Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

“Neosporosis bovina, actualidad y avances en el

diagnóstico y control”

Zufriategui, Juan Bernardo; Casaro, Gustavo; Muchiut, Sebastián

Diciembre, 2018

Tandil

“Neosporosis bovina, actualidad y avances en el diagnóstico y

control”

Tesina de la Orientación Producción Animal, presentada como parte de los

requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Zufriategui, Juan

Bernardo.

Tutor: Médico Veterinario Casaro, Gustavo Director: Médico Veterinario Muchiut, Sebastián

Evaluador: Médico veterinario, Saumell, Carlos

Agradecimientos

- A mis padres.

Resumen

La neosporosis es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo

intracelular Neospora caninum. Este coccidio posee un ciclo de tipo

heteroxeno, siendo el perro y otros cánidos sus hospedadores definitivos,

mientras que los bovinos y otros rumiantes actúan como hospedadores

intermediarios. En estos últimos es causante de abortos alrededor de todo el

mundo, y se caracteriza por causar la perdida fetal entre el 4to y 6to mes,

aunque puede ocasionarlo en cualquier momento de la gestación. La

neosporosis bovina es reconocida como una de las principales causas de

aborto, ocasionando pérdidas millonarias tanto en la producción de carne como

en la de leche. La diseminación se da a través de infección transplacentaria

(madre a hijo) o a través del consumo de agua o comida infectada. El presente

trabajo tiene como objetivo describir la enfermedad, analizar los métodos de

diagnóstico existentes y estudiar las medidas actuales para el control y

prevención de la misma.

Palabras clave: Neospora caninum, bovinos, abortos, vacunas.

Índice

Introducción………………………………………………………………….1

Agente etiológico, taxonomía, ciclo de vida y transmisión.………….....2

Patogenia y signos clínicos………………………………………………...5

Impacto económico………………………………………………………….7

Diagnóstico…………………………………………………………………...8

Perspectivas para la vacunación………………………………………….13

Tratamiento y medidas de control…………………………………………18

Conclusiones…………………………………………………………………20

Bibliografía……………………………………………………………………22

1

Introducción

La neosporosis bovina es una enfermedad causante de abortos distribuida

mundialmente, al ocasionar perdidas millonarias tanto en la producción de

carne como en la de leche, es un motivo constante de consultas, tanto de

productores como también de colegas veterinarios.

Numerosos investigadores han indagado con respecto a la temática a partir del

año 1988 donde el agente causal de la enfermedad fue caracterizado como

Neospora caninum, antes de esto el agente había sido mal identificado, siendo

confundido con otro protozoo de similares características, el toxoplasma gondii.

Los trabajos, investigaciones y revisiones consultados varían desde el año

1989 hasta el año 2017.

2

Agente etiológico, taxonomía, ciclo de vida y transmisión

Neospora caninum es un protozoo del phylum Apicomplexa, clase Sporozoea,

subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriina, familia

Sarcocystidae, género y especie Neospora caninum (Dubey, 2003). El parasito

se encuentra distribuido por todo el mundo afectando a un gran rango de

animales incluido el ganado bovino, ovino, caprino, equino (Monney et al.,

2011) así como también animales salvajes como distintos tipos de ciervos,

venados, rinocerontes, búfalos y otros mamíferos. Las especies mencionadas

anteriormente cumplen el rol de hospedadores intermediarios en la enfermedad

(Dubey, 2003). Los hospedadores definitivos descubiertos hasta el momento

son el perro (Mc.allister et al., 1998), el coyote (Gondim et al., 2004), el dingo

australiano (King et al., 2010) y el lobo gris (Dubey et al., 2011).

El ciclo de vida del parasito consta de tres estadios, los taquizoitos, bradizoitos

y esporozoitos. Los primeros se caracterizan por la invasión y la infección

aguda afectando células nerviosas, miocitos, hepatocitos, células renales y

células placentarias. Los segundos surgen a partir de la presión del sistema

inmune, forman quistes tisulares principalmente en el tejido muscular y en el

tejido nervioso y proliferan solo lentamente, marcando así la fase crónica de la

infección.

3

Fig. 1. (A-B) Quistes tisulares en sistema nervioso de un gato infectado experimentalmente (55

d.p.i.). Nótese la coloración roja de los bradizoitos envueltos en el quiste tisular (B). (C) quiste

tisular en cerebro de un gerbo naturalmente infectado con ooquistes de un perro, 75 dias p.i.

(D) Quiste tisular en cerebro de un ciervo infectado naturalmente. (E) Quiste tisular extraído de

la medula espinal de un ternero recién nacido, naturalmente infectado. (F-G) Quiste tisular de

cerebro de cabra naturalmente infectada. (H) quiste tisular obtenido del cerebro de una oveja

naturalmente infectada. (I) Quiste tisular de Toxoplasma gondii, el mismo se obtuvo de cerebro

de ratón con 90 días p.i. Obsérvese la diferencia en el grosor de la pared del quiste tisular, una

de las características morfológicas más importantes para la diferenciación de estos 2 protozoos

(Dubey et al., 2002).

La ingestión de estos quistes por parte de los hospedadores definitivos (perro,

lobo, dingo, etc.) puede llevar al contagio y a la infección de los mismos,

llevando a la reproducción sexual del parasito en el intestino del hospedador y

4

posteriormente a la eliminación de ooquistes los cuales tienen dos esporocistos

con cuatro esporozoítos cada uno (Monney et al., 2011). Estos ooquistes

esporulan a las 24 hs en el medio ambiente transformándose en infectivos,

tanto para los hospedadores definitivos como así para los hospedadores

intermediarios (Dubey et al., 2007).

Como se mencionó anteriormente el bovino (hospedador intermediario) puede

adquirir la enfermedad por el consumo de alimento o agua contaminada

(transmisión horizontal) pero esta no es la única vía de contagio, ya que

también puede hacerlo transplacentariamente (transmisión vertical o congénita)

resultando en el nacimiento de una cría normal pero persistentemente infectada

que mantendrá la infección en el rodeo (Dubey et al., 2007). La probabilidad de

este tipo de contagio varía según diferentes autores entre el 40,7 y el 95 %,

siendo un método muy efectivo para la perpetuación de la enfermedad en el

rodeo (Anderson et al., 2000, Dubey et al., 2006).

Fig. 2. Ciclo biológico de Neospora caninum con la presencia de la transmisión horizontal y

vertical de la infección (Dubey, 2003).

5

La transmisión transplacentaria puede dividirse en endógena y en exógena,

estos términos se propusieron para distinguir con mayor claridad el origen de la

infección congénita del feto. Al referirse al contagio endógeno, hace referencia

a que la madre ya tenía una infección latente que fue reactivada por la

inmunodepresión de la preñez. En cambio cuando se refiere al contagio

exógeno, significa que la madre ha sufrido una infección primaria por el

consumo de agua o alimento infectado con ooquistes (Trees y Williams, 2005).

Patogenia y signos clínicos

Luego de la ingestión de los ooquistes, los esporozoitos son liberados a la luz

intestinal, estos parasitan el epitelio y se transforman en taquizoitos, a

continuación se multiplican en los linfonodos mesentéricos para pasar a sangre

e invadir los distintos tejidos del hospedador. Se desconoce si los taquizoitos

durante su diseminación viajan libres o intracelularmente (Dubey et al., 2006).

Con el comienzo de la respuesta inmune, el organismo empieza a controlar la

infección y es en este momento cuando se produce la diferenciación a

bradizoitos los cuales forman quistes tisulares que están presentes

principalmente en el tejido nervioso y/o muscular. Estos bradizoitos pueden

reactivarse ante cualquier inmunodepresión del hospedador (Buxton et al.,

2002; Dubey et al., 2006; Dubey et al., 2011).

La única manifestación clínica de la neosporosis bovina en los animales adultos

es el aborto. El mismo puede ocurrir entre los 3 y 8 meses de gestación (Dubey

et al., 2006), pero la mayoría se dan entre el cuarto y el sexto mes (Moskwa et

al., 2007).

Numerosos estudios en distintos países han descripto que el ganado infectado

con Neospora caninum, es de tres a siete veces más propenso a sufrir pérdidas

fetales comparado con ganado no infectado y a su vez, se destaca que el

riesgo mayor se encuentra en la primer preñez (vaquillonas) (Thurmond y

Hietala, 1997; Moen et al. 1998; Wouda et al., 1998; Innes et al., 2002).

Los abortos pueden ser enzooticos o epizoóticos. Se define como un brote

epizoótico cuando un número mayor al 10% de las vacas en riesgo abortan en

un rango de 6 a 8 semanas. En rodeos con abortos enzooticos puede llegar a

haber hasta el 10% de pérdidas. Existen rodeos donde se han observado las 2

6

presentaciones a la vez (Moskwa et al., 2007). Una pequeña proporción de las

vacas (5%) puede llegar a repetir el aborto (Dubey et al., 2006).

Cuando hay reactivación de los bradizoitos por influencias hormonales e

inmunológicas o cuando hay una infección exógena en una hembra bovina

preñada se produce parasitemia (Buxton et al., 2002; Innes et al., 2002), los

taquizoitos no solo atraviesan la placenta originando necrosis e inflamación,

sino que también llegan al feto por vía sanguínea (Dubey, 2003; Moore et al.,

2005). En las células infectadas del feto, se inician procesos de multiplicación

mediante endodiogenia que ocasionan daño celular con necrosis e inflamación

o se forman quistes tisulares capaces de persistir durante toda la vida del

animal (Dubey y Lindsay, 1996).

Pueden existir diferentes desenlaces para la infección de una hembra bovina

preñada y esto depende principalmente de la etapa de gestación en la cual se

encuentre (temprana-media-tardia) (Innes et al., 2002). Si la vaca está en la

etapa de gestación temprana o primer trimestre, se producirá la muerte

embrionaria-fetal ocasionada principalmente por la presencia de citoquinas

proinflamatorias del tipo de respuesta Th1, con producción fuerte de IFN-

gamma en respuesta a la estimulación antigénica, esta controla la parasitosis

pero produce un daño irreversible en la conexión placentaria (Innes et al.,

2002).

En caso que la hembra bovina se encuentre en la etapa media de la gestación

(3 a 7 meses), se produce el aborto, el cual puede ser autolitico o momificarse,

o puede ocurrir el nacimiento de un ternero débil y anormal. En esta etapa, el

sistema inmune del feto es inmaduro y está imposibilitado de combatir

completamente la infección, además la preñez favorecida por una respuesta

Th2 compromete la resistencia materna al parásito ocasionándose un aumento

de la población de Neospora caninum con la posterior invasión de los

taquizoitos a la placenta y al feto. Dependiendo del mes de gestación ocurrirá

la perdida de la preñez o el nacimiento de un ternero anormal, débil, con

formación deficiente del SNC o encefalomielitis debido al daño tisular inducido

por los taquizoitos lo cual conlleva a síntomas neurológicos y a bajo peso al

nacer (Bryan et al., 1994; Innes et al., 2002; Haddad et al., 2005).

En el caso de una infección en el último trimestre de gestación puede haber

nacimiento de un ternero débil o de un ternero clínicamente normal pero

7

infectado congénitamente el cual es seropositivo precalostralmente a Neospora

caninum. Durante esta etapa el feto es, inmunológicamente, más maduro y ya

está capacitado para hacer frente a la infección aunque lo que no puede evitar

es la formación de quistes tisulares (Innes et al., 2002).

A pesar de no ser muy común, puede observarse en los terneros recién

nacidos congénitamente infectados, un peso de nacimiento disminuido y la

presencia de signos clínicos nerviosos (Dubey y Lindsay, 1996). Entre estos se

observan las extremidades flexionadas o hiperextendidas y al examen

neurológico puede observarse ataxia, disminución del reflejo patelar,

disminución propioceptiva (Dubey et al., 2006) y hasta parálisis completa

(Moskwa et al., 2007). También se reportaron exoftalmia o asimetría de los ojos

y ocasionalmente, defectos al nacimiento como escoliosis, hidrocefalia y

estrechamiento de la médula espinal (Dubey et al., 2006). Si bien estos

hallazgos son factibles, la mayoría de los terneros que adquieren la infección

durante la gestación nacen clínicamente normales (Moskwa et al., 2007).

Impacto económico

La principal pérdida económica ocasionada por la neosporosis se debe a los

problemas reproductivos, incluyendo pérdidas directas como abortos,

natimortos, muertes perinatales, incremento del intervalo parto concepción e

indirectas como la asistencia profesional, gastos asociados a establecer el

diagnóstico, además de los costos de reposición si las vacas abortadas son

eliminadas (Dubey et al., 2007; Moskwa et al., 2007).

Algunas investigaciones afirman que la enfermedad causa reducción en la

producción de carne y de leche, aunque todavía faltan estudios que ratifiquen

dichas observaciones (Hernández et al., 2001; Romero et al., 2005).

Una revisión bibliográfica realizada con el objetivo de evaluar las pérdidas

económicas causadas por N. caninum determino que la probabilidad de aborto

en vacas lecheras es de 14,3%, y en vacas para carne de 9,1%. La

seroprevalencia media mundial a N. caninum, fue de 16,1% (rango 3,8-89,2%),

siendo mayor en las vacas lecheras en comparación con la industria de la

carne, en la cual fue de 11,5% (rango 2,5-81,7%) (Reichel et al., 2013). El

promedio total de pérdidas en las industrias ganaderas de los países

encuestados (Argentina, Australia, Brasil, Canadá, España, Estados Unidos,

8

Holanda, Inglaterra, Nueva Zelanda) fue de U$ 1.298 millones por año. Cerca

de dos tercios de las pérdidas impactaron sobre la industria lechera (U$ 842,9

millones, 64,9%) y un tercio a la industria de carne (U$ 455,4 millones; 35,1%)

(Reichel et al., 2013).

Otro estudio realizado por Moore et al., (2013) el cual estimo las pérdidas

económicas causadas por el parasito en la región Argentina de la Pampa

Húmeda, determino que las poblaciones en riesgo para el ganado de leche y

de carne eran de 1.771.326 y 9.726.684 respectivamente y estableció que el

costo por aborto era de US$1.865 (rango 1.400–2.331) en el ganado lechero y

de US$440 (rango 150–730) en el ganado de carne. Al ganado lechero le

otorgó una posibilidad de aborto del 8% (rango, 5–12.9 %) de los cuales el

16,5% (rango, 12.6–36.5 %) se atribuyó como agente causal a N. Caninum, lo

cual derivaría en una pérdida anual para la industria de la leche de

US$43.607.430 (rango, 15.622.600–194.412.390). En el ganado de carne la

posibilidad de aborto fue de 4,5% (rango, 2,5–7,5 %) de los cuales el 6,7%

(rango, 3.1–7.9 %) es atribuido a N. caninum, así la pérdida anual para la

industria de la carne seria de US$12.903.440 (rango, 1.130.700–42.070.630)

(Moore et al., 2013).

Diagnóstico

Para establecer un diagnóstico de Neosporosis bovina es necesario tener en

cuenta la historia clínica y epidemiológica del rodeo, como así también la edad

de las vacas afectadas, el patrón de aborto, el estado de los mismos, otra cosa

a considerar es la presencia de hospedadores definitivos (perros), su existencia

y contacto con los bovinos ya que hay estudios que han encontrado asociación

entre brote de abortos, seroprevalencia a la enfermedad y presencia y cantidad

de caninos (Hobson et al., 2005; Schares et al., 2004).

Los datos mencionados anteriormente son importantes, pero no son suficientes

para establecer el diagnóstico definitivo. Para ello es menester recurrir a

técnicas de laboratorio, las cuales pueden ser agrupadas en técnicas directas

(detecta el agente o parte de ellos) y técnicas indirectas (detecta la presencia

de anticuerpos por contacto del agente con el sistema inmune).

Técnicas directas:

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Aislamiento

Puede utilizarse para recuperar el parasito a partir de tejidos sospechosos, la

inoculación en cultivos celulares y en ratón, el éxito estará ligado a la cantidad

de parásitos que posea la muestra y al grado de autolisis de la misma.

Inmunohistoquímica

Esta técnica, permite localizar el parasito en cortes de tejido, mediante la

utilización de un suero con anticuerpos específicos (Lindsay y Dubey, 1989).

Por lo general, los cortes que presentan lesiones compatibles con las causadas

por el agente son sometidos a esta prueba, con el fin de confirmar la presencia

de antígeno, taquizoítos enteros o quistes con bradizoítos en los tejidos

afectados. Hay que tener en cuenta que la sensibilidad de las técnicas

histológicas utilizadas con fines diagnósticos puede variar en función del

número de cortes histológicos analizados y del grado de autolisis de los tejidos.

Detección de ácidos nucleicos (PCR)

Las técnicas de detección de ácidos nucleicos sobre tejidos fetales basadas en

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) presentan una elevada

sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de la infección, siendo capaces de

detectar la presencia de un solo taquizoito (Gottstein et al., 1998). También

existe la PCR cuantitativa, la cual permite estimar la carga parasitaria de los

tejidos infectados (Collantes Fernández et al., 2002).

Técnicas indirectas:

Las pruebas serológicas tienen buena sensibilidad y especificidad, permiten el

análisis de los animales in vivo, establecen el diagnóstico y la epidemiologia de

la infección.

Las principales limitaciones residen en las discrepancias existentes entre los

diferentes laboratorios, en las propiedades de la técnica empleada y en las

oscilaciones de los niveles de anticuerpos específicos que se producen en los

animales infectados.

Las fluctuaciones de anticuerpos descriptas en el ganado bovino pueden influir

considerablemente en la sensibilidad de la técnica empleada. Todas las

técnicas serológicas resultan ser eficaces en la identificación de animales con

títulos de anticuerpos anti N. caninum moderados o altos, como consecuencia

de una recrudescencia de la infección. Sin embargo, las discrepancias entre las

10

diversas pruebas aparecen cuando se analizan sueros con bajos niveles de

anticuerpos (Dubey, 1999).

El propósito de las técnicas serológicas puede variar según se utilicen para el

diagnóstico de infección en fetos bovinos abortados recientemente,

determinación del estado de infección en bovinos individuales antes de su

compra o del ingreso a un rodeo, o estimación de prevalencia en estudios

epidemiológicos; por ello es que puede ser necesario utilizar diferentes puntos

de corte, por ejemplo el uso de un valor máximo de sensibilidad podría ser

interesante para investigar el estado de bovinos individuales antes de su

compra. Por el contrario, un valor de corte con un máximo de especificidad

podría utilizarse para evaluar la presencia de la enfermedad en un área

(Alvarez Garcia et al., 2003). El diagnóstico serológico deberá emplearse para

evaluar la exposición del rodeo y el riesgo de infección teniendo limitado valor

cuando se aplique individualmente (Anderson et al., 2000). La seropositividad

en un animal individual determina que está infectado pero esto no prueba que

la infección haya causado el aborto. Existen diferentes situaciones frente a las

cuales, el nivel de anticuerpos en un hospedador infectado puede ser bajo y no

alcanzar el punto de corte. Estas circunstancias incluyen vacas con fluctuación

o disminución de los niveles de anticuerpos, como ocurre varios meses

después del parto o aborto, vacas recientemente infectadas o terneros luego de

unos meses de nacidos (Atkinson et al., 2000).

El análisis de las muestras de madres e hijas y la edad de distribución de

animales seropositivos, contribuyen a determinar si la vía de transmisión en el

rodeo es predominantemente vertical u horizontal. Si predomina la vía vertical,

las madres y sus hijas serán seropositivas y hay una distribución uniforme de

animales seropositivos en los diferentes grupos de edad. Si en cambio, la que

predomina es la vía horizontal, los animales seropositivos están agrupados en

edades y hay una falta de asociación entre el estado serológico de las madres

y sus hijas. El análisis de los antecedentes del manejo y alimentación de los

grupos infectados, puede ayudar a definir el período más probable de infección

postnatal (Dubey et al., 2007).

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Esta técnica fue la primer prueba serológica aplicada a neosporosis (Dubey et

al, 1988) y fue la técnica más utilizada para diagnosticar la infección.

11

Esta técnica detecta anticuerpos que se unen a los antígenos localizados en la

superficie celular de N. caninum. Se considera resultado positivo cuando se

observa la fluorescencia en toda la superficie del taquizoíto (Paré et al., 1996)

que normalmente aparece cuando se analizan sueros con títulos moderados o

altos. El patrón de IFI varía cuando se analizan sueros con títulos bajos,

reduciéndose considerablemente la fluorescencia o quedando restringido a la

parte apical del taquizoíto.

Para su realización es necesario contar con experiencia previa, además la

interpretación de la prueba posee un alto grado de subjetividad. Los puntos de

corte empleados en la IFI varían entre los diferentes laboratorios. En general,

se emplean puntos de corte distintos para fetos y vacas. Un valor recomendado

de corte de IFI para detectar la infección es una dilución 1:200 en bovinos

adultos y 1:16-01:25 en los fluidos fetales (Pereira Bueno et al., 2003).

Enzimoinmunoensayo (ELISA)

El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una

enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto

inmunológica como enzimática pudiendo ser revelada mediante la adición de

un substrato específico que, en contacto con la enzima, producirá un color

observable a simple vista y cuantificable por un lector de densidad óptica. Se

han desarrollado numerosas pruebas de ELISA para la detección de

anticuerpos específicos, cuya sensibilidad es adecuada y la especificidad

elevada. La sencillez, rapidez de su realización, la interpretación objetiva de los

resultados, la capacidad de automatización y el bajo costo económico son

ventajas a tener en cuenta cuando se analizan un número elevado de

muestras.

El ELISA indirecto que emplea antígeno soluble, mezcla de antígenos

intracelulares y de membrana, de los diferentes aislados de N. caninum es la

técnica diagnóstica que se emplea con mayor frecuencia en la detección de

anticuerpos específicos en suero y líquidos fetales (Björkman et al., 1999).

Una variante de los ELISAs convencionales se ha desarrollado para detectar el

grado de avidez de IgG específicas (Björkman et al., 1999). El análisis de

avidez se basa en el hecho de que los anticuerpos sintetizados en los primeros

momentos de la infección tienen una menor afinidad que los que se generan

12

cuando la infección es más antigua. Esto permite diferenciar entre una

infección reciente y una infección crónica.

Dong et al., (2012) realizaron el desarrollo de un método de diagnóstico

utilizando proteínas recombinantes de N. caninum. Las proteínas co-

inmovilizadas fueron 3, de las cuales 2 de ellas pertenecían a proteínas de

membrana y la tercera pertenecía a una proteína de gránulos densos. Al co-

inmovilizar estas proteínas recombinantes, se desarrolló un nuevo ELISA

indirecto para la detección de neosporosis, con resultados muy buenos, ya que

se obtuvo una sensibilidad del 91,7% y una especificidad del 100%.

Campero et al., (2015) realizaron la evaluación, en la Argentina, de una prueba

de enzimoinmunoensayo, con el antígeno nativo de 38 kDa de N. caninum

(ELISA-p38) para el diagnóstico de la neosporosis bovina, utilizando un panel

de sueros bien caracterizados infectados de modo experimental o naturalmente

expuestos. También compararon el rendimiento y establecieron el nivel de

concordancia de tres pruebas serológicas para la detección de N. caninum,

ELISA-p38, inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inmunoblot (IB), con el mismo

panel de sueros.

La sensibilidad y especificidad relativa del ELISA-p38 fue 97,8 % y 99,5 %,

respectivamente, las pruebas exhibieron altos valores de sensibilidad y

especificidad (mayores del 95 %) y excelente concordancia.

Western blot

La técnica de Western blot es una técnica utilizada para detectar proteínas

específicas que actúan como antígenos inmunodominantes (Bjerkas et al.,

1994), razón por la cual se lo ha utilizado, fundamentalmente, para estudiar la

composición antigénica de N. caninum.

Es una técnica que se ha empleado en escasos estudios de rebaño como

apoyo a otras pruebas serológicas como IFI y ELISA más que como una

técnica rutinaria, para establecer valores de concordancia y puntos de corte

(Schares et al.,1998).

Aglutinación directa

La aglutinación directa se basa en la capacidad de aglutinación de los

taquizoítos en presencia de inmunoglobulinas específicas (Canada et al.,

2004). La prueba, posteriormente, ha incluido una modificación en la cual

únicamente se detectan IgG mientras que las IgM son destruidas mediante un

13

tratamiento con mercaptoetanol. En esta técnica de aglutinación directa

modificada se basan las pruebas diseñadas para el diagnóstico de la infección

por N. caninum. La prueba ha demostrado tener elevada sensibilidad (Packham

et al., 1998). Sin embargo, en la actualidad se debe evaluar su aplicación en

las diferentes especies, razón por la cual no ha reemplazado a las técnicas

serológicas de IFI y ELISA que se emplean de forma habitual en los estudios

epidemiológicos.

Histología

En muchos casos, el diagnóstico de la enfermedad se ha basado en la

detección de lesiones características y compatibles con aquellas causadas por

protozoos. La identificación del parásito en este tipo de estudios es muy difícil

debido a su similitud morfológica con T. gondii y Sarcocystis spp. y a que,

generalmente, el número de parásitos (taquizoítos y/o quistes) presentes en las

muestras es escaso. La observación de lesiones histológicas degenerativas e

inflamatorias típicas de las infecciones por protozoos, permiten emitir un

diagnóstico presuntivo de aborto por neosporosis. N. caninum se localiza con

mayor frecuencia en el cerebro, corazón y músculos de los fetos. Además es

probable la detección de taquizoítos del parásito en los tejidos de los fetos

abortados al principio de la gestación, apareciendo los quistes tisulares en

mayor número en los terneros mortinatos o en animales neonatos con

sintomatología y sacrificados antes de los 7 días de vida (Dubey & Lindsay,

1996).

Perspectivas para la vacunación

Hay tres opciones principales, para que el productor de ganado controle la

neosporosis, dentro de estas tres opciones tenemos: (1) eliminación y sacrificio

de animales positivos del rodeo. (2) tratamiento parasiticida. (3) vacunación.

Teniendo en cuenta estas opciones, la más rentable parece ser la última

variante, (Reichel & Ellis, 2006) es por ello que se vienen realizando

numerosos y exhaustivos estudios para desarrollar una vacuna contra la

infección por N. caninum.

Los estudios correspondientes in vivo sobre las interacciones hospedador-

parásito y las respuestas inmunológicas se han llevado a cabo principalmente

en pequeños modelos de laboratorio, como ratones y meriones. Estudios en

14

bovinos también han sido realizados, aunque estos tienen claramente la valiosa

ventaja de realizar investigaciones en el hospedador objetivo real, solo unos

pocos laboratorios tienen realmente las instalaciones para realizar estos

estudios. Muchos experimentos iniciales sobre vacunas candidatas se han

realizado en pequeños animales de laboratorio, principalmente en ratones

(Monney et al., 2011).

Básicamente, una vacuna eficaz contra la infección por N. caninum debe

cumplir los siguientes requisitos: (i) prevención de la proliferación y

diseminación de taquizoitos en bovinos preñados (u otros animales) para evitar

la transmisión transplacentaria al feto; (ii) prevención o reducción del

desprendimiento de ooquistes en perros (u otros hospedadores finales); (iii)

prevención de la formación de quistes tisulares en animales que han sido

infectados con oocistos o quistes tisulares (para evitar la transmisión del

parásito a hospedadores carnívoros) (Monney et al., 2011).

Para diseñar una vacuna efectiva contra la infección por N. caninum, se debe

considerar la inducción de la inmunidad de tipo Th1 y Th2. Para el ganado, la

importancia de la inmunidad celular de tipo Th1 se ha informado como

necesaria para el desarrollo de la inmunidad protectora, se ha demostrado que

la producción de IFN-γ e IL-12 en la etapa temprana de infección por N.

caninum desempeñó un papel crucial en el control de los parásitos. Por lo

tanto, una estrategia mediante la cual se induce la inmunidad celular será clave

para el desarrollo de vacunas para estos animales (Nishikawa, 2017).

La respuesta inmune tipo Th2, con producción predominante de anticuerpos

humorales específicos para antígenos del parásito, es capaz de mediar la

protección contra la neosporosis. Sin embargo, la transferencia de anticuerpos

contra NcSRS2 (antígeno de superficie del parasito) a ratones no inhibe la

transmisión vertical de N. caninum. Estos resultados sugieren que las

reacciones de anticuerpos específicos solos, no pueden proporcionar un control

efectivo de las infecciones por N. caninum. Debido a que N. caninum existe en

el citosol de la célula hospedador, los anticuerpos no pueden unirse a los

parásitos. No obstante, dado que la inmunidad celular puede destruir las

células infectadas por patógenos a través de las células T citotóxicas, este tipo

de inmunidad del hospedador contribuirá a la eliminación de las células

hospedadoras infectadas con N. caninum. Interferón-gamma (IFN-γ) e

15

interleucina-12 (IL-12), que son citocinas cruciales para el desarrollo de la

inmunidad de tipo Th1 (inmunidad celular), son importantes para obtener

inmunidad protectora contra infecciones agudas de N. caninum. En el caso de

infección, la producción de IL-12 e IFN-γ es detectable en animales

hospedadores. Los ratones deficientes en el gen IL-12 o el gen IFN-γ son

susceptibles a la infección por N. caninum, lo que indica la importancia de estas

citocinas en la inmunidad protectora del hospedador (Nishikawa, 2017).

Los diversos tipos de vacunas que han sido estudiados hasta el momento para

el control de la neosporosis como por ejemplo inmunógenos inactivos,

taquizoítos vivos, antígenos recombinantes, vacunas en vectores, vacunas

quiméricas y vacunas de ADN, han sido descriptos y analizados en diferentes

revisiones y trabajos como los realizados por Monney et al., (2011), Hecker et

al., (2012) e Innes et al., (2002). Estos diferentes tipos de vacunas varían en el

tipo de adyuvante y el tipo de antígeno utilizado.

Inmunógenos inactivos: aquí se destaca la vacuna a base de lisado de

taquizoitos, se han hecho diferentes ensayos y pruebas utilizando diferentes

tipos de adyuvantes. En este tipo de vacunas los resultados no fueron muy

satisfactorios, ya que el rango de protección alcanzado varió entre el 25 y el 60

%, este tipo de vacunas pueden ser utilizadas en rodeos con altos niveles de

infección (mayor al 21%) como una medida para bajar la prevalencia pero no

como para erradicar la enfermedad (Hecker et al., 2012).

Vacunas vivas: La utilización de las vacunas vivas para controlar la

neosporosis bovina, si bien ha demostrado ser efectiva, se encuentra limitada

debido a la posibilidad de generar infecciones crónicas con posterior

transmisión vertical.

Una vacuna viva, en general se logra sobre la base de poblaciones de

parásitos que han sido atenuados en una o más de sus características

fenotípicas. Las mutantes sensibles a temperaturas y los taquizoítos irradiados

son algunos ejemplos de estas poblaciones.

Se han aislado cepas de N. caninum de baja patogenicidad y ha habido

estudios en ratones con resultados esperanzadores. Aunque todavía faltan

publicaciones de experimentos en bovinos, esta puede ser una alternativa para

el desarrollo de una vacuna con alto porcentaje de protección (Hecker et al.,

2012).

16

Vacunas a subunidades: El desarrollo de vacunas con proteínas

recombinantes es otra de las posibilidades para la obtención de un inmunógeno

para mejorar el control de la neosporosis; no obstante, su participación en los

ensayos vacunales es aún limitada. Dentro de estas tenemos el uso de

proteínas de superficie y el uso de proteínas del complejo apical como

inmunógenos.

Las proteínas de superficie de los parásitos intracelulares son las primeras en

interactuar con la célula huésped y juegan un papel crítico en la infección,

NcSAG1 y NcSRS2 son dos de las proteínas de superficie localizadas en

la membrana del parásito que más se han estudiado hasta el momento,

ambas han sido probadas en modelos murinos, utilizadas solas con algún

adyuvante o en combinación con otras proteínas y se han encontrado

resultados positivos obteniendo buenos porcentajes de protección y

disminuyendo la incidencia de infección transplacentaria. A pesar de estos

buenos resultados todavía quedan realizar pruebas en bovinos para ver su

comportamiento en esta especie.

Las proteínas de los micronemas (proteínas del complejo apical) han sido

consideradas como posibles candidatos vacunales debido a que son

secretadas en el momento en que se produce la interacción física entre la

superficie del parásito y la célula del hospedador. Algunas de las proteínas que

han sido identificadas son NcMIC1, NsMIC2, NcMIC3, NcMIC4 y NcMIC10.

Estos antígenos han sido probados combinados o solos, con distintos

adyuvantes y distintas formulaciones, y ha habido resultados con buena

protección al desafío cerebral en los ratones pero la reducción del contagio

transplacentario fue solo parcial.

Las roptrias son organelas secretorias que se liberan en el momento de la

invasión al hospedador y su contenido facilita la propulsión del parásito dentro

de la célula una vez producido su ingreso. Hasta el momento, solo una proteína

de roptria (NcROP2) de N. caninum ha sido investigada como un posible

candidato vacunal, el cual ha reducido considerablemente la cantidad de

parásitos en cerebro, pero la transmisión transplacentaria fue del 100% con

baja incidencia de crías muertas (6%) (Hecker et al., 2012).

Vacunas de ADN: las vacunas de ADN están basadas en la inmunización con

un plásmido que contiene la información genética de uno o varios genes que

17

codifican proteínas inmunogénicas del parásito. En este tipo de vacunas hay un

estudio en el cual la protección alcanzada mediante la vacunación con dos

plásmidos fue de 54 y 47 % con lo cual se dedujo que estas vacunas

transfieren una protección parcial a la infección transplacentaria (Hecker et al.,

2012).

Vacunas en vectores: Los vectores biológicos recombinantes representan

también una opción interesante para el transporte de antígenos de N. caninum

al sistema inmunitario del hospedador susceptible. Entre los virus que actúan

como vectores de expresión, el Herpesvirus recombinante y el virus Vaccinia

han demostrado ser eficientes para infecciones parasitarias por protozoos. Se

realizó un trabajo inmunizando caninos vía nasal con Herpesvirus canino

recombinante que expresaba la proteína de superficie NcSRS2 y se logró la

producción de anticuerpos IgG contra N. caninum. Otro virus que se ha

utilizado como vector es el de Vaccinia. En un trabajo se realizó la vacunación

con virus Vaccinia recombinante que expresaba NcSAG1 o NcSRS2. Los

resultados evidenciaron que la inmunización con este recombinante pudo

proteger a los ratones ante el desafío con N. caninum. Más tarde, en otro

ensayo en ratones, la vacunación de las madres con Vaccinia recombinante

que expresaba NcSRS2 confirió protección efectiva contra la transmisión

vertical a las crías de ratones y no se detectó ADN de parásitos en el cerebro

de los animales analizados.

También ha sido utilizada la bacteria Brucella abortus como vector, obteniendo

resultados dispares, pero esta bacteria queda relegada al uso en ratones por

su riesgo de infección del ganado bovino tanto como el riesgo de infección en

el hombre (Hecker et al., 2012).

Cabe destacar los buenos resultados que se han obtenido al usar liposomas

recubiertos con manotriosa el cual es un trímero de la manosa (OML), como un

nuevo adyuvante para la inducción de respuestas inmunitarias Th1 y linfocitos

T citotóxicos (LTC) específicos para el antígeno encapsulado. Es importante

destacar que, en respuesta a la absorción de OML, las células fagocíticas

secretan IL-12 selectivamente y mejoran la expresión de moléculas

coestimuladoras, lo que indica su actividad adyuvante. Por lo tanto, los OML

atrapados en el antígeno de Neospora tienen potencial como una nueva

vacuna contra la infección por N. caninum. Nishikawa (2017) ha identificado la

18

proteína de granulo denso 7 (NcGRA7) y el antígeno de membrana apical 1

(NcAMA1) de N. caninum como antígenos vacunales candidatos y ha generado

OML atrapando estos antígenos. El NcGRA7 atrapado en OML y NcAMA1

indujeron la inmunidad celular y humoral específica de N. caninum, y evitaron la

transmisión vertical del parásito en ratones. Además, se observó inmunidad

celular y humoral contra N. caninum e infecciones cerebrales reducidas en

bovinos inmunizados con NcGRA7 atrapado en OML. Por lo tanto, a pesar de

que faltan investigaciones complementarias, OML podría usarse como una

vacuna nueva y efectiva para controlar la transmisión vertical y el aborto de la

neosporosis bovina (Nishikawa, 2017).

Tratamiento y medidas de control

Si bien no existen tratamientos en los bovinos que garanticen la eliminación del

agente, existe información de la sensibilidad in vitro de N. caninum a ciertos

antimicrobianos y coccidiostáticos (Moore et al., 2001). La administración de

monensina a razón de 40-120 mg/cabeza/día no resultó efectiva en bovinos

naturalmente infectados con N. caninum.

Debido a la diversidad de los factores de riesgo que podrían influenciar la

manifestación de la enfermedad, las estrategias de control son variadas y

deberían ser adoptadas en base a un análisis de costo-beneficio de cada

establecimiento en particular (Dubey et al., 2007).

En rebaños libres de N. caninum, la meta primaria es prevenir la introducción

de la infección mediante medidas estándar de bioseguridad (Haddad et al.,

2005). Mientras que en rebaños infectados con N. caninum, los programas de

control se basan en la disminución de la transmisión vertical en el rodeo

mediante la reducción del número de bovinos seropositivos y/o la disminución

del riesgo de transmisión horizontal de N. caninum (Dubey et al., 2007).

Como pautas para evitar el ingreso del agente al rodeo/granja y para

evitar/disminuir las posibilidades del contagio vertical u horizontal de la

enfermedad se postulan las siguientes medidas:

• Cuarentena y prueba serológica de todo el ganado que va a ser

introducido. Una de las herramientas más relevantes es comprar ganado de

reemplazo de rodeos libres de enfermedad o rodeos con registros de excelente

rendimiento reproductivo.

19

• Evitar que perros y otros potenciales hospedadores definitivos

contaminen con sus heces las pasturas y otras fuentes de alimento y agua.

Además, estos animales no deberían tener acceso a material posiblemente

infectado de hospedadores intermediarios como fetos, membranas fetales u

otros tejidos.

• Implementar un control integrado de roedores y reducir, de esta manera,

el potencial riesgo de infección que puede existir para los hospedadores

definitivos.

• Evitar los factores que probablemente favorezcan la reactivación de la

enfermedad en los bovinos infectados congénitamente como podrían ser el

suministro de alimento contaminado con micotoxinas, condiciones de estrés o

infecciones concomitantes por ejemplo con el virus de la DVB (Dubey et al.,

2007).

• Prueba y eliminación. Con el fin de determinar la extensión de la

infección por N. caninum en el rodeo, deben instituirse pruebas serológicas

sistemáticas de las poblaciones viejas y jóvenes (precalostralmente o después

de los 6 meses de edad para evitar falsos positivos de anticuerpos maternos)

para identificar a los animales infectados y no infectados, así como también

saber cuál es la principal vía de contagio en el rodeo. Con base en los

resultados de las pruebas serológicas, la cría selectiva de juveniles

seronegativos debería ser la columna vertebral para la reducción de la

prevalencia a largo plazo. En rebaños con una seroprevalencia superior al

30%, un solo ELISA positivo es suficiente para considerar un animal infectado y

una posible eliminación. En rebaños con una baja seroprevalencia, todos los

bovinos con más de 1 título de anticuerpos positivo, o un título de anticuerpos

positivos fuertes en una sola prueba, deben clasificarse como positivo a N.

caninum y considerado para el sacrificio (Haddad et al., 2005).

• Como medidas reproductivas para minimizar el contagio transplacentario

se propone el uso de transferencia embrionaria, desde donantes seropositivas

hacia receptoras seronegativas. Los embriones bovinos en estado de

preimplantación, están protegidos por la zona pelúcida contra la invasión de N.

caninum, por lo tanto, esta técnica puede ser usada para recuperar embriones

de gran valor genético de madres infectadas con el parásito.

20

• Otra medida reproductiva utilizada es el uso de semen de toros para

carne en rodeos lecheros en los cuales las madres infectadas están

identificadas, esto sirve para destinar las crias a venta y no quedarse con un

reemplazo el cual tiene altas posibilidades de ser seropositivo y continuar con

la infección en el rodeo (Dubey et al., 2007).

• Repetir el diagnóstico de gestación para confirmar el mantenimiento de

la preñez en el lote de vacas gestantes a los fines de detectar vacas abortadas

o con mantenimiento de fetos momificados en el útero (Moore et al., 2001).

Vale la pena recordar, que cada productor en particular, debe realizar un

análisis costo-beneficio antes de realizar cualquier medida de control y que

ninguna maniobra de las mencionadas anteriormente es efectiva si se aplica

por separado y no integrada en un plan de control de la enfermedad.

Conclusiones

La neosporosis ha demostrado ser una enfermedad distribuida mundialmente y

con un fuerte impacto económico en la producción ganadera, tanto de carne

como de leche. Al poseer un mecanismo de infección y de transmisión muy

variada y muy eficiente se ha tornado en una afección muy difícil de controlar

para los productores. A pesar de ello, ha habido grandes avances en el campo

del diagnóstico y de la vacunación.

En cuanto al diagnóstico, la prueba más utilizada durante años fue la

inmunofluorescencia indirecta, aunque actualmente se sigue usando, una mejor

alternativa ha pasado a ser la técnica de ELISA, ya que la misma brinda una

mayor capacidad para procesar muestras, posee un costo económico menor y

tiene capacidad de automatización.

Dentro de los ELISAs tenemos diferentes tipos, el más utilizado es el indirecto

que usa antígeno soluble, mezcla de antígenos intracelulares y de membrana,

de los diferentes aislados de N. caninum, tenemos el ELISA de avidez

(determina cronicidad) y también hay nuevos ELISAs como el desarrollado por

Dong et al., (2012) que utiliza 3 proteínas recombinantes y ha dado muy

buenos resultados al igual que el desarrollado por Campero et al., (2012) el

21

cual utiliza una proteína de 38 KDa (ELISA p-38) con muy buenos resultados

de especificidad y sensibilidad.

Teniendo en cuenta que no hay forma de curar a los animales ya infectados y

el costo que tiene la eliminación de todos los animales positivos, sumado a la

presencia de un ciclo biológico silvestre, pareciera que la alternativa más viable

seria la implementación de una vacuna que proteja del contagio y del aborto a

los animales.

Si bien en la actualidad no hay disponible en el mercado una vacuna eficaz

contra la neosporosis bovina, en los últimos años se han producido notables

avances en busca de un inmunógeno experimental contra la enfermedad.

Teniendo en cuenta los antecedentes en el desarrollo de vacunas vivas contra

otros protozoos, sería factible pensar en una vacuna de este tipo contra N.

caninum. Por otra parte, se ha avanzado en el estudio de vacunas inactivadas

y recombinantes en modelos murinos; sin embargo, se necesitan más trabajos

experimentales en bovinos.

22

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