento de su pro-ductividad podra ser el resultado de una modificacin en los mecanismos de con-trol que limitan el nivel de produccin y/o de una variacin en los precursoresque llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y mecanis-mos de control de la biosntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir enel aislamiento.

Es importante en los programas de bsqueda y seleccin, tener una alta pro-porcin de mutantes entre la poblacin sobreviviente al tratamiento, debido aque slo estos individuos son los estudiados. Con el aumento de la dosis del mu-tgeno en general se incrementa esta proporcin, aunque para cada mutgeno ycada organismo hay una dosis ptima.

Los agentes mutagnicos pueden ser agrupados en:1) Fsicos, como la luz ultravioleta, que es un mutgeno muy conveniente. La

longitud de onda puede variar de 200 a 300 nm y el tiempo de exposicin entre0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X yrayos v son actualmente poco utilizados.

2) Qumicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de 0.05M con exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no txicos, elgrado de mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento serealiza adicionando el mutgeno a una suspensin de clulas, la cual es incubadaa temperatura constante un determinado tiempo. Estas manipulaciones requie-

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ren personal con experiencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entreestos agentes se destacan los siguientes: a) Acido nitroso. Este agente inducetransiciones A-T --- G-C y/o deleciones por uniones cruzadas en el interior de lacadena. b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Es uno de los mutgenosms potentes, produciendo una alta tasa de mutacin con bajo porcentaje de mor-tandad. Requiere de un manejo sumamente cuidadoso. c) Anlogos de base. Pro-ducen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2-aminopurina, siendo otros an-logos menos efectivos. Sus modos de accin dependen de sus incorporaciones alnuevo ADN formado y del lugar que ocupen al sustituir a la base normal. d) Mu-tgenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que no son incorpo-rados covalentemente al ADN, sino que actuan como agentes de intercalado en laestructura, promoviendo adiciones o deleciones simples durante la sntesis.

Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primariosMetabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorga-

nismo como por ejemplo, aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos.Antes de considerar la seleccin de este tipo de mutantes, es necesario cono-

cer los mecanismos de control involucrados en la biosntesis de estos metabolitos.Las concentraciones de los mismos estn reguladas por sistemas de control porretroalimentacin ("feed back). Los dos principales sistemas involucrados son in-hibicin y represin "feed back".

En la inhibicin, el producto final de una va metablica inhibe la actividadde una enzima (normalmente la primera) de su va de formacin, cundo se hasobrepasado un valor mximo de concentracin intracelular de dicho producto(caso de biosntesis de aminocidos). La primera enzima de la va es de tipo "alos-trica", lo que significa que en este caso el producto final se une a ella en el cen-tro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamadainhibicin competitiva), afectando la unin de la enzima al sustrato. Es un con-trol fino y casi instantneo.

La represin es aquella donde el producto final de una va metablica previe-ne la sntesis de una enzima o de todas las que catalizan la va mencionada. Estoocurre a nivel de cido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripcindel gen a cido ribonucleico mensajero (ARNm). Este mecanismo es de accinms lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas.

Los mecanismos de regulacin son ms complejos en caso de vas biosintti-cas ramificadas donde los productos de cada brazo son raramente requeridos porel organismo en igual proporcin. Los procesos de control de estos son los siguien-tes: a) por isoenzimas; b) concertado o multivalente; c) cooperativo; d) acumulati-vo; e) secuencial. Para un conocimiento detallado de estos mecanismos de controlse remite al lector a la bibliografa.

Como se ve, la concentracin de un metabolito microbiano es controlada poruna variedad de mecanismos. El conocimiento de la va metablica y su controlfacilita la construccin del mutante deseado. Estos pueden tener distintas modi-ficaciones: a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o represor; b) nose produce producto final, que es el que controla la enzima clave de la va meta-blica; c) el producto final es eliminado de la clula debido a una modificacin enla permeabilidad de la membrana celular.

Los mutantes que no producen inhibidores o represores por producto finalpueden ser empleados para la produccin de intermediarios en caminos no rami-ficados, o de intermediarios y productos finales en caminos ramificados.

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Al no producirse el producto final de la ruta, el control de la misma es elimi-nado, pero como estos productos son esenciales para el crecimiento, los mismosse deben incorporar al medio en concentraciones tales que permitan el desarrollo,pero que no ejerzan el control normal por inhibicin o represin. En este caso losmutantes son auxotrficos para uno o ms productos finales. El aislamiento destos mutantes puede resultar en la obtencin de un cepa altamente productora,si la mutacin ocurre en el sitio correcto.

La seleccin de auxtrofos se puede realizar empleando tcnicas de enrique-cimiento o mediante la identificacin visual de mutantes. Por ejemplo, la separa-cin mecnica de esporos auxtrofos y prototrficos de organismos filamentososha sido alcanzada por el mtodo de "enriquecimiento por filtracin". Se ha aplica-do a Aspergillus, Neurospora, etc.. El procedimiento implica la incubacin de unasuspensin de esporos mutada, en un medio lquido mnimo; los prottrofos desa-rrollan en tanto que los auxtrofos no. La suspensin es luego filtrada a travs deun filtro adecuado, obtenindose un filtrado enriquecido en auxtrofos, debido aque los esporos germinados por su mayor tamao son retenidos en el filtro.

Si bien los mutantes auxotrficos se utilizan para producir grandes cantida-des de muchas sustancias de inters, los mismos no son adecuados para la obten-cin de productos que controlan independientemente su sntesis. Un caso tpicoes el que figura a continuacin, donde se sintetiza un producto P.

Las letras minsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso.En este caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxtrofo.La solucin es modificar el organismo de tal forma que la primer enzima (a)

no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de talesmutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos an-logos y/o de revertantes.

Los metabolitos anlogos (compuestos similares a otros en su estructura)han ampliado el rango de inhibidores para los cuales se obtienen mutantes resis-tentes.

En el ejemplo de la va metablica anteriormente presentado si P* es un an-logo txico de P, un mutante puede ser aislado en presencia de P* si por ejemplo,la primera enzima de la va no es suceptible a la inhibicin por el anlogo. Estaenzima tambin podra ser resistente al efecto de control de P, por lo cual habrauna produccin no inhibida. Para el aislamiento de este tipo de mutantes se pue-de emplear la tcnica de gradiente en placa, en la cual existe una variacin en laconcentracin del anlogo en un sentido de la placa, presentando la misma, zo-nas de escaso crecimiento por altos niveles del anlogo txico desde donde es po-sible aislar los mutantes resistentes. Estos debern ser posteriormente estudia-dos en relacin a la produccin de P.

Otra posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es elempleo de revertantes. En este caso un mutante auxotrfico para P (no producela enzima "a") es sometido a una segunda mutacin con el objeto de obtener re-vertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima "a" produ-cida no reconoce en control de P).

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Mutantes resistentes a anlogos de aminocidos han sido empleados en pro-cesos de mejoramiento de cepas, para la obtencin de antibiticos.

El mejor ejemplo de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso dela fermentacin de cido glutmico. Se ha aislado un mutante de Corynebacte-rium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de bioti-na. O sea la permeabilidad celular es controlada por la composicin del medio decultivo; de esta forma el organismo puede excretar glutamato (50 g l -1 ) con bajasconcentraciones de biotina (5 ug l-1 ). Esto sugiere la posibilidad de modificar ge-nticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad.

Mutantes productores de enzimas de inters industrialSolamente se tendrn en cuenta las enzimas degradativas, cuya produccin

puede ser controlada por induccin, represin "feed back" y/o represin catabli-ca. Las tcnicas de mutacin en este caso pretenden alterar los mecanismos decontrol para obtener mutantes que puedan producir enzimas en ausencia de in-ductor y an en presencia de represores. Las mutaciones pueden tener lugar enun gen regulador, eliminando la produccin de un represor activo, o si se produ-cen en el operador, se podra evitar la unin del represor. Los mutantes que pro-ducen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes cons-titutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en elcual el sustrato inductor est en concentraciones limitantes, lo cual favorece eldesarrollo de los mutantes constitutivos sobre la poblacin inducible; empleandoinductores dbiles o utilizando ciclos con y sin inductor, tratando de favorecer elenriquecimiento en la poblacin del mutante constitutivo, ya que al transferir aun medio con inductor el tipo inducible requiere un tiempo de induccin que no lorequiere el constitutivo.

Para la seleccin de mutantes resistentes a la represin catablica puedenaprovecharse las posibilidades del sistema continuo empleando un medio de cul-tivo con el sustrato de la enzima y el represor catablico. En estas condiciones elorganismo capaz de emplear ambos sustratos tendra una ventaja competitiva ypodra ser seleccionado a una determinada velocidad de dilucin.

Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundariosMetabolitos secundarios son sustancias no imprescindibles para las funcio-

nes vitales como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibiticos, giberelinas, etc.La relacin entre metabolito primario y secundario presenta todava numero-

sos interrogantes con relacin a los mecanismos que controlan la sntesis de estosltimos. Se deben hacer algunas consideraciones, ya que en ciertas fermentacio-nes de antibiticos la velocidad de crecimiento regula la formacin de enzimasbiosintticas. En el caso de la gramicidina S (GS), las GS sintetasas se forman enla ltima parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas despus de al-canzar un pico en sus actividades especficas desaparecen rpidamente al entrarla poblacin en fase estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo conti-nuo permitieron establecer una relacin inversa entre la velocidad especfica decrecimiento y la produccin de sintetasa. Si bien el mecanismo no es conocido, seestableci que los picos de actividad especfica en funcin de u varan de acuerdoa la naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y P).

Otro factor del proceso de control es la regulacin "feed back" lo que significaque la acumulacin de metabolitos secundarios (penicilina, cloranfenicol, ciclohe-ximida, cte.) es lo que limita su propia sntesis. En el caso de caminos ramifica-22

dos como el de penicilina, la acumulacin intracelular de lisina disminuye su pro-duccin, efecto que se revierte por el agregado de a-aminoadipato.

Algunos tipos de regulacin "feed back" involucran a fosfato inorgnico, elcual regula la actividad de fosfatasas. En algunos casos la adicin del fosfato almedio de cultivo limitado se asocia con un incremento de ATP con disminucinde la formacin de antibitico.

Como ya se dijo, la glucosa y la fuente de nitrgeno (en especial amonio) si esrpidamente metabolizada ejerce represin catablica. Un ejemplo es la produc-cin de cafalosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida poramonio.

Debido a que la produccin de estos metabolitos es afectada por mecanismosde control genticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos im-portantes en el mejoramiento de cepas. Los programas iniciales en la industriade antibiticos inducan mutaciones sobre clulas o esporos mediante el empleode agentes fsicos y qumicos. Si uno repasa el caso tpico de la penicilina en elcual las primeras cepas de Penicill um chrysogenum producan alrededor de 20unidades ml -1 ,(20 U ml -1 ), se observa que las tcnicas de mutacin clsica hanpermitido obtener mutantes adecuados para la aplicacin posterior de tcnicasms recientes como la fusin de protoplastos y las de clonaje de genes.

Se pueden emplear dostcnicas de seleccin alazar, de mutantes obteni-dos despus de un trata-miento como se indica enla Fig. 4.

Los procedimientos enmedios lquidos son en ge-neral largos y requierengran cantidad de material.La ventaja es que el proce-so es controlado en condi-ciones relativamente com-parables a las de produc-cin en relacin a agitaciny aeracin.

El test en placas es msrpido, permite controlarun mayor nmero de colo-nias con menor materialpero en condiciones que noreproducen la fermenta-cin en medio lquido. Setrata aqu de evaluar lacantidad de antibitico ex-cretado por una colonia.Una variante consiste encubrir la placa con un celo-fn estril y agregar sobreel mismo una capa de agarconteniendo el organismo

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indicador, incubando luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias delos mutantes son mantenidas libres de contaminacin por el organismo sensible.En este caso el tamao de la zona de inhibicin es controlado por el espesor de lacapa. Evidentemente, como se mencion anteriormente, el programa de mejora-miento debe incluir una mejora en el medio de produccin.

Se observa, en general, en un programa de mejoramiento, que los saltos en laproduccin al inicio del programa son importantes, pero despus la seleccin demutantes superproductores se vuelve cada vez ms difcil.

Con referencia a los estudios de "screening" en placas, un factor importantees la composicin del medio slido para lograr que la cepa pueda expresar toda sucapacidad productora. En algunos casos las condiciones de limitaciones de nutrientes, que favorecen el comienzo de la produccin de antibiticos en medio l-quido no son alcanzadas en medio slido, sin embargo esto se puede corregir su-primiendo la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenidode agua de macerado de maz, como en el caso de penicilina.

Es posible en base a la experiencia adquirida en el curso de los trabajos demutagnesis-seleccin, establecer una correlacin entre los caracteres fisiolgicoo bioqumicos y la produccin del microorganismo. En este sentido pueden a veces intervenir en la seleccin en medios slidos criterios morfolgicos, pigmenta-cin de colonias, resistencia al antibitico producido, etc.

3. Recombinacin genticaEl mejoramiento de una cepa industrial empleando tcnicas de mutagnesis-

seleccin conduce a la creacin de lineas divergentes. Una estrategia ms lgicaen tal programa de mejoramiento sera reagrupar las potencialidades de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinacin de genes respon-sables de codificar la produccin de determinado metabolito.

A partir de 1977 con los trabajos de Hopwood se muestra que es posible lo-grar la recombinacin gentica, definiendo por tal a cualquier proceso que generenuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en individuosdiferentes.

Todos los procesos no meiticos en clulas vegetativas que llevan a recombi-nacin son llamados parasexuales y aparecen tanto en organismos procariotescomo eucariotes.

Los virus pueden intercambiar material gentico entre cepas heterognicasdespus de una infeccin mixta en el mismo husped. En bacterias el fenmenode recombinacin se observa en: 1) conjugacin, en donde la transferencia de ma-terial gentico se realiza a travs de pilis, teniendo algunas caractersticas de unproceso sexual; 2) transduccin, en el que la transferencia de ADN de una clulaa otra se realiza mediante una partcula viral que acta como vector; y 3) trans-formacin, donde la recombinacin puede ocurrir despus de la insercin experi-mental de un ADN aislado, a una bacteria receptora.

El intercambio de material gentico entre diferentes especies puede tambinser alcanzado por fusin celular. El primer paso en este caso es la preparacin deprotoplastos, los cuales son clulas que han perdido su pared celular externa yson limitadas solamente por su membrana. Se los prepara sometiendo una sus-pensin celular a la accin de enzimas degradativas de la pared (lisozima) en unmedio isotnico, para minimizar la ruptura por efectos osmticos. Los protoplas-tos de los cultivos que se desea fusionar, son mezclados y fusionados en presencia

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de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos ca-sos, luego de lo cual se los siembra rpidamente en un medio completo para rege-nerar las clulas. La incubacin de protoplastos resulta en regeneracin de la pa-red celular y reversin a una clula de morfologa normal, lo cual es una propie-dad crtica, ya que despus de la fusin se desea recuperar un organismo, el cualpueda ser cultivado normalmente en pequea y gran escala. La fusin celular esseguida por fusin nuclear. La tcnica de fusin celular se emplea en la obtencinde hibridomas que son clulas que se obtienen por fusin de linfocitos con clulasde mieloma (cncer de piel) de ratn u otro animal. Cada clula de hibridomasintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este tipo de clu-las produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una enorme importanciaen reactivos de diagnstico, en la purificacin de molculas por su alta afinidadespecfica y como vectores de drogas u otros reactivos para combatir tumores.

Obtencin de nuevas cepas por ingeniera genticaLa dcada de 1970 marca el comienzo de la unin entre las tcnicas bioqui-

micas para manipular el ADN in vitro con las tcnicas genticas para transferirel ADN de una clula a otra. La nueva metodologa resultante conocida con elnombre de ingeniera gentica ha revolucionado el campo especfico de la Biotec-nologa. A travs del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier tipopueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y reinsertadosen el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Es as que la produccin desolventes, productos qumicos, hormonas, antgenos, enzimas y otras sustanciasde inters farmacolgico puede realizarse en grandes cantidades, a travs del clo-nado de genes especficos en organismos que pueden ser desarrollados en escalaindustrial. Gran parte del xito de una fermentacin, como incrementar el rendi-miento de un producto, aumentar su velocidad de formacin, eliminar productosindeseables o la inhibicin por un producto final, se puede alcanzar, al menos enprincipio, mediante el empleo de tcnicas genticas y estrategias que involucranmetodologa de ADN recombinante in vitro. Esta metodologa ha contribudo ade-ms al conocimiento de las funciones del ADN, a la organizacin de los genes, ala regulacin de la expresin y a la estructura primaria de protenas.

El aspecto principal del clonado es la propagacin de un fragmento determi-nado de ADN en una lnea celular en crecimiento. Este fragmento, para poderpropagarse debe ser unido a una molcula transportadora o vector el cual s escapaz de multiplicarse en el husped.

El clonado de genes ha sido posible gracias a una serie de descubrimientosfundamentales. En primer lugar la puesta en evidencia de enzimas denominadasendonucleasas de restriccin, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios biendefinidos, generando fragmentos de distintos tamaos, determinados por la dis-tancia que separa cada sitio de restriccin ubicado al azar sobre el genoma.

Existen distintos tipos de enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccinde tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen se-cuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de reconoci-miento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la ruptura delADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo fragmentos romos( Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se produce en forma de es-calones, dejando extremos "cohesivos" (Eco RI) como se observa en la Fig. 5. Entodos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3' dejando ex-tremos libres 3' -OH y 5' -fosfatos. Los extremos romos resultantes de un cortepueden transformarse en cohesivos aadiendo a los extremos 3', nucletidos (poliA a uno y poli T al otro) por accin de una transferasa terminal.

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Figura 6. Secuencias y cortes de enzimas de restricin.A: Adenina. G: Guanina. T: Timina. C; Citosina.

Otro de los avances fundamentales en esta tecnologa fue el descubrimientode enzimas que pueden unir extremos libres de hebras de ADN. As molculasseparadas de ADN de doble hebra pueden ser ligadas ya sea por la ADN ligasadel bacterifago T4 si los extremos son romos, o por la accin de la ligasa de E.coli o de T4 si son cohesivos.

Vectores de clonadoPara la transferencia y expresin de un ADN "extrao" en una clula hus-

ped, se requiere de un vector de expresin, el cual debe ser capaz de entrar y re-plicarse dentro de ella. Un vector ideal debera ser pequeo, de fcil preparaciny replicacin en la clula husped, no generar productos txicos para la misma,poseer uno o ms marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar unarpida y positiva seleccin y contener al menos un sitio donde se pueda integrarel ADN extrao sin destruir una funcin esencial (replicacin).

Los plsmidos son muy empleados como vectores. Son molculas de ADN cir-cular extracromosomal que se replican independientemente. Los que poseen ge-nes para resistencia a antibiticos son de gran utilidad debido a que su adquisi-cin por bacterias "competentes" es fcil de detectar. Uno de los ms conocidos, elpBR322 posee sitios nicos de restriccin y lleva genes para resistencia a ampici-lina y tetraciclina. Estos genes poseen sitios de restriccin para la insercin defragmentos de ADN, resultando luego de esta insercin en una inactivacin delgen. En este caso la bacteria que reciba este plsmido, adquirir la resistenciaespecificada por el otro gen intacto.

Los plsmidos que presentan un gran nmero de copias por clula, son losms empleados como vectores, debido a que al amplificar muchas veces el nme-ro de segmentos del ADN de inters, permiten incrementar los rendimientos delproducto del o los genes que transportan.

En una clula la informacin gentica est presente en dos formas diferen-tes, el ADN genmico y el cido ribonucleico mensajero (ARNm), que posee laparte codante del gen sin el promotor. Estas dos formas pueden ser clonadas em-pleando dos estrategias distintas. El primer caso es el mostrado en la Fig. 6, don-de el conjunto de colonias resultantes de la transformacin representa la "biblio-teca genmica" o "genoteca", de la cual habr que extraer los clones de inters.

En el segundo caso a partir del ARNm se obtiene un ADN complementario(ADNc), como se observa en la Fig. 7 para un ARN eucaritico. Este ADNc sepuede insertar posteriormente en un plsmido u otro vector.

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En la formacin de unagenoteca para la expresinde genes de un organismoeucaritico, se debe tener encuenta que en este caso elADN genmico contiene se-cuencias que estn ausentesen el ARN correspondiente.Los genes eucariticos estnconstitudos por secuencias oregiones que no aparecen enel ARNm, denominadas "in-trones" o "secuencias intervi-nientes" y por regiones pre-sentes en el ARNm llamadas"exones". El nmero y tama-o de los intrones vara deun gen a otro, pudiendo en-contrarse genes que carecende ellos. En el proceso detranscripcin, se obtiene unARNm primario (localizadoen el ncleo) que contienetanto las secuencias de losexones como de los intrones,por ste sufre luego un pro-ceso de "maduracin" o mo-dificaciones post-transcrip-cionales que involucran des-de alteracin qumica de ba-ses individuales (metilacio-nes), adiciones al 5' ("ca-ping") o 3' del transcripto(poliadenilacin), hasta laforma ms grande de proce-samiento que involucra laseparacin de los intrones ("splicing"). Como consecuencia de estas modificacio-nes y procesamiento se obtiene como producto un ARNm funcional que ser tra-ducido a nivel ribosomal. Por lo tanto si se quiere obtener una protena eucariti-ca en bacterias, es imprescindible obtener un ADNe al ARNm en cuestin, a par-tir del cual se llevar a cabo el donado.

El proceso de transformacin por plsmidos se caracteriza en general por serde baja eficiencia; por lo tanto para incrementar la misma se deben tener encuenta una serie de factores: a) eleccin de una cepa husped adecuada; en el ca-so de E. coli existen varias recomendadas (la mayora de las cepas K12, MC1061, C 600, DH 1, DH 5, IM 109, HB 101, etc); b) etapa de crecimiento, ya quela frecuencia de transformacin es mayor cuando el cultivo de E. coli est en lamitad tarda de la fase exponencial; c) procedimiento de transformacin emplea-do. En general existe un modelo lo que implica la obtencin en un primer paso declulas "competentes" mediante un tratamiento con una solucin de CaCl 2 (50mM) en fro, luego de lo cual las clulas se ponen en contacto con la solucin delplsmido purificado incubando en hielo de 10 a 60 min. El porcentaje de clulas

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Figura 7. Obtencin de cido desoxiribonucleico complementa-rio (ADNc) a partir de cido ribonucleico mensajero (ARNm).

competentes en una poblacin tratada, oscila entre 0,01% y 10% de las clulasviables. La frecuencia de la transformacin o eficiencia se puede determinar em-pleando un ADN standard (como pBR322) y puede oscilar entre 1 x 106 a 1 x 108unidades formadoras de colonias mg-1 de ADN.

Una aclaracin especial es la referida a la calidad de las drogas a emplear(en general reactivos para biologa molecular) y los cuidados del operador parano "contaminar" las soluciones.

Otros vectores del clonado incluyen a los faltos k, los cuales poseen un nme-ro de ventajas que los hacen atractivos para el clonado. El cromosoma de estebacterifago es una molcula de ADN lineal de 49 Kb de longitud, en el cual cerca del 40% no es esencial para su propagacin. Fragmentos de ADN extrao dehasta 24 Kb pueden ser propagados empleando este vector, ubicando estos frag-mentos en la regin central del genoma, la cual contiene genes no esenciales. Elreemplazo de estos es fundamental debido a que slo genomas de 40-52 Kb pue-den ser empaquetados dentro de las partculas del fago con alta eficiencia. Si slose ligan los dos extremos o brazos, la molcula de ADN obtenida es muy pequeapara ser empaquetada.

La molcula de ADN recombinante del fago puede ser introducida como talen la clula bacteriana (transfeccin) con una eficiencia de 10` 1 clones recombi-nantes ug-1 ADN o puede superar a 10 6 clones ug-1 si se realiza por infeccin,empaquetando previamente in vitro al DNA recombinante.

Si el objetivo es clonar grandes fragmentos de ADN pueden emplearse comovectores los csmidos, que son elementos genticos equivalentes a plsmidos degran tamao y encapsulados dentro de la cabeza de un fago para ser introducidosen las clulas. En los csmidos se pueden introducir fragmentos de hasta 45 Kb,lo cual reduce el nmero de clones a obtener para disponer de una genoteca re-

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presentativa. Como llevan el origen de replicacin de un plsmido, se replican co-mo tal dentro de la clula. Su desventaja es que por su gran tamao su nmerode copias (como plsmido) en la clula es reducido.Tamao de la genoteca

Este es uno de los aspectos ms importantes y que consiste en determinaraproximadamente cuntos clones es necesario disponer para tener una probabili-dad p de contener una secuencia determinada de ADN. Se debe asumir una re-presentacin de secuencias al azar, que cada inserto es de igual tamao y que eltamao genmico del organismo sea conocido. As, si "a" es el tamao del insertoy "b" es el tamao del genoma (en las mismas unidades), luego una genoteca deN clones tendr una probabilidad p de contener determinada secuencia:

As por ejemplo para E. coli con un geoma de 4.2x10 3 Kb y si a = 20 Kb, si sefija p = 0.99 (99% de probabilidad de contener determinada secuencia), el valorde N ser de 9.6 x 10 2 clones.

Identificacin de clones de intersLa identificacin de los clones de inters entre cientos o miles de clones re-

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