Mutación de una cepa de la bacteria E. coli mediante la transformación de su material genético...
9
Click here to load reader
-
Upload
jorgito-luis-fernandez-dejesus -
Category
Documents
-
view
458 -
download
4
Transcript of Mutación de una cepa de la bacteria E. coli mediante la transformación de su material genético...
UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO
RECINTO UNIVERSITARIO DE MAYAGÜEZ
FACULTAD DE ARTES Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Mutación de una cepa de la bacteria E. coli mediante la transformación de su
material genético para que sea resistente a la ampicilina y fluorescente bajo la
exposición a luz ultravioleta inducida por el plásmido pGLO realizada en el
laboratorio de Genética del Departamento de Biología de la Universidad de
Puerto Rico - Recinto de Mayagüez
Puntuación
Obtenida
Presentación
Informe
Conclusión
Total
Jorge L. Fernández De Jesús
Isamar Flores Rodríguez
Stefanny Santana Rivera
BIOL3300-066L
Inst. Stephanie Cosme Reyes
7 de marzo de 2011
Mutación de una cepa de la bacteria E. coli mediante la transformación de su
material genético para que sea resistente a la ampicilina y fluorescente bajo la
exposición a luz ultravioleta inducida por el plásmido pGLO realizada en el
laboratorio de Genética del Departamento de Biología de la Universidad de
Puerto Rico - Recinto de Mayagüez
JORGE L. FERNÁNDEZ DE JESÚS
ISAMAR FLORES RODRÍGUEZ
STEFANNY SANTANA RIVERA
Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico,
P.O. Box 9000, Mayagüez, Puerto Rico, 00681-9000
Palabras Claves – Escherichia coli, ampicilina, PGlo, mutación, .
INTRODUCCIÓN
Para el año 1928, Frederick Griffith,
un bacteriólogo inglés, demostró el proceso
de transformación mientras buscaba una
vacuna contra la neumonía bacteriana.
Griffith descubrió que una cepa no-virulenta
de Steptococcus pneumoniae si se expone a
cepas virulentas matadas con calor se torna
también virulenta. Luego de éste y otros
experimentos, se definió un nuevo concepto
llamado transformación genética de bacterias,
un procedimiento mediante el cual se
introduce o se incorpora material genético a
una bacteria. Los genes forman el ADN y dan
las instrucciones de cómo sintetizar o
codificar proteínas, las cuales dan a un
organismo sus características específicas. La
transformación genética ocurre cuando una
célula incorpora dentro de ella y expresa un
nuevo pedazo de material genético o ADN.
Muchas veces, esta nueva información
genética provee al organismo una nueva
característica que es identificable tras la
transformación (Depto. De Biología -
Universidad Interamericana de P.R., 2011).
A través de este procedimiento han
surgido nuevos campos de estudio,
principalmente en el área de la biotecnología.
Por ejemplo, en la agricultura, genes que
codifican para características como la
resistencia a la descomposición, a la
congelación y a las enfermedades pueden ser
transformados genéticamente en las plantas
(Depto. De Biología - Universidad
Interamericana de P.R., 2011). En la
biorremediación, las bacterias pueden ser
genéticamente transformadas con genes que
les permitan digerir derrames de petróleo.
También, en la medicina, enfermedades
causadas por genes defectuosos están
comenzándose a tratar con terapia genética
transformando genéticamente la célula de una
persona enferma a una copia sana del gen
defectuoso que causa la enfermedad. Por otra
parte, los genes pueden ser sacados del
genoma humano, animal o vegetal y puestos
dentro de una bacteria. Un ejemplo para esto
es la producción de la hormona humana
insulina ahora por bacterias, cuyo producto es
purificado y vendido en las farmacias para el
tratamiento de la diabetes, ya que las
personas con esta enfermedad tienen genes
que no funcionan normalmente (Depto. De
Biología - Universidad Interamericana de
P.R., 2011).
Para mover los genes de un
organismo a otro se necesita la ayuda de
vectores. Los vectores más utilizados por
científicos se llaman plásmidos, aunque
también se puede utilizar los bacteriófagos,
los cósmidos y aun otros virus (Asamoah-
Baah, 2005). En esta investigación se le dará
énfasis al plásmido, ya que será el vector
utilizado. Los plásmidos son fragmentos
extracromosómicos de ácidos nucleicos y
poseen la capacidad de transferir linajes
filogenéticos distintos desarrollando
resistencia a antibióticos (Klug, 2010).
Las bacterias suelen tener
pedazos cromosomales circulares pequeños,
aparte de los grandes; esto es a lo que se le
denomina plásmido. El ADN del plásmido
usualmente contiene genes para una o muchas
características que pueden ser beneficiosas
para la sobrevivencia de la bacteria.
Mediante conjugación u otras formas de
intercambio genético, las bacterias pueden
transferirse plásmidos entre éstas, los cuales
les permiten adaptarse a cambios en su
entorno.
La bacteria E.coli sobrevive por
largos periodos de tiempo afuera de la célula
huésped. Esta bacteria crece fácilmente en el
laboratorio y por eso es muy utilizada en
investigaciones. Es la bacteria mas estudiada,
lleva 60 años de continua investigación, ya
que tiene gran importancia para los campos
de biotecnología y microbiología donde ha
servido como organismo huésped para
mejorar los trabajos con ADN recombinante
(Vogt et Dipold, 2005).
El PGlo es un plásmido usado en
biotecnología como vector y es utilizado
como marcador de seres modificados
genéticamente. Éste posee una estructura
circular en la que se expresan diversos genes
como la β-lactamasa que es resistente al
antibiótico ampicilina. Por otra parte, el PGlo
se usa como marcador por la proteína
fluorescente verde (GFP, por sus siglas en
inglés) y necesita un medio de cultivo que
contenga el azúcar arabinosa (Phillips, 2001).
La fluorescencia se puede observar al
exponerlo a luz ultravioleta.
Un operón es una unidad genética
que consiste de una o mas estructuras
genéticas que codifican para polipéptidos
(Klug, 2010). Hay dos clases de operones: el
inducible y represible. El operón inducible
está inactivado a menos que la célula necesite
un producto y una molécula represora está
unida a éste bloqueando la transcripción y
evitando la unión de la polimerasa ARN
dependiente de ADN con el productor,
aunque puede ser activado por medio de un
agente inductor que funciona como activador.
Éste es el que expresa la fluorescencia.
La síntesis de proteínas es el proceso
por el cual se componen nuevas proteínas a
partir de los veinte aminoácidos esenciales.
En este proceso, se transcribe el ADN en
ARN que luego es traducido a proteínas. La
síntesis de proteínas se realiza en los
ribosomas situados en el citoplasma celular.
En el proceso de síntesis, los aminoácidos son
transportados por ARN de transferencia
correspondiente para cada aminoácido hasta
el ARN mensajero donde se unen en la
posición adecuada para formar las nuevas
proteínas. Al finalizar la síntesis de una
proteína, se libera el ARN mensajero y puede
volver a ser leído, aun antes de que la síntesis
de una proteína termine, ya puede comenzar
la siguiente, entonces, el mismo ARN
mensajero puede utilizarse por varios
ribosomas al mismo tiempo (Klugs, 2010).
Esta investigación tiene como
objetivo utilizar el método de transformación
bacteriana para mutar una cepa de la bacteria
E.coli insertando el gen GFP por medio del
plásmido sintético PGlo que, en reacción con
arabinosa, provoca una fluorescencia color
verde. Los plásmidos PGlo contienen además
un gen de resistencia al antibiótico ampicilina
e incorporan un sistema especial de
regulación genética usado para el control de
la expresión de la proteína fluorescente en
células transformadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se comenzó el proceso colocando
cloruro de calcio (CaCl2) y el plásmido,
PGlo en hielo (en sus respectivos tubos).
Luego se tomó dos microtubos, uno
rotulado PGlo(+) y otro PGlo(-), y se les
añadió 250 μL de cloruro de calcio a cada
uno con la micropipeta. Después de
limpió el área para evitar contaminación
lo mejor posible, y además se utilizó
mechero para esterilizar las bocas de los
tubos de ensayo. Los microtubos se
colocaron en hielo y se tomó colonias de
un cultivo fresco de Escherichia coli con
una aguja de inoculación y se introdujo
las colonias a cada uno de los microtubos.
Al microtubo rotulado PGlo(+) se le
añadió 10 μL del plásmido PGlo y con la
aguja inocular se resuspendió la colonia
con movimientos suaves y circulares. Por
20 minutos se dejó en reposo. Entonces se
transfirió los microtubos a un baño de
maría para incubar a 42° C por 50
segundos. Enseguida que se terminó de
incubar, se colocaron los microtubos en
hielo y se dejó reposar por cinco minutos.
Lo próximo fue añadir 250 μL de caldo
de lisogenia (LB, por sus siglas en inglés)
a cada microtubo y luego se dejó reposar
por más de 20 minutos en una incubadora
a 37° C. Cuatro platos petri se rotularon
de la siguiente manera LB, LB + Amp(+),
LB + Amp(-) y LB + Amp + Arab: Amp
siendo ampicilina y arab, arabinosa. Del
microtubo PGlo(+) se tomó 200 μL y se
echaron al plato rotulado LB + Amp(+).
Con el microtubo de PGlo(-) y el plato
LB + Amp (-) se repitió el proceso. Y,
para finalizar, se selló los platos con
parafina y se colocaron en una incubadora
a 37° C hasta el próximo laboratorio.
RESULTADOS
El primer plato petri, que era el control
al contener LB sin ampicilina ni el
plásmido de resistencia a la ampicilina, la
población de colonias fue muy alta para
poder ser cuantificado sin la ayuda de
instrumentos especializados para el
conteo de colonias. Para el segundo plato
petri rotulado como LB + Amp(+), o sea,
con el plásmido insertado de resistencia a
ampicilina, la cantidad de colonias,
visiblemente, fue menor que el del plato
petri control, pero las colonias fueron más
grandes; tampoco pudieron ser
contabilizadas sin tecnología utilizada
con este fin. Se supone que para el tercer
plato petri sin el plásmido de resistencia a
la ampicilina insertado, o LB + Amp(-),
no haya habido crecimiento de población
pero sí la hubo y, de hecho, fue mucho
mayor a los dos platos petris anteriores,
aunque con colonias más pequeñas.
Finalmente, el cuarto plato petri, el cual
no sólo tenía el plásmido de resistencia a
la ampicilina sino que también el
monosacárido arabinosa, hubo
crecimiento de colonias de bacterias
menor que en los otros tres platos, pero
éstas eran las más grandes de todas.
Control LB + Amp (+) LB + Amp (-) LB + Amp (+) +
Arabinosa
Crecimiento de
colonias Sí Sí Sí Sí
Número de
colonias TMTC TMTC TMTC TMTC
Tamaño de las
colonias Pequeñas Grandes Muy pequeñas Muy grandes
Tabla 1. Aquí se muestra un resumen de los resultados: para todos los platos petris
hubo demasiado crecimiento de colonias de bacterias para ser contado y con tamaños
que variabas desde muy pequeñas hasta muy grandes.
DISCUSIÓN Para el grupo control hubo
crecimiento en las colonias de bacterias
porque no había ningún químico ni
alteración genética en éste que inhibiera
el aumento poblacional ni que causara la
muerte cuando se infectó con E. coli. En
el segundo plato petri, florecieron las
colonias de E. coli porque se les mutó
insertando el plásmido resistente a
ampicilina. Se supone que en el tercer
plato petri, con las bacterias sin el
plásmido resistente a ampicilina no hayan
crecido colonias, pero sí sucedió quizá
por una contaminación con saliva, mucha
exposición al aire, instrumentos no-
esterilizados suficientemente u otros
factores que pudieron haber dañado la
muestra. Por último, en el cuarto plato
petri, la bacteria se propagó debido a que
también fue mutada para ser resistente a
la ampicilina, y también mostró la
fluorescencia verde que se supone haya
expresado por habérsele tratado con
arabinosa, ya que este monosacárido
permite que esto suceda.
CONCLUSIÓN
En base a la investigación y el
trasfondo teórico, una cepa de bacteria
puede ser mutada mediante la
transformación de su material genético al
insertársele un plásmido como vector con
una característica que se desea se exprese
en ésta. Para este caso, la bacteria
utilizada fue E. coli y los rasgos que se
quería que se expresaran eran resistencia
a ampicilina y fluorescencia verde.
LITERATURA CITADA
Asamoah-Baah, A. (2005) “MANUAL
DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO”. Ginebra 27,
Suiza, Organización Mundial de la
Salud. Glosario. Web.
http://www.paho.org/spanish/ad/th
s/ev/LAB-Biosafety_OMS_spa.pdf. 29
febrero 2012.
Chaparro, A., Lopez, A. (2007) Propuesta
de un sistema de transformación de
plantas de papa (Solanum tuberosum
sp. andigena var. Pastusa suprema)
mediado por Agrobacterium
tumefaciens Agronomía Colombiana,
vol. 25, núm. 1, enero-junio,
2007, pp. 16-25 Universidad
Nacional de Colombia Bogotá,
Colombia. Web.
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/
html/1803/180316240003/1803162400
03_1.html. 29 Febrero 2012.
Phillips G (2001). "Green fluorescent
protein--a bright idea for the study of
bacterial protein localization".
FEMS Microbiol Lett 204 (1): 9–18.
29 Febrero 2012.
Universidad Interamericana de P.R.
(2011) “Transformación Bacteriana”
Web.
http://facultad.bayamon.inter.edu/
amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III
/TRANSF
ORMACI%C3%93N%20%20%2
0BACTERIANA.htm. 29 febrero de
2012.
Vogt RL, Dippold L (2005). "Escherichia
coli O157:H7 outbreak associated with
consumption of ground beef,
June–July 2002". Public Health Rep
120 (2): 174–8. 29 Febrero 2012.
William S. Klug, et. al. 2010 “Essentials
of Genetics”. San Francisco, Pearson
Education, Inc. Glossary. 29 Febrero
2012.
AGRADECIMIENTOS
Se le agradece a la instructora del
Laboratorio de Genética del Recinto
Universitario de Mayagüez, Stephanie
M. Cosme Reyes, por su
profesionalismo al ayudarnos a hacer este
experimento. Además, el mérito va al
personal encargado de brindar todos los
materiales requeridos y las guías
necesarias para poder realizar el mismo, y
a la coordinadora de los laboratorios, Sra.
Gladys Toro Labrador. Por último, se
reconoce la cooperación de todos los
compañeros del laboratorio de la Sección
066L por su colaboración y orden.
