Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Facultad de Ciencias Químicas

Lic. Químico Farmacobiólogo

Laboratorio de serología

Práctica

Morfología celular (leucocitos)

 

Alumnos:

Diego Armando Frías Vázquez

Verano 2015

Objetivo  Identificar   la   morfología   celular   de   un   frotis   sanguíneo   de   sangre   periferia específicamente de la línea leucoide

Esquema de trabajo

Fundamento Para estudiar la sangre se utilizan frotis o extensiones sanguíneas: sobre un portaobjetos de vidrio se coloca una gota de sangre que es extendida con otro portaobjetos. Después de secarse al aire la extensión sanguínea se la tiñe con algún colorante ya sea por método de wrigth o por tinción con hemocolorantes.

Introducción

La sangre es un tejido líquido, al que puede considerarse como una variedad de tejido conectivo, que circula por el  aparato cardiovascular  gracias al   impulso que  le proporciona el  corazón. La sangre está compuesta por dos fracciones bien diferenciables: 

•   células   sanguíneas  o  elementos   formes  de   la   sangre  El   conjunto  de   las   células   sanguíneas suponen el 45% del volumen sanguíneo. Hay diversos tipos de elementos formes en la sangre:

 • eritrocitos (de 4.106 a 5.106/mm3 de sangre)

 • plaquetas (de 200.000 a 400.000/mm3)

 • leucocitos (de 6000-9000/mm3) 

• granulocitos

 • neutrófilos (55-60% de los leucocitos)

 • eosinófilos (2-5%)

 • basófilos (0-1%)

 • agranulocitos

 • linfocitos (30-35%) 

• monocitos (3-7%)

 • plasma sanguíneo:  es la sustancia intercelular líquida en la que nadan las células y que puede asimilarse a la matriz extracelular en otros tipos de tejido conectivo. El plasma sanguíneo supone el 55% del volumen sanguíneo y está compuesto por:

  agua 

 electrolitos 

 proteínas (albúmina, fibrinógeno, globulinas...)

 nutrientes (glucosa, lípidos, aminoácidos)

 sustancias nitrogenadas no proteicas (urea, creatinina,...) 

 sustancias reguladoras (hormonas, vitaminas…) 

•   hay   diferencias   importantes   entre   la  matriz   extracelular   del   tejido   conectivo   y   el   plasma sanguíneo que justifican el que la sangre sea considerada como un tipo de tejido diferente al tejido conectivo. Estas diferencias estriban en: 

  el tipo de compuestos químicos que forman parte del plasma son muy diferentes a los que componen la matriz del tejido conectivo 

  los  compuestos  químicos  que  forman parte del  plasma no son sintetizados por  las  propias células   sanguíneas,  al   contrario  de   lo  que  sucede  con   los  principales  componentes  del   tejido conectivo que sí  son sintetizados por  las  células  propias  del   tejido (fibroblastos,  osteoblastos, condrocitos) 

• el hecho de que buena parte de los componentes del plasma (agua, electrolitos, moléculas de pequeño  peso  molecular)   puedan   atravesar   la   pared   de   los   vasos   e   incorporarse   al   espacio intercelular conectivo con facilidad y viceversa (ante cambios de presión osmótica, por ejemplo) permite considerar al plasma como la "matriz extracelular" de la sangre.

FUNCIONES DE LA SANGRE• transportar oxígeno y nutrientes a las células

• transportar anhídrido carbónico y otros residuos del metabolismo celular

• transportar hormonas

• transportar productos (anticuerpos) y células (leucocitos) involucrados en labores defensivas del organismo

LEUCOCITO NEUTRÓFILO

Los leucocitos granulocitos neutrófilos son células incoloras, como el resto de los leucocitos, que permanecen en  la sangre solamente unas horas (≈6 h) hasta que alcanzan el  tejido conectivo donde tienen una vida media de 2-5 días en condiciones normales. Los neutrófilos, al igual que los otros   leucocitos,   llegan  al   tejido  conectivo  atravesando   la  pared  de   las   vénulas  postcapilares (donde   previamente   han   quedado   "marginados")   por   diapédesis   a   través   de   las   células endoteliales.

1.- Estructura 

• en sangre circulante son células esféricas con ≈7 µm diám. pero en los frotis sanguíneos se aplanan y tienen un diámetro de ≈10-12 µm 

• núcleo característico: 

• compuesto por 2-5 lóbulos unidos por pequeños puentes de material nuclear: la lobulación es mayor cuanto más maduro es el neutrófilo (las células jóvenes son neutrófilos en banda, con el núcleo solo hendido, y las células maduras tienen núcleos polilobulados). El núcleo polilobulado hace parecer que la célula tiene varios núcleos, por eso se les llama impropiamente leucocitos polinucleares, en realidad son leucocitos polimorfonucleares. 

• las cromatina está muy condensada en grumos y en algunos neutrófilos de las mujeres aparece un apéndice nuclear característico (corpúsculo de Barr) que corresponde al cromosoma X 

• no se ve nucléolo 

• citoplasma: 

•  gránulos  azurófilos  o  primarios:   se  tiñen   con  el   azul  de  metileno  pero   son  escasos  en   los leucocitos adultos y apenas se pueden distinguir en las preparaciones de rutina 

• gránulos específicos o secundarios: tienen poco afinidad por los colorantes (apenas se tiñen con la eosina) y son pequeños por lo que no se ven en las preparaciones rutinarias, aunque son los responsables del ligero color rosa con que se tiñe el citoplasma.

2.- Ultraestructura 

• membrana algo irregular 

• núcleo segmentado con grumos densos de cromatina 

• citoplasma 

• halo periférico con abundante actina y miosina 

• ap. Golgi, REG y mitocondrias en pequeña cantidad 

• gránulos de glucógeno • gránulos azurófilos o primarios: son lisosomas con un tamaño (≤ 0.5 µm)   y   electrondensidad   apreciables.   Estos   gránulos   contienen   enzimas   hidrolíticas   (fosfatasa ácida, β-galactosidasa, β- glucurunidasa, esterasa, 5'-nucleotidasa,...) y peroxidasa 

• gránulos específicos o secundarios: son más abundantes (el doble) y más pequeños (0'1-0'2 µm) que   los   azurófilos   y  tienen   forma,   tamaño  y   electrondensidad   variable.   Contienen  productos (fosfatasa alcalina,   lisozima, colagenasa,  proteínas con actividad antibacteriana -fagocitinas-   ...) que se liberan al medio extracelular y que actúan como mediadores de la inflamación

3.- Función

  Los neutrófilos forman parte del sistema defensivo y su papel es la fagocitosis de bacterias o células muertas que se encuentran en el tejido conectivo.

LEUCOCITO EOSINÓFILO

Los eosinófilos son células que solo están 3-8 h en sangre. Las cifras de eosinófilos en sangre muestran una variación diurna: son máximas por la mañana y mínimas por la tarde. Una vez que alcanzan el tejido conectivo, sobre todo de la piel, del aparato respiratorio y del tubo digestivo, tienen una vida media de 8-12 días. 

1.- Estructura 

• en la sangre circulante tienen ≈9 µm de diám. pero en las extensiones sanguíneas alcanzan ≈12-17 µm de diám. 

• núcleo 

• bilobulado habitualmente y su cromatina nuclear es menos densa que la del neutrófilo 

• citoplasma 

• gránulos específicos: se tiñen de rosa con la eosina y son bastante gruesos 

• gránulos azurófilos: son más escasos y difíciles de ver 

2.- Ultraestructura 

• núcleo con cromatina densa 

• citoplasma 

• escasas vesículas de REG, ap. de Golgi y mitocondrias 

•   gránulos  específicos:   son   grandes,  tienen  una   forma  ovoide   y   contienen  en   su   interior  un cristaloide central  electrondenso rodeado por una matriz menos electrondensa.  Estos gránulos contienen los siguientes productos: 

 proteína básica principal: tiene acción destructora sobre los parásitos y activa plaquetas 

 proteína eosinófila catiónica: destruye parásitos y neutraliza la acción de la heparina 

 neurotoxina derivada de eosinófilos: tiene un potente efecto neurotóxico y destruye parásitos   diversos   enzimas   lisosomiales,   entre   ellos   histaminasa,   fosfatasa   ácida,   glucurunidasa, arilsulfatasa y peroxidasa 

• gránulos azurófilos: son pequeños y contienen fosfatasa ácida y arilsulfatasa y otras enzimas hidrolíticas propias de los lisosomas

3.- Función 

• Los eosinófilos son también células fagocitarias pero que parecen mostrar preferencia por la fagocitosis   de   complejos   Ag-AC.   También   parecen   estar   involucrados   en   la   destrucción   de parásitos:

• Los eosinófilos tienen también algún papel en los procesos alérgicos ya que su número aparece aumentado en estos procesos patológicos.

LEUCOCITO BASÓFILO

Los basófilos son los menos numerosos de los leucocitos sanguíneos y cuando se incorporan al tejido conectivo tienen una función similar a la de las células cebadas. 

1.- Estructura 

• tamaño similar al resto de los leucocitos granulocitos 

• núcleo 

• es bilobulado o presenta una simple hendidura nuclear 

• cromatina condensada 

• citoplasma 

• gránulos específicos: no son muy numerosos pero son muy grandes y dispersos por el citoplasma y llegan a "oscurecer" al núcleo ya que se tiñen con el azul de metileno del Giemsa. Estos gránulos son metacromáticos cuando se tiñen con azul de toluidina o de tionina. 

• gránulos azurófilos o inespecíficos: son lisosomas que se tiñen con el azul de metileno y que apenas se pueden distinguir de los gránulos específicos 

2.- Ultraestructura 

• membrana irregular con receptores para la fracción Fc de la IgE e IgE asociada a ellos 

• núcleo con cromatina heterogénea 

• citoplasma 

• escasos orgánulos (REG, REL, ap. Golgi, mitocondrias, gránulos de glucógeno...) 

•   gránulos   específicos:   son   grandes   (hasta   más   de   1   µm),   de   forma   variable   y   bastante electrondensos pero homogéneos (no se ven los cristales que se ven en los gránulos de las células cebadas). 

Estos gránulos contienen: 

• histamina (aumenta la permeabilidad vascular y contrae el m. liso) 

• heparina (anticoagulante) y condroitín sulfato 

• ATP 

• serotonina (contrae el m. liso)

• factor quimiotáctico de eosinófilos y neutrófilos 

• proteinasas 

• enzimas de degradación de los glicosaminoglicanos 

•   gránulos   azurófilos   o   inespecíficos:   son   lisosomas   de   ≈   0.5   µm   y   que   contienen   enzimas hidrolíticas similares a las de los gránulos azurófilos de los neutrófilos 

• en el momento de la degranulación se produce la liberación de fosfolipasa A que hace que se sinteticen en ese momento, a expensas de fosfolípidos de la membrana, productos que no están contenidos en gránulos secretorios pero que también son secretados al espacio extracelular: 

• leucotrieno C (aumenta la permeabilidad vascular y contrae el m. liso) 

• prostaglandinas 

•  productos  del  metabolismo del  oxígeno   (producen  daño tisular  y  tienen poder  microbicida: peróxido de hidrógeno, radicales superóxido, radicales hidroxilo)

3.- Función 

Similar a la de las células cebadas

LINFOCITO

Los linfocitos son más numerosos en los niños jóvenes que cualquier otro de los leucocitos pero en los niños mayores y en los adultos están en una proporción inferior a los leucocitos neutrófilos. Los linfocitos se producen en la médula ósea y se vierten a la sangre en forma de linfocitos inmaduros. Estos linfocitos inmaduros maduran en puntos determinados del sistema inmunitario que reciben el nombre de órganos linfoides primarios (timo y médula ósea). Los linfocitos maduros recirculan por la sangre para ir a localizarse en lugares determinados de los órganos linfoides secundarios (ganglios linfáticos, bazo, tejido linfoide asociado a mucosas) o de otros tejidos. En estas zonas los linfocitos  maduros  pueden  entrar  en  contacto  con  un  Ag   (un  Ag  concreto  para  cada  tipo de linfocito) y convertirse en un linfocito activo. Los linfocitos son las células principales del sistema inmunitario. Estas células tienen una vida media variable entre varios días y varios meses.

1.- Estructura 

• linfocitos pequeños 

• son la mayoría de los linfocitos circulantes en sangre y parecen ser los linfocitos inmaduros que circulan desde la médula ósea a los lugares de maduración 

• tienen de 6-9 µm de diám. en los frotis sanguíneos 

• núcleo: ocupa casi toda la célula y presenta cromatina densa 

• citoplasma: es un estrecho anillo ligeramente basófilo con algún gránulo azurófilo 

• linfocitos grandes 

• son solo el  3% de  los  linfocitos circulantes y parecen ser  los  linfocitos maduros/activos que circulan   desde   los   lugares   donde  maduraron   [médula   ósea   o   timo]   o   se   activaron   [órganos linfoides secundarios] hasta los tejidos 

• tienen de 9-15 µm de diám. en los frotis 

• núcleo ovoideo o reniforme y cromatina densa 

• citoplasma escaso basófilo con algún gránulo azurófilo 2.- Ultraestructura 

• membrana con pequeñas proyecciones citoplasmáticas (microvellosidades cortas).  El  M.E. de barrido permite distinguir dos tipos de linfocitos: 

• linfocitos con pocas microvellosidades (linfocitos T) 

• linfocitos con abundantes microvellosidades (linfocitos B) 

• núcleo con cromatina condensada 

• citoplasma: escaso y contiene alguna mitocondria, algunos ribosomas libres, algún lisosoma y ocasionales agregados de glucógeno

3.- Tipos de linfocitos 

En los frotis sanguíneos teñidos de rutina y en las micrografías electrónicas de transmisión no hay diferencias  estructurales  apreciables  entre   los   linfocitos.   Sin  embargo  hay  tipos  diferentes  de linfocitos circulantes: 

• linfocitos B (≈15%) 

•   son   células   que   se   producen   en   la  médula   ósea   y   adquieren   sus   atributos   característicos (marcadores   de  membrana)  madurando   en   la   propia  médula   ósea.   Como   en   las   aves   esta maduración se produce en una estructura que se llama bolsa de Fabrizio, a este tipo de linfocitos se le denomina linfocito B 

• los linfocitos B "maduros" recirculan por la sangre hasta alcanzar los tejidos y zonas específicas de   los   órganos   linfoides   secundarios   donde   se   pondrán   en   contacto   con   los   antígenos correspondientes

• linfocitos T (≈80%) 

•   son   células   que   se   producen   en   la  médula   ósea   pero   adquieren   sus   atributos   especiales (marcadores de membrana) madurando en el timo, por eso se les llama linfocitos T 

• los linfocitos T "maduros" recirculan por la sangre hasta alcanzar los tejidos y zonas específicas de los órganos linfoides secundarios

• células nk (≈5%) 

• entre estas células se encuentran células madre hematopoyéticas circulantes (pluri-, multi- y/o unipotenciales) y células o linfocitos NK (de “natural killer”) 

•  los  linfocitos NK son linfocitos que tienen funciones similares a  los  linfocitos TK (o TC) pero actúan de forma inespecífica (no maduran en el timo y no le son presentados los antígenos por medio de las moléculas del HMC)

4.- Diferenciar linfocitos B de linfocitos T 

Aunque en las preparaciones de rutina no pueden distinguirse los linfocitos B de los linfocitos T, hay técnicas que permiten diferenciarlos: 

• con el  microscopio electrónico de barrido los  linfocitos B tienen una superficie irregular con muchas microvellosidades mientras que los linfocitos T tienen una superficie casi lisa 

• con técnicas inmunocitoquímicas: 

• los linfocitos B tienen en su superficie inmunoglobulinas: con técnicas inmunocitoquímicas que emplean AC específicos contra esas inmunoglobulinas (Ac-antiAC) se puede detectar la presencia de estas inmunoglobulinas en la superficie celular 

• los linfocitos T tienen en su superficie receptores de células T: con técnicas inmunocitoquímicas que emplean AC específicos contra esos receptores (AC-antirreceptores de células T) se puede detectar su presencia en la superficie celular. Todos los linfocitos T expresan en su superficie una proteína Thy-1 que puede ser detectada inmunocitoquímicamente. 

•  los  linfocitos expresan proteínas de membrana que reciben el  nombre de moléculas CD (de "cluster  of  differentiation").   Los  diversos  tipos  de   linfocitos  se  pueden distinguir  con   técnicas inmunocitoquímicas  que  usan  AC  específicos   para  poner   de  manifiesto   los  diversos  tipos  de moléculas CD: 

• los linfocitos B expresan moléculas CD22 

• los linfocitos T jóvenes expresan moléculas CD2 

• todos los linfocitos T expresan moléculas CD3 

• los linfocitos TH expresan moléculas CD4 

• los linfocitos TC y TS expresan moléculas CD8

MONOCITO

Los monocitos son las células sanguíneas que, cuando emigran al tejido concectivo, se convierten en los macrófagos, en los diversos tipos celulares del sistema fagocítico mononuclear. 

1.- Estructura 

▪ son las células más grandes de una extensión sanguínea: ≈12-15 µm de diám.

▪ tienen un núcleo grande ligeramente hendido (reniforme) con cromatina bastante condensada 

▪ el citoplasma contiene bastantes gránulos azurófilos (lisosomas) 

2.- Ultraestructura ▪ núcleo excéntrico reniforme 

▪ lisosomas 

▪ RE escaso 

▪ alguna inclusión citoplasmática 

▪ superficie celular bastante lisa

Localización

Los  monocitos   pasan   sólo   unos   días   en   la   sangre   antes   de  migrar   a   los   tejidos,   donde   se diferencian hasta convertirse en macrófagos. Los macrófagos sobreviven desde varios meses hasta años en el tejido conjuntivo.

Función

Los monocitos forman el sistema reticuloendotelial,  que participa sobre todo en la fagocitosis. Destruyen   células  muertas   e   ingieren  material   extraño.   Los   antígenos   se  procesan   y   pueden presentarse  a   los   linfocitos  para   iniciar  una   respuesta   inmunitaria  adaptativa.  Los  macrófagos también tienen una función proinflamatoria, con la liberación de diversas citocinas.

Realización de las extensiones de sangre periférica

La extensión sanguínea es de gran importancia en algunas enfermedades hematológicas, ya que su diagnóstico puede realizarse o sospecharse sólo con observar la morfología de las células de la sangre.

Uno de  los  métodos más empleados para  la  realización del   frotis sanguíneo es  el  método de los dos portaobjetos.  Consiste  en   la  extensión  de  una  gota  de   sangre   sobre  un  portaobjetos mediante otro portaobjetos. La técnica es la siguiente:

1. Depositar una pequeña gota de sangre en el extremo de un portaobjetos.

2. Con el borde de otro portaobjetos a 45 grados, tocar la gota, esperar a que la sangre se distribuya por capilaridad y después deslizar suavemente un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal hasta que la gota quede bien extendida sobre la superficie del primar poirtaobjetos.

3. Dejar secar el frotis.

Cuando la extensión se realiza por este procedimiento, el frotis presenta tres zonasdiferenciadas, en   las  que   la  morfología   eritrocitaria   puede   variar   y   la   distribución  de   leucocitos  puede   ser diferente.

La zona en que inicialmente se depositó la gota (“cabeza”) es excesivamente gruesa y no puede ser   valorada   adecuadamente.   A   continuación   se   extiende   el “cuerpo” de   la   extensión,   que corresponde a la región intermedia del frotis y en ella existe un reparto equilibrado de las células; es   la   zona   ideal   para   la   observación  microscópica.   Por   último,   al   final   de   la   extensión,   se encuentran las “barbas” o la “cola”, es una zona fina dónde las células adoptan una disposición de cordones.

Observación al microscopio de las extensiones de sangre periférica:

Las extensiones una vez teñidas y secadas pueden ser observadas al microcopio óptico.

Inicialmente se puede observar la extensión con objetivos de aumento bajo o intermedio (x20, x40). Con ellos se puede visualizar áreas suficientemente extensas para hacernos una idea global del   aspecto   del   frotis.   Con   una   barrido   de   diferentes   zonas   del   cuerpo   de   la   extensión observaremos los hematíes (el elemento más abundante) y entre ellos los leucocitos (los únicos elementos nucleados en condiciones normales en sangre periférica) y sus diferentes tipos, y por último comprobaremos las presencia de las plaquetas. En esta primera aproximación podemos comprobar el adecuado tamaño, forma y coloración de los hematíes, así como su uniformidad en estos tres aspectos. También podremos observar la presencia dispersa entre los hematíes de los leucocitos, entre los que visualizaremos diferentes tipos (heterogeneidad) como son en orden de abundancia: los neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. Por último no hay que descuidar la observación de los elementos más pequeños de la sangre periférica: las plaquetas.

La correcta apreciación de los detalles morfológicos de las células de la sangre se realiza con el objetivo de inmersión en aceite (x100). El campo de visualización es más reducido, pero se ven mucho mejor los detalles morfológicos celulares, con lo que podremos reconocer fácilmente los diferentes leucocitos (y realizar la fórmula leucocitaria), los hematíes y las plaquetas.

La correcta forma de observar el frotis es realizando un barrido sobre el mismo, de forma que evitemos (salvo que expresamente deseemos lo contrario) pasar dos veces por la misma zona.

Valores aproximados de frotis sanguíneo en un conteo de 100 celulas 

Neutrófilos segmentados……………………..50-70

Neutrofilos en banda…………………………….0-5

Linfocitos………………………………………………..20-40

Monocitos ……………………………………………..3-11

Eosinofilos………………………………………………0-5

Basófilos…………………………………………………0-1

Preguntas

Menciona los diferentes leucocitos presentes en sangre ?

En sangre periférica normal podremos encontrar según por número de células encontradas en un barrido normal: neutrófilos segmentados, neutrófilos en banda, linfocitos, monocitos, eosinofilos y basófilos.(la observación de la técnica de barrido es por tinción de Wright o tinción rápida con hemocolorantes, estos nos permiten una observación preliminar pero no muy específica de detalles acerca de detalles por alguna patología) a veces se pueden hacer visualizaciones de algunas células inmaduras pero dependerá de la patología.

Menciona el porcentaje normal de una diferencial y su función de cada uno en el sistema inmune?

Valores aproximados de frotis sanguíneo en un conteo de 100 células

Neutrófilos segmentados……………………..50-70%

Neutrófilos en banda…………………………….0-5%

Linfocitos………………………………………………..20-40%

Monocitos……………………………………………..3-11%

Eosinofilos………………………………………………0-5%

Basófilos…………………………………………………0-1%

Los neutrófilos forman parte del sistema defensivo y su papel es la fagocitosis de bacterias o células muertas que se encuentran en el tejido conectivo.

Los eosinofilos son también células fagocitarias pero que parecen mostrar preferencia por la fagocitosis de complejos Ag-AC. También parecen estar involucrados en la destrucción de parásitos:

Los eosinofilos tienen también algún papel en los procesos alérgicos ya que su número aparece aumentado en estos procesos patológicos.

La función de los basófilos es Similar a la de las células cebadas

La función de los linfocitos dependerá del tipo ya sea T o B en caso de los T son los encargados generalmente de la activación de los macrófagos, activación de los B y activación de replicación, control de la replicación y en estos son más relacionados con la respuesta inmune celular; mientas que los linfocitos tipo B son encargados de la respuesta inmune humoral y estos son encargados de la creación de anticuerpos, citosinas, etc. para la respuesta inmune especifica.

Los monocitos forman el sistema reticuloendotelial, que participa sobre todo en la fagocitosis. Destruyen células muertas e ingieren material extraño. Los antígenos se procesan y pueden presentarse a los linfocitos para iniciar una respuesta inmunitaria adaptativa. Los macrófagos también tienen una función proinflamatoria, con la liberación de diversas citocinas.

Como se distinguen las células leucoides en el microscopio?

Bibliografía

Inmunología celular y molecular 6ta edición ABBAS editorial elsevier Hematología, la sangre y sus enfermedades 2da edición J. PEREZ/ GOMEZ ALMAGUER

editorial mc Graw Hill Hematología e inmunología 4ta edición GARGANI editorial mosby Inmunología básica y clínica 10ª edición PARSLOW editorial manual moderno Introducción a la inmunología humana 6ta edición GEFFNER editorial panamericana