ÍNDICE - ITColima
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ÍNDICE
I.- Justificación………………………………………………………………………………………………………………..1
1.1.- Introducción..…………………………………………………………………………………………………….1
1.2.- Justificación........………………………………………………………………………………………………..3
II.-Objetivos…….………………………………………………………………………………………………………………5
III.-Problemas a resolver…………….…………………………………………………………………………………..5
IV.-Procedimientos….……………………………………………………………………………………………………..6
4.1.- Aislamiento, cultivo y obtención de células madre mesenquimales a partir de
Tejido adiposo……………………………………………………………………………………………………6
4.1.1.- Procedimiento para el aislamiento y cultivo de la células madre .
mesenquimales a partir de tejido adiposo………………………………………………7
4.1.2.- Procedimiento para cosecha de células mesenquimales autólogas
cultivadas……………………………………………………………………………………………….8
4.1.3.- Elaboración de la solución ITC………………………………………………………………….8
4.1.4.- Elaboración de la solución bio-regenerativa……………………………………………9
4.1.5.- Protocolo para las pruebas in vivo…………………………………………………………..9
V.-Resultados……………………………………………………………………………………………………………….10
5.1.- Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales a partir de
tejido adiposo……………………………………………………………………………………………….…10
5.2.- Cosecha de células mesenquimales autólogas cultivadas…………………………………12
5.2.1.- Análisis de resultados de la técnica de citometría de flujo………………………13
5.3.- Elaboración de solución ITC……………………………………………………………………………..15
5.4.- Solución bio-regenerativa………………………………………………………………………………..16
5.5.- Pruebas in vivo…………………………………………………………………………………………………17
5.5.1.- Realización de las lesiones…………………………………………………………………….17
5.5.2.- Monitoreo de lesiones…………………………………………………………………………..17
5.5.3.- Histopatología de las lesiones……………………………………………………………….20
5.6.- Pruebas de vida de anaquel……………………………………………………………………………..21
VI.-Conclusión y recomendaciones……………………………………………………………………………….22
6.1.- Conclusión de proliferación celular………………………………………………………………..22
6.2.- Conclusión de Citometría de flujo……………………………………………………………………22
6.3.- Conclusión de elaboración de la solución ITC…………………………………………………..22
6.4.- Conclusión de la solución bio-regenerativa………………………………………………………23
6.5.- Conclusión de pruebas in vivo………………………………………………………………………….23
6.6.- Conclusión de pruebas de vida de anaquel………………………………………………………23
VII.-Limitaciones……………………………………………………………………………………………………………24
VIII.-Competencias……………………………………………………………………………………………………….24
IX.-Anexos……………………………………………………………………………………………………………………25
X.- Referencias…………………………………………………………………………………………………………….33
ÍNDICE DE IMÁGENES
1.- Tipo de quemaduras………………………………………………………………………………………………….2
2.- Proliferación celular…………………………………………………………………………………………………11
3.- Marcador 7ADD……………………………………………………………………………………………………….13
4.- Marcador CD45……………………………………………………………………………………………………….13
5.- Marcador CD106 CD190…………………………………………………………………………………………..13
6.- Marcador CD45 CD34……………………………………………………………………………………………...14
7.- Marcador CD44 CD105…………………………………………………………………………………………….14
8.- Cuantificación celular………………………………………………………………………………………………14
9.- Procedimiento para realizar quemaduras en cerdos………………………………………………..17
10.- Monitoreo de cicatrización de las lesiones en cerdo……………………………………………..18
11.- Grado de cicatrización del cerdo 1 A……………………………………………………………………..19
12.- Grado de cicatrización del cerdo 2 B……………………………………………………………………..19
ÍNDICE DE GRAFICAS
1.- Proliferación celular…………………………………………………………………………………………………10
2.- Numero de células por ml………………………………………………………………………………………..16
3.- Capas celulares en estudios histológicos………………………………………………………………….20
ÍNDICE DE TABLAS
1.- Proliferación celular…………………………………………………………………………………………………10
2.- Marcadores……………………………………………………………………………………………………………..12
3.- Numero de células por ml………………………………………………………………………………………..16
4.- Capas celulares en estudios histológicos………………………………………………………………….20
ÍNDICE DE ANEXOS
1.- Estudios de microbiología de cultivos de células………………………………………..……………25
2.- Estudios del conteo de células con countess…………………………………………………………..26
3.- Resultado de la Citometría de flujo………………………………………………………………………….27
4.- Análisis de histopatología………………………………………………………………………………………..29
5.- Estudios de microbiología en vida de anaquel………………………………………………………….32
1
I.- JUSTIFICACIÓN
1.1 Introducción
La piel es el órgano más grande del cuerpo y su función principal es la protección.
Ésta protege al organismo de factores externos como bacterias, sustancias químicas y
temperatura. La piel contiene un pigmento químico, llamado melanina, que sirve como
defensa contra los rayos ultravioleta que pueden dañar las células de la piel. Otra función
importante es la regulación de la temperatura corporal, cuando ésta se expone a una
temperatura fría, los vasos sanguíneos de la dermis se contraen, lo cual hace que la
sangre, que es caliente, no entre a la piel, por lo que ésta adquiere la temperatura del
medio frío al que está expuesta. El calor se conserva debido a que los vasos sanguíneos no
continúan enviando calor hacia el cuerpo. Por lo tanto, la piel es un órgano sorprendente,
ya que es la primera defensa del organismo ante agentes externos por lo que es
indispensable su cuidado.1
Una quemadura es una lesión en tejidos vivos causada por la acción de diversos agentes,
la cual se manifiestan a través de un enrojecimiento hasta la destrucción total de las
estructuras afectadas, siendo la piel el órgano que con mayor frecuencia sufre este tipo de
lesiones. Esta lesión resulta de la exposición a llamas o líquidos calientes, contacto con
objetos calientes, con cáusticos, químicos o radiación, efecto de la corriente eléctrica o de
noxas biológicas.2
Las quemaduras se clasifican de acuerdo a la profundidad de la lesión en: 1°, 2° y 3°
grados.
Primer grado.- Las quemaduras de primer grado afectan sólo la epidermis, o capa
externa de la piel. El lugar de la quemadura duele, no presenta ampollas y tiene un
aspecto enrojecido y seco. Un ejemplo sería una quemadura solar leve. No es
2
frecuente que se produzca daño permanente de los tejidos y, generalmente, luego
de la lesión, se produce un aumento o disminución de la coloración de la piel.3
Segundo grado.- Esta lesión puede ser superficial o profunda, el daño en la piel es
parcial, hay vesículas y es muy dolorosa. La lesión se puede extender desde la
epidermis hasta la dermis profunda o tejido celular subcutáneo superficial. Si es
superficial, sana espontáneamente, si es profunda, toma más tiempo en sanar o se
puede convertir en una lesión de tercer grado por infección secundaria.
Tercer grado.- Esta lesión se conoce como una quemadura de espesor total.
Destruye la capa exterior de la piel (epidermis) y toda la capa debajo (la dermis).4
La mayoría de las quemaduras son una combinación del primero, segundo y tercer grados
(Alfaro Davila., 2003).
A B
C D
Imagen 1.- Tipos de quemaduras A) Capas de la piel, B) Quemadura de primer grado, C) Quemadura de segundo grado y D) Quemadura
de tercer grado.
3
1.2 Justificación
En la actualidad existen distintos métodos y productos que contribuyen a la cicatrización,
algunos ofreciendo una pronta mejora pero con un alto costo y otros muy dolorosos,
exponiendo la salud de los pacientes.
A continuación se mencionan algunas terapias regenerativas:
Autoinjertos.- Es un segmento de piel sana extraída de un área del cuerpo para
reparar el sitio dañado o faltante en otra parte del cuerpo. Esta piel no tiene su
propia fuente de flujo de sangre.1 El éxito de los injertos cutáneos depende de la
técnica quirúrgica y de los cuidados post-operatorios, hay que vigilar
frecuentemente su viabilidad y la aparición de infección; la zona donde se han
implantado puede ser movilizada al cuarto-quinto día de evolución.
Queratinocitos cultivados.- Los queratinocitos permiten en tres semanas obtener
injertos de aproximadamente 75 m2 a partir de una muestra de 1cm2.
Sintéticos o sustitutos de piel (piel artificial).- Tiene como objetivo cubrir la
herida, protegerla de agresiones externas y de bacterias procedentes del medio
ambiente, proporcionar un medio ambiente óptimo para la cicatrización
aportando factores dérmicos que activan y estimulan la reparación tisular.5
Según el Instituto de Salud del Estado de México, la tasa nacional promedio de
quemaduras es de 107.26 por cada 100,000 habitantes6, esto nos da la pauta para
desarrollar una solución bio-regenerativa a base de células madre que aporte mayores
beneficios al paciente quemado; como una rápida cicatrización y una menor
contaminación.
4
Las células madre mesenquimales (MSCs) son una población de células que tienen la
capacidad de auto-renovarse y ser multipotentes (Dexheimer, Frank, & Richter, 2012), se
han aislado de una variedad de tejidos, tales como la médula ósea, músculo esquelético,
pulpa dental, el hueso, el cordón umbilical y el tejido adiposo (Castro Manrreza, 2015).
Son una población de células adherentes capaces de diferenciarse a linajes
mesenquimales (cartílago, hueso y tejido), también hacia otros linajes no derivados de
capas mesodermales (Neri et al., 2013); por lo tanto, MSCs se pueden utilizar en medicina
regenerativa basada principalmente en su capacidad de diferenciarse en tipos celulares
específicos y también como biorreactores de factores solubles que promuevan la
regeneración de tejidos a partir de los progenitores celulares (Castro Manrreza, 2015).
Las células MSCs tienen la capacidad de modular la respuesta inmune: expresan elevadas
moléculas de histocompatibilidad clase I (MHC-I), interfieren en la función de la células
dendríticas, linfocitos T y células NK; y generan factores solubles que crean un ambiente
de inmunosupresión (Wan, Cheng, Wang, & Liu, 2008).
La principal ventaja de las MSCs es su fácil obtención a través de aspirados de médula
ósea y otros tejidos como grasa o membrana sinovial (Dexheimer et al., 2012). Las MSCs
obtenidas de médula ósea, representan el estándar de la biología; sin embargo, las células
estromales obtenidas de tejido adiposo se están convirtiendo en una alternativa atractiva
debido a su mínima accesibilidad invasiva y su abundante disponibilidad (Neri et al., 2013)
. En estudios realizados se ha encontrado que el porcentaje de obtención de MSCs de
medula ósea es del 0.01% y en tejido adiposo del 5.0% (Perdisa et al., 2015).
El tejido adiposo se distribuye principalmente como grasa subcutánea y visceral; su
remoción (generalmente por liposucción) suministra una gran cantidad de células
troncales mesenquimales (alrededor de 300,000 células/ml). El cultivo de estas células
permite la expansión homogénea de una población de células tipo fibroblasto, que se
adhieren al plástico, con una capacidad amplia de proliferación. Esta población se
5
identifica como células troncales/estromales derivadas de adipocitos (ASCs) (Neri et al.,
2013).
II.- OBJETIVOS
Objetivo general:
Desarrollar una solución bio-regenerativa a base de células madre mesenquimales
que ayude a la regeneración de tejido quemado en cerdos.
Objetivos específicos:
Obtención de células MSCs a partir de tejido graso obtenido por liposucción.
Realizar cultivos celulares para proliferar las células madre mesenquimales.
Desarrollar una solución bio-regenerativa, evaluando las mejores condiciones para
el correcto funcionamiento de la misma.
Plantear y efectuar las pruebas in vivo con los animales de estudio (cerdos).
Evaluar la solución bio-regenerativa en el tejido quemado comparándolo contra
un tratamiento convencional (placa de queratinocitos).
III.- PROBLEMAS A RESOLVER
Evaluar las condiciones necesarias para mantener la viabilidad celular en la
solución bio-regenerativa.
Seleccionar las condiciones para realizar la lesión en las pruebas in vivo (tamaño y
grado de la quemadura de los cerdos).
6
IV.- PROCEDIMIENTOS
El laboratorio de cultivo de tejidos y células debe de cumplir con ciertas especificaciones:
estar en un cuarto limpio aislado con aire a presión positiva, el personal deberá utilizar
una vestimenta especial (overol, guantes, cubre-bocas, cubre-zapatos, lentes de
seguridad); garantizando de esta manera un área completamente aséptica.
4.1 AISLAMIENTO, CULTIVO Y OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES A
PARTIR DE TEJIDO ADIPOSO:
Equipos:
Incubadora de CO2
Microscopio invertido de contraste de fases
Campana de bio-seguridad tipo II
Centrifuga refrigerada
Countess INVITROGEN
Materiales7:
Tubos cónicos (falcon) de 15 y 50ml
Pipetas serológicas estériles de 10 a 25 ml
Caja de cultivo de 75cm2 y 150cm2
Reactivos:
Enzima
Solución salina
Medio enriquecido (Fórmula ITC)
o Medio DMEM bajo en glucosa
o Antibióticos-antimicóticos
o Solución de enriquecimiento (ITC)
Tripsina-EDTA
7
4.1.1 Procedimiento para el aislamiento y cultivo de las células madre mesenquimales a
partir de tejido adiposo:
1.- Lavar el tejido adiposo 3 veces con solución salina (esperar 20 minutos entre cada
lavado).
2.- Digerir la grasa con una proteína a base de colagenasa y lipasa, manteniendo a
movimiento constante y a una temperatura de 37°C.
3.- Pasar el contenido a los tubos cónicos de 50ml.
4.- Centrifugar a 3500rpm durante 10 minutos.
5.- Decantar el sobrenadante.
6.- Resuspender el pellet (botón) con 5ml de medio enriquecido, para posteriormente
pasarlo a las cajas de cultivo.
7.- Colocar 15ml de medio enriquecido a la caja de cultivo.
8.- Incubar en la caja de cultivo a una presión del 5.0% de CO2 y a una temperatura de
37°C.
9.- Realizar una supervisión a las 24 horas con ayuda del microscopio invertido; las células
mesenquimales tiene la propiedad de adhesión, por lo que permite que estas se adhieran
a la superficie del frasco de cultivo.
10.- Cambiar el medio de cultivo cada tercer día.
Notas:
El medio desechado se envía al laboratorio de microbiología para la búsqueda de
bacterias, hongos y levaduras (las muestras se siembran durante 72 horas).
Al observar un porcentaje mayor al 50% de afluencia celular, resembrar las células
en nuevos frascos de cultivo.
8
4.1.2 Procedimiento para la cosecha de células mesenquimales autólogas cultivadas:
1.- Vaciar el medio completamente y adicionar 10ml de solución salina.
2.- Repetir el paso anterior 3 veces.
3.- Precalentar la solución de tripsina-EDTA.
4.- Adicionar 3ml de tripsina-EDTA y agitar vigorosamente el frasco de cultivo e incubar 3
minutos a 37°C.
5.- Adicionar 10ml de medio enriquecido (Este paso sirve para inactivar el efecto de la
tripsina).
6.- Pasar el contenido del frasco de cultivo a un tubo cónico de 15ml.
7.- Centrifugar los tubos cónicos a 1000rpm durante 5 minutos.
8.- Decantar el sobrenadante y adicionar 10ml de solución salina.
9.- Centrifugar a 1000rpm durante 5 minutos.
10.- Decantar todo el sobrenadante y adicionar solución salina.
NOTA:
Se tomará una muestra representativa y se enviará a un laboratorio certificado
para analizar la viabilidad celular (7AAD) y marcadores específicos para células
madre mesenquimales (CD34, CD45, CD90, CD105 y CD106).
4.1.3 Elaboración de la solución ITC:
Se realizarán experimentos para evaluar diferentes factores que ayuden a
mantener la viabilidad y crecimiento celular como factores de crecimiento y
antibióticos.
NOTA: Los procedimientos realizados de la solución ITC no serán descritos en este trabajo
debido a la confidencialidad de la empresa.
9
4.1.4 Elaboración de la solución bio-regenerativa:
1. A través del equipo Countess de INVITROGEN contar el número de células que hay
por cada mililitro de solución ITC.
2. Realizar el cálculo para colocar 100 millones de células mesenquimales por cada
frasco.
3. Aforar la solución bio-regenerativa con solución ITC para alcanzar un volumen final
de 100ml.
4. Almacenar en refrigeración a 4°C.
4.1.5 Protocolo para las pruebas in vivo
1.- Se seleccionarán dos cerdos.
2.- Lavar el lomo de los cerdos con una solución pH neutro.
3.- Anestesiar al cerdo por completo.
4.- Rasurar la zona donde se realizará la quemadura.
5.- Realizar las heridas (3) de forma estandarizada: 39240Pa, 400°C durante 3 segundos.
6.- Colocar sobre las heridas la solución respectiva: control, solución bio-regenerativa y la
placa de queratinocitos.
7.- Aplicar tres veces al día el control y la solución bio-regenerativa sin mover la placa de
queratinocitos solo se removerá en la revisión de avances la cual será cada 5 días.
8.- Después de dos semanas realizando los mismos procedimientos observar los
resultados.
10
V. RESULTADOS
5.1 Aislamiento y cultivo de las células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo:
Se digirió la muestra de tejido adiposo que se obtuvo mediante liposucción de
adultos humanos (aproximadamente 500ml) para obtener las células mesenquimales. Una
vez obtenidas se incubaron en frascos de cultivo durante 3 días a 37°C y una
concentración de 5% de CO2. Al tercer día se realizó un lavado vigoroso a los 10 frascos de
cultivo por el alto contenido de grasa. Del medio que se descartó se tomaron 5ml para
realizar estudios microbiológicos, los cuales resultaron negativos para: bacterias, hongos y
levaduras (Anexo 1).
Cada tercer día se evalúo visualmente la proliferación celular de la población. En la tabla 1
se aprecia que las células alcanzan aproximadamente un 80% de proliferación a los 15 días
de cultivo (Gráfica 1). En la figura 2 se puede observar la proliferación celular de acuerdo
al porcentaje mencionado previamente.
Tabla 1. Proliferación celular.
Gráfica 1. Porcentaje de proliferación celular durante los 15 días de incubación.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
3 6 9 12 15
Proliferación celular
11
A B
C D
E
Imagen 2. Proliferación celular: A) 0 - 10%, B) 10 – 30%, C) 30-50%, D) 50 -70% E) 70 – 90%
12
5.2 Cosecha de células mesenquimales autólogas cultivadas
Una vez observada una proliferación mayor del 90% de las celulas mesenquimales, se
procedio a la que nosotros llamamos cosecha (tripsinizacion), para desprender las células
de la superficie del frasco de cultivo, se centrifugó para obtener el paquete de células
mesenquimales, y finalmente se resuspendió el botón celular en la solución ITC.
Se envió al laboratorio de Citometría de flujo del CINVESTAV un frasco de cultivo con una
proliferación aproximada del 90% para realizar el inmunofenotipo y viabilidad de las
células mesenquimales. A continuación se detalla en la tabla 2 los marcadores utilizados
para la evaluación del inmunofenotipo y viabilidad celular.
MARCADOR FUNCIÓN
7ADD Es un intercalador fluorescente que se asocia al DNA y se excluye de las células vivas.
CD90 Es una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Es un marcador precursor de células mesenquimales tempranas.
CD105 Interviene en la regulación de distintos componentes de la matriz extra celular como fibronectina y colágeno, razón por la cual se creé que está relacionada con procesos de angiogénesis y reparación vascular. Se expresa en células endoteliales, macrófagos activados, fibroblastos y células de músculo liso.
CD106 Funciona como una molécula de adhesión celular. Se expresa predominantemente en endotelio vascular activo, células dendríticas, algunos macrófagos, células estromales de la médula ósea y población de células no vasculares.
CD34 Se expresa selectivamente en las células progenitoras hematopoyéticas mieloides y linfoides.
CD45 Se expresa en la superficie de la mayoría de los leucocitos humanos, incluidos los linfocitos, los monocitos y los eosinófilos; pero se encuentra ausente en los eritrocitos y trombocitos.
Tabla 2.- Marcadores utilizados en citometría de flujo para la evaluación del
inmunofenotipo y viabilidad celular.
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5.2.1 Análisis de resultados de la técnica de Citometría de flujo (anexo 2):
Imagen 3: se observa la población de
células vivas en la región 15, que
corresponde a un 68.61% a través
del marcador 7ADD.
Imagen 4: Las células están
negativas para el marcador CD45,
que es un marcador específico de
monocitos y macrófagos. (Una
población positiva se ubica en el
rango mayor a 102
aproximadamente).
Imagen 5: Las células están
expresado CD106 y CD90,
marcadores de células
mesenquimales (84%, sumatoria de
las regiones R23, R24 y R26).
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Imagen 6: Las células no expresan
los marcadores CD45 y CD34.
El 3.67% de la zona R30 corresponde
a una población de células con
mayor tamaño que se debió haber
omitido al momento de seleccionar
la población a buscar.
Imagen 8 : Cuantificación celular de acuerdo al
número de perlas.
Células/µL= (células)x (Factor perlasxDilución)
(#perlas)
Células/µL= (35543/(11392))X1080X7000)=
Células/µL=23.59x106
Imagen 7: Las células expresan los
marcadores CD44 y CD105 (99.77%)
15
5.3 Elaboración de la solución ITC:
A través de varios diseños se evaluaron los componentes óptimos para la célula y el
cuerpo humano; considerando características de almacenamiento, viabilidad,
proliferación y protección ante agentes patógenos. Obteniendo como resultado la
siguiente composición: factores de crecimiento, citosinas pro-inflamatorias y 5ml
nanopartículas de plata coloidal que equivale a 5ppm, entre otros.
Los factores de crecimiento celular son proteínas que se unen a receptores en la superficie
de la célula con el principal motivo de activar la proliferación y/o diferenciación (Kindt
Thomas J., 2007).
Las citocinas son proteínas de señalización que se utilizan en la comunicación celular y en
funciones inmunológica (Kindt Thomas J., 2007).
La plata coloidal es el mayor antibacteriano, antivírico, antiséptico y antifúngico conocido;
que en dosis adecuadas no tiene repercusión al cuerpo humano. Estudios realizados
muestran que una concentración de plata coloidal de 5 ppm es suficiente para eliminar la
mayoría de los patógenos (Kindt Thomas J., 2007).
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5.4 Solución bio-regenerativa:
La cuantificacion por Citometría de flujo fue de un aproximado de 600 millones de células
mesenquimales totales; por lo que en base a este resultado se diluyó el botón celular en
90ml de solución ITC para realizar 6 alícuotas de 15ml con 100 millones de células
mesenquimales cada una. Se aforó con solución ITC para llegar a un volumen final de
100ml. Se almacenó la solución bio-regenerativa en un frasco a una temperatura entre 4-
6°C en base a los estudios de vida de anaquel.
A través del equipo Countess de INVITROGEN se corroboró que en cada alícuota que se
realizó se tienen 6.9x106 células mesenquimales por mililitro aproximadamente (Gráfica
#2), dándonos un volumen final de 100 millones de células resuspendidas en 15 mililitros
de solución ITC (Anexo 3).
Tabla 3 y Gráfica 2 . Número de células mesenquimales por mililitro.
Muestra Número de células
1 6.9x106 cels/ml
2 7.0 x106 cels/ml
3 6.8 x106 cels/ml
4 7.2 x106 cels/ml
5 6.4 x106 cels/ml
6 6.9 x106 cels/ml 0123456789
1 2 3 4 5 6
NUMERO DE CELULAS
MUESTRAS
17
5.5 Pruebas in vivo
5.5.1 Realización de las lesiones
Las pruebas in vivo tuvieron lugar en instalaciones con un estricto control de calidad e
higiene. Primeramente se procedió a rasurar, sanitizar el área donde se realizaría la herida
y anestesiar a los cerdos. Una vez anestesiado el animal de estudio se procedió a realizar
el calentamiento de la yerra (instrumento de acero utilizado para marcar a los animales)
con un soplete de gas, al alcanzar una temperatura de 400°C (la temperatura final
alcanzada se confirmó con una pistola de infrarrojo) se enganchó el acero a una báscula
para estandarizar la herida de los cerdos, teniendo como punto base 5cm2 de herida y
2kgf, aplicando una presión de 39240 pascales durante 3 segundos.
Imagen 9. Procedimiento para realizar la quemadura en cerdos. A) Calentamiento de la
yerra, B) Estandarización de las quemaduras y C) Control y tratamientos.
5.5.2 Monitoreo de las lesiones
Las lesiones realizadas a los cerdos se monitorearon en un lapso de dos semanas;
realizando el primer chequeo a los 6 días, el segundo a los 11 días y finalmente, el tercero
a los 16 días post-herida. En la imagen #10 se observa que los avances fueron
significativos en ambos tratamientos.
A B C
18
Imagen 10. Cicatrización de las lesiones en cerdos (A) A los 6 días la lesión mostró una
cicatrización cercana al 40% con células MSCs y con la placa de queratinocitos, mientras
que en el control se observa sólo un 20%, (B) la evolución a los 11 días es más significativa,
observando una cicatrización del 70% con células MSCs, un 60% con la placa de
queratinocitos y del 40% en el control, y (C) Finalmente a los 16 días el progreso es
considerable, se observó entre un 80-90% de cicatrización con las células MSCs, un 75-
85% en la placa de queratinocitos y un 50-55% con el control
A
B
C
A
C
B
Cerdo 1A Cerdo 2A
19
Imagen 11. Grado de cicatrización del cerdo 1A. A) Control,
B) Solución bio-regenerativa y C) Placa de queratinocitos.
Imagen 12. Grado de cicatrización del cerdo 2A. A) Control,
B) Solución bio-regenerativa y C) Placa de queratinocitos.
B C A
A C B
20
5.5.3 Histopatología de las lesiones:
De una muestra de tejido en proceso de cicatrización se tomaron aproximadamente de
dos a tres centímetros para realizar análisis histopatológicos en un laboratorio certificado,
y determinar de esta manera el grado de cicatrización (anexo 4).
En la gráfica 4 se muestran las capas celulares, realizado un estudio comparativo entre el
control, la placa de queratinocitos y la solución bio-regenerativa. Los resultados obtenidos
muestran que la solución bio-regenerativa presenta una mayor regeneración celular que
el tratamiento con la placa de queratinocitos; sin embargo, se requiere realizar otros
estudios para poder concluir esta eficiencia.
Cerdos Capas celulares
C CM E
1A 1 A 4 7 A 9 6 A 8
2A 8 A 10 9 A 10 9 A 10
C= CONTROL , CM= CELULAS MADRE, E= QUERATINOCITOS
Tabla 4 Gráfica 3. Capas celulares por tratamiento. C= control,
CM= células MSCs y E= Placa de queratinocitos.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
C CM E
C
CM
E
Capas de Celulas
C CM E
11.5 17.5 16.5
21
5.6 Pruebas de vida de anaquel
La solución bio-regenerativa se expuso a diferentes condiciones para evaluar la mejor
alternativa de conservación. A continuación se describen los dos experimentos realizados
para buscar la mejor opción para una mayor vida de anaquel (anexo 5).
Experimento 1
Se colocó la solución bio-regenerativa (solución rosa) en un frasco de cristal a
temperatura ambiente durante dos meses.
Al término de este tiempo se evaluaron varios criterios:
Apariencia: Se observó que la solución presentó la misma coloración rosa de un
inicio.
Microbiología: Negativo para bacterias, hongos y/o levaduras.
Citometría de flujo: 30% de viabilidad
Experimento 2
La solución bio-regenerativa, guardada en un frasco de cristal, se almacenó en
refrigeración a 4°C aproximadamente durante dos meses.
Al término de este tiempo se evaluaron varios criterios:
Apariencia: Se observó que la solución no mostró cambio de color (rosa).
Microbiología: Negativo para bacterias, hongos y/o levaduras .
Citometría de flujo: 80% de viabilidad
22
VI CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES:
6.1 Conclusión proliferación celular:
En base a los cultivos y perfeccionamiento de la técnica podemos concluir que ningún
cultivo resultó con contaminación a ninguna bacteria, hongo y/o levadura gracias a las
buenas prácticas de manufactura y buen control de calidad que se lleva en el Instituto de
Terapia Celular.
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede deducir que en un lapso de 15 días se
obtuvo un 80% de proliferación en una muestra representativa de la población celular (10
cajas de cultivo), comparando este dato con un estudio realizado en el 2008 donde se
obtenía un resultado similar en un tiempo de 10 a 14 días (Ye, Wang, Xie, & Zheng, 2008)
6.2 Conclusión de Citometría de flujo:
La aplicación de la técnica de Citometría de flujo al análisis celular permite conocer
aspectos físicos de la célula (tamaño, viabilidad y complejidad) y determinar la presencia o
ausencia de determinados antígenos en los diferentes compartimentos celulares
(superficie celular, citoplasma, mitocondria y núcleo) (Barrera Ramirez, 2004).
En base a los resultados obtenidos con esta técnica podemos determinar que se
obtuvieron cerca de 25 millones aproximadamente de células por frasco de cultivo. La
población celular corresponde al inmunofenotipo de célula troncal mesenquimal, ya que
es positivo a los marcadores CD44, CD90, CD105 y CD106; y negativo para los marcadores
CD45 y CD34.
A través del marcador 7AAD se determinó la viabilidad celular, dando como resultado un
69% aproximadamente de células vivas por frasco de cultivo.
En el año 2006 la Sociedad Internacional de Terapia Celular propuso tres criterios para
definir las células madre mesenquimales (MSCs); primero estas células deben de ser
adherentes en cultivo, segundo expresar los antígenos: CD90 Y CD105, en ausencia de
antígenos hematopoyéticos y el tercero, las MSCs deben de ser capaces de diferenciarse
(Arevalo Romero, 2007).
6.3 Conclusión de elaboración de la solución ITC:
Inicialmente se decidió utilizar Vancomicina como antibiótico para la solución ITC, pero
debido a la posible reacción alérgica que pudiera presentar el paciente ante este
antibiótico, se decidió colocar nanopartículas de plata coloidal como antibacteriano,
antivírico, antiséptico y antifúngico; reduciendo el posible rechazo.
Las concentraciones, los compuestos y los procedimientos de la elaboración de la solución
ITC no son descritos por confidencialidad de la empresa.
23
6.4 Conclusión de la solución bio-regenerativa:
Los resultados obtenidos con el equipo Countess de INVITROGEN concuerdan con los
datos analizados en CINVESTAV a través de la técnica de Citometria de flujo. El análisis del
equipo Countes de INVITROGEN arrojo un resultado de 6.9x106 células mesenquimales en
15 mililitros (resultados aproximados).
6.5 Conclusión pruebas in vivo:
Se llegó a la conclusión que la solución bio-regenerativa presenta una mayor cicatrización
que la placa de queratinocitos.
A través de los estudios histopatológicos realizados se puede concluir que la solución bio-
regenerativa presenta una mayor capacidad de regeneración celular comparándolo con
el tratamiento alterno utilizado, aunque la diferencia no es significativa se recomienda
realizar estudios que ayuden a corroborar estos resultado
6.6 Conclusión de pruebas de vida de anaquel
Por lo tanto se concluye que la mejor forma de conservación de la solución bio-
regenerativa es en refrigeración a 4°C aproximadamente y alejada de la luz solar, ya que
las viabilidades resultantes de los dos experimentos realizados es variable; obteniendo un
resultado con mayor eficiencia en el experimento dos. Esto se debe a que la solución ITC
está formulada para otorgar los nutrientes necesarios para que las células sigan viables;
de igual forma se recomienda mantener la solución bio-regenerativa a ésta temperatura
ya que disminuye el metabolismo celular, induciendo una mayor estabilidad de la solución
bio-regenerativa.
Conclusión general y recomendaciones:
Se desarrolló una solución bio-regenerativa a base de células madre mesenquimales para
aplicarse a tejido quemado en cerdos. En este estudio se demostró que la solución bio-
regenerativa tiene mayor eficiencia en cicatrización que el tratamiento alternativo. Se
recomienda realizar estudios en humanos para evaluar la eficiencia de la solución y tener
un stock en material y medios de cultivo para evitar contratiempos por la escasez con el
proveedor.
24
VII LIMITACIONES:
Las limitaciones durante la realización de la solución bio-regenerativa y todo lo que
conlleva presentar este proyecto fueron específicamente, la escasez de animales para
realizar las pruebas in vivo, ya que para un estudio estadístico es necesario realizar más
pruebas en animales, otra limitación son los altos costos en el material y el tiempo de
entrega ya que todos los materiales provienen del extranjero.
VII COMPETENCIAS
(Investigación científica y tecnológica en el campo de la Ingeniería Bioquímica y difundir sus
resultados.) Este punto fue aplicado en la totalidad del proyecto que tuvo como fin el desarrollar
un producto que fuese innovador demostrando su efectividad en base a resultados obtenidos en
las pruebas in vivo.
(Aplicar herramientas de planificación y optimización). Durante todo el proyecto se estuvo
estudiando y evaluando las mejores alternativas para lograr desarrollar el producto de una forma
estandarizada y optimizando recursos.
(Comparar y seleccionar alternativas tecnológicas.) Este punto es clave para la selección de
material y equipos entre las distintas características que ofrece cada proveedor.
(Búsqueda efectiva y eficiente de información confiable y pertinente.) para poder llevar acabo este
proyecto fue necesario realizar investigaciones, realizando comparativas con artículos y fuentes
distintas.
(Capacidad de análisis y síntesis de información.) se analizó detenidamente las referencias
seleccionadas para sintetizar la información para el proyecto en estudio.
(Interpretar resultados obtenidos de experimentos diseñados), después de cada proceso se
evaluaron los resultados para valorar la efectividad y productividad del mismo.
(Recopilar información experimental y organizarla) se realizaron tablas donde se tenia toda la
información obtenida en cada experimento.
(Hacer representaciones gráficas de la información experimental en diagramas de barras,
histogramas, de pastel empleando software.) se realizaron análisis en base a la información de
cada experimento expresándolo en gráficas.
25
IX ANEXOS
Anexo 1
26
Anexo 2
27
Anexo 3
28
29
Anexo 4
30
31
32
Anexo 5
33
X REFERENCIAS:
Alfaro Davila., M. (2003). Quemaduras. Unidad Nacional de Quemados. Arevalo Romero, J. A., Paez Guerrero, D. M. y Rodriguez Pardo, V. M. (2007). Células madre
mesenquimales: características biológicas y aplicaciones clínicas. NOVA- Publicación científica en ciencias biomédicas, 5.
Barrera Ramirez, L. M. (2004). Citometría de flujo: vínculo entre la investigación básica y la
aplicación clínica. REV INST NAL ENF RESP MEX 17. Castro Manrreza, M. E. (2015). Células troncales mesenquimales: biología y uso en el transplante
de células troncales hematopoyéticas. Rev Med UV. Dexheimer, V., Frank, S., & Richter, W. (2012). Proliferation as a requirement for in vitro
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Perdisa, F., Gostynska, N., Roffi, A., Filardo, G., Marcacci, M., & Kon, E. (2015). Adipose-Derived
Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Articular Cartilage: A Systematic Review on Preclinical and Clinical Evidence. [Review]. Stem Cells Int, 2015, 597652. doi: 10.1155/2015/597652
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Kindt Thomas J., G. R. A., Osborne Barbara A. . (2007). Inmunologia de Kuby. MC Graw Hill, 6.
34
INTERNET:
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2.- Quemaduras; recuperado de http://www.colmedsa.com.ar/files/Quemaduras.pdf
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4.- University of Utah Health care, quemaduras de tercer grado recuperado de
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6.- Instituto de Salud del Estado de México recuperado de
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5.- Tratamiento de quemaduras; recuperado de https://www.ucm.es/data/cont/docs/420-2014-
02-07-TRATAMIENTO-QUEMADURAS-15-Dic-2013.pdf
7.- Corniig; recuperado de http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-
US/Shopping/ProductDetails.aspx?pid=430725U(Lifesciences)&cid=&productid=430725U(Lifescien
ces)
