NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COMO VEHÍCULO PARA …
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NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COMO VEHÍCULO PARA LIBERACIÓN CONTROLADA DE FÁRMACOS EN TERAPIA CONTRA EL CÁNCER DE PULMÓN Trabajo de grado en química Mary Luz Isaza Pierotti Asesor(a): Elizabeth Jiménez Díaz, Ph.D. Co Asesor: Juan Carlos Cruz Jiménez, Ph.D. Palabras clave: Nanopartículas, magnetita, cáncer de pulmón, doxorrubicina, liberación controlada de fármacos Grupo de Investigación en Bioquímica Aplicada Departamento de Química Facultad de Ciencias Universidad de Los Andes Mayo 2019
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NANOPARTÍCULAS DE MAGNETITA COMO VEHÍCULO PARA LIBERACIÓN CONTROLADA DE
FÁRMACOS EN TERAPIA CONTRA EL CÁNCER DE PULMÓN
Trabajo de grado en química
Mary Luz Isaza Pierotti
Asesor(a):
Elizabeth Jiménez Díaz, Ph.D.
Co Asesor:
Juan Carlos Cruz Jiménez, Ph.D.
Palabras clave: Nanopartículas, magnetita, cáncer de pulmón, doxorrubicina, liberación
controlada de fármacos
Grupo de Investigación en Bioquímica Aplicada
Departamento de Química
Facultad de Ciencias
Universidad de Los Andes
Mayo 2019
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todos quienes hicieron parte de este proceso, ya sea con su tiempo, trabajo,
conocimiento y/o apoyo. En especial quiero agradecer a los profesores Elizabeth Jiménez y a Juan Carlos
Cruz por su sustento incondicional. A los profesores Mario Macías, Andrés González, y Carolina Muñoz por
su colaboración. Al Departamento de Ingeniería Química y al Departamento de Ingeniería Biomédica por el
apoyo con equipos y materiales.
Adicionalmente, quiero agradecer a Carol Paola Melo, Javier Cifuentes, Juan Barbosa y Julián Serna por su
disposición incondicional. Finalmente, a Nathaly Rangel, Catherine Cabrera, Andrés Pérez, Claudia
Castellanos, Paola Ruiz, David Arango y Santiago Melo por toda su ayuda.
3
CONTENIDO
Pg. 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………................................................
4
2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………….............................................
3.1 Objetivo general
3.2 Objetivos específicos
12
3. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL…………………………………………................................................
3.1 Síntesis de nanopartículas de magnetita
3.2 Funcionalización de superficie
3.3 Inmovilización de Doxorrubicina
3.4 Inmovilización de la proteína OmpA
3.5 Caracterización
3.6 Evaluación de citotoxicidad
13
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS………………………………………………………………………………………………….
21
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS …………………………………………………………………………………….
40
6. CONSIDERACIONES ÉTICAS ………………………………………………….............................................
43
7. REFERENCIAS…………………………………………………………………………………………………………………. 44
4
1. INTRODUCCIÓN
Cada año, la Sociedad Americana de Cáncer (ACS) estima el número de casos nuevos y muertes esperadas,
asociados a esta enfermedad en los Estados Unidos. Para el 2019, se proyecta un estimado de 1.762.450
reportes de casos nuevos (más de 4.800 casos diarios diagnosticados) y 606.640 muertes (casi 1.700
diarias).1 El cáncer es un problema de salud pública mundial y la segunda causa de muerte en los Estados
Unidos.2 Los canceres de próstata, pulmones/bronquios y colorrectal representan el 42 % de los casos
reportados en hombres, mientras que en mujeres los de mayor incidencia son de mama, de pulmón y
colorrectal; en ambos casos, la mayor cantidad de muertes se debe a canceres de pulmón y bronquios,
equivalente casi a 1/4 del total (Fig. 1).1 La incidencia del cáncer a través del tiempo se relaciona con
cambios en prácticas médicas, tales como el uso de pruebas para detección de la enfermedad; la
supervivencia ha mejorado desde mediados de los años 70 para todos los tipos de cáncer más comunes.2,3
Este progreso se debe especialmente a mejoras en los protocolos de los tratamientos, incluyendo el
descubrimiento de terapias dirigidas además de la mejora en técnicas para la detección temprana.4,5
Figura 1. Predicciones de muertes de los diez tipos principales de cáncer por sexo en Estados Unidos para el 2019.1
El cáncer es una enfermedad compleja, caracterizada por una división celular descontrolada que incluye
una secuencia de interacciones genes-ambiente (epigenéticos) en un proceso progresivo; diferentes
cambios genéticos conllevan al proceso de carcinogénesis, donde las células normales se transforman en
malignas.6 Estos sucesos se desencadenan de una disfunción de múltiples sistemas, tales como la
reparación del ADN, funciones inmunes y apoptóticas.7 Por su parte, el cáncer de pulmón es una
enfermedad agresiva y heterogénea. Aun cuando se han logrado avances en abordajes quirúrgicos,
radioterapéuticos y quimioterapéuticos, la tasa de supervivencia a largo plazo sigue siendo baja.8 El cáncer
de pulmón causa más muertes que el cáncer de mama, colon y próstata juntos.1
5
Las causas de este tipo de cáncer pueden ser desde defectos genéticos innatos, hasta factores ambientales
y estilo de vida. De acuerdo con las características histológicas, el cáncer de pulmón se divide en dos grupos:
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC en inglés) y de células no pequeñas (NSCLC por sus siglas en
inglés).9 El NSCLC es dominante, representando el 85 % de todos los casos, y los subtipos más comunes son
el adenocarcinoma (de células epiteliales que recubren las vías aéreas periféricas), carcinoma de células
escamosas (células epiteliales de los bronquios) y carcinoma de células grandes (del tejido periférico de los
pulmones), entre otros.10
La alta tasa de mortalidad de esta enfermedad se debe principalmente al diagnóstico tardío, donde el 70
% de los casos son identificados en etapas avanzadas; esto se debe principalmente a la dificultad del
diagnóstico temprano, debido a que los síntomas iniciales son fácilmente confundidos con otras afecciones
respiratorias, además del alto costo de las pruebas y su carácter invasivo.9 Actualmente, los tratamientos
para el cáncer de pulmón incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia; el tratamiento recetado depende
tanto de la histología, como del estadío del tumor.9 Por ejemplo, en el NSCLC, la cirugía se recomienda en
pacientes con estadio I, II y IIIA, mientras que para estadios IIA, IIB y IIIA se hace necesario un tratamiento
post-quirúrgico, tal como la quimioterapia. En contraste, los pacientes con SCLC se tratan principalmente
con quimioterapia, debido a que existe una alta probabilidad de metástasis temprana; el SCLC es altamente
sensible a la quimioterapia durante el tratamiento inicial, sin embargo, la mayoría de los pacientes (~90%)
tienden a desarrollar quimioresistencia.9 Adicionalmente, la quimioterapia es prácticamente la única
opción para los pacientes con NSCLC metastásico, debido a que la mayoría mueren porque no pueden ser
tratados mediante procedimiento quirúrgico.1
En este orden de ideas, el único tratamiento curativo para el cáncer de pulmón es la cirugía radical, sin
embargo, el retraso en el diagnostico conlleva a un mal pronóstico. Con esto en mente, los tratamientos
estándares para estadios avanzados requieren terapias agresivas, tales como la quimioterapia citotóxica,
la cual incluye de cuatro a seis ciclos de terapia basada en platino (cisplatino/carboplatino), sumado a
terapias de mantenimiento para evitar la reincidencia.11 El objetivo de la quimioterapia es impedir el
crecimiento de células tumorales a través de la acción de sustancias químicas que inhiben la función celular.
Existen diferentes tipos de fármacos para atacar la función celular de varias maneras, incluida la
interrupción de la replicación y reparación del ADN, la interferencia con la expresión de proteínas y otros
mecanismos que pretenden detener o inhibir la división celular. Aun cuando la heterogeneidad clínica y
patológica del cáncer se reconoce hace ya un tiempo, el principal problema de las terapias contra esta
enfermedad sigue siendo el uso de fármacos citotóxicos inespecíficos (falta de selectividad), con efectividad
6
solo en algunos pacientes, causando una serie de efectos secundarios en la mayoría de los casos.12 Unas
de las principales causas de los problemas desencadenados de las terapias anticancerígenas, reside en la
inhabilidad de entregar los agentes terapéuticos únicamente en los sitios tumorales, sin inducir efectos
adversos en los tejidos y órganos sanos.13 Nace entonces un interés en terapias dirigidas para tratamientos
contra el cáncer: la administración selectiva de productos quimioterapéuticos a las células cancerosas.14
Desde su surgimiento a principios de los años 70, los sistemas de administración de medicamentos
controlados (CDDS por su siglas en inglés) han desafiado las terapias modernas;15 lograr un efecto
terapéutico maximizado y una minimización de los efectos secundarios fuera del objetivo requiere una
liberación restringida de la carga útil del fármaco a las células tumorales, o al menos a su entorno local.16,17
La estrategia de administración dirigida de fármacos (TDD en inglés) a los tejidos tumorales se basa en la
idea de que, a pesar de la similitud molecular general entre el cáncer y las células normales, queda
suficiente heterogeneidad celular para distinguir las células normales de las cancerosas.14 En este marco
de trabajo aparecen los sistemas inteligentes de micro y nano escala, capaces de maximizar la eficacia de
los tratamientos terapéuticos existentes, los cuales pueden ser diseñados para ser sensibles a su entorno
(estímulos); terapias hibridas prometedoras para el desarrollo de formulaciones avanzadas y
especializadas.16
Los nanovehículos brindan innumerables oportunidades en el área de administración de medicamentos
contra el cáncer: por ejemplo, ofrecen la posibilidad de atrapar fármacos poco solubles o inestables
(protegiéndolos de la degradación y entornos hostiles), adecuándolos para su administración, permitiendo
modificar su circulación sanguínea y distribución tisular (farmacocinética). Todo esto gracias a una mejor
permeabilidad del fármaco, lo cual a su vez mejora su acumulación y retención en tumores sólidos (efecto
conocido como permeación y retención mejorada - EPR por sus siglas en inglés).18–20 Por lo tanto, drogas
con potencial citotóxico altamente efectivo que aún no son aplicables o que fallan en pruebas de estadío
clínico (debido a su alta toxicidad sistémica o a la imposibilidad de atravesar barreras metabólicas), pueden
ser ahora transportadas en nanopartículas para su aplicación in vivo.21,22 De igual manera, los nanosistemas
presentan propiedades físicas y químicas únicas debido a su tamaño, confiriéndoles características de
biomimetismo (posicionándolas en el mismo rango de anticuerpos, receptores, ácidos nucleicos, proteínas
y otras macromoléculas biológicas),23 y presentando una relación superficie-volumen provechosa que les
permite superar significativamente la farmacocinética y la biodistribución no adaptada de las terapias
existentes.24,25 Para fines oncológicos esto se traduce en un nivel máximo (dosis alta) de antineoplásicos en
el tumor, con una vida media prolongada (y controlada), y un nivel minimizado en las partes sanas del
7
cuerpo, maximizando la eficacia del tratamiento. Además, existe la posibilidad de una coparticipación de
múltiples tipos de fármacos y/o agentes de diagnóstico (e.g. agentes de contraste) para una terapia de
combinación, que tiene el potencial de superar la resistencia a múltiples fármacos y permite la lectura en
tiempo real de la biodistribución del medicamento.13
En las últimas décadas se han desarrollado una gran variedad de TDD a escala nanométrica como sistemas
‘inteligentes’, los cuales permiten una liberación controlada, empleando sistemas sensibles a estímulos. La
respuesta a diferentes estímulos físicos ha sido evaluada en el marco del desarrollo (térmicos, electro o
electroquímicos, fotosensibles, magnéticos y ultrasonido),26–30 químicos (pH, iónico y redox)31–33 y
biológicos (enzimas, concentración de glucosa, inflamación).34–36 Luego de largos periodos de investigación,
se han establecido algunas pautas generales sobre las características de tamaño y superficie de las
nanopartículas, necesarias para lograr optimas aplicaciones anticancerígenas. Por ejemplo, es sabido que
nanopartículas con diámetro <100 nm son capaces de penetrar tumores a través de vasculatura (EPR); de
hecho, la neoangiogénesis rápida conduce a una vasculatura endotelial porosa lo suficientemente grande,
que permite el paso de las nanopartículas.20 Sin embargo, la administración efectiva de nano drogas no se
basa únicamente en el tamaño de las partículas; la funcionalización de superficie es un enfoque común que
permite reducir la adsorción de proteínas, mejorando la estabilidad y prolongando el tiempo de circulación
in vivo (e.g con PEG, PLA).37 De igual manera se encuentra establecido que los ligandos e superficie como
péptidos, anticuerpos, etc., permiten la dirección de los formulados a órganos específicos (Fig. 2).14,38,39
Figura 2. Resumen de exploración realizada en nanopartículas como terapia dirigida contra el cáncer e ilustraciones de
propiedades biofisicoquímicas13
8
Las nanopartículas (NP) inorgánicas tales como las de óxido de hierro, oro y plata han demostrado ser
biocompatibles, biológicamente inertes y estables, cualidades óptimas para la CDD.40,41 Las NP inorgánicas
se pueden definir como partículas de óxido metálico o composición metálica, las cuales se encuentran en
la escala nanométrica de tamaño.18 Estas comprenden una categoría muy importante en sistemas de
administración de fármacos debido a su amplia variedad, precisión en el control de tamaño/forma,
excelentes propiedades fisicoquímicas y multifuncionalidad, lo que les permite versatilidad para
formulación; sin embargo, la incapacidad para degradarse de algunas limita su aplicabilidad.13 De los
diferentes componentes posibles para la elaboración de NP inorgánicas como oro (Au), plata (Ag),
nanotubos de carbono, fullerenos, óxidos de manganeso (MnO2), lípidos, micelas, etc., el óxido de hierro
(Fe3O4/magnetita) ha sido ampliamente investigado para la fabricación de estas, debido a que poseen
carácter magnético, son de fácil síntesis, alta biocompatibilidad y biodegradabilidad.42 Avances recientes
en nanotecnología han mejorado la capacidad de adaptar las características y propiedades específicas de
las nanopartículas magnéticas (NPM) para diferentes aplicaciones biomédicas.43 Además, debido a que ya
existen formulaciones de NP de magnetita en el mercado – con aprobación por parte de la FDA para uso
en humanos en terapias para deficiencia de hierro y agentes de contraste para MRI – la extensión de
terapias similares presenta ventajas para la aprobación, en comparación con formulaciones de NP que
carecen de aceptación (con diferentes núcleos metálicos).44
Por su parte, el método de acumulación de NP en sitios tumorales usualmente se categoriza en dos clases:
orientación activa y pasiva. El mecanismo pasivo se basa en EPR, mencionado anteriormente, mientras que
el activo se logra al modificar las NP por unión de ligandos en superficie. Recientemente se demostró que
NP como las de óxido de hierro (Fe3O4) inducen micro espacios entre las células endoteliales (células que
forman las paredes interiores de los vasos sanguíneos).45,46 El mecanismo por el cual causan tales aberturas
se denominó permeabilidad endotelial inducida por nanopartículas (NanoEl), proceso que ocurre mucho
más rápido que la endocitosis o la difusión a través de las uniones celulares, explicando la facilidad con la
que se mueven estas partículas a través de tejidos vascularizados.47,48 Otra aplicabilidad reside en que las
NPM tienen el potencial de proporcionar un tratamiento en tiempo real que supervisa la administración
terapéutica del fármaco y la respuesta tisular; en la actualidad, la eficacia de un tratamiento de cáncer se
evalúa a través de ensayos ex vivo de biopsias, generando retrasos en el monitoreo que a su vez retrasan
posibles optimizaciones de los tratamientos (e.j. dosis).49 Adicionalmente, un modo de direccionamiento
único para NP de carácter magnético, es el uso de un campo magnético externo para llevarlas al sitio de
acción.50 Estudios se han realizado sobre la viabilidad de diferentes fármacos quimioterapéuticos contra el
cáncer en combinación con NPM, incluyendo temozolomida,51 doxorrubicina (Dox),52 paclitaxel,52 y 5-
9
fluoroacilo.53 Los resultados demuestran que la biocompatibilidad de las formulaciones de hierro son
dependientes del tipo de célula y de la química de superficie de las nanopartículas.16,54
El desarrollo exitoso de la doxorrubicina como un antibiótico antitumoral de amplio espectro fue el
resultado de una búsqueda sistemática de las especies químicas más efectivas, dentro de un grupo de
metabolitos microbianos biológicamente activos, específicamente los glucósidos de antraciclina.55 En su
forma inalterada, la doxorrubicina (Fig. 3) ha mostrado un gran potencial de tratamiento, siendo
considerada como una de las drogas quimioterapéuticas más potentes aprobadas por la Administración de
Alimentos y Medicamentos (FDA).56 El fármaco es una antraciclina de clase I no selectiva, la cual posee
restos aglicónicos y de azúcar. La aglicona en este caso está compuesta por un anillo tetracíclico, unida a
grupos adyacentes de quinina-hidroquinona, mientras que el componente de azúcar se une a uno de los
anillos por un enlace glucosídico. Esto se compone de un resto 3-amino-2,3,4-tridesoxi-L-fucosilo.57,58
A.
B.
Figura 3. Derivados de antraciclinas: A. Doxorrubicina. B. Epirrubicina
Dentro del grupo de antraciclinas, las más utilizadas en tumores sólidos son la doxorrubicina y la
epirrubicina (Fig. 3). Estos medicamentos han demostrado ser activos en diferentes tipos de cáncer: cáncer
de mama, linfomas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer
gástrico.59 Específicamente, la Dox se utilizó en gran medida en las décadas de los 70’s y 80’s en NSCLC,
presentando una tasa de respuesta (RR en inglés) del 15 %.60 A finales de la década de los 80’s los fármacos
como cisplatino, mitomicina C, ifosfamida, vindesina y vinblastina que demostraban una actividad
antitumoral ≥15 % eran considerados de referencia en quimioterapia para el NSCLC. Sin embargo, en la
actualidad, terapias combinadas de paclitaxel/cisplatino o paclitaxel ligado a albúmina (nab-paclitaxel),
entre otros, han demostrado una tasa de respuesta inclusive del 68 %, superando a la Dox.61 Así, el bajo
nivel de actividad, junto con su potencial de cardiotoxicidad (principal efecto secundario), contribuyen a
determinar un papel marginal del tratamiento de NSCLC con Dox.62
10
La Dox ingresa a la célula por difusión pasiva, y tiene la capacidad de penetrar los tejidos de manera
altamente efectiva, mientras que su capacidad para permanecer dentro de las células nucleadas se debe a
sus características lipofílicas y a las propiedades de unión/intercalación del ADN. La Dox actúa uniéndose a
las enzimas asociadas al ADN, pudiendo intercalar los pares de bases de la doble hélice del ADN.58 Al unirse
a enzimas topoisomerasas I y II, se producen una serie de efectos citotóxicos, fomentando la
antiproliferación y dando como resultado daños en el ADN.63 La vía de apoptosis se activa cuando el intento
de reparar las interrupciones en el ADN falla y el crecimiento celular se inhibe en las fases G1 y G2 del ciclo
celular. También se sabe que la doxorrubicina se intercala en el ADN, con inhibición tanto del ADN como
de la ARN polimerasa, lo que finalmente detiene la replicación del ADN y la transcripción del ARN.58 Sin
embargo, como se mencionó anteriormente, los principales efectos secundarios de las drogas de
antraciclina son los efectos citotóxicos multidireccionales, siendo la cardiotoxicidad la más prominente. Con
el fin de reducir su toxicidad sistémica y efectos secundarios, este fármaco se estudia para ser utilizado en
un sistema de vehículo de fármaco que pueda activarse bajo determinados estímulos.
Por su parte, la proteína de membrana externa A (OmpA) es una proteína abundante de Escherichia coli y
otras enterobacterias con un gran número de funciones.64 Su estructura se caracteriza por un dominio N-
terminal que forma un barril β anti-paralelo de ocho cadenas, el cual se encuentra incrustado en la
membrana externa. Se sabe que los cuatro loops extracelulares de la OmpA (Fig. 4) interactúan con una
variedad de tejidos del huésped para la adhesión, invasión y evasión de los mecanismos de defensa.65 Esto
se basa en el conocimiento de que las proteínas de membrana externa (OMP) y las lipoproteínas de las
bacterias Gram negativas, cumplen un papel importante en la adaptación de los microorganismos a
diversos ambientes externos.66 La mayoría de las OMP se encuentran expuestas a la superficie y, por lo
tanto, son potencialmente importantes en la interacción de las bacterias con el huésped mamífero y sus
defensas, bacteriófagos y otras bacterias o microorganismos.67
11
Figura 4. Proteína de membrana externa A de E. coli K12 68
Se ha demostrado que las proteínas séricas y los anticuerpos normales pueden unirse a OmpA y sus
homólogos y pueden potenciar la resistencia sérica de varias especies bacterianas, como E. coli patógena.69
En otras palabras, la OmpA y sus homólogos pueden ayudar a las bacterias a evadir las defensas del
huésped. Además, estas proteínas son altamente inmunogénicas y en muchos casos sirven como objetivos
del sistema inmune innato que resulta en efectos bactericidas mejorados y eliminación bacteriana.69 Varios
homólogos de la OmpA también sirven como objetivos para la respuesta inmune innata y adaptativa del
huésped, lo que da como resultado una mayor resistencia de este frente a la infección. Sin embargo, un
desafío que se presenta en la entrega de fármacos con NP es la forma en la que estas especies se absorben
por las células; si los fármacos permanecen localizados en un compartimento endosomal o lisosómico, el
agente terapéutico puede perder su eficacia.70 En este orden de ideas, se pretende emplear la OmpA con
el fin de facilitar la traslocación de membranas y evitar formación de endosomas en las terapias.71
El objetivo principal de este proyecto consiste en la síntesis de nanopartículas de magnetita,
funcionalizadas en superficie con la proteína OmpA como vehículo para el ingreso a las células, en co-
formulación con el quimioterapéutico Doxorrubicina (co-inmovilizado superficie), para tratamiento in vitro
contra el cáncer de pulmón. Esta formulación pretende ser un nanovehículo que transporte el fármaco
para el tratamiento de cáncer de pulmón, permitiendo aumentar la citotoxicidad en comparación con el
medicamento solo, la cual se evaluará por ensayos de viabilidad celular de la línea A549.
12
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
Sintetizar nanopartículas de magnetita funcionalizadas en superficie con Doxorrubicina, unida por medio
de un linker sensible a ambientes reductores, en co-formulación con la proteína OmpA, para la evaluación
de citotoxicidad en la línea celular de cáncer de pulmón A549.
2.2 Objetivos específicos
• Sintetizar de nanopartículas de magnetita con tamaño aproximado de 100 nm
• Inmovilizar el fármaco quimioterapéutico Doxorrubicina en la superficie de las nanopartículas,
unido por medio de un linker sensible a ambientes reductores
• Inmovilizar la proteína OmpA (proteína de membrana externa A de E. coli K12) en la superficie de
las nanopartículas
• Evaluar la citotoxicidad de las nanopartículas funcionalizadas sobre la línea celular cáncer de
pulmón A549
13
3. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Los equipos empleados durante la experimentación fueron: baño ultrasonido Cole-Parmer 8891, wáter
purification system Direct-Q® 3UV para la obtención de agua ultrapura tipo II, horno de secado
Lindberg/Blue M Laboratory Gravity Convection Oven – Artisan, incubadora de CO2 Series 8000 DH – Thermo
Scientific. Adicionalmente, para la caracterización se emplearon los equipos Alpha FT-IR Spectrometer from
Bruker para espectroscopía infrarrojo, Horiba Scientific XploRA One para espectros de Raman, Empyrean
multipurpose diffractometer - Malvern Panalytical para los análisis de rayos X, TESCAN Lyra3 en análisis
SEM-EDS, TGA 55 – TA Instruments para análisis termogravimétrico y Multiskan Sky – Thermo Scientific para
espectros de absorción UV-Vis.
3.1 Síntesis de nanopartículas de magnetita
Existen diversos métodos de preparación de nanopartículas de magnetita, tales como co-precipitación
química,72 síntesis electroquímica,73 síntesis asistida por microondas y/o ultrasonido,74 técnica
hidrotérmica,75 coprecipitación invertida76 y descomposición térmica,77 entre otros. Sin embargo, el
método de síntesis de co-precipitación es ampliamente utilizado tanto en la investigación, como para fines
comerciales debido a su simplicidad y bajo costo.72
En este caso el protocolo de síntesis de las nanopartículas de magnetita se basa en un procedimiento de
co-precipitación. Este método consiste en la preparación de soluciones de Fe3+ y Fe2+ y en la posterior
adición de una solución básica (NaOH), dando paso a la cristalización del producto (Eq. 1).78
Fe2++ 2Fe3+ + 8OH- → Fe3O4 + 4H2O (1)
En un balón de dos bocas se disolvieron 12 mmol de FeCl3∙6H2O en agua tipo 1. Posteriormente, se
adicionaron 6 mmol g de FeCl2∙4H2O a la solución de Fe (III) previamente preparada, agitando hasta disolver
completamente todos los cristales. La solución obtenida se purgó 3x con vacío/nitrógeno y luego se
mantuvo en atmosfera inerte de N2, en agitación constante (150 rpm) y a temperatura ambiente. A
continuación, se preparó una solución básica de 0.08 mol de NaOH en agua tipo 1. Se procedió a adicionar
la solución básica sobre la solución de Fe(II)/Fe(III), inyectándola con una aguja de plástico a una velocidad
aproximada de 3 mL/min, observando la formación de un precipitado negro. Al completar la adición de
NaOH, se dejó la solución en agitación constante durante 3 horas adicionales (150 rpm). Finalizado el
tiempo de agitación se decantaron las nanopartículas magnéticas por acción de un imán externo,
14
permitiendo realizar lavados con agua tipo II. Por último, las nanopartículas fueron secadas en un horno de
80 °C durante 24 h para su posterior caracterización.
Para la síntesis de las nanopartículas se realizaron modificaciones de algunos parámetros como la
atmosfera y la velocidad de adición de la solución básica, con el fin de optimizar el protocolo, encontrando
la combinación de parámetros que permitiera obtener resultados óptimos para nanopartículas de 100 nm
con alto grado de pureza.
3.2 Funcionalización de superficie
El esquema de hidroxilación por adición de hidróxido de tetrametilamonio (TMAH) y la posterior
silanización con 3-aminopropiltrietoxilano (APTES) se observa en el Esq. 1.
Esquema 1. Hidroxilación y silanización de las nanopartículas de magnetita
Se preparó una solución de 2 mg/mL de nanopartículas previamente secadas, en agua tipo II. La solución
fue llevada a baño ultrasonido durante 5 horas, para luego adicionar TMAH 25 % a una concentración final
de 0.2 M. El pH se ajustó a 4.1 por adición de ácido acético glacial y se llevó a sonicar durante 5 min
adicionales. Posteriormente, se adicionó APTES 99 % a una concentración final de 8.5 mM y se llevó a baño
ultrasonido durante 30 min. Finalmente, se realizaron 5 lavados con una solución agua/etanol 5 % y se
secaron a 80 °C durante 24 h para su posterior caracterización
3.3 Inmovilización de Doxorrubicina
En primer lugar, se preparó una solución de NPM de 2 mg/mL y se llevó a baño ultrasonido durante 30 min.
Luego, se adicionó glutaraldehído 25 % a una concentración final de 26.8 mM, dejándolo reaccionar
durante 1 hora, sin agitación y a oscuras (Esq. 2). Para retirar el exceso de glutaraldehído sin reaccionar se
hicieron 5x lavados con agua ultrapura. A continuación, se agregó el linker ácido 3-[(2-
aminoetil)ditio]propiónico (AEDP) a una concentración final de 2.2 mM, con el fin de que se inmovilizara
APTES
15
sobre el 75 % del glutaraldehído adicionado (Esq. 3). Esta reacción se agitó a 150 rpm y 25 °C un overnight.
Finalizada la reacción se realizaron 5x lavados con agua ultrapura, secando las nanopartículas en horno a
80 °C durante 24 h.
Esquema 2. Adición de glutaraldehído
Esquema 3. Adición de linker AEDP
Para la inmovilización de la Dox, se preparó nuevamente una solución de 2 mg/mL de las NPM
funcionalizadas, en agua ultrapura y luego se les añadió hidrocloruro de 1-etil-3-(3-
dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC∙HCl) 0.1 M y N-hidrosuccinimida (NHS) 5 mM. Se agitó manualmente
la solución hasta disolver por completo los compuestos. Posteriormente se añadió Dox a la solución, a una
concentración final de 19 mM y se dejó reaccionar un overnight a 37 °C y 180 rpm (Esq. 4). Finalmente, se
retiró el sobrenadante para su análisis, y se procedió a realizar 5x lavados con agua ultrapura, decantando
las NPM con ayuda de un imán externo. Las NPM con Dox fueron secadas en horno a 80 °C durante 24 h.
Esquema 4. Adición de Doxorrubicina
Glutaraldehído
AEDP
Doxorrubicina
16
3.4 Inmovilización de la proteína OmpA
La OmpA empleada fue amablemente donada por el Departamento de Ingeniería Química en conjunto con
el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de los Andes, la cual se obtiene cultivando una
cepa de E. coli modificada genéticamente, que posteriormente se lleva a un biorreactor, se filtra, se purifica
por columna de niquel (II) y se liofiliza, obteniendo el sólido empleado.
Esquema 5. Adición de la proteína OmpA
Para la inmovilización de la OmpA, las nanopartículas funcionalizadas con Dox se resuspendieron en PBS a
una concentración de 2 mg/mL, y posteriormente se llevaron a baño ultrasonido durante 30 min.
Transcurrido este tiempo se adicionó OmpA a ¼ de los equivalentes de glutaraldehído, es decir, a una
concentración final 0.02 mM (Esq. 5). La reacción se llevó a cabo durante un overnight a 180 rpm y 37 °C.
Finalizado el tiempo se realizaron lavados con PBS 5x.
3.5 Caracterización
La caracterización de la síntesis de las NP se realizó por medio de difracción de rayos X de polvos (DRX),
dispersión de rayos X de bajo ángulo (SAXS), espectro infrarrojo de reflectancia total atenuada (ATR-FTIR),
microscopía de barrido electrónico con detector de rayos X (SEM-EDS) y espectroscopía Raman.
El DRX es una técnica que permite identificar el sistema cristalino de un material, a través de la incidencia
de una muestra (polvo) con rayos X, analizando su patrón de difracción.79 Es capaz de ofrecer información
sobre los parámetros de red del material analizado; esta es una técnica bastante útil para materiales como
la magnetita, debido a que existen grandes bases de datos con difractogramas reportados para el mismo
material, los cuales sirven de referencia para la caracterización. Por otra parte, el SAXS es similar al DRX en
cuanto a que la fuente incidente es de rayos X, sin embargo, en este caso la muestra es incidida en ángulos
muy pequeños (típicamente 0.1 – 10 °).79 Con esta técnica se puede caracterizar, por ejemplo, la
OmpA
17
distribución de tamaño de materiales nanométricos. Por su parte, la ATR-FTIR es una técnica de
caracterización basada en la espectroscopía infrarrojo, donde el rayo infrarrojo incidente se refleja
internamente múltiples veces, puesto que el cristal que está en contacto con la muestra presenta un al alto
índice de refracción.80 A diferencia del infrarrojo tradicional, en esta técnica, el recorrido corto del rayo
hasta la muestra permite evitar la atenuación de las señales, permitiendo obtener una baja relación
señal/ruido. El Raman es una técnica espectroscópica basada en la dispersión inelástica del rayo incidente.
En esta técnica, la aparición de bandas depende en gran medida de la polarizabilidad de las moléculas; se
considera una técnica complementaria a la espectroscopía infrarrojo, debido a que, a diferencia de la
primera, en la segunda se depende principalmente del momento dipolar de las moléculas.80 Esta diferencia
permite que cada técnica sea más sensible que la otra a ciertos tipos de enlaces; en conjunto, ambas
técnicas ofrecen una caracterización más completa. Finalmente, el SEM es una técnica de microscopía
electrónica que produce imágenes al escanear una superficie con un haz de electrones enfocados. En este
tipo de caracterizaciones se puede obtener información sobre la topografía de superficie y en conjunto con
un detector EDS se puede detectar en escalas micro y nano la composición elemental de la superficie de la
muestra analizada.81
En cuanto a la silanización, se realizó una caracterización por medio de espectroscopía ATR-FTIR, Raman,
SEM-EDS, y termogravimetría (TGA), con una rampa de 10 °C/min en un rango de 25-700 °C, atmósfera
inerte (N2) con un flujo de 100 mL/min. La termogravimetría es un método de análisis térmico en el cual la
masa de una muestra es medida a través del tiempo, conforme cambios de temperatura ocurren en un
ambiente controlado. Esta técnica permite obtener información sobre fenómenos físicos que ocurren en
la muestra, tales como transiciones de fase, absorción, adsorción y desorción, dados por la estabilidad
térmica de los componentes de un material.82
La funcionalización de superficie con glutaraldehído y AEDP fue caracterizada por espectroscopía ATR-FTIR,
Raman y SEM-EDS. Para la inmovilización de la Dox, se realizó una caracterización por medio de espectro
de absorción del sobrenadante (análisis indirecto), luego de la inmovilización. Finalmente, luego de la
inmovilización de la proteína, se realizó un ensayo de cuantificación de proteína utilizando el ácido
bicinconínico (o BCA por sus siglas en inglés, análisis indirecto).
18
3.6 Evaluación de citotoxicidad
Para los ensayos de citotoxicidad in vitro se planteó emplear células de la línea A549, correspondientes a
células epiteliales humanas de tipo adherente, provenientes de carcinoma alveolar – de pulmón (Fig. 5),
aisladas en 1972 de un hombre caucásico de 58 años. Estas células se cultivan en medio Dulbecco’s
Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con de suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina-
estreptomicina a 37°C, en atmósfera de CO2 al 5% y tienen un tiempo de doblado estimado de 22 h. Esta
línea celular ha sido pilar para investigación respiratoria, durante más de 40 años, dentro de lo que se
incluyen ensayos in vitro de cáncer y la generación de modelos de tejido epitelial de pulmón distal.
Figura 5. Células A549 de baja densidad (izq.) y alta densidad (der.)83
Para las pruebas de viabilidad celular, inicialmente se planteó encontrar el EC50 de la línea celular con
doxorrubicina, la cual se encuentra reportada en 0.42 ± 0.06 μM.84 Para lograr esto, se realizaron en
paralelo un ensayo MTT y un ensayo LDH, con el fin de contrarrestar los resultados. En ambos casos, en
platos de 96 pozos se sembraron 100 μL de células en medio (DMEM), a densidad celular de 10.000 células
por pozo, las cuales se incubaron durante 24 horas, permitiendo su adhesión al plato. Adicionalmente se
sembraron pozos de control positivo (sin tratamiento) y de medio (blanco), por triplicado. Transcurridas las
24 horas se realizó la adición de 100 μL de Dox en concentraciones entre 0.1 – 1.0 μM, por triplicado, y se
dejaron incubando con el tratamiento durante 72 horas; al control positivo y al blanco se les adicionaron
100 μL adicionales de medio.
Para el ensayo MTT, transcurridas las 72 horas de exposición al tratamiento, se procedió a adicionar 25 μL
de MTT 1 mg/mL en cada pozo, y se incubó el plato durante 3 horas a 37 °C. Posteriormente se centrifugó
19
el plato a 2000 rpm durante 10 min, y se eliminó por completo el sobrenadante en cada pozo. A
continuación, se adicionaron 500 μL de DMSO en cada pozo y se incubó el plato 10 min/37 °C. Finalmente,
se realizó la lectura del ensayo a 562 nm.
Ahora bien, para el ensayo de LDH se realizó el mismo procedimiento general, hasta la adición del
tratamiento (Dox) a diferentes concentraciones. En este caso se pretendió optimizar la cuantificación de
LDH para la línea celular, sin el uso de kits comerciales, con el fin de superar sus respectivas desventajas.
La preparación de los reactivos y el protocolo seguido se realizó en dos etapas. Inicialmente según lo
reportado en un estudio con células neuronales (C6) y posteriormente de acuerdo a un protocolo de Cold
Spring Harbor (2018).85,86 Cabe resaltar que para el ensayo LDH se sembraron 6 réplicas y no por triplicado,
con el fin de tener un volumen suficiente de sobrenadante para realizar una optimización del tiempo de
incubación.
El primer acercamiento del LDH consistió en preparar 3 soluciones principales: Buffer A (4 mM cloruro de
yodonitrotetrazolio - INT, en una solución 0.2 M Tris-HCl, pH 8.2), Buffer B (6.4 mM nicotinamida adenina
dinucleótido - NAD, 320 mM L-lactato de sodio, en una solución 0.2 M Tris-HCl, pH 8.2) y un suplemento
MPMS (150 mM metosulfato de 1-metoxifenacina – MPMS, en solución 0.2 M Tris-HCl, pH 8.2).85 El
protocolo entonces consistió en remover 50 μL de cada pozo y transferirlos a un nuevo plato de 96 pozos.
Luego, se preparó lo que se llamó la solución de ensayo, mezclando volúmenes iguales del Buffer A y B, y
suplemento MPMS 0.01 mM, obteniendo una solución color rosado pálido; esta solución se preparó fresca
para cada ensayo realizado. Rápidamente se adicionaron 50 μL de la solución de ensayo en cada pozo,
asegurando homogeneidad. Acto seguido, el plato se incubó durante un determinado tiempo (60, 120 y
180 min) a temperatura ambiente y transcurrido el respectivo tiempo del ensayo se adicionaron 50 μL de
una solución 1 M de ácido acético a cada pozo, con el fin de detener la reacción y estabilizar el producto.
La lectura del plato se realizó a 490 nm.
Con la densidad celular objetivo establecida, se procedió a realizar el ensayo de citotoxicidad. Para eso se
siguió el protocolo mencionado anteriormente (100 μL con 10 000 células por pozo, 24 h para adhesión,
adición de Dox concentraciones 0.1 – 1.0 μM por triplicado durante 72 h). Cumplido el tiempo del
tratamiento, se centrifugó el plato (250 g/4 min) y se transfirió una alícuota de 50 μL del sobrenadante de
cada réplica a un plato de 96 pozos nuevo. Posteriormente se adicionaron 50 μL de la solución de ensayo a
cada pozo y se incubó el plato durante 30 min/37 °C, cubierto con aluminio. Finalizado este tiempo se
adicionaron 100 μL de solución de parado y se dejó reaccionar durante 1 hora, tiempo tras el cual se midió
20
la absorbancia a 490 y 690 nm. Como control positivo se sembraron 3 pozos con 100 μL (10.000
células/pozo) y en vez de los 100 μL de tratamiento, se sembraron 100 μL de DMEM.
Posteriormente, para la realización del ensayo con el constructo sintetizado, se realizó el mismo protocolo
mencionado anteriormente, pero ahora solo se sembró como tratamiento (por triplicado): la concentración
de Dox EC50 (control positivo), las NPM con Dox, y un control negativo de magnetita con inmovilización de
Dox sin linker y sin OmpA. Para los tratamientos con NPM funcionalizadas, el plato se somete a un campo
magnético externo (imán de neodimio comercial), para facilitar el ingreso a las células.
Desafortunadamente, la realización varios de los pasos mencionados en el protocolo anteriormente
descrito no fueron posibles, debido a una contaminación de la línea celular (Fig. 6-8).
Figura 6. Línea celular A549
confluente y sana
Figura 7. A549 con células adheridas
y contaminación desconocida
Figura 8. Pozo de plato de 96 con
contaminación desconocida
21
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS
La magnetita (Fe3O4) es un óxido de hierro II y III que cristaliza en forma de espinela inversa, donde los iones
de oxígeno forman una celda cúbica centrada en las caras, y la mitad de los átomos de Fe3+ ocupan los
espacios tetraédricos, mientras la segunda mitad de Fe3+ y lo átomos de Fe2+ ocupan los espacios
octaédricos, dando paso a la formula Fe2+Fe23+O2-
4.87 En ambientes con pH mayor a 8 y atmósfera inerte, se
favorece la hidroxilación de los iones de Fe2+ y Fe3+; los hidróxidos férricos y ferrosos precipitan
rápidamente (Eq. 2 y 4). Posteriormente, el hidróxido férrico se descompone por la pérdida de agua,
convirtiéndose en oxihidróxido de Fe (III) (Eq. 3), para luego dar paso a una reacción en estado sólido entre
el FeOOH y el Fe(OH)2 en los primeros 30 min de reacción, dando como resultado la magnetita en solución
acuosa (Eq. 5).78,88
2 Fe3+ + 3 OH- → Fe(OH)3 (2)
Fe(OH)3 → FeOOH + H2O (3)
Fe2+ + 2 OH- → Fe(OH)2 (4)
2 FeOOH + Fe(OH)2 → Fe3O4 + 2 H2O (5)
En este caso, la base empleada para la síntesis fue el hidróxido de sodio (NaOH), debido a que según han
evidenciado hallazgos, la mayor pureza del producto se obtiene con el catión Na+ (impurezas < 2 % wt).89
De igual manera, los tamaños reportados para la síntesis de magnetita con NaOH concuerdan con los
esperados, según los objetivos planteados en este trabajo (~11 nm). Adicionalmente, la síntesis a
temperatura ambiente permite tener buenos resultados en una ventana más amplia de pH, lo que permite
versatilidad para trabajar.89
Ahora bien, la primera variación que se realizó del protocolo fue la síntesis en atmósfera inerte (N2) vs.
únicamente realizando vacío. Las dos muestras fueron analizadas por SAXS, con un patrón de TiO2 (radio
promedio de 44.8 ± 2.0 Å), permitiendo evidenciar que el tamaño de cristal variaba sustancialmente. Se
encontró que el radio promedio de la muestra sintetizada en vacío fue de 121.1 nm, mientras que para la
muestra sintetizada en atmósfera inerte el radio promedio fue de 70.5 nm. Esto concuerda con lo reportado
en literatura, donde se reconoce que la síntesis con gas inerte, además de evitar la oxidación de las
nanopartículas a γ-Fe2O3 (maghemita), permite la obtención de cristales de menor tamaño y uniformes.90,91
La caracterización por DRX de polvo de los cristales obtenidos por síntesis en atmósfera inerte se observa
a continuación (Fig. 9). Los resultados experimentales se compararon con patrones de difracción estándar
22
de magnetita, donde se encuentran los planos (111), (220), (311), (400), (422), (511), (440) y (533), con sus
respectivas intensidades relativas, similares a las reportadas, siendo el (311) el plano de mayor
intensidad.88,89,92,93 Esto demuestra que la muestra tiene estructura de espinela inversa, con una fase cubica
centrada en las caras (Fd-3m). Adicionalmente, se realizó un refinamiento de Rietveld, donde fue posible
comprobar la isotropía de los cristales. A partir del análisis, fue posible identificar la muestra como
magnetita, con impurezas menores al 1 %. En caso de existir contaminantes, como por ejemplo γ-Fe2O3, se
observarían sus respectivos picos característicos en (110), (210) y (211) con intensidades mayores a la del
plano (111).
2
Inte
ns
ida
d R
ela
tiv
a
0 2 0 4 0 6 0 8 0
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
Figura 9. Patrón de difracción de rayos X de magnetita sintetizada en atmósfera inerte
Adicionalmente, se realizó una caracterización por medio de SEM-EDS (Fig. 10), que permite evidenciar las
nanopartículas aglomeradas, con geometría esférica y con composición de hierro 30 % abundancia atómica
y oxígeno 70 %; esto concuerda en alta medida con los valores esperados en porcentajes, para la magnetita
equivalentes a 27.6 y 72.3 %. Cabe resaltar que el EDS detecta rayos X característicos de cada elemento,
dentro de un espectro de energía; es decir, este detector no es capaz de diferenciar entre estados de
oxidación de un mismo elemento. Con los resultados anteriores, sumados al carácter magnético de las
(111)
(220)
(311)
(400)
(422)
(511)
(440)
(533)
23
nanopartículas (comprobado al acercarles un imán), además de su apariencia (cristales negros), fue posible
confirmar la obtención del producto deseado (Fe3O4).
Figura 10. Imagen de microscopia electrónica de barrido SEM y espectrometría de dispersión de rayos X EDS de
muestra de nanopartículas sintetizadas en atmosfera inerte
En este caso, de acuerdo con la imagen obtenida por SEM, se detectaron nanopartículas con tamaños
aproximados de 15 nm; esto difiere con los resultados obtenidos por SAXS previamente. Por su parte, SAXS
ofrece información sobre el tamaño de partícula en términos de un promedio de volumen, ajustado a un
modelo probabilístico. En contraste, en SEM de nanopartículas cristalinas, los límites de grano son visibles,
por lo cual es posible determinar el tamaño del grano, a veces llamado cristalito. Aunque existen casos
donde una partícula puede estar compuesta por un único grano, esto es especialmente difícil en materiales
nano, los cuales tienden a aglomerarse, especialmente en materiales con carácter magnético.94
Por otro lado, la segunda modificación que se realizó al protocolo de síntesis fue la variación de la velocidad
de adición. De acuerdo a la revisión de literatura, bajo la misma relación estequiométrica, una velocidad de
adición de la base a 6 mL/min ofrecía un mayor porcentaje en peso del producto (magnetita),
adicionalmente a un menor tamaño de partícula.89 Esto se debe a que una adición “rápida” favorece una
nucleación continua, permitiendo que se formen nanopartículas de menor tamaño. Por lo tanto, se decidió
realizar la síntesis previa en dos modalidades, una de rápida adición de base (6 mL/min) y una lenta (3
mL/min). En la Fig. 11 se evidencia el resultado de la suspensión de nanopartículas para la síntesis en ambos
casos; izquierda adición rápida, derecha lenta. En este caso la solución de adición 6 mL/min presentó una
tonalidad marrón, mientras que la de 3 mL/min era de tonalidades negras. Al realizar una nueva revisión
de literatura se encontró que una adición rápida, además de lo mencionado anteriormente, también
24
favorecía en gran medida a la formación de maghemita, lo cual podría explicar el color marrón de la
solución.89
Figura 11. Síntesis de nanopartículas con velocidad de adición de base: 6 mL/min (izq.) y 3 mL/min (der.)
La maghemita (γ-Fe2O3) es también un óxido de hierro al igual que la magnetita, una de las fases cristalinas
del óxido de hierro (III), que cristaliza en espinela cúbica; se considera como una magnetita deficiente de
Fe (II) en las posiciones octaédricas. Es un material ferrimagnético y estable a temperatura ambiente, que
también es biocompatible.95 Por lo tanto, la presencia de este material en bajas proporciones no genera
contraindicaciones en la formulación propuesta; sin embargo, con el fin de cumplir los objetivos específicos,
se estableció la síntesis con una adición de base a 3 mL/min.
Finalmente, se realizó una caracterización de las nanopartículas sintetizadas en atmósfera inerte, con
velocidad de adición de base de 3 mL/min por medio de ATR-FTIR (Fig. 12) y espectroscopía Raman (Fig.
13); ambos espectros fueron registrados en fase sólida y se identifican con línea roja (magnetita sin ningún
tipo de funcionalización). En lo que respecta al espectro IR, de acuerdo a lo reportado en literatura, era de
esperarse la presencia de una única banda muy fuerte en 560 cm-1, correspondiente a la vibración del
enlace Fe-O.96 En este caso, debido al alcance del equipo, no es posible evidenciar la banda completa, sin
embargo, es visible. Ahora bien, en el espectro Raman fue posible identificar las bandas esperadas, como
una banda fuerte y ancha en 670 cm-1, correspondiente a modos vibracionales A1g, y dos bandas más débiles
en 300 (Eg) y 550 cm-1 (T2g).97 Los parámetros de potencia de láser y tiempo de adquisición son
especialmente importantes en este caso, debido a que es posible inducir cambios de fase por la excitación
del láser, lo cual se evidenció en la práctica al observar el espectro de hematita (α-Fe2O3), en vez de
magnetita.97–101 Los parámetros bajo los cuales se registró el espectro presentado en este caso, y bajo los
25
cuales no se observó un cambio de fase, fueron: laser de 638 nm, objetivo de 50 y 1.1 % de intensidad,
equivalente a aproximadamente 10.5 mW.
F T -IR
L o n g itu d d e o n d a (c m-1
)
Ab
so
rb
an
cia
5 0 01 0 0 01 5 0 02 0 0 02 5 0 03 0 0 03 5 0 04 0 0 0
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0 M N P _ S i M N P _ A E D PM N P
Figura 12. Espectros IR para muestras de magnetita
(rojo), magnetita silanizada (verde) y magnetita con
AEDP (violeta)
R a m a n (6 3 8 n m )
L o n g itu d d e o n d a (c m-1
)
Inte
ns
ida
d
0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0
5 6 0
5 8 0
6 0 0
6 2 0
6 4 0
M N P M N P _ S i M N P _ A E D P
Figura 13. Espectro Raman para muestras de magnetita
(rojo), magnetita silanizada (verde) y magnetita con
AEDP (violeta)
El siguiente paso consistió en llevar a cabo la silanización de la superficie de la magnetita previamente
sintetizada, según el procedimiento descrito en la metodología experimental (funcionalización de
superficie).
El TMAH, al ser una sal, se disocia en solución acuosa, permitiendo hidroxilar la superficie de las
nanopartículas, confiriéndoles carga negativa para formar partículas dispersas. Luego el APTES, una
molécula orgánica con un extremo de amino y tres extremos etoxi, se hidroliza al entrar en contacto con la
solución acuosa (proceso favorecido en pH entre 4.5 y 5.5) y posteriormente, se condensan los silanoles,
formando un polímero, que posteriormente se deposita sobre la superficie de las nanopartículas (Fig. 14).
Una vez depositados sobre el sustrato, los grupos etoxi forman un recubrimiento de polímero, unido
covalentemente con los grupos de aminas primarias que sobresalen de la superficie, disponibles para su
posterior conjugación.102 Los lavados con solución agua/EtOH 5 % permiten retirar el exceso de silanos que
no reaccionaron.
Figura 14. Proceso de condensación de APTES sobre superficie de nanopartículas102
26
La silanización se llevó a cabo dos veces: una prueba inicial por adición de APTES 5.1 mM (0.12 %), con la
cual se obtuvo un porcentaje de silanización cercano al 4 %, y una silanización posterior con adición de
APTES 8.5 mM (0.2 %), cuya gráfica se encuentra aquí presentada (Fig. 14). Los valores teóricos de la prueba
inicial fueron calculados, asumiendo una geometría esférica de las nanopartículas, con radio de 70.5 nm
(según caracterización por SAXS), y considerando que cada silano puede ocupar un área de 5.37 Å2 sobre
la superficie de la magnetita. Luego, con el peso molecular del APTES y el número máximo de silanos que
podían caber en la superficie esférica, se convirtió en una cantidad de gramos de APTES, y con su respectiva
densidad se calcularon los mililitros necesarios. En este caso se adicionó una cantidad 3 veces mayor a la
calculada en la solución (0.12 % APTES). La caracterización por termogravimetría (Fig. 15) permitió
evidenciar una silanización equivalente al 4.5 % en peso de la muestra silanizada con 0.2 % APTES. En el
termograma inicialmente se evidencia la pérdida de masa aproximada del 1 %, (T < 200 °C), la cual se
atribuye a la pérdida de agua adsorbida en la superficie de las partículas; esta misma pérdida se encuentra
reportada en literatura.103,104 Luego, se encuentra la pérdida de los ligandos orgánicos silanos; esta pérdida
se encuentra reportada hasta 900 °C.104
T G A M a g n e tita S ila n iz a d a
T e m p e ra tu ra (°C )
% W
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0
9 4
9 6
9 8
1 0 0
Figura 15. TGA de MNP silanizadas con 0.2 % APTES
Ahora bien, se encuentran reportadas diferentes metodologías para la silanización de nanopartículas, las
cuales alcanzan porcentajes de silanización desde 9.5 %, inclusive hasta del 30 % en peso, empleando
diferentes tipos de silanos y diferentes tipos de soportes (nanopartículas).103–108 De acuerdo a los resultados
4.5 %w
27
encontrados en las dos silanizaciones realizadas, y debido a que el porcentaje de silanización no tuvo
cambio sustancial entre las pruebas, se procedió a continuar con el proceso de esta manera.
Sin embargo, un estudio realizado sobre la cinética de silanización de nanopartículas de óxido de hierro con
APTES, permite evidenciar la importancia de un parámetro que no fue considerado en este caso; la
temperatura.103 En este estudio realizan el proceso de silanización de magnetita con APTES a dos
concentraciones que denominaron baja y alta (0.2 % y 2.0 %), en solución acuosa y a dos temperaturas
diferentes (30 y 70 °C). En este caso, pudieron evidenciar en primer lugar que, durante la primera hora de
reacción se lleva a cabo una rápida densificación de silanos sobre la matriz, equivalente casi al 80 % de la
saturación. Adicionalmente, se encontró que la combinación que permitió la mayor silanización fue 70 °C/2
% APTES. Con los parámetros de temperatura 30 °C y 0.2 % APTES, inclusive luego de 24 h, el porcentaje
de silanización únicamente llegó hasta 9.5 %. Esto pudiendo justificar los bajos porcentajes de silanización,
resultado del procedimiento realizado, donde se empleó APTES 0.2 %, a temperatura ambiente y durante
24 h.
De igual manera, se realizó la caracterización del producto obtenido por ATR-FTIR y espectroscopía Raman.
En la Fig. 12 se evidencia el espectro IR tomado del producto en fase sólida, representado con color verde.
Era de esperar encontrar las vibraciones características de los enlaces Si-O-Si (980 y 1120 cm-1), C-N (~1300
cm-1), N-H (1680 y ~3000 cm-1) y C-H (~2800 cm-1), como se evidenciaron, debido a la presencia de los
nuevos grupos funcionales en el producto por la adición de APTES, adicionalmente de la banda previamente
caracterizada para el enlace Fe-O de la magnetita.105 La caracterización del producto se fundamentó
principalmente en la presencia de las bandas de los enlaces de los silanos y las de las aminas primarias
(terminales). Adicionalmente, se encontraron bandas características de presencia de agua (3000-3500 cm-
1) y de CO2 del ambiente (~2400 cm-1). En cuanto al espectro Raman (Fig. 13), los modos vibracionales
visibles sería únicamente los debidos al enlace Si-O-Si, con una banda fuerte en 450-550 cm-1 y otra débil
entre 1010-1095 cm-1, los cuales se encuentran en el espectro presentado, adicionalmente a las bandas de
la magnetita previamente mencionadas.109 Además, se encuentra una banda cercana a los 1400 cm-1, la
cual se asocia a modos vibracionales de los C-H del esqueleto del silano. Finalmente, se realizó una
caracterización del producto por SEM-EDS (Fig. 16). En la imagen SEM se evidencian nuevamente las
28
nanopartículas con morfología casi esférica aglomeradas, mientras que el análisis por EDS permitió
identificar la presencia de una pequeña cantidad de Si, equivalente a un porcentaje atómico del 0.81 %.
Figura 16. Imagen microscopia electrónica de barrido SEM y espectrometría de dispersión de rayos EDS de MNP
silanizadas con 0.2 % APTES
Siguiendo la secuencia de la metodología experimental, el siguiente paso fue la adición de glutaraldehído
para unir la amina terminal primaria de los silanos en superficie, con la amina terminal primaria del linker
AEDP (Esq. 3 y 4). La adición del AEDP se realizó inmediatamente después de la adición del glutaraldehído
(y los respectivos lavados para retirar la porción en exceso que no reaccionó), debido a que en solución
acuosa el glutaraldehído tiende a polimerizarse, y los extremos aldehídos libres de las nanopartículas
podrían reaccionar rápidamente.110 En este caso, tanto la amina primaria terminal de los silanos, como la
amina terminal del linker AEDP tienen alto carácter nucleofílico, mientras que el glutaraldehído tiene alto
carácter electrofílico, lo que permite llevar a cabo ambas reacciones, donde el nitrógeno en cada caso ataca
el carbono del aldehído, dando como resultado iminas, también llamadas bases de Schiff.
El AEDP es un linker soluble en agua, con un extremo amino primario y un extremo de carboxilo. Dentro de
la cadena carbonada del esqueleto que compone esta molécula, se encuentra un puente disulfuro. Esto es
especialmente útil, debido a que, en ambientes reductores, como lo es el citoplasma de las células
eucariotas, el enlace tiol se reduce, liberando en el ambiente celular lo que esté unido al sistema. Esto se
debe principalmente a la alta concentración de glutatión que existe el medio (2-10 mM).111 En este caso, la
reducción del enlace disulfuro permitiría la liberación de la Dox, una vez el nanovehículo ingrese el
ambiente celular, permitiendo a su vez disminuir la toxicidad no específica. En base a estos principios, los
sistemas sensibles a redox son un enfoque prometedor para la administración intracelular de fármacos.112
29
Para calcular la cantidad de glutaraldehído agregado, se tuvieron en cuenta las caracterizaciones
previamente realizadas, en especial el 4.5 % de silanos de la muestra. En este caso, se deseaba que hubiera
al menos un mol de glutaraldehído por cada mol de silano; a este cálculo se le añadió un 50 % más,
agregando un total de 1.5 equivalentes de glutaraldehído a la solución. Con respecto al AEDP, se deseaba
que ¾ de la cantidad de glutaraldehído fueran equivalentes del linker, es decir, que por cada 4 moles de
glutaraldehído presentes, a 3 de estas se uniera el AEDP; de nuevo, se adicionaron 1.5 equivalentes de la
cantidad calculada, con el fin de tener un exceso en el medio de reacción.
Los resultados de la inmovilización del glutaraldehído/AEDP se evidencian en los espectros IR (Fig. 12) y
Raman (Fig. 13); en ambos casos, se representan por la línea violeta. Para la identificación de la presencia
del linker y el aldehído se esperaban observar bandas fuertes en 1720-1740 cm.1 v(C=O aldehído), en 1705-
1720 cm-1 v(C=O ácido) y en 2500-3300 cm-1 v(OH ácido), además de una banda de intensidad media en
2690-2840 cm-1 v(C-H aldehído), y una en 1660-1660 cm-1 v(C=N), del espectro IR. La banda de vibración
del enlace S-S no era observable, debido a que se encuentra reportada en 500-540 cm-1, región donde se
sobrelapa con la banda de vibración Fe-O de la magnetita. En este caso, ninguna de las bandas esperadas
se encontró y únicamente se observó la banda de vibración del enlace Fe-O, adicional a unas bandas en la
región 1300-1700 cm-1, atribuidas a v(C-H) y/o v(N-H), además de una de baja intensidad correspondiente
al CO2 (~2400 cm-1). En cuanto al espectro Raman, se observaron los modos vibracionales de la magnetita,
y algunas bandas que podrían ser atribuidas a la presencia del linker, como la que se observa en 1630-1665
cm-1 (banda muy fuerte) correspondiente al enlace C=N. Adicional a esta, eran de esperarse las bandas de
los enlaces S-S en 430-550 cm-1 (fuerte) y C-S en 670-780 cm-1 (fuerte), sin embargo, estas últimas se
sobrelapan con las bandas de la magnetita y los silanos, previamente caracterizadas. Cabe resaltar que en
la zona de 1000-1500 cm-1 se evidencia algo de emisión de fluorescencia de fondo, por lo cual en el espectro
se ve ruido y un aumento en la intensidad que asemeja la forma de una banda ancha.
Algunos de los problemas en el espectro IR (ausencia de bandas esperadas), podrían deberse a la baja
concentración de los compuestos, debido al bajo porcentaje de silanización sobre la superficie de las
nanopartículas. Recordando que la silanización presentó una eficiencia de conjugación del 4.5 % según
TGA, y que para llegar hasta el AEDP se realizaron dos pasos adicionales de inmovilización
(glutaraldehído/AEDP), se considera idealmente que el AEDP se debería encontrar en proporción 3.4 % de
peso, con respecto a la magnetita. Sin embargo, las funcionalizaciones tienen eficiencias mucho menores
al 100 % en cada uno de sus pasos, así que se esperan valores mucho menores al 3 % de los compuestos
en superficie. Adicionalmente, tomando en cuenta que la intensidad de absorción de las bandas es
30
proporcional a la concentración de los compuestos, de acuerdo con la ley de Lambert Beer, se podría
explicar que la presencia de cantidades tan pequeñas en la muestra, no son observables con esta técnica
de caracterización.
Al presentarse la incertidumbre, se recurrió a una técnica adicional de caracterización por SEM-EDS (Fig.
17). La imagen SEM en este caso muestra nanopartículas altamente aglomeradas, donde la morfología
esférica de estas casi no es observable. En este caso, el espectro EDS no se registró sobre la misma área de
la imagen, sino que, por el contrario, se alejó el objetivo para analizar un espacio mayor.
Desafortunadamente, la presencia de azufre no fue identificable. En este caso, únicamente se detectó la
presencia de hierro y oxígeno, además de Si en bajos porcentajes. De acuerdo con lo enunciado
anteriormente, existe la posibilidad de que la presencia de azufre no fuera observable, debido a su baja
concentración. La señal de silicio es sustancialmente pequeña, por lo cual la intensidad de la señal del azufre
podría encontrarse sobrelapada por el ruido.
Figura 17. Imagen microscopia electrónica de barrido SEM y espectrometría de dispersión de rayos EDS de MNP
silanizadas y funcionalizadas con glutaraldehído y AEDP
A continuación, con los resultados de los espectros de Raman, los cuales sugerían la posible presencia del
AEDP, se procedió a la inmovilización de la Dox. Para esto, fue necesario llevar a cabo una reacción que
permitiera acoplar el extremo de ácido carboxílico del AEDP con el amino terminal libre de la Dox; en este
caso se llevó a cabo una reacción con EDC/NHS. La solubilidad del EDC en agua permite llevar a cabo
conjugaciones directas, sin la necesidad de emplear solventes orgánicos. El NHS por su parte, permite
aumentar la estabilidad del intermediario de ester formado, ya que es fácilmente hidrolizable en medio
acuoso. En el mecanismo de la reacción, en primer lugar, el carbonilo (de carácter nucleofílico) ataca al
31
carbono de la carbodimida del EDC, formando el intermediario de éster. Posteriormente se adiciona el
compuesto que contiene el grupo amino primario libre, altamente nucleofílico, sobre el intermediario éster
altamente reactivo. El producto en este caso es una amida y un derivado de EDC como subproducto (Esq.
6).
Esquema 6. Esquema de reacción EDC/NHS, carboxilo terminal de MNP amino terminal de Dox
Tras la adición de Dox se realizó un análisis del sobrenadante de la reacción, permitiendo hacer una
medición indirecta sobre el contenido de Dox en las nanopartículas. Previamente se realizó una curva de
calibración con Dox (Fig. 18), leída a 480 nm (R2 = 0.9576). La cantidad de Dox añadida se calculó con
respecto a las moles de AEDP, equivalentes al 75 % del glutaraldehído; se adicionó un exceso de 0.5
equivalentes. Por interpolación, la lectura del sobrenadante permitió concluir que una eficiencia del 36.1
% de la inmovilización. Con esto, se puede decir que la muestra contiene una concentración final de Dox
de 0.025 mM. En este caso, la concentración final de Dox es relativamente baja, debido a que el EC50
reportado para este medicamento con la línea celular A549 es de 0.42 ± 0.06 μM.84 Cabe resaltar que la
concentración máxima de la Dox de acuerdo a la funcionalización realizada es de 0.06 μM, casi un orden
de magnitud menor a la concentración reportada. En este caso, la carga de Dox en las nanopartículas podría
aumentar desde pasos anteriores, entendiendo, como se explicó anteriormente, que se puede maximizar
la silanización y sucesivamente los siguientes pasos de la inmovilización.
EDC Intermediario
Ester
Producto de
isourea MNP
Formación
enlace Amida
32
Figura 18. Curva de calibración para análisis de Dox en sobrenadante
En este caso, se procedió como último paso de la síntesis, a la co-inmovilización de la proteína OmpA. Esta
reacción es posible, debido a la presencia de aminos altamente nucleofílicos, provenientes de los
aminoácidos que componen la proteína, los cuales pueden unirse a los extremos de glutaraldehído libres,
formando un enlace imina. Se constituyó este como el último paso de la síntesis, esperando disminuir los
efectos estéricos de la proteína con el resto de los compuestos inmovilizados, sabiendo que la proteína (37
201 Da) es sustancialmente más grande que la Dox, lo cual podría haber generado impedimento para la
inmovilización del medicamento, y en consecuencia se hubiera obtenido menor rendimiento. La
caracterización se realizó por medio de un ensayo BCA sobre el sobrenadante.
El BCA por sus siglas en inglés, es un ensayo colorimétrico que se basa en el ácido bicinconínico (Esq. 7),
para la detección y cuantificación de proteínas en una muestra. En este método se hace uso del principio
de la reacción de Biuret, que comprende la reducción de Cu2+ a Cu1+ - por acción de una proteína en medio
alcalino, junto con el BCA, el cual es un agente quelante selectivo del Cu1+ (Esq. 8), que en forma quelada
forma un complejo morado, soluble en agua, con fuerte absorción de luz en 562 nm. Esta absorción se
comporta de manera casi lineal con el aumento de proteína en el medio. El método como tal tiene un rango
de acción entre los 20 y los 2000 μg/mL. En este caso, las concentraciones de proteína se determinan y
reportan con respecto a una referencia a una proteína estándar, como lo es la albúmina bovina (BSA en
inglés).
y = 3.7526x - 0.0953R² = 0.9576
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
Ab
sorb
anci
a
Concentración Dox (mM)
Curva de Calibración Dox
33
Esquema 7. Ácido bicinconínico
Esquema 8. BCA quelado
Ahora bien, los resultados de la curva de calibración se muestran a continuación (Fig. 19). De acuerdo con
la interpolación, se inmovilizó un 28.8 % de la proteína adicionada, es decir que la proteína logró
inmovilizarse con una concentración final de 5.76 μM. Debido a que la función de la OmpA en el constructo
es facilitar el ingreso y reconocimiento de las células, las concentraciones necesarias para el proceso no
son elevadas; se ha demostrado que en bajas concentraciones, se logra translocar membranas.71
Figura 19. Curva de calibración para ensayo BCA
En este caso, para el primer acercamiento a las pruebas de viabilidad celular se realizó inicialmente un
ensayo MTT. Dentro del grupo de investigación GIBA, previamente se estandarizaron las condiciones del
ensayo MTT, por lo cual se estableció este como un punto de partida para estandarizar las condiciones para
la línea celular a emplear (A549); estos datos se consideraron preliminares para la posterior evaluación de
la viabilidad en la línea celular A549 con el ensayo LDH, como se planteó en los objetivos del proyecto. Por
su parte, el MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) es un ensayo colorimétrico,
donde se emplean compuestos de tetrazolio para evaluar la tasa mitocondrial metabólica. En este caso,
y = 0.6264x + 0.1542R² = 0.9457
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 0.5 1 1.5 2
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg/mL)
Curva de calibración ensayo BCA
34
una reducción del colorante MTT (amarillo), de como resultado el producto insoluble formazán, de color
morado (Esq. 9); este proceso puede ser llevado a cabo por enzimas citosólicas dependientes de NADPH,
por lo cual es posible medir la actividad metabólica celular. La realización de este ensayo requiere un paso
adicional, donde la adición de DMSO permite la disolución de los productos de formazán insolubles,
obteniendo una solución coloreada. La lectura de la absorbancia es por lo tanto proporcional a la viabilidad
celular.113
Esquema 9. Producción de formazán en ensayo MTT
Como se mencionó anteriormente, el siguiente paso consistió en estandarizar las condiciones del ensayo
LDH en la línea A549, como ensayo para evaluación de viabilidad celular. La lactato deshidrogenasa (LDH)
es una enzima citolítica presente en la mayoría de las células eucariotas, la cual es liberada en el medio de
cultivo al haber muerte celular, causada por un daño en la membrana plasmática.114 Existen cinco isoformas
diferentes de LDH presentes en diferentes tipos de tejido, donde difieren en cantidad, especificidad y
cinética de acción enzimática; sin embargo, todas catalizan la reacción común de conversión piruvato a
lactato, acompañada de la oxidación de NADH a NADH+. El ensayo LDH se basa en el supuesto de que, un
aumento en la actividad de LDH en el sobrenadante es proporcional al número de células lisadas en el
medio. Los kits de LDH, por su parte, son ensayos colorimétricos, basados en el principio de que la LDH
cataliza la reducción de NAD+ a NADH en la presencia de lactato, mientras que la formación de NADH es
capaz de reducir una sal de tretrazolio al producto rojo de formazán, en una reacción acoplada (Esq. 10). El
producto en este caso puede ser medido espectrofotométricamente a 490 nm, arrojando una absorbancia
proporcional a la actividad de la LDH en el medio. Cabe resaltar que las principales desventajas de los kits
de ensayo LDH disponibles en el mercado incluyen formulaciones patentadas, opciones limitadas de
optimización y alto costo, todo lo que resulta en una reproducibilidad limitada en aplicaciones de
investigación.85
35
Esquema 10. Formación de rojo de formazán en ensayo de LDH115
En cuanto a las pruebas de viabilidad celular, únicamente fue posible realizar un primer ensayo para la
obtención del EC50 Dox con la línea celular A549, a partir de un ensayo MTT (Fig. 20). Sin embargo, se
presentan ciertos inconvenientes para el análisis de los datos obtenidos. En primer lugar, cabe resaltar que
se evidencian problemas experimentales, dentro de los cuales se encuentran el pipeteo y el tiempo que
tomó llevar a cabo el conteo (el cual fue extendido). Durante la lectura del ensayo fue posible evidenciar la
formación de burbujas en los pozos del plato, lo que significa ruido en los datos. En cuanto a la velocidad
de conteo, debido a que esta fue lenta, las células pudieron sedimentarse en el recipiente donde se tenían,
por lo cual la densidad celular calculada y sembrada no fueron iguales. Adicionalmente, se observa que el
EC50 obtenido por la regresión es de 1.72 μM, muy alejado del valor de referencia.84 Esto también se pudo
haber debido a que la línea celular tuviera resistencia a la Dox, inducido también por estrés de las
condiciones bajo las cuales se manejó la línea celular. En la literatura, múltiples mecanismos se reportan
para la resistencia a la doxorrubicina, como por ejemplo la presencia de transportadores medicamentos
eflujo, alteraciones en la habilidad de la Dox para irrumpir el ADN y alteraciones en la señalización corriente
debajo de apoptosis, provocada por daños en el ADN.116,117
Figura 20. Primer ensayo EC50 Doxorrubicina con línea celular A549
y = -36.638x + 112.98R² = 0.4365
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Via
bili
dad
Cel
ula
r %
Concentración Doxorrubicina (uM)
36
En paralelo al primer ensayo MTT se realizó un primer ensayo de LDH de acuerdo al protocolo con
células neuronales reportado.85 De acuerdo con los resultados encontrados, se decidió cambiar el
procedimiento inicialmente planteado para la prueba LDH. En este caso se prepararon cinco nuevas
soluciones: solución de lisis (9 % v/v de Tritón X – 100), solución de INT (INT 100 Mm en PBS), solución de
MPMS (MPMS 100 mM en PBS), solución LDH (L-láctato de sodio 0.054 M, NAD 1.3 mM en 0.2 M Tris-HCl,
pH 8.2) y solución de parado (50 % dimetilformamida – DMF y 20 % dodecil sulfato de sodio – SDS, pH 4.7).86
El siguiente paso consistió en realizar una optimización de la densidad celular. Para esto se sembraron 6
réplicas de 200 μL, con densidades celulares equivalente a 0, 2500, 5000, 7500 y 10000 células por pozo y
se les añadió 15 μL de la solución de lisis a cada pozo; las 6 réplicas fueron necesarias para realizar la
optimización del tiempo de incubación. Para realizar los ensayos se preparó – fresca - la denominada
solución de ensayo, a partir de la solución LDH, añadiendo solución INT 0.66 mM, y solución MPMS 0.28
mM. Luego se centrifugó el plato donde se sembraron las células (250 g/4 min) y se transfirieron 50 μL del
sobrenadante de cada pozo en un plato nuevo. A cada pozo con sobrenadante se le añadieron 50 μL de la
solución de ensayo y se incubó el plato 30 min/37 °C, protegiéndolo de la luz con aluminio. Transcurridos
los 30 min se añadieron 100 μL de la solución de parado en cada pozo a los 60, 120, 180 y 240 min
posteriores, y se hicieron las lecturas de absorbancia a 490 (absorción primaria) y 690 nm (absorción de
fondo). Con este ensayo se pretendió encontrar la densidad celular objetivo, de tal forma que la
absorbancia fuera al menos el doble de la absorbancia de fondo del control de medio (densidad celular de
0).
En los dos protocolos aquí empleados, se mide la reducción de una sal de tetrazolio amarillo, INT (con
NADH), a un colorante rojo de tipo formazán, soluble en agua, con absorbancia en 490 nm. La cantidad del
producto de formazán en este caso es directamente proporcional a la cantidad de LDH en el medio, que a
su vez es proporcional al número de células muertas o dañadas.86 Para el primer ensayo de LDH se hicieron
lecturas del sobrenadante a diferentes horas, con el fin de evaluar la evolución del ensayo; cabe resaltar
que las lecturas fueron únicamente tomadas a 490 nm y que la solución de parado era una solución de
ácido acético, siguiendo el protocolo descrito. Se pretendía entonces, encontrar el tiempo óptimo de
incubación del ensayo, en el cual se estabilizará la liberación de LDH. Esto no sucedió, lo que sugestionó el
ensayo y llevó a realizar una revisión.
En primer lugar, la liberación máxima de LDH de la línea celular no estaba establecida. Este es un ensayo
que permite establecer el máximo de actividad LDH, cuando todas las células mueren bajo las condiciones
37
del ensayo; este es el verdadero 100 % sobre el cual se deben calcular las estadísticas, para normalizar los
resultados. Esto también puede justificar las viabilidades superiores al 100 %. Adicionalmente se notó que
la absorbancia del medio (blanco) tomaba valores casi de 1, lo cual genera un efecto adicional del medio
en el ensayo, el cual no estaba siendo contrarrestado o tomado en cuenta de alguna manera. Además, bajo
este protocolo establecido no se realizaba un proceso de centrifugación, por lo cual interferentes
suspendidos en el medio pudieron haber sido transferidos al nuevo plato con el sobrenadante, y por lo
tanto generar lecturas erróneas. Finalmente, una fuente de error adicional pudo deberse a que la solución
de parado (para detener a actividad enzimática), en este caso era una solución de ácido acético. Sin
embargo, se encuentra reportado que el uso de una solución de dimetilformamida (DMF) y SDS es mejor
para medios que contienen fenol rojo, debido a que esta solución neutraliza la absorción del medio.86 Los
errores experimentales de pipeteo mencionados anteriormente también pudieron haber sido fuentes de
error en este caso.
C o n c e n tra c ió n D o x (u M )
Ac
tiv
ida
d L
DH
(% C
on
tro
l)
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 01 h o ra
2 h o ra s
3 h o ra s
Figura 21. Lectura de LDH para Dox en diferentes periodos de tiempo
El siguiente ensayo consistió en cuantificar la cantidad de LDH liberado en el medio a diferentes densidades
celulares (Fig. 22); este procedimiento se realizó con un protocolo diferente al anterior. Durante este paso
se adicionó tritón solución de lisis en todos los pozos, el cual es un detergente que permite lisar las células,
liberando la cantidad máxima de LDH al medio, posteriormente centrifugado y analizado.118 Debido a que
cada línea celular contiene diferentes cantidades de LDH, se hace necesario realizar un experimento
preliminar para encontrar el número óptimo de células necesarias para asegurar una adecuada relación
señal/ruido. La primera corrección realizada en este protocolo fue tomar en cuenta la absorción de fondo,
38
leída a 690 nm. En este caso se cumple que, la absorbancia de todas las densidades celulares es siempre
mayor al doble de la absorbancia de fondo registrada para el blanco (medio); la gráfica en este caso
presenta los datos sin absorbancia de fondo (690 nm).
C a n tid a d d e L D H lib e ra d o
H o ra s
Ab
so
rb
an
cia
1 2 3
0 .0
0 .5
1 .0
1 .50
2 5 0 0
5 0 0 0
7 5 0 0
1 0 0 0 0
Figura 22. Liberación de LDH en 3 horas en diferentes densidades celulares
Sin embargo, algunos errores también se encontraron en este procedimiento. Cabe resaltar que las
densidades celulares menores presentaron mayor absorbancia que aquellas con menor densidad celular,
es decir, en teoría existe mayor actividad de la LDH a menores densidades celulares. Esto es contradictorio,
entendiendo que la LDH es una enzima citosólica. Este resultado se puede deber a la presencia de fenol
rojo en el medio. En general, dos factores pueden influir en el medio de cultivo en contextos de ensayos
LDH: el fenol rojo y el suero. El fenol rojo es un compuesto empleado como indicador de pH de los medios
de cultivo celular; al aumentar la tasa metabólica y densidad celular, el medio se acidifica y cambia de color
rojo/fucsia a amarillo/naranja. Cabe resaltar que los máximos de absorción del fenol rojo varían
dependiendo del pH, encontrándose en el rango visible entre 430 y 570 nm.119 En este caso, el valor de
absorbancia de medio se utiliza para normalizar los valores obtenidos en las muestras. Ahora bien,
entendiendo que en los pozos de menor densidad celular hay mayor proporción de medio, se esperaría
que la cantidad de fenol rojo en estas fuera mayor, y por lo tanto, mayor el efecto del compuesto sobre la
absorbancia. La absorbancia de fondo del fenol rojo se puede eliminar empleando medios libres de fenol
rojo.86 En cuanto al suero, se puede decir que este contiene cierta actividad de LDH, siendo la del suero
bovino más alto que el suero humano, por ejemplo. Para solucionar este inconveniente, se podrían realizar
ensayos con medio a concentración de suero 5 %, concentración bajo la cual se reporta que la viabilidad
39
celular no se afecta sustancialmente.86 Sin embargo, forzar las células a un cambio como estos podría
afectar las condiciones del ensayo, e inducir mayor muerte celular por efectos diferentes al tratamiento.
En cuanto a la densidad celular, como se mencionó anteriormente, todas cumplen con el parámetro de
superar la absorbancia de fondo. Sin embargo, la única que mantiene sus valores por debajo de 1, a través
del tiempo, es aquella con 10 000 células/pozo. En este caso, para que se cumplan los principios de la ley
de Lambert-Beer, la absorbancia debe encontrarse siempre debajo de 1, de tal manera que sea un
parámetro proporcional a la concentración del compuesto en solución. Por lo tanto, para ensayos futuros
se plantea que la densidad celular ideal sea de 10 000 células/pozo para realizar los ensayos.
40
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El cáncer de pulmón es una enfermedad heterogénea y agresiva que continúa liderando las estadísticas de
muertes asociadas al cáncer, teniendo la menor probabilidad de supervivencia a 5 años; esto se encuentra
directamente ligado al difícil diagnóstico temprano. El principal problema de las terapias contra esta
enfermedad sigue siendo el uso de fármacos citotóxicos que no son específicos, los cuales causan una serie
de efectos secundarios en la mayoría de los pacientes. Por su parte, los nanosistemas han surgido dentro
del campo de las terapias dirigidas como vehículos con propiedades físicas y químicas únicas, que presentan
circulación sanguínea y distribución tisular diferencial. Adicionalmente, estos sistemas presentan una
relación superficie-volumen provechosa que permite su funcionalización, pudiendo mejorar su estabilidad
y prolongar el tiempo de circulación in vivo. En este orden de ideas, se pueden inmovilizar en superficie
agentes para reconocimiento específico de tumores, que permitan la liberación controlada del fármaco en
el sitio deseado, lo que a su vez se traduce en dosis más altas del tratamiento y una disminución de efectos
secundarios. Además, existe la posibilidad de co-participación de múltiples tipos de fármacos y/o agentes
de diagnóstico para una terapia de combinación, lo cual tiene el potencial de superar la resistencia a
múltiples fármacos, dentro de muchos beneficios.
El óxido de hierro (II) y (III) o magnetita ha sido ampliamente investigado en el área biomédica debido a su
carácter magnético, facilidad de síntesis, alta biocompatibilidad y biodegradabilidad. Adicionalmente, en
terapias contra el cáncer tienen potencial para la supervisión en tiempo real del fármaco y la respuesta
tisular, superando a las biopsias, que usualmente retrasan el monitoreo. Por su parte, la doxorrubicina, un
antibiótico antitumoral de amplio espectro, considerado como uno de los quimioterapéuticos más
potentes aprobados por la FDA, y de los más utilizados en tumores sólidos, presenta un bajo nivel de
actividad contra el NSCLC (predominante entre los cánceres de pulmón). Específicamente, se utilizó en gran
medida en los 70/80’s para este tipo de cáncer, sin embargo, terapias combinadas en la actualidad
presentan mejor actividad antitumoral que la Dox, que, sumado a su potencial cardiotóxco, determinan el
papel marginal de este tratamiento para NSCLC.
Con el fin de reducir su toxicidad sistémica y efectos secundarios, este fármaco se estudia para ser utilizado
en un sistema de vehículo de fármaco que pueda activarse bajo determinados estímulos. Por lo tanto, la
formulación aquí propuesta pretendió la síntesis de un nanovehículo para el transporte de Dox, la cual es
liberada en el citosol (ambiente reductor), en co-formulación en superficie con la proteína OmpA, que
permite el ingreso a las células, aumentando la citotoxicidad del fármaco en NSCLC, en comparación con el
41
medicamento solo. A futuro se plantea la inmovilización en superficie de receptores específicos para la
detección de las células cancerosas, permitiendo aumentar la especificidad del tratamiento.
En este caso fue posible lograr la síntesis de nanopartículas de magnetita, caracterizada por medio de las
técnicas ATR-FTIR, Raman, DRX de polvos, SAXS y SEM-EDS, obteniendo las características y pureza
deseadas. Durante el proceso de síntesis se modificaron parámetros como la atmósfera (vacío/N2) y la
velocidad de adición de la base, encontrando que para los objetivos planteados la mejor combinación de
parámetros fue síntesis en atmósfera de N2, adicionando la base a una velocidad de 3 mL/min. Se plantea
a futuro la modificación de la base, pudiendo formar soluciones estables. Adicionalmente, se logró la
funcionalización de superficie con silanos, caracterizando por TGA, ATR-FTIR, Raman y SEM-EDS. El
porcentaje de silanización obtenido fue bajo, aun cuando se realizó la adición de APTES en 2
concentraciones diferentes (0.1 y 0.2 %). Se plantea para aumentar le eficiencia del proceso, realizando el
mismo procedimiento, pero con una solución con exceso de APTES (2 %) y temperatura de 70 °C, basado
en la revisión de literatura sobre la cinética de la reacción.
Debido al bajo resultado de la silanización, los pasos consecutivos fueron difíciles de caracterizar, sin
embargo, se llevaron a cabo. La adición del cross-linker AEDP se comprobó con la presencia de modos
vibracionales observados en Raman. Sin embargo, se propone la inmovilización de cantidades mayores de
sustrato (magnetita), lo que permitiría reducir el ruido en espectros como los FTIR; en este caso no fue
posible debido a que se contaba con recursos limitados. De igual manera, se espera que un aumento en el
porcentaje de silanización permita escalar todos los procesos consecutivos, pudiendo aumentar las
concentraciones de los productos y por lo tanto visualizar bandas más claras.
La inmovilización de Dox tuvo un buen rendimiento (> 30 %), sin embargo, la concentración final en las
nanopartículas fue casi de un orden de magnitud menor al EC50 reportado para la línea celular con la que
se trabajó, A549. Por otra parte, la co-inmovilización de la proteína OmpA fue posible y comprobada por
un análisis colorimétrico (BCA), obteniendo una concentración final de 5.76 μM de la misma, con la que se
espera sea posible translocar membranas. De igual manera, se espera que la mejora en el protocolo de la
primera funcionalización permita aumentar la capacidad de carga del medicamento en las nanopartículas.
Se plantea a futuro realizar pruebas de liberación de Dox - comprobando la efectividad del cross-linker
empleado, sometiendo el constructo a medios reductores, por ejemplo, con glutatión; se espera realizar
lecturas de la solución a través del tiempo y ver la liberación controlada del fármaco.
42
Finalmente, la optimización preliminar del ensayo LDH (sin kit comercial) permitió establecer una densidad
celular ideal para en ensayo con la línea A549 (10 000 células/pozo), donde se observó la interferencia y el
efecto en las lecturas de absorbancia, causado por la presencia de fenol rojo en el medio y suero, los cuales
generan ruido de fondo; se propone emplear medios libres de fenol rojo para futuros ensayos LDH, además
de disminuir la concentración de PBS al 5 %. Adicionalmente, el EC50 obtenido por MTT no es congruente
con el reportado para la misma línea celular, lo cual se asocia a errores experimentales y posible resistencia
de las células al tratamiento. En lo que respecta al resto de los ensayos y pruebas de citotoxicidad
propuestas, se resalta que no fue posible llevarlos a cabo, debido a la presencia de una contaminación
desconocida, recurrente en todas las pruebas.
43
6. CONSIDERACIONES ÉTICAS
En este proyecto se trabajó con líneas celulares tumorales, las cuales fueron manejadas en una cabina de
bioseguridad tipo II. Los desechos biológicos y químicos generados durante la realización de este proyecto
fueron tratados de acuerdo con las normas estipuladas por la Universidad de Los Andes para el manejo de
residuos peligrosos. Por esto, se consideró que la ejecución de este proyecto tuvo un riesgo mínimo y se
declaró que no existía conflicto de intereses.
44
7. REFERENCIAS
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