RESUMEN: Disfunción sináptica en síndromes miasténico congénito

Los Síndromes miasténico congénito son trastornos hereditarios de la transmisión neuromuscular caracterizado por debilidad muscular fatigables. El número de casos reconocidos aumenta con un mejor diagnóstico. Hasta la fecha se han identificado más de 300 mutaciones diferentes presentes en más de 350 parentescos no relacionados. Los defectos genéticos subyacentes son diversos, que implica una serie de genes diferentes con una variedad de diferentes fenotipos. El tipo de tratamiento y su efectividad va a depender del mecanismo patogénico subyacente. El objetivo del estudio a tratar es definir el mecanismo molecular para cada mutación identificada y añadir esta información a la clínica como base para adaptar el tratamiento del paciente. Aquí, se describen algunos de los métodos que se pueden utilizar para definir si una variante de secuencia de ADN es patógeno con referencia a las variantes en DOK7. Destacamos un nuevo mecanismo para la interrupción de la función AChR, donde una mutación en los genes subunidad AChR causas reduce la conductancia de los canales iónicos y discutir nuevos métodos para identificar mutaciones genéticas.

El estudio de estos trastornos está demostrando altamente informativo para la comprensión de los diversos mecanismos moleculares que pueden subyacer a la disfunción sináptica.

Introducción

Los síndromes miasténico congénito (CMS) son un grupo heterogéneo de trastornos causados por mutaciones en una serie de diferentes genes que afectan la transmisión neuromuscular. Hasta la fecha, al menos 15 genes diferentes se han asociado con estos trastornos. El fenotipo de la base de la debilidad muscular fatigable es compartida entre los síndromes, y aunque puede haber indicios fenotípicos, predecir qué genes son defectuosos desde el examen clínico a menudo es desafiante. La mayoría de los casos al menos se pueden tratar parcialmente, y en muchos casos el tratamiento conduce a una profundo beneficio de la calidad de vida del paciente. Como siempre, el tratamiento apropiado va a depender del mecanismo molecular subyacente. Por ejemplo, en el síndrome de los canales lentos, donde hay un efecto excitotóxica, el tratamiento médico actual se basa en el uso de bloqueadores de los canales que sujetan la cinética de la canal iónico del receptor de acetilcolina (AChR) sin inhibir la transmisión de señales, mientras que en los síndromes de canal rápido, las estrategias de tratamiento se basan en el aumento de la disponibilidad del neurotransmisor acetilcolina. Si se puede determinar la base genética y el mecanismo molecular subyacente de un síndrome miasténico congénito, entonces el tratamiento puede ser adaptado a cada paciente. En muchos centros, el cribado genético apuntado es ahora el principal método utilizado para determinar que el síndrome miasténico congénito los puertos de pacientes. En este enfoque pistas fenotípicas se reunieron a partir del examen clínico, tales como la participación del músculo del ojo, los patrones de debilidad muscular y la aparición de crisis de apnea y contracturas de las articulaciones, y los resultados se introducen en neurofisiología un algoritmo para determinar el orden en que los genes son seleccionados para mutaciones. Este método ha demostrado ser extremadamente eficaz, y en el servicio de genética Oxford, Reino Unido, hemos identificado mutaciones en más de 350 parentescos. Sin embargo, con el advenimiento de las técnicas de secuenciación de próxima generación, es probable que en los próximos cinco años la bioinformática aplicadas a todo el genoma y datos de la secuencia del exoma enteros jugará un papel nuevo y crítico en el diagnóstico genético. Aunque hay varias mutaciones más comunes probablemente asociado con los efectos fundadores, tales como la c.1267delG4 o 12935 mutación en CHRNE o la mutación de sentido

erróneo en p.Asp88Lys RAPSN, 6 la mayoría de los genes asociados-CMS tienen múltiples mutaciones "privadas", muchas de las cuales son mutaciones sin sentido. Aunque varios programas de software están disponibles para predecir si una variante de secuencia es probable que sea patógena, más a menudo que no prueba de patogenicidad se establece mejor mediante el análisis funcional de la proteína variante en sistemas de cultivo celular.

Mutaciones DOK7

DOK7 es una proteína adaptadora que se une a almizcle y amplifica la vía de señalización que es en gran parte responsable tanto de la formación de sinapsis unión neuromuscular y, posteriormente, para el mantenimiento de la estructura sináptica. Dentro de lo humano la población gen DOK7 muestra un alto grado de variabilidad y la detección de mutaciones revela numerosas variantes de la secuencia. Algunas variantes pueden ser eliminados por referencia a bases de datos de variación humanos tales como dbSNP, o por análisis de segregación, pero en muchos casos las variantes son miembros de la familia raras y otros no están disponibles para el análisis. Cuando mioblastos C2C12 línea celular de músculo de ratón se diferencian para formar miotubos en cuture, grupos de receptores de acetilcolina (AChR) pueden ser inducidas a formar en la superficie celular de miotubos por la adición de neural agrin.

La agrina interactúa con LRP4 para estimular MUSK que, a su vez, induce la agregación de AChR en grupos que se pueden visualizar bajo el microscopio con α -bungarotoxina marcado sobreexpuestas compresión de DOK7 en miotubos C2C12 tiene la notable propiedad de inducir grupos AChR en ausencia de Agrin. Las mutaciones identificadas en DOK7 CMS han demostrado afectar la eficiencia de la agrupación AChR inducido en miotubos C2C12, y es posible utilizar este sistema modelo para deteminar la patogenicidad de DOK7 variantes detectadas en el gen screens , una característica clave de este sistema es asegurar una mayoría de los mioblastos C2C12 son transfectadas con DOK7 o la expresión mutante DOK7 construye antes de la diferenciación en miotubos. Para asegurar la mayoría de las células expresan el mutante, se puede usar un sistema de expresión / infección retroviral. Una vez formados los miotubos infectadas con el constructo de expresión DOK7, los grupos AChR se pueden visualizar después de la incubación, ya sea con -bungarotoxin marcado con fluorescencia o anti-AChR anticuerpos y patogenicidad determinan a través de una reducción en el número y la complejidad de los grupos formados. Tras el cribado de posibles casos DOK7 CMS, el uso de este sistema, en combinación con técnicas de genética molecular estándar, activar 34 mutaciones patogénicas diferentes para ser identificado en 72 pacientes, y 27 variantes raras para ser clasificado como mutación no patogénica 1124 es 1127dupTGCC una mutación común que se encuentra en más de la mitad de los pacientes DOK7 CMS que publica. Hay varias otras incidencias de truncamientos en la gran exón 3 de DOK7 donde se conservan las propiedades de la proteína MUSK DOK7 necesarios para la unión, pero un adicional aunque no la función crucial en la región C-terminal se pierde. Mientras que los casos DOK7 CMS descritos anteriormente tienen al menos un alelo con una mutación en el último exón 3 del gen que codifica una gran región C-terminal de la proteína, fue posible demostrar que se producen casos donde las mutaciones en ambos alelos están presentes hacia la región N-terminal de la proteína que contiene el pleckstrin( proteína periférica de membrana) homología y dominios de unión a fosfotirosina. Sin embargo, incluso el uso de estas técnicas para definir la naturaleza de la DOK7 variantes de unos pocos casos adicionales se encuentran en las cuales sólo una mutación patógena se identifica en la secuencia codificante. Potencialmente mutaciones adicionales pueden ser identificados a nivel de ARN / proteína a través de análisis de ARN de biopsia muscular del paciente, pero la ubicación de las mutaciones que causan empalme de ARN alterado o expresión sólo puede llegar a ser identificables cuando toda la secuenciación del genoma está disponible.

La identificación de un gran número de mutaciones en DOK7, y sus diferentes efectos sobre el número y la complejidad de las agrupaciones AChR, proporciona un conjunto de información que potencialmente puede ser utilizado en la investigación de la vía de señalización de la activación de MUSK a la formación de racimos asociado AChR-RapSyn que sigue siendo en gran medida no determinados.

AGRN, mutaciones MUSK, y RAPSN

Metodologías similares utilizando células musculares cultivadas se pueden utilizar para analizar los efectos de secuencia de las variantes identificadas en los genes que codifican otras proteínas clave en la vía de la agrupación AChR. Las mutaciones en AGRN y MUSK son raras, pero las mutaciones son más encontradas con frecuencia en factores RAPSN. Otras tales como los niveles de expresión pueden estar involucrados en que afecta a la función de la proteína respectiva, pero analizar el efecto de una mutación en el agrupamiento de AChR en células cultivadas es útil para evaluar la patogenicidad. Por mutaciones en MUSK y RAPSN que es útil tener disponibles células musculares líneas que no expresan MUSK endógena o RapSyn, mientras que para las mutaciones en AGRN es posible sintetizar la proteína mutante, añadirlo a miotubos C2C12 diferenciadas, y para comparar AChR clustering a la observada con expresado de tipo salvaje agrin.Como se ha indicado, las mutaciones en AGRN y MUSK son raros, pero esta metodología se pueden utilizar para determinar la patogenicidad de mutación en RAPSN donde hay un número de mutaciones y también variantes de secuencia no patógeno considerable.

Mutaciones AChR

Durante la evolución de los genes que codifican el músculo AChR subunidad han sido altamente conservadas. Como siempre, la selección número considerable de pacientes potenciales CMS revela un sorprendente número de variantes poco comunes en la población humana. Las mutaciones de la CADH dar lugar a varias formas diferentes de CMS, que incluyen síndromes de deficiencia AChR, síndrome del canal lento y el síndrome de canal rápido Cuando ADNc que codifican las cuatro subunidades de AChR se introducen en células HEK 293 que expresan AChR ensamblados en el superficie celular. En patch clamp grabaciones electrofisiológicas de los canales individuales AChR las propiedades cinéticas de la AChR montada como se parecen a los observados in vivo de músculo humano biopsies. Análisis de las grabaciones de canales individuales revelará si una mutación prolonga duración de la ráfaga de canal, abrevia duración de la ráfaga, o no tiene ningún efecto. El uso de estas técnicas, un procedimiento estándar para el análisis de secuencia de AChR variantes es mutagénesis in vitro de la respectiva ADNc, la expresión del ADNc mutante en células HEK 293, seguida por la unión de [125I] α-bungarotoxina a la superficie de las células HEK 293. En raras ocasiones, las mutaciones que causan la deficiencia de AChR se encuentran en el, o subunidades, y estos pueden ser recogidos fácilmente en la superficie celular alfa-bungarotoxina experimentos de unión. Cómo siempre las subunidades alfa, beta y delta, pueden combinar en ausencia de la subunidad ε para generar alfa bungarotoxina superficie de unión, y por lo tanto si la mutación es en CHRNE (ε subunidad), los niveles de expresión de la mutante AChR puede ser determinada por inmunoprecipitación de la AChR- [125I] -bungarotoxina complejo con un anticuerpo específico de la subunidad AChRε, que sólo detectará pentámeros AChR que albergan la subunidad ε. Este ensayo ha demostrado ser eficaz en la determinación de si el mecanismo patogénico principal es debido a la deficiencia de AChR placa terminal. Las mutaciones en CHRNE causando defciencia AChR placa terminal son la causa más común de del síndrome masténico congénito. Sin embargo, los niveles de expresión en la superficie de la variante de AChR son comparables con el de tipo salvaje AChR, entonces variante de la subunidad puede ser no patógeno o tienen la cinética de los canales alterados, resultando potencialmente en cualquiera de un síndrome de canal lento o un

síndrome de canal rápido. Solo parche canal de análisis de la abrazadera de HEK 293 células expresó AChR está obligado a determinar ya sea activaciones de canal prolongados o acortados indicativos de canal respectivo lenta o síndromes canal rápido. En un informe reciente, se encontró que un paciente tiene mutaciones hetero allelo en CHRNE (p.εP282R y p.εF266del) mutado p.εP282R mostró reducida superficie AChR expresión en células HEK 293, mientras que, sorprendentemente, p.εF266del expresó así. Por lo tanto, es las propiedades de p.εF266del que determina el fenotipo del paciente. Cuando patch clamp de un solo canal se realizó en AChR acogida p.εF266del, la duración de la ráfaga de las activaciones de canal no difirió significativamente de la de tipo salvaje AChR. Como siempre, el análisis de las amplitudes de corriente a diferentes potenciales de mantenimiento demuestra que esta mutación causa una reducción del flujo de iones a través del canal, y por consiguiente, perjudicar la despolarización de la placa de extremo requerida para activar los canales de sodio dependientes de voltaje.

Por lo tanto, un nuevo mecanismo molecular ha sido identificado para alteración de la función del canal iónico AChR . Este mecanismo para la disfunción de los canales iónicos mucho tiempo se ha postulado pero ha tomado hasta ahora para identificar un caso. Las características fenotípicas de los pacientes con la conductancia del canal iónico reducido es probable que compartan algunas similitudes con el síndrome del canal rápido, en que tanto causar una pérdida de la función y requieren de una mutación en el segundo alelo para desenmascarar las propiedades con problemas del canal iónico causado por estas mutaciones.

Advenimiento de secuenciación de próxima generación

Las metodologías utilizadas para identificar el gen asociado con el síndrome miasténico congénito se han basado en el conocimiento de las moléculas clave que participan en la transmisión de la señal a través de la unión neuromuscular o que rigen la estructura sináptica para proporcionar genes candidatos para el cribado. alternativa, análisis de ligamiento, si las familias son adecuados disponible, se puede utilizar para definir las regiones genéticas que luego se pueden utilizar para el hogar en el más candidato genes. Estas metodologías han demostrado fructífera, pero aún quedan casos en los que las mutaciones aún no se han identificado. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación, ya sea la secuenciación del exoma o la secuenciación de todo el genoma, ofrece una oportunidad para identificar la causa genética de estos trastornos restantes. Estratificación del fenotipo es útil y se ha utilizado para identificar las mutaciones en DPAGT1.22 Sin embargo, con la masa de datos que se están recogidos en la secuenciación de muchos genomas humanos, es potencialmente posible identificar las mutaciones en un nuevo gen en un solo individuo. Es de notar que los dos genes más recientemente identificado asociados con CMS, GFPT122 y DPAGT1,23 son expresó doquier y por lo tanto no son candidatos obvios para las mutaciones que causan los trastornos de la unión neuromuscular.

El tratamiento de los síndromes miasténico congénito

Una razón principal de estudios funcionales de las mutaciones es establecer el mecanismo patogénico y proporcionar así una base racional para la terapia. Por ejemplo, en el síndrome de los canales lentos el objetivo sería para bloquear el exceso de cationes a través de la entrada de AChR en la placa terminal a través de fármacos que bloquean el canal cuando en el estado abierto, tales como fluoxetina; mientras que para un síndrome de canal rápido uno se destinaría a reforzar la señal postsináptica ya sea a través de medicamentos anticolinesterásicos o aumento la liberación de neurotransmisores a través de bloqueo de canales de voltaje cerrados de potasio con 3,4-diaminopiridina.

Como siempre, un avance clave en el tratamiento de la CMS en los últimos años ha sido el uso selectivo del receptor 2 adrenérgicos efedrina y salbutamol / albuterol. Después de la identificación de las mutaciones en DOK7 como causa de la CMS, 12 se hizo evidente que este conjunto de pacientes logra notable beneficio del tratamiento con efedrina o salbutamol. Es de destacar que el efecto no es inmediato, sino una mejora gradual se experimenta durante un período de meses hasta la meseta de efectos beneficiosos, por lo general entre seis meses y un año de initiation.24 Aunque los efectos de estos fármacos son probablemente más dramático en DOK7 CMS también hay varios informes de sus efectos beneficiosos en otros CMS, como los pacientes con mutaciones en COLQ28 o incluso algunos casos de deficiencia AChR .Al parecer, los 2-agonistas son probablemente proporcionar una compensación a través del segundo vías mensajeras para ayudar a aliviar la desestabilización de las estructuras de placa terminal causados por mutaciones de proteínas de placa terminal. Un reto para el futuro será el de comprender los detalles de exactamente cómo estos medicamentos tienen sus efectos en la región de rodete de músculo. Esto, a su vez, puede ayudar a punto de nuevos medicamentos y permitir una mayor optimización de los tratamientos para el síndrome miasténico congénito.

INTEGRANTES:

Jorge Juica Navea

Sebastián López Acosta

Tania Ledezma Maluenda

Nicolás Olivares Mondaca