NORMAARGENTINA

29012-162003

Calidad ambiental – Calidad del agua

Muestreo

Parte 16: Guía para el bioensayo demuestras

Environmental quality - Water qualitySamplingPart 16: Guidance on biotesting of samples

IRAM29012-16

Primera edición2003-11-25

Referencia Numérica:IRAM 29012-16:2003

IRAM 2003-11-25No está permitida la reproducción de ninguna de las partes de esta publicación porcualquier medio, incluyendo fotocopiado y microfilmación, sin permiso escrito del IRAM.

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Prefacio

El Instituto Argentino de Normalización (IRAM) es una asociacióncivil sin fines de lucro cuyas finalidades específicas, en su carácterde Organismo Argentino de Normalización, son establecer normastécnicas, sin limitaciones en los ámbitos que abarquen, además depropender al conocimiento y la aplicación de la normalizacióncomo base de la calidad, promoviendo las actividades decertificación de productos y de sistemas de la calidad en lasempresas para brindar seguridad al consumidor.

IRAM es el representante de la Argentina en la InternationalOrganization for Standardization (ISO), en la ComisiónPanamericana de Normas Técnicas (COPANT) y en la AsociaciónMERCOSUR de Normalización (AMN).

Esta norma IRAM es el fruto del consenso técnico entre losdiversos sectores involucrados, los que a través de susrepresentantes han intervenido en los Organismos de Estudio deNormas correspondientes.

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Índice

0 INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 5

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................... 6

2 NORMAS PARA CONSULTA ......................................................................... 6

3 MUESTREO .................................................................................................... 8

4 TRANSPORTE................................................................................................ 9

5 CONSERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO..................................................... 9

6 APARATOS Y EQUIPOS .............................................................................. 10

7 PRETRATAMIENTOY PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS .................... 10

8 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DURANTE EL ENSAYO.................. 18

9 LÍNEAS DIRECTRICES GENERALES PARA EL DISEÑO DELENSAYO........................................................................................................ 19

10 LÍNEAS DIRECTRICES ESPECIALES RELATIVAS ALFUNCIONAMIENTO DEL ENSAYO.............................................................. 21

11 BIOENSAYOS ESPECIALES ....................................................................... 24

12 EVALUACIÓN ............................................................................................... 28

13 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS .......................................................... 32

14 INFORME DE ENSAYO................................................................................ 33

15 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDADEN ENSAYOS BIOLÓGICOS ....................................................................... 34

Anexo A (Informativo) Mínima dilución inefectiva (MDI) ...................................... 37

Anexo B (Informativo) Bibliografía ....................................................................... 38

Anexo C (Informativo) Integrantes de los organismos de estudio ....................... 42

Página

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Calidad ambiental – Calidad del aguaMuestreo

Parte 16: Guía para el bioensayo de muestras

0 INTRODUCCIÓN

Importancia y utilidad

Los ensayos biológicos son adecuados paradeterminar el efecto de los parámetros físicos yquímicos en los organismos de ensayo bajocondiciones experimentales específicas. En prin-cipio, los métodos de análisis químico no sonadecuados para determinar los efectos biológi-cos. Estos efectos pueden ser de estimulación oinhibición, y pueden ser determinados por lareacción de los organismos, por ejemplo, muerte,crecimiento, proliferación, cambios morfológicos,fisiológicos o histológicos. Los efectos de inhibi-ción son desencadenados por los elementostóxicos del agua o por otras influencias nocivas.

Los efectos pueden manifestarse en varios ni-veles, desde estructuras subcelulares o sistemasde enzimas, hasta organismos completos y,eventualmente, hasta el nivel comunitario.

En el contexto de esta parte de la IRAM 29012,la toxicidad es la capacidad de una sustancia deejercer un efecto nocivo sobre los organismos ola biocenosis, debido a sus propiedades quími-cas y a su concentración.

El potencial nocivo de una sustancia tóxica pue-de ser contrarrestado por el sistema biológico,mediante, por ejemplo, las reacciones metabóli-cas que conducen a la detoxificación y laexcreción de tóxicos. La toxicidad aparente quese evalúa en el ensayo biológico es el resultadode la interacción entre la sustancia y el sistemabiológico.

Además del efecto tóxico directo de uno o másconstituyentes del agua, se pueden ejercerefectos dañinos en general sobre sistemas bio-lógicos por la acción combinada de todas lassustancias nocivas, incluso también por aquellas

sustancias que no son tóxicas por sí mismas, pe-ro afectan las propiedades químicas o físicas delmedio y, consecuentemente, las condiciones devida de los organismos. Esto se aplica, porejemplo, a las sustancias que agotan el oxígeno,sustancias coloreadas o material particulado quereduce la intensidad de la luz, así como efectosno relacionados con sustancias tales como eldeterioro o daño producido por temperaturas ex-tremas.

Los ensayos biológicos también incluyen aque-llos ensayos que estudian el efecto de losorganismos sobre las sustancias, por ejemplo,los estudios de biodegradación.

Los resultados de estos bioensayos se refieren,en primer lugar, a los organismos usados en elensayo y a las condiciones estipuladas en elprocedimiento de ensayo. Un efecto nocivo es-tablecido por medio de ensayos normalizadospuede alertar sobre un posible peligro para losorganismos acuáticos y la biocenosis. Sin em-bargo, estos resultados no permiten asegurarque en el ambiente acuático se produzcan efec-tos similares. Esta observación es particular-mente aplicable cuando no se trabaja con el or-ganismo entero, sino con células o enzimas, yaque propiedades importantes del organismo en-tero, tales como tegumentos protectores, meca-nismos de reparación, han sido desactivados.

Los resultados no permiten obtener conclusionesdirectas o por extrapolación acerca de efectossimilares en el medio acuático.

En principio, no hay organismo ni biocenosisque puedan ser usados para ensayar todos losefectos posibles sobre el ecosistema bajo lasdiversas condiciones abióticas y bióticas. Sola-mente unas pocas especies (especies modelo),que representen funciones ecológicas relevan-tes, pueden ser ensayadas en la práctica.Además de estas limitaciones fundamentales y

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prácticas en la selección de organismos de en-sayo, la muestra a ser ensayada puede tambiénplantear problemas experimentales para elbioensayo.

Las aguas, en particular las aguas de deshecho(aguas servidas, efluentes), son mezclas com-plejas y a menudo contienen sustancias pocosolubles, volátiles, inestables, coloreadas y/o aveces partículas coloidales en suspensión. Lacomplejidad y heterogeneidad de los materialesda lugar a una variedad de problemas experi-mentales cuando se realizan los bioensayos.

Ciertos problemas especiales están relacionadoscon la inestabilidad del material de ensayo debi-do a reacciones y procesos que pueden clasifi-carse de la siguiente manera:

− procesos físicos (por ejemplo, separación defases, sedimentación, volatilización);

− procesos químicos (por ejemplo, hidrólisis,fotodegradación, precipitación); y/o

− procesos biológicos (por ejemplo, biodegra-dación, biotransformación, captación por losorganismos).

Otros problemas, especialmente cuando se uti-lizan mediciones espectrofotométricas, se rela-cionan con la presencia de turbiedad y color.

Esta parte de la IRAM 29012 es una de unconjunto de normas relacionadas con el mues-treo de aguas. Debe ser leída en conjuncióncon las otras partes y en particular con lasPartes 1, 2 y 3.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta parte de la IRAM 29012 da una serie dedirectivas prácticas sobre el muestreo, pre-tratamiento, tratamiento y evaluación de lasaguas mediante los bioensayos. En ella se dainformación sobre cómo afrontar los problemasque se presentan en los bioensayos como con-secuencia de la naturaleza de la muestra deagua, además del adecuado diseño del ensayo.

Mediante la descripción de métodos satisfacto-riamente probados se intenta transmitir laexperiencia práctica para resolver o evitar al-gunos de los problemas experimentales que sedan en los bioensayos de aguas.

En la medida de lo posible, se ha hecho refe-rencia a normas o guías generales internacio-nales existentes.

Principalmente, se tratan problemas relaciona-dos con la sustancia a ensayar que puedantener influencia sobre el muestreo, pre-tratamiento y preparación de las muestras deagua en los bioensayos y tratamiento de lasmuestras durante el ensayo, especialmentecuando los ensayos se efectúan sobre aguas oaguas residuales que tienen constituyentesinestables o removibles. Se subrayan los prin-cipios básicos de aseguramiento de la calidad,evaluación y presentación de datos.

Se hace especial énfasis en los ensayos ecoto-xicológicos con organismos (bioensayos conuna única especie). Algunas características se-ñaladas en esta guía general se aplicantambién a estudios de biodegradación y/o bioa-cumulación en lo que se refiere al muestreo ypreparación de las muestras. Se aborda tam-bién la preparación de sustancias poco solu-bles y su ensayo por encima de su límite desolubilidad en agua.

Esta parte de IRAM 29012 no es aplicable alestudio bacteriológico del agua. En otras nor-mas internacionales se describen métodosapropiados.

2 NORMAS PARA CONSULTA

Los documentos normativos siguientes contie-nen disposiciones, las cuales, mediante su citaen el texto, se transforman en disposiciones váli-das para la presente norma IRAM. Las edicionesindicadas son las vigentes en el momento de supublicación. Todo documento es susceptible deser revisado y las partes que realicen acuerdosbasados en esta norma se deben esforzar parabuscar la posibilidad de aplicar sus edicionesmás recientes.

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Los organismos internacionales de normaliza-ción y el IRAM mantienen registros actualizadosde sus normas.

IRAM 25610:1994 - Agentes tensioactivos.Determinación del grado de biodegradabilidadúltima.

IRAM 29012-1:2002 - Calidad ambiental. Calidadde agua. Muestreo. Parte 1: Directivas generalespara el diseño de programas de muestreo.

IRAM 29012-2:1996 - Calidad del medio am-biente. Agua. Muestreo. Directivas generalessobre técnicas.

IRAM 29012-3:1998 - Calidad ambiental. Cali-dad del agua. Muestreo. Parte 3: Guía para lapreservación y manipulación de las muestras.

IRAM 29012-10:1995 - Medio ambiente. Cali-dad del agua. Muestreo de aguas residuales.

IRAM-ISO 9000:2000 - Sistemas de gestión dela calidad. Fundamentos y vocabulario.

IRAM-ISO 9001:2000 - Sistemas de gestión dela calidad. Requisitos.

IRAM-ISO 9004:2000 - Sistemas de gestión dela calidad. Directrices para la mejora del de-sempeño.

IRAM-ISO 19011 - Lineamientos sobre Audito-rías de Sistemas de Gestión de la Calidad yAmbientales. (En estudio).

ISO 7827:1994 - Water quality. Evaluation in anaqueous medium of the ultimate aerobicbiodegradability of organic compounds. Methodby analysis of dissolved organic carbon (DOC).

ISO 9408:1991 - Water quality .Evaluation in anaqueous medium of the ultimate aerobicbiodegradability of organic compounds -Methodby determining the oxygen demand in a closedrespirometer.

ISO 9439:1990 - Water quality. Evaluation in anaqueous medium of the ultimate aerobicbiodegradability of organic compounds. Methodby analysis released carbon dioxide.

ISO 9887:1992 - Water quality. Evaluation of theaerobic biodegradability of organic compounds inan aqueous medium. Semicontinuous activatedsludge method (SCAS).

ISO 9888:1991- Water quality. Evaluation of theaerobic biodegradability of organic compoundsin an aqueous medium. Static test (Zahn-Wellens method).

ISO 10634:1995 - Water quality. Guidance forthe preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequentevaluation of their biodegradability in anaqueous medium.

ISO 10707:1994 - Water quality. Evaluation inan aqueous medium of the ultimate aerobicbiodegradability of organic compounds. Methodby analysis of biochemical oxygen demand(closed bottle test).

ISO 10708:1995 - Water quality. Evaluation inan aqueous medium of the ultimate aerobicbiodegradability of organic compounds. Methodby determining the biochemical oxygen demandin a two-phase closed bottle test.

ISO 11733:1995 - Water quality. Evaluation ofthe elimination and biodegradability of organiccompounds in an aqueous medium. Activatedsludge simulation test.

ISO 11734:1995 - Water quality. Evaluation ofthe ultimate anaerobic biodegradability oforganic compounds in digested sludge. Methodby measurement of the biogas production.

ISO 14592-1:2002 - Water quality. Evaluation ofthe aerobic biodegradability of organic com-pounds at low concentrations. Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surfacewater/sediment suspensions.

ISO 14592-2:2002 - Water quality. Evaluation ofthe aerobic biodegradability of organic com-pounds at low concentrations. Part 2:Continuous flow river with attached biomass.

ISO 14593:1999 - Water quality. Evaluation inof the ultimate aerobic biodegradability of or-ganic compounds in aqueous medium. Method

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by the analysis of inorganic carbon in sealedvessels (CO2 headspace test).

ISOTR 15462, Water quality - Selection of testsfor biodegradability.

3 MUESTREO

3.1 Generalidades

La elección de puntos de muestreo representati-vos, la frecuencia del muestreo, el tipo demuestras tomadas, entre otros, depende del ob-jetivo del estudio. En general, el planteamientodel muestreo para análisis químico es compatiblecon los propósitos de los bioensayos.

No obstante, algunos ensayos requieren que elagua y el agua residual se manejen y conser-ven de una determinada manera.

Dependiendo del tipo de investigación (porejemplo, ensayos de toxicidad o de biodegra-dación) y de la manera en la que se procesenlas muestras, es necesario dividir una muestraen distintas fracciones que se conservan y/oalmacenan de diferente manera y se procesande formas distintas.

Si se han tomado varias muestras (por ejemplo,en distintos puntos, o en distinto momento) sepueden combinar para conseguir una mayorrepresentatividad. Es conveniente que estasmuestras se mezclen bien, y si es necesario, sedividan en submuestras. Para obtener sub-muestras de la misma calidad, es convenienteasegurarse que la muestra original conjuntamantenga su homogeneidad durante el procesode obtención de las submuestras, por ejemplo,mediante agitación o movimiento constante.Esto es de particular aplicación en el caso demezclas con dos fases, por ejemplo, aguas quecontengan partículas en suspensión o suspen-sión de algas. Se recomienda usar un sistemade muestreo refrigerado cuando se vayan acombinar varias muestras tomadas en diferen-tes momentos.

3.2 Recipientes de muestreo

El volumen, la forma y el material de los reci-pientes depende de la naturaleza de la muestra(por ejemplo, degradabilidad/estabilidad), delnúmero de réplicas, del volumen necesario pa-ra la realización de los ensayos, y de lanecesidad de preservar y almacenar las mues-tras antes de su procesamiento.

Es conveniente:

• minimizar el tiempo requerido para la con-gelación y descongelación, reduciendo elvolumen de muestra, es decir, el tamaño delrecipiente. En general, resulta apropiado uti-lizar recipientes de un litro para la congela-ción. Para aquellos ensayos que requieranvolúmenes más grandes, es convenienteque la muestra se reparta en recipientes devolumen no superior a 10 L;

• que el volumen total de muestra tomado seasuficiente como para permitir ensayos adicio-nales o repeticiones. Es conveniente que lassubmuestras congeladas sobrantes, que es-tén almacenadas separadamente, se guardenhasta que se haya efectuado la evaluación fi-nal;

• que el material de los recipientes sea quími-camente inerte, fácil de limpiar y resistenteal calentamiento y a la congelación. Se re-comienda utilizar recipientes de vidrio, depolietileno o de politetrafluoretileno (PTFE).

3.3 Nivel de llenado de los recipientes

Es conveniente decidir si los recipientes han dellenarse completamente hasta el borde o sóloparcialmente, dejando un espacio de aire,siempre teniendo en cuenta el tipo de muestra,el procedimiento de conservación y los ensayosprevistos.

El llenado parcial puede plantear los siguientesproblemas:

− potenciar la agitación durante el transporte, loque origina el desagregado de las partículas;

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− interacción con la fase gaseosa, provocandoliberación de sustancias;

− oxidación de sustancias, provocando, porejemplo, la precipitación de compuestos demetales pesados.

El llenado total puede plantear los siguientesproblemas:

− disminución del oxígeno y posible descom-posición, con formación de metabolitostóxicos (por ejemplo, nitrito, sulfuro);

− homogeneización deficiente por falta deagitación o movimiento del volumen total.

No es conveniente llenar completamente los re-cipientes de muestras cuando se va a proceder acongelación como modo de conservación,puesto que se produce un aumento de volumen.

4 TRANSPORTE

Es conveniente que las muestras tomadas seprotejan frente al riesgo de ruptura, incremen-tos de temperatura y frente a la contaminaciónexterna. Se recomienda evitar la posible confu-sión en la identificación de las muestras que setransportan en hielo semi fundido, utilizandomarcadores o etiquetas resistentes al agua.

5 CONSERVACIÓN YALMACENAMIENTO

Como se indica en la Norma IRAM 29012-3 esimposible dar normas generales de conserva-ción, por ejemplo, tiempo de conservación yeficacia de los distintos métodos, ya que depen-de principalmente de la naturaleza de la muestray, en particular, de su actividad biológica.

Las aguas potables y las aguas subterráneasson generalmente menos susceptibles a lasreacciones químicas y biológicas que las aguassuperficiales y las aguas residuales crudas otratadas. Si se puede conocer anticipadamentesu composición química aproximada, es con-

veniente referirse a la IRAM 29012-3 con vistasa su ensayo biológico. De todos modos, se de-ben considerar algunas precauciones adicio-nales, que se describen a continuación.

Es conveniente que las muestras destinadas aensayos biológicos se procesen, preferente-mente sin demora, después de su recolección,para evitar cambios en la composición originalcomo resultado de reacciones físicas o quími-cas y/o procesos biológicos. Es convenienteque la duración máxima de su conservación nosea superior a 12 h a temperatura ambiente(máximo 25 °C). Es conveniente conservar lasmuestras en la oscuridad para prevenir el cre-cimiento de algas.

Si no es posible realizar el ensayo casi inme-diatamente después del muestreo (o de lapreparación de la muestra), por ejemplo cuan-do se preparan muestras compuestas, serecomienda enfriar o congelar.

EI método más común y el más recomendadopara la conservación de las muestras de aguaresidual es enfriar a una temperatura compren-dida entre 0 °C y 5 °C. Cuando se enfría a estatemperatura y se mantiene en la oscuridad, lamayoría de las muestras son estables durante24 h (ver IRAM 29012-10). El proceso de en-friamiento debe aplicarse lo más pronto posibleluego del muestreo, ya sea en el campo, porejemplo, en cajas con hielo semi fundido, o enun refrigerador en el vehículo que transportelas muestras.

La congelación a temperatura inferior a -18 °C deacuerdo con la IRAM 29012-10 permite, gene-ralmente, un incremento en el tiempo deconservación. En términos generales, los perío-dos máximos de conservación están compren-didos entre unas cuantas semanas y 2 meses,dependiendo de la estabilidad de las muestras.

La experiencia ha demostrado que la calidaddel agua residual puede quedar afectada tantoen el procedimiento de congelación como des-congelación.

Para bioensayos ha de excluirse el empleo deconservantes de carácter biocida. Para estabili-zar las muestras tampoco se recomienda la adi-

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ción de ácidos o bases muy concentrados como,por ejemplo, HCl o NaOH.

Es conveniente remarcar que en caso de duda,el analista químico y el biológico deben consul-tarse antes de decidir cuál es el método a aplicarpara la manipulación y conservación de lasmuestras. Si las técnicas de conservación paraanálisis químicos y para bioensayos no soncompatibles, se debe disponer de submuestrasseparadas para los distintos propósitos.

6 APARATOS Y EQUIPOS

6.1 Selección de los dispositivos

El tipo, tamaño y material del equipamientotécnico dependen del ensayo y de la naturalezade la muestra. Es conveniente que todos losmateriales que entren en contacto con lamuestra a ensayar sean tales que se reduzcana un mínimo las interferencias causadas poradsorción/absorción o difusión de componentesde la muestra, por elución de materias extrañas(por ejemplo, plastificantes) o por crecimientode organismos. Resultan adecuados materialesinertes como, por ejemplo, vidrio y PTFE. Esconveniente que los tubos de conexión sean lomás cortos posible y que se reemplacen perió-dicamente. Es conveniente evitar la contami-nación del material a ensayar, por ejemplo, porla grasa que se utiliza en los tapones o cone-xiones. Los tubos de cobre, aleación de cobre oplásticos no inertes no resultan apropiados.

6.2 Silanización

Para minimizar la adsorción de los componen-tes de la muestra pueden silanizarse losrecipientes, tuberías, tubos, material de vidrio omaterial plástico, sumergiéndolos en o enjua-gándolos con una solución al 5 % en peso dediclorodimetilsilano en cloroformo o heptano. A

medida que se evapora el disolvente orgánico,se deposita silano sobre la superficie, que debeenjuagarse repetidas veces con agua o calen-tarse a 180 °C durante 2 h antes de su utiliza-ción (salvo los materiales plásticos). Solamentees conveniente utilizar la silanización si se vana ensayar sustancias o constituyentes del aguacuya adsorción sea intensa y no se dispongade un material inerte adecuado (por ejemplo,PTFE).

6.3 Limpieza de los dispositivos y equipos

Antes de su utilización, es conveniente limpiarlos dispositivos y equipos con agentes de lim-pieza adecuados, por ejemplo, ácido clorhídri-co, hidróxido de sodio, detergentes, etanol, áci-do sulfúrico/peróxido de hidrógeno y, si proce-de, esterilizar térmicamente o por vía química(por ejemplo, con solución de hipoclorito). Noes conveniente utilizar mezcla sulfocrómica.

El enjuague repetido de los dispositivos conagua destilada (o agua de igual grado de pure-za), asegura que no queden restos o trazas delagente de limpieza o desinfección.

Para eliminar de manera eficaz restos proce-dentes del uso previo del material, serecomienda lavar con ácido antes de un ex-haustivo enjuague final con agua destilada.

7 PRETRATAMIENTOY PREPARACIÓNDE LAS MUESTRAS

7.1 Generalidades

El siguiente diagrama (figura 1) contiene infor-mación o términos comúnmente utilizados en lasnormas y guías generales para ensayos biológi-cos.

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Figura 1 - Preparación de muestras para ensayo biológico

La muestra es una preparación, en forma sólidao de disolución, de una sustancia química, unamezcla de varias sustancias, agua o agua resi-dual. La muestra de ensayo se obtiene a partirde la muestra original tras varias etapas depreparación específicas para la muestra y elensayo, por ejemplo, por disolución, homoge-neización, sedimentación, filtración, neutraliza-ción o aireación. Se añade agua de dilución pa-ra preparar una serie de diluciones definidas.Después de añadir el medio nutritivo específicodel ensayo, se obtiene el medio de ensayo (queincluye la muestra de ensayo).

El lote de ensayo final se obtiene añadiendo losorganismos de ensayo - en el caso de microor-ganismos se denomina el inóculo -. El lote de

control, o varios en paralelo, se preparan conuna mezcla de agua de dilución y solución nu-tritiva con los organismos de ensayo y sin lamuestra de ensayo.

Cuando el efecto o el comportamiento de unasustancia se conoce a partir de ensayos ante-riores ('sustancia de referencia') y cuando estasustancia se analiza en el marco de una seriede ensayos como muestra de ensayo, se de-nomina lote de referencia.

7.2 Descongelación

Es conveniente que se descongelen las mues-tras que se han conservado congeladas inme-diatamente antes de su utilización. Se reco-

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mienda utilizar agua corriente o agua templadaa una temperatura no superior a 25 °C y apli-cando una ligera agitación, para evitar sobreca-lentamientos locales.

Es esencial una completa descongelación delas muestras antes de su utilización, ya que elproceso de congelación puede tener el efectode concentrar algunos componentes en la parteinterna de la muestra, que se congela más tar-de. El tratamiento con microondas involucra elriesgo de sobrecalentamiento, por lo que no serecomienda su uso para la descongelación delas muestras.

7.3 Homogeneización

Es conveniente asegurar una distribución uni-forme de todos los componentes solubles y enforma particulada.

Dependiendo de la naturaleza de las muestras,se puede aplicar agitación suave o vigorosa,tratamiento con ultrasonidos y dispersión me-cánica a alta velocidad. Durante esta etapa deltratamiento, es conveniente prestar atención ala pérdida potencial de componentes volátiles.

Como regla general, es conveniente tomar lasprecauciones adecuadas para recuperar el es-tado original de la muestra o, al menos, queésta sufra la mínima alteración posible.

7.4 Separación del material particulado

En general, los ensayos biológicos se efectúansobre la muestra original. Sin embargo, en al-gunos casos, cantidades elevadas de materiaen forma particulada, lodos y sedimentos, inter-fieren con los requerimientos de los organismosde ensayo (obturación de las branquias de lospeces, entorpecimiento de la alimentación porfiltración de los organismos filtradores, limita-ción del ingreso de luz en ensayos con algas).

En el caso en el cual no se quiera evaluar estetipo de efectos, tales interferencias puedenevitarse o superarse de varias maneras.

Las aguas ricas en partículas pueden ocasionarinterferencias, por ejemplo, en la cuantificacióncon un contador de partículas. El recuento mi-croscópico también se ve fuertemente perjudica-

do. La dosificación en continuo puede ser pococonfiable por la posible obstrucción de los tubos.

Sin embargo, la filtración, la centrifugación yotros métodos de separación implican el riesgode que los componentes activos que estánasociados a las partículas queden eliminadosantes del comienzo del ensayo. Además, espreciso tener en cuenta los problemas relacio-nados con la filtración, como, por ejemplo, laadsorción sobre los materiales filtrantes y laposible lixiviación de los componentes del filtro.La sedimentación y la centrifugación obvianestos problemas. Cuando la realización de losensayos en presencia de partículas ocasioneproblemas, se recomienda dejar sedimentar lamuestra durante un período comprendido entre30 min y 2 h o efectuar una filtración (mayora 50 µm), lo cual elimina únicamente las partí-culas gruesas. La materia particulada separadapuede ser examinada independientemente.

Algunos métodos de ensayo ofrecen la posibili-dad de determinar un factor de corrección paraparámetros como la turbiedad.

Las aguas ricas en bacterias interfieren en losensayos relacionados con la actividad bacteria-na, por ejemplo, la inhibición de la respiración. Lainterferencia debida a la actividad de las bacte-rias en la muestra puede estimarse, al menosparcialmente, realizando los controles adecua-dos. Al ensayar ciertas algas, huevos y estadiosiniciales de peces o cultivos celulares, puedenproducirse interferencias por infecciones bacte-rianas. Todos los métodos de esterilizacióndisponibles, como el tratamiento térmico o conradiación UV o la filtración por membrana(0,2 µm) conllevan un alto riesgo de efectos nodeseados. Cuando se necesita realizar una filtra-ción es preferible efectuarla sobre un filtro defibra de vidrio. En general, la centrifugación, porejemplo, 10 min a 4 500 g ± 1 500 g, es preferi-ble a la filtración.

7.5 Preconcentración

La preconcentración de las muestras incre-menta la concentración, no solamente de lassustancias nocivas sino también de otros cons-tituyentes del agua, que probablemente puedanser dañinos en concentraciones más elevadas.

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Además, es esencial tomar en consideraciónque, en cualquier caso, la preconcentración esselectiva dependiendo del procedimiento aplica-do. Esto altera el perfil original de composiciónde los constituyentes del agua, por ejemplo:

− la evaporación y la liofilización pueden origi-nar una pérdida de sustancias volátiles yaumentar la fuerza iónica y la presión osmó-tica;

− la ultrafiltración puede originar una pérdidaselectiva de moléculas pequeñas capacesde atravesar la membrana;

− la extracción líquido/líquido con solventesorgánicos y la extracción en fase sólida poradsorción sobre sólidos (por ejemplo, resi-nas XAD) es particularmente eficiente paralos componentes hidrófobos de la muestra.La presión osmótica y la fuerza iónica pue-den verse reducidas. Los iones tóxicos, lassustancias químicas polares y otros compo-nentes de la fase acuosa, tales como losácidos húmicos, pueden quedar excluidos(por ejemplo, por enmascaramiento).

El incremento de la concentración por encimadel límite de solubilidad puede originar la preci-pitación o la floculación de sustancias previa-mente disueltas.

La bioacumulación no se puede simular me-diante la preconcentración de las muestras, yaque los factores de bioconcentración (FBC) nopueden relacionarse o extrapolarse.

La concentración de ciertos compuestos pre-sentes en la muestra de agua puede originarque se produzcan reacciones químicas a mayorvelocidad que en la muestra original.

Solamente se pueden obtener valores apropia-dos de blanco si se dispone de muestras dereferencia no contaminadas, como por ejemplo,provenientes de aguas arriba de la fuente decontaminación. El incremento de salinidad pue-de aceptarse si se preparan blancos con igualpresión osmótica y similar composición iónica(ejemplo, relación Na:K).

No es posible extrapolar, a partir de los ensayosde toxicidad aguda con muestras preconcentra-

das, los efectos crónicos de la muestra original.Por lo tanto, es preferible seleccionar un sistemade ensayo más sensible o prolongar el tiempo deexposición a preconcentrar una muestra. Si nohay un método sensible disponible para ensayarla muestra original y se aplica un procedimientode preconcentración, los resultados son tantomás discutibles cuanto mayor es el factor deconcentración.

Por las razones anteriormente mencionadas, losensayos de toxicidad aguda y de toxicidad cróni-ca con muestras preconcentradas carecen designificado y no se recomiendan. En todos loscasos conviene interpretar los resultados obteni-dos en ensayos con muestras de agua precon-centradas con extrema precaución. No es posi-ble normalizar investigaciones preliminares deeste tipo y es conveniente que sean validadaspor ulteriores investigaciones más completas.

7.6 Ajuste de pH

La selección del valor de pH al que se va aajustar la muestra depende del objetivo del en-sayo:

− el ajuste del pH igual al del agua que recibela descarga, produce resultados más repre-sentativos del efecto de los tóxicos una vezen el ambiente;

− el ajuste a un valor definido de pH compren-dido entre 6 y 9 (que usualmente estolerable por la biota acuática) permite ponerde manifiesto tóxicos ionizables que, de otromodo, quedan enmascarados por condicio-nes de pH fuera de este intervalo.

Normalmente, hay que neutralizar las muestrascon valores extremos de pH que exceden loslímites de tolerancia de los organismos de en-sayo. Es conveniente omitir la neutralización sise trata de analizar el efecto del pH en el re-sultado del ensayo o si se observan cambiosfísicos o reacciones químicas (por ejemplo,precipitación) como consecuencia del ajuste depH. Es conveniente que la concentración delácido o de la base requerida para la neutraliza-ción sea tal que el cambio de volumen sea elmínimo posible. Es conveniente evitar sobrepa-sar el punto de neutralización.

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Es conveniente que los agentes neutralizantesno reaccionen con los constituyentes de lamuestra, ya que pueden, por ejemplo, originarprecipitación o formación de complejos. Además,conviene que no afecten al organismo de ensa-yo, ya sea por activación o por inhibición.Normalmente, se recomienda utilizar solucionesde ácido clorhídrico o de hidróxido de sodio.

7.7 Preparación de las soluciones madre ylotes de ensayo

7.7.1 Sustancias solubles en agua

Cuando se prepara la solución madre, no esconveniente que la cantidad de sustancia pe-sada supere la cantidad máxima que puededisolverse (menor que la concentración de sa-turación). Se puede aumentar la cinética dedisolución por agitación y/o calentamiento. Noes conveniente que esto provoque, sin embar-go, pérdidas de sustancia o descomposicióntérmica de la muestra de ensayo.

7.7.2 Emulsiones y suspensiones

Si no se obtiene una distribución homogéneaen la solución madre, es conveniente agitar oremover la muestra durante un período detiempo no superior a un día.

7.7.3 Sustancias poco solubles

7.7.3.1 Generalidades

Es conveniente considerar como poco solublesaquellas sustancias cuya solubilidad en aguasea inferior a, aproximadamente, 100 mg/L.Cuando se están examinando sustancias pocosolubles, hay que asegurarse que la materia sindisolver no quede en forma de sedimento, departículas flotantes o de dispersión. Por lo tan-to, para obtener resultados seguros y reprodu-cibles, al utilizar estos métodos hay que asegu-rarse de que se obtiene una distribución lo máshomogénea posible del compuesto a ensayaren el lote de ensayo.

En caso de ensayos de toxicidad, es aconseja-ble, primero, asegurarse si la sustancia tieneefectos en el intervalo de su solubilidad enagua. Es conveniente tener presente que en elcaso de algunas sustancias puras, algunas ve-

ces hay superposición entre sistemas condispersiones moleculares, micelares, coloidalese incluso con dispersiones de partículas grue-sas (ejemplo: tensioactivos isoméricamentepuros). En el caso de mezclas de isómeros, porejemplo, isómeros tensioactivos no hay un lí-mite especifico de solubilidad de la sustancia.Los métodos ópticos simples (por ejemplo, me-didas de dispersión de la luz) no permiten ladeterminación fiable del grado de dispersión.

Es imposible recomendar un único método paragenerar una solución o distribución óptima delas sustancias en el medio, ya que el métodoseleccionado debe corresponderse con laspropiedades físicas de la sustancia en cuestión.Por esta razón, la elección de un método ade-cuado se deja a criterio de la experiencia delinvestigador y/o a la información aportada porel fabricante de la sustancia.

Las siguientes recomendaciones generales sederivan de experiencias prácticas y proporcio-nan consejos sobre los modos y medios quepermitan al investigador, una vez evaluados lospros y los contras, seleccionar el método másadecuado.

7.7.3.2 Ensayos en el intervalo de solubili-dad en agua

Con este fin, se mezcla por agitación una can-tidad, definida por pesada, de sustancia (porejemplo, 100 mg) con 1 L de agua destilada du-rante aproximadamente 24 h, preferiblementeen la oscuridad. Se debe informar la cantidadutilizada para la preparación de la solución ma-dre. Tras la separación de fases, la fase nodisuelta se separa completamente por filtración(en caso necesario, utilizando un filtro de mem-brana de 0,2 µm de tamaño de poro) o porcentrifugación. Las series de diluciones se pre-paran con la fase acuosa. Según convenga ydependiendo de las propiedades de la sustan-cia (por ejemplo, elevada viscosidad odescomposición en agua), es conveniente con-siderar tiempos más largos o más cortos demezclado, siendo necesario, eventualmente, eluso de agentes aditivos.

NOTA: Dependiendo de las sustancias a ensayar, lastécnicas de filtración y de centrifugación pueden conducira la obtención de resultados diferentes.

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Si la solubilidad se ve reducida por la adiciónde constituyentes del medio (por ejemplo, salesnutritivas), resulta ventajoso preparar una solu-ción saturada por mezclado de la sustancia conel medio de ensayo. En algunos casos indivi-duales, es conveniente considerar la sustituciónde las sales (por ejemplo, iones Ca o Mg) porotras (por ejemplo, iones Na o K), que no origi-nen precipitados, siempre que el bioensayo arealizar lo permita.

Puede conseguirse una buena distribución defluidos de alta viscosidad mediante moliendamecánica a bajas temperaturas (por ejemplo,utilizando nitrógeno líquido y posterior tritura-ción en un molino de bolas).

Los filtros para recoger los constituyentes nodisueltos deben ser templados (filtros inorgáni-cos). Generalmente, el uso de materialesfiltrantes inorgánicos produce menores pérdi-das que si se emplean filtros de tipo orgánico.Los filtros orgánicos requieren un tratamientorepetido con agua destilada hirviendo paraasegurarse de que no se transfieran compo-nentes constitutivos del material del filtro a lasolución de ensayo. No son recomendables losfiltros de acetato de celulosa. Dependiendo delmaterial del filtro, la filtración puede retener nosolamente los constituyentes no disueltos sinoque también puede haber pérdidas por adsor-ción/absorción de sustancias disueltas. Aconcentraciones menores a 1 mg/L esto puedeoriginar una perdida considerable de sustancia.Las pérdidas pueden reducirse descartando laprimera porción de filtrado.

Existe una variedad de métodos mecánicos yquímicos para alcanzar la concentración desaturación. Sin embargo, debe tenerse pre-sente que es conveniente dar prioridad a losmecánicos para preparar soluciones saturadas.Solamente se recomienda recurrir a los méto-dos químicos (ácidos, bases, disolventes) encasos excepcionales.

Los medios que pueden utilizarse para alcanzarla concentración de saturación, son los si-guientes:

a) Sonicación/mezclador de alta velocidad(ventaja: mayor velocidad de disolución;desventajas: mayor dificultad para la sepa-

ración de fases, posible descomposición ycalentamiento por aporte de energía). En laISO 10634 se dan más detalles al respecto.

b) Aumento de temperatura (ventaja: usual-mente mayor solubilidad y mayor velocidadde disolución; desventajas: aumenta lavolatilización, riesgo de descomposición yreacciones de hidrólisis, posibilidad de so-bresaturación con posterior precipitaciónretardada). No resulta conveniente enfriarlas soluciones saturadas.

c) Uso de ácidos/bases con la subsiguienteneutralización (ventaja: aprovechamientode la mayor solubilidad de la forma proto-nada o no protonada; desventajas: sola-mente es aplicable en casos excepciona-les, a valores extremos de pH hay riesgode cambios químicos en la muestra de en-sayo, por ejemplo, por hidrólisis y, algunasveces, un restablecimiento muy lento delequilibrio tras la neutralización, por ejem-plo: ácidos grasos/jabones).

d) Disolución de la sustancia en un solventevolátil, no-miscible con el agua (por ejem-plo, n-hexano o éter de petróleo) que sepurga después del mezclado con agua(ventaja: distribución fina y rápida de lasustancia a ensayar; desventajas: puedeproducirse arrastre y pérdida de la sustan-cia a ensayar; no se puede evitar quequeden pequeños residuos de solvente enel lote de ensayo).

e) Disolución de la sustancia en un solvente,miscible en el agua (por ejemplo, etanol,acetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, di-metilformamida). Es conveniente conside-rar, a la hora de seleccionar el solvente, sucapacidad de solubilización, toxicidad, de-gradabilidad y volatilidad. Los agentes desolubilización (concentración menor a0,1 g/L) permanecen durante un ciertotiempo en la serie de ensayo. Es improba-ble que produzcan un incremento conside-rable en la concentración de saturación enagua; más bien producen una distribuciónfina y rápida de la sustancia de ensayo enla solución madre. Es necesario un lote decontrol adicional con la concentración má-xima de solvente utilizada en el ensayo.

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Incluso aunque no se observen efectos no-civos, no se puede excluir que la presenciadel solvente afecte a la acción de la sus-tancia de ensayo sobre los organismos deensayo, por ejemplo contribuyendo al pasoa través de la membrana/pared celular.

f) Adsorción/Absorción de la sustancia en unsoporte inerte. Puede prepararse una solu-ción acuosa saturada por aplicación de lasustancia, utilizando un solvente volátil co-mo n-hexano o éter de petróleo en casonecesario, sobre un soporte inerte (porejemplo, perlas de vidrio, gel de sílice, resi-nas cromatográficas). Esto se introduce enun sistema de flujo y se lava con agua. Lassustancias a disolver están frecuentementedisponibles en forma de verdadera disper-sión molecular.

7.7.3.3 Ensayos por encima del límite desolubilidad

En estudios de degradación, se ensayan even-tualmente sustancias poco solubles por encimade su límite de solubilidad. Es importante conse-guir un alto grado de distribución para la materiano disuelta, con objeto de asegurar un área decontacto amplia entre los microorganismos y lasustancia. Siempre es necesario agitar los lotesde ensayo a lo largo del ensayo con el objeto degarantizar una resuspensión y disolución cons-tante de la sustancia. Se recomienda utilizar lossiguientes métodos:

a) Dosificación directa

La sustancia se introduce directamente en ellote de ensayo. Los portaobjetos de micros-copio resultan adecuados para la introduc-ción de sustancias sólidas o de líquidos dealta viscosidad. Con frecuencia se utilizan,como solubilizantes, solventes miscibles conel agua, no tóxicos y no degradables como,por ejemplo, dimetilsulfóxido (ver 7.7.3.2).Esta técnica queda restringida a sustanciasde ensayo no volátiles.

b) Tratamiento con ultrasonidos

El tratamiento con ultrasonidos (por ejem-plo, 20 kHz, 30 min) permite conseguir confrecuencia una dispersión mecánica sufi-

cientemente estable, que después de15 min a 30 min de decantación, puededistribuirse directamente a cada uno de loslotes de ensayo. Son necesarios métodosanalíticos adecuados, por ejemplo, Carbo-no orgánico total (COT) o análisis específi-cos, para determinar la concentración ini-cial en el lote de ensayo.

c) Adsorción de la sustancia en un soporteinerte

Es conveniente que este método esté enconsonancia con los procedimientos men-cionados en el apartado 7.7.3.2 f) (adsor-ción de la sustancia en un soporte inerte).El soporte con la sustancia a ensayar ho-mogéneamente aplicada es ahora un cons-tituyente del lote de ensayo. Este métodono resulta adecuado para sustancias volá-tiles que se eliminan durante la aplicación ysubsecuente secado del soporte.

d) Dispersión de la sustancia con un agenteemulsionante

Es conveniente que los agentes emulsio-nantes, en la concentración utilizada (apro-ximadamente a 100 mg/L), sean estables yno tóxicos a lo largo del período de ensayo.Como agentes emulsionantes se puedenutilizar las siguientes sustancias:

− monolaurato de polietilen sorbitol;

− trioleato de polietilen sorbitol;

− nonilfenol-20 EO-acetal (muy adecuadopara ensayos de degradación);

− aceite de ricino modificado (menos ade-cuado para ensayos de degradación);

− copolímeros de óxido de eteno/óxido depropeno (adecuados para ensayos dedegradación).

Para preparar una emulsión químicamente es-table, se recomienda mezclar la sustancia aensayar con el agente emulsionante antes desu introducción en agua. En caso de utilizar unsolvente volátil adicional, no-miscible con elagua (por ejemplo n-hexano o éter de petróleo)para la preparación de una emulsión, es con-

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veniente remover el solvente adicional de lamuestra a ensayar antes de la incorporacióndel organismo de ensayo.

Generalmente, las sustancias sólidas poco so-lubles no se ensayan por encima de su límitede solubilidad, excepto que se trate de:

− sustancias sólidas fácilmente dispersables;

− sustancias sólidas que se comercializan co-mo dispersiones; o

− sustancias que, cuando se manipulan ade-cuadamente, entran en contacto con agentesemulsionantes.

No es recomendable efectuar estudios de bioa-cumulación y bioensayos a largo plazo porencima del límite de solubilidad.

La propensión de una sustancia a dispersarseen el agua depende sobre todo de su densidad,de su viscosidad y de su tensión superficial.Aumentando el aporte de energía, se puedeobtener un tamaño de partícula menor y a me-nudo con ello una mayor estabilidad de ladispersión. Sin embargo, existen indicios deque el efecto nocivo de una emulsión está tam-bién influenciado por el tamaño de las gotasemulsificadas. Es probable que los mecanis-mos por los que se produce la asimilación departículas emulsionadas, por parte de los orga-nismos, sean diferentes de los mecanismos deasimilación de las sustancias disueltas.

Frecuentemente, las dispersiones mecánicasson inestables. Algunas veces se puede evitarla separación de fases por agitación o movi-miento constante u otros modos de mezclar lamuestra durante el ensayo. Es conveniente to-mar precauciones para evitar daños mecánicosa los organismos de ensayo.

NOTA: Las gotas de aceite y las películas superficialespueden tener efectos perjudiciales sobre los organismos,especialmente en el caso de los dáfnidos. Es posible pre-venir el contacto de los dáfnidos con películas superficia-les por separación mecánica con redes/tamices o por os-curecimiento de la superficie.

Se puede estimar la estabilidad de una emul-sión por observación visual, análisis químico,por ejemplo. Carbono Orgánico Disuelto o Total

(COD/COT) y por medidas de la turbidez. Enprincipio, es conveniente preparar las disper-siones mecánicamente en lugar de agregaragentes emulsionantes.

Hay dos formas de preparar una serie de dilu-ciones de una dispersión madre con agentesemulsionantes:

− mantener una concentración constante deagente emulsionante;

− mantener una relación constante de con-centración de sustancia a ensayar, frente aconcentración de agente emulsionante.

Como norma es preferible dar prioridad amantener la misma concentración de agenteemulsionante en todas las series de ensayo,para asegurar que la relación concentración-efecto depende únicamente de la concentra-ción de la sustancia de ensayo, evitando así laruptura de la emulsión a diluciones más eleva-das. Siempre es necesario un lote de controladicional, con la concentración más elevada deagente emulsionante.

A la hora de interpretar los resultados, es con-veniente tener en mente que los efectosobservados son efectos combinados, incluso siel emulsionante, por sí mismo, no muestraefecto en el lote control.

7.7.3.4 Problemas especiales con mezclasde sustancias o productos técnicos

Cuando se ensayan sustancias con impurezastóxicas fácilmente solubles (por ejemplo, tetrabu-tilestaño contaminado con óxido de tributilesta-ño) y mezclas de sustancias poco solubles (porejemplo, productos derivados del petróleo), elextracto acuoso puede estar enriquecido en loscomponentes más solubles. A menudo, esto sepone de manifiesto por un aumento en el CODcon incremento en la fracción másica, en pre-sencia de una fase existente todavía no disuelta.Para registrar efectos de este tipo, se recomien-da preparar y ensayar una solución acuosaadicional saturada, con una relación de mezclamás alta (por ejemplo, 0,1 g o 1 g de sustanciapor litro de agua). La comparación de los resul-tados obtenidos con varias relaciones de mezcla

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puede indicar los efectos de componentes fácil-mente solubles de una mezcla heterogénea.

Como alternativa a este procedimiento, esaconsejable ensayar mezclas de sustancias deensayo que no sean fácilmente solubles y sus-tancias con componentes minoritarios fácil-mente solubles, preparando una serie de ex-tractos acuosos en los cuales los niveles decarga disminuyen en progresión geométrica. Esconveniente ensayar los extractos acuosos enforma no diluida y el resultado referirlo a los ni-veles de carga, en vez de a la concentración dela fase acuosa. Es importante remarcar que noes conveniente diluir los extractos acuosos.

Como es frecuente que la composición químicade la fracción disuelta de mezclas varíe consi-derablemente con respecto a la del productooriginal, es aconsejable examinar también losefectos del producto original en forma de dis-persión (ver 7.7.3.3).

8 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRASDURANTE EL ENSAYO

8.1 Aireación

Se debe satisfacer la demanda de oxígeno delos organismos de ensayo y microorganismosheterótrofos mediante, por ejemplo, aireacióncontinua o intermitente. En casos especiales,como por ejemplo, aguas residuales con unademanda bioquímica de oxígeno (DBO) extre-madamente alta, es necesario aportar oxígenopuro en vez de aire. Debe evitarse la sobresa-turación (con respecto al aire). Los problemasrelacionados con la liberación de compuestosvolátiles y las pérdidas de sustancias por for-mación de espuma puede evitarse mediantemétodos especiales (ver 10.1.3).

8.2 Suspensión

La materia particulada presente en el agua sepuede poner en suspensión durante el ensayosi no se prevee un efecto interferente (ver 7.4).Es conveniente mantener los microorganismosplanctónicos en suspensión durante el ensayo

mediante métodos adecuados, por ejemplo,agitación o mediante rotación o aireación.

Se deben tomar las medidas adecuadas paraevitar el deterioro de los organismos de ensayodebido a acciones mecánicas.

8.3 Ajuste y control del pH

En determinadas circunstancias (por ejemplo, aconsecuencia de la aireación) el pH varia du-rante el ensayo, incluso cuando la muestra hasido previamente neutralizada. El ajuste y con-trol del pH durante el ensayo se debe decidir enfunción de la causa que provoca la variacióndel pH y el objetivo del ensayo. Los cambiosdel pH por causas abióticas pueden distinguirsemediante el análisis de un lote sin organismos.

Desde el punto de vista analítico y legislativo,se puede preferir trabajar con una sustancia enun estado químico claramente definido y cons-tante. Es conveniente evitar, o contrarrestar, elaumento del valor de pH debido a problemasexperimentales, por ejemplo, el desprendi-miento de CO2 por aireación.

Esto es especialmente importante para loscambios de toxicidad que dependen del pH deciertas sustancias, según estén o no ionizadas,como por ejemplo el amonio o amoníaco enpeces. Otros ejemplos de sustancias quemuestran una toxicidad dependiente del pH sonlos sulfuros, cianuros, aminas, fenoles y ácidosorgánicos entre otros.

No obstante, si el cambio del valor del pH du-rante el ensayo se produce a consecuencia deprocesos vitales fundamentales, tales como lafotosíntesis en el crecimiento de las algas, queestá necesariamente acompañada de un con-sumo de CO2, resulta razonable no ajustar el pH.

Dejar que el pH varíe a lo largo de un intervaloamplio no solamente mejora la aplicabilidad y elvalor indicativo del ensayo, sino que tambiénofrece la oportunidad de desencadenar elefecto de un compuesto químico que, de otromodo, puede haber permanecido sin detectar.

El aumento del valor del pH en los ensayos conalgas se puede reducir por varios métodos:

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− adición de soluciones reguladoras de pH;

− adición de carbonato;

− adición de CO2 gas;

− aumento del intercambio de gases medianteaireación y/o agitación;

− limitación de la iluminación;

− limitación de nutrientes;

− limitación de la temperatura;

− limitación de la duración del ensayo;

− reducción del inóculo.

Todas estas opciones tienen consecuencias yefectos colaterales no deseables, por ejemplo,por reacción con algún compuesto del ensayo,precipitación, liberación de volátiles, compleji-dad del diseño del ensayo, limitación delcrecimiento y problemas relacionados con lasmediciones. En general, un intercambio de ga-ses optimizado y la realización del ensayo enlos límites mínimos de luminosidad y tempera-tura reducen el problema.

El control del valor del pH en los ensayos conpeces puede lograrse por adición de dióxido decarbono o ácido clorhídrico, o bien, llevando acabo el ensayo bajo concentraciones específi-cas de CO2 atmosférico. El ajuste del pHdurante el ensayo requiere de una regulaciónindependiente de la retroalimentación para ca-da recipiente de ensayo.

9 LÍNEAS DIRECTRICES GENERALESPARA EL DISEÑO DEL ENSAYO

9.1 Preparación de las diluciones

Por razones fisiológicas, los ensayos biológicosque emplean organismos acuáticos no se pue-den llevar a cabo utilizando como medio aguadesionizada. En función de la naturaleza de losanálisis se debe utilizar agua de la canilla libre decloro, agua dulce sintética, agua de mar (posi-blemente con aditivos nutritivos), agua subterrá-nea o agua superficial. Esta última es menosadecuada para investigaciones toxicológicas, pe-ro está mas indicada para investigaciones

ecológicas, por ejemplo, para evaluar la capaci-dad de soporte del agua en función de lasituación local (carga existente, adaptación).

Cuando se realicen ensayos de toxicidad espe-cífica frente a una sustancia, si no se utiliza unmedio sintético normalizado, es necesario ajustarla dureza del agua, el pH y, posiblemente, la re-lación molar específica de los iones calcio ymagnesio. Para algunos ensayos con organis-mos marinos, es esencial la utilización de aguade mar natural.

Se combinan cantidades definidas de la mues-tra con los correspondientes volúmenes deagua de dilución, con objeto de obtener la con-centración o dilución deseada.

Como agua de dilución se utiliza el agua espe-cificada en la norma apropiada. Habitualmentese utilizan series con niveles de concentraciónen progresión geométrica.

9.2 Ensayos preliminares de una únicaconcentración límite

Es expeditivo determinar mediante un ensayo deinvestigación preliminar con un menor númerode organismos de ensayo, el intervalo aproxi-mado de concentraciones efectivas, y luego,entonces, llevar a cabo el ensayo principal.

Las muestras inestables (por ejemplo, agua re-sidual) pueden alterar sus propiedades duranteel tiempo requerido para el ensayo preliminar.En este caso, es conveniente que el ensayoprincipal se efectúe de forma inmediata (sin elensayo preliminar), posiblemente con una dis-tribución más amplia, sobre un extenso interva-lo de concentraciones.

Cuando únicamente se desea averiguar si unaconcentración dada o un nivel de dilución pre-sentan determinado efecto (ensayo de unaúnica concentración), no resultan necesariaslas series de diluciones.

9.3 Ensayos suplementarios

Cuando, en casos particulares, el intervalo deconcentraciones efectivas no se cubra total-mente por las concentraciones elegidas, esconveniente repetir el ensayo o establecer se-

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ries de ensayos suplementarios. En este caso,al menos dos concentraciones deben ser idén-ticas a otras dos pertenecientes a las series deensayo precedentes.

La evaluación conjunta de las dos series deensayo (principal y suplementaria) solamentees posible si las concentraciones escalonadas(entre las dos series) no muestran variacionesmayores que las existentes entre los lotes enparalelo, dentro de una misma serie. Los ensa-yos suplementarios no son practicables en elcaso de aguas o de aguas residuales que esténsujetas a alteraciones.

9.4 Lotes de control y de referencia

Es conveniente que para cada ensayo se exa-minen uno, o en su caso varios, lotes de controlen paralelo (ver 9.5). Los lotes de control debenser idénticos a los lotes de ensayo, pero sincontener los componentes a ensayar. Con elobjeto de identificar posibles interferencias enel transcurso del ensayo y para excluir orga-nismos de ensayo inapropiados, es recomen-dable someter a ensayo, a intervalos regulares,una sustancia de efecto conocido (sustancia dereferencia), realizando así un lote de referencia.Algunas sustancias de referencia frecuente-mente empleadas en los ensayos de toxicidadson, por ejemplo, el dicromato de sodio y el3,5-diclorofenol. En el caso de experimentoscon animales que requieran autorización, elnúmero de lotes en paralelo y de referencia sedebe mantener al mínimo.

9.5 Lotes paralelos/replicados

9.5.1 Generalidades

Cuando se someten a ensayo replicados paracada nivel de concentración/dilución, es posibleobtener observaciones independientes bajo con-diciones idénticas. Es conveniente que lascondiciones ambientales, tales como la tempe-ratura y la luz, se mantengan constantes eiguales, en la medida de lo posible. Con objetode compensar las restantes diferencias, esaconsejable no disponer los replicados uno al la-do del otro.

NOTA 1: Repetición de las medidas: Cuando se llevan acabo varias medidas de un mismo lote de ensayo (por

ejemplo, varios recuentos de un único lote en el ensayode algas), éstas no constituyen observaciones realmenteindependientes (replicados). Estas medidas sirven másbien para corregir inexactitudes en la medida. En tales ca-sos, es posible determinar el valor medio de las repeticionesy utilizarlo como "el mejor valor individual" para las estima-ciones estadísticas. En el caso del ensayo de inhibición delcrecimiento de algas, los lotes paralelos pueden, por tanto,considerarse como replicados verdaderos, independiente-mente del número de muestras que se tomen de ellos.

NOTA 2: Pseudo replicados: Por ejemplo, en el ensayo dereproducción de Daphnia, un mismo recipiente contiene va-rios animales, lo que significa que el número de nacimientosque se producen se puede determinar únicamente para ca-da recipiente (y no para cada animal), por lo que el númerode observaciones independientes (replicados) correspondeal número de recipientes y no al número de animales.

El número de lotes paralelos está con frecuen-cia restringido por motivos de falta de tiempo,espacio o recursos financieros. Además, en elcaso de ensayos con animales vertebrados, esimperativo mantener el número de animales deensayo al mínimo por razones éticas.

Un requisito adicional para determinar el núme-ro de lotes en paralelo para cada nivel deconcentración y para los experimentos de con-trol, es el tipo de evaluación que se pretenderealizar en dicho ensayo (ver el capítulo 12).

9.5.2 Concentraciones umbral(NOEC/LOEC)

Al contrario que para los ensayos preliminares(ver 9.2), las concentraciones umbral(NOEC/LOEC, ver 12.3.1) se determinan me-diante un análisis de la varianza (ANOVA, porejemplo, ensayo de Dunnett) para reconocer siuna concentración específica produce un efectosignificativo.

El número de réplicas requeridas depende dela varianza del punto final, del número utilizadode concentraciones (o diluciones) y de la dife-rencia entre las mismas, así como de la mag-nitud de la diferencia entre los efectos corres-pondientes al lote de ensayo y al experimentode control, verificado estadísticamente para unnivel de significación determinado. Se reco-mienda, generalmente, que el número de lotesde control duplique, como mínimo, al númerode replicas para cada nivel de concentra-ción/dilución, o bien que se incremente en un

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factor de p , donde p es el número de con-

centraciones de ensayo.

9.5.3 Relación entre la concentración y larespuesta

Cuando se determina la relación entre la con-centración y la respuesta, resulta de decisivaimportancia para el diseño del ensayo el tipo dedato que se obtiene en el punto final, es decir, sivan a determinarse variables discretas o conti-nuas.

La mortalidad (o inmovilidad) de los organismosde ensayo que se determina en el ensayo detoxicidad aguda es una variable discreta típica.

Por el contrario, las variables métricas mues-tran incrementos continuos, como por ejemplouna respuesta de tipo gradual. Algunas varia-bles métricas típicas son, por ejemplo, lalongitud corporal o la biomasa, las velocidadesmetabólicas, las tasas de producción o consu-mo de oxígeno o las velocidades de transfor-maciones enzimáticas. El número de animalesjóvenes producidos se puede considerar comouna variable continua aproximada.

En el caso de variables continuas, los resulta-dos correspondientes a cada uno de los nivelesde concentración/dilución se evalúan con res-pecto a los resultados de los lotes de control.Por lo tanto, debe prestarse especial atencióncon el fin de asegurar la fiabilidad estadísticade los controles.

Cuando se determinan variables discretas, lasobservaciones correspondientes se incluyen di-rectamente en la relación establecida entre laconcentración y la respuesta. No es necesario,en consecuencia, que el número de réplicas enel experimento de control sea mayor que en loslotes de ensayo.

Generalmente, cuando se determina la relaciónque existe entre la respuesta y la concentración,es aconsejable reducir el número de réplicas enlos lotes de ensayo y aumentar el número de ni-veles de concentración. Este procedimientoresulta aceptable porque los puntos de medidaadyacentes en una serie de dilución escalonadaen pequeños intervalos pueden servir de apoyo

mutuo. El número mínimo de réplicas para cadanivel de concentración es de dos.

No es conveniente establecer los distintos ni-veles consecutivos de concentración dema-siado próximos entre sí, si se quiere evitar quelas concentraciones efectivas sean virtualmenteidénticas como consecuencia de la variabilidaddel sistema de ensayo.

10 LÍNEAS DIRECTRICES ESPECIALESRELATIVAS AL FUNCIONAMIENTO DELENSAYO

10.1 Problemas y medidas preventivas paramuestras que pueden sufrir pérdidas deciertos componentes

10.1.1 Generalidades

Una muestra de agua puede perder compo-nentes en el sistema de ensayo por diferentesrazones:

− evaporación de sustancias volátiles;

− biodegradación;

− degradación abiótica (ejemplo hidrólisis, fo-tólisis);

− adsorción/absorción sobre los materiales delrecipiente, particularmente en el caso de loscomponentes hidrófobos;

− formación de espuma de los agentes ten-sioactivos;

− precipitación;

− floculación.

En estos casos, las fracciones de sustancia uti-lizadas en el sistema de ensayo no estándisponibles para los organismos a un nivelconstante durante todo el ensayo.

Un ensayo preliminar con y sin organismos pue-de ayudar a clarificar qué vía de eliminación esresponsable de la pérdida de sustancia. Medidascomparativas de concentración, por ejemplo,mediante parámetros globales, pueden revelar

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los mecanismos de pérdida. La comparación en-tre.

− un recipiente abierto y otro cerrado indica laspérdidas por evaporación;

− una muestra expuesta a la luz y otra sin ex-posición indica la extensión de la degrada-ción fotoquímica;

− un recipiente de ensayo sin tratar y otro sila-nizado da idea de las pérdidas por adsor-ción/absorción;

− una muestra envenenada (por ejemplo concloruro de mercurio (II) u otro veneno inor-gánico adecuado) y otra sin envenenar,permite una estimación de la eliminación porbiodegradación.

Las pérdidas de sustancia durante el ensayobiológico pueden, no obstante, estar causadassimplemente por adsorción y acumulación enlos organismos de ensayo o por adsorción so-bre las partículas alimenticias. En estos casos,aunque solamente pueda determinarse analíti-camente en el agua una fracción del compo-nente, los organismos continúan sustancial-mente expuestos. Para clarificar si la pérdidaque se produce es real o simulada, puedenrealizarse análisis comparativos entre lotes cony sin organismos y con y sin alimento.

Existen indicios de que en el caso de microor-ganismos (por ejemplo algas o bacterias), lasensibilidad del sistema de ensayo disminuyeal aumentar la densidad de organismos. Laspérdidas de sustancias pueden compensarsepor dosificaciones adicionales o, preferible-mente, mediante sistemas semiestáticos o deflujo continuo que eviten la acumulación demetabolitos en el sistema de ensayo.

Sin embargo, existen limitaciones en el caso desustancias poco solubles, de las que no pue-den prepararse soluciones madre lo suficiente-mente concentradas.

10.1.2 Volatilización

Las sustancias volátiles se liberan de forma rápi-da del sistema de ensayo, particularmente en losmétodos de ensayo que requieren aireación. En

tales casos, debe considerarse la utilización desistemas cerrados o de flujo continuo. Es conve-niente tener presente que, por ejemplo, en elcaso de ensayos de inhibición de la multiplica-ción celular con bacterias o algas, debe garanti-zarse un intercambio gaseoso suficiente.

En el caso de sustancias volátiles tóxicas, esconveniente asegurarse de que el personal querealiza el ensayo no corre ningún tipo de riesgo.

10.1.3 Formación de espuma

Las sustancias tensoactivas se acumulan en lasuperficie de un líquido y tienden a formar bur-bujas cuando se airea el lote de ensayo.

Puede asegurarse el aporte de oxígeno nece-sario, sin formación de espuma, aumentando larelación superficie:volumen (recipientes de en-sayo aplanados) o, cuando resulte apropiado,utilizando un flujo de aire (rompe espuma) diri-gido sobre la superficie.

El empleo de agentes antiespumante implicauna interacción impredecible con las sustanciasde ensayo y, generalmente, es convenienteevitar su utilización, salvo en casos especiales(por ejemplo, estudios de biodegradación).

10.1.4 Adsorción

Las sustancias hidrófobas pueden adsorbersesobre las paredes del recipiente, quedandoentonces limitada su biodisponibilidad, espe-cialmente a concentraciones bajas. Con elobjeto de prevenir pérdidas importantes desustancia, es recomendable que previamente alensayo, se incuben los recipientes durante almenos 30 min con la muestra a la concentra-ción prevista. A continuación se descarta lamuestra y, finalmente, se llena el recipiente conuna nueva alícuota de la muestra para prepararel lote de ensayo.

La silanización de los recipientes puede reducirla capacidad de adsorción/absorción de la su-perficie de sus paredes. Sin embargo, solamentees recomendable si no se dispone de otro mate-rial inerte y si puede asegurarse que no lixivienada de silicona residual (ver 6.2).

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10.1.5 Precipitación/floculación

Puede producirse la precipitación del materialde ensayo durante el mismo como consecuen-cia de reacciones con los constituyentes delmedio nutritivo (por ejemplo, iones calcio), enparticular si se produce una variación del pH enel lote de ensayo. Las medidas encaminadas amantener constante el pH (ver 8.3) puedenayudar a evitar esta interferencia.

10.1.6 Degradación

Los constituyentes pueden experimentar duranteel ensayo distintos tipos de degradación, ya seabiológica, fotolítica o por hidrólisis. Este hechopuede conducir a la formación de productos se-cundarios (por ejemplo, metabolitos) cuyatoxicidad sea diferente a la del producto original.

Generalmente, es difícil prevenir la biodegrada-ción en los sistemas de ensayo estáticos, dadoque los organismos de ensayo, tales como pe-ces, entre otros, no pueden separarse de lasbacterias que los acompañan.

En ciertos casos, como por ejemplo en el ensa-yo con peces, puede aplicarse una menortemperatura de ensayo para disminuir la biode-gradación, siempre que puedan cambiarse lasespecies de peces empleadas (por ejemplo tru-cha arco iris, en vez de pez cebra).

En los ensayos con bacterias, la biodegrada-ción es, con frecuencia, inherente al sistema yse refleja en incrementos relacionados con elcriterio de evaluación del ensayo (por ejemplo,tasa de consumo de oxígeno o la proliferacióncelular). En ciertos casos, pueden utilizarsesistemas de flujo continuo donde la utilizaciónde trampas térmicas previene normalmente lapropagación de la infección bacteriana por re-troceso a través de las tuberías.

10.1.7 Hidrólisis

Algunos componentes (por ejemplo los isocia-natos, los ésteres o los anhídridos) sufrenhidrólisis por reacción con el agua, lo que signi-fica que, en el transcurso del ensayo, losorganismos están cada vez más expuestos asus productos de degradación. En el caso de lahidrólisis, el valor del pH del lote de ensayo

puede alterarse, produciendo en ocasionescambios en la velocidad de dicha hidrólisis. Enestas circunstancias, es conveniente ajustar elpH o aumentar la capacidad de regulación delpH. En algunos casos concretos, si se selec-cionan otras especies para el ensayo, puedeaplicarse una temperatura menor y reducir, deeste modo, la velocidad de hidrólisis. Cuandose utilizan sistemas semiestáticos o de flujocontinuo, puede examinarse el efecto de lamuestra sin descomponer con mayor facilidad.

En el caso de los ensayos de biodegradación,la hidrólisis del material de ensayo puede con-ducir a una deriva de los intervalos deinhibición por pH durante el ensayo.

Cuando no pueda controlarse el pH por ajusteo mediante soluciones reguladoras de pH, serecomienda preparar una solución madre acuo-sa, dejar que progrese la hidrólisis durante, porejemplo, 24 h, neutralizar la solución e iniciarentonces el ensayo de biodegradación con lamuestra hidrolizada.

10.1.8 Fotólisis

Algunos componentes (por ejemplo, el hexaclo-rociclopentadieno, el EDTA o el hexaciano-ferrato) se descomponen por exposición a laluz. En el caso de ensayo con algas, el efectode la luz es inherente al sistema.

En otros ensayos, dichas reacciones de des-composición pueden evitarse si se trabaja enambiente oscuro (utilizando luz roja cuando seanecesario). Al igual que para la degradaciónbiológica y por hidrólisis, es preferible llevar acabo el ensayo en sistemas semiestáticos o deflujo continuo.

10.2 Problemas y medidas preventivas rela-tivas a muestras turbias y/o coloreadas

En algunos ensayos biológicos, la determinaciónen el punto final se basa en medidas espectro-métricas (fotometría, fluorometría). En el caso demuestras turbias o que presentan una fuerte co-loración, el efecto inhibitorio producido no puededeterminarse en forma confiable. Con el objetode superar esta dificultad, se pueden tomar lassiguientes medidas:

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− adopción de un método diferente para ladeterminación en el punto final (por ejemplo,recuento celular en vez de medida de la tur-bidez en el ensayo de algas);

− medida de la turbidez causada por los orga-nismos utilizando una o dos longitudes deonda diferentes (los colorantes tienen confrecuencia longitudes de onda característi-cas, diferentes a la dispersión de la luzprovocada por los microorganismos);

− combinación con otro método adecuado, porejemplo, medida de la tasa de consumo oproducción de oxígeno al final de un ensayode inhibición de multiplicación celular; eneste caso, es conveniente repetir la admi-nistración del medio nutritivo;

− determinación de la influencia del colorantey/o turbidez en el resultado, con ayuda de re-cipientes combinados en los que la muestrade ensayo y los organismos se encuentrenseparados (por ejemplo, celdas de correccióndel color para el ensayo con bacterias lumi-niscentes).

En el ensayo con algas, las sustancias colorea-das y la turbidez pueden impedir, de mododirecto, el crecimiento celular como resultado dela atenuación de la luz; este hecho no debeconfundirse con efectos tóxicos. Las siguientesindicaciones resultan adecuadas para diferen-ciar, en el ensayo con algas, la toxicidad de lasinterferencias físicas de las sustancias colorea-das:

a) realización de ensayos a diferentes inten-sidades de luz, dado que la velocidad decrecimiento por encima de la saturación deluz es prácticamente independiente de laintensidad luminosa;

b) disminución del trayecto recorrido por la luzmediante una reducción de la profundidado el volumen de los recipientes de ensayo,obteniendo así mayor homogeneidad e in-tensidad de la luz;

c) medida de la reducción de la proliferacióncelular en el lote de control en el que la luzse filtra previamente a través de un filtro lí-quido de transmisión de luz, por ejemplo,

un disco plano que contiene las oportunasdiluciones de la muestra con su correspon-diente color y espesor de capa;

d) utilización de un filtro de transmisión de luzpreparando diluciones recíprocas a la con-centración de exposición, manteniendo unalongitud de paso óptico común (profundi-dad constante) y las características deabsorbancia espectral de la muestra.

11 BIOENSAYOS ESPECIALES

11.1 Ensayos de biodegradación

La determinación experimental de la degrada-bilidad de sustancias y agua residual, así comolos estudios de bioacumulación, también sonensayos de tipo biológico. La degradación pue-de considerarse como la descomposición delcompuesto orgánico como resultado de efectosfisicoquímicos (por ejemplo, la degradación fo-tolítica causada por la luz) y la actividadbiológica (por ejemplo, la degradación biológicaproducida por microorganismos).

Debe distinguirse entre:

a) Degradación primaria, por medio de la cualla sustancia pierde sus propiedades espe-cíficas (identidad, actividad) y se descom-pone en constituyentes más simples;

b) Degradación última o final, es decir, la de-gradación completa hasta la obtención deproductos inorgánicos termodinámicamenteestables, como, por ejemplo, dióxido de car-bono y agua. Este proceso conduce a lacreación de nueva biomasa, junto con dióxi-do de carbono, agua y sales minerales.

Algunos ejemplos de criterios de biodegrada-ción son:

− la disminución de la concentración de loscomponentes de reacción (por ejemplo, O2)necesarios para la biodegradación;

− el aumento de la concentración en el siste-ma de los productos de reacción que se

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originan en la degradación total (por ejem-plo, CO2);

− la transformación de la sustancia marcadacon 14C en 14CO2;

− la reducción de la sustancia inicial detecta-ble mediante análisis específico;

− la disminución de la concentración de lasustancia detectable mediante parámetrosglobales no específicos (por ejemplo, COT,COD).

NOTA: Las dos últimas consideraciones no indican si loque se ha producido es biodegradación o eliminación fisi-coquímica (por ejemplo, por paso a la fase gaseosa), ni sehan producido cambios en la estructura química (porejemplo, a consecuencia de la degradación primaria).

Cuando se utiliza el lodo resultante de un en-sayo de biodegradabilidad inherente (potencial)como inóculo para un ensayo de degradabili-dad rápida, puede ocurrir:

− que el contaminante sea eliminado por ad-sorción/absorción en el lodo o,

− que el contaminante sea biodegradado.

Para distinguir entre estas dos posibilidadespuede examinarse en paralelo un lote envene-nado, en el cual no hay actividad biológica opuede comprobarse analíticamente la presen-cia de metabolitos.

Los métodos de ensayo de biodegradaciónpueden clasificarse en los siguientes grupos:

a) Métodos de medida de la biodegradabi-lidad rápida:

Cuando se mide la biodegradabilidad rápida,se pone en contacto la sustancia de ensayocon una pequeña cantidad de un cultivomixto de microorganismos. Los ensayos sediseñan como ensayos discontinuos, es de-cir, implican una única inoculación delsustrato. El desarrollo de la biodegradaciónpuede evaluarse por medio de distintos pa-rámetros. En caso de que las sustancias noalcancen el criterio mínimo de degradabili-dad en este sistema de ensayo, puede

estudiarse su degradabilidad en otro sis-tema de ensayo.

b) Métodos para determinar la biodegra-dabilidad potencial (inherente):

En los métodos para determinar la biode-gradabilidad potencial, se hace una distin-ción entre los sistemas de ensayo por lotes(estáticos) y los semicontinuos (semiestáti-cos). Ambos tienen una densidad deinoculación relativamente alta con un culti-vo mixto de microorganismos.

Los sistemas de ensayo por lotes (estáticos)se diseñan para trabajar con una única ino-culación y agregado de sustancia, mientrasque en los sistemas semiestáticos, la sus-tancia de ensayo se adiciona diariamente.

NOTA: Es conveniente que el empleo de los términos bio-degradabilidad "rápida" e "inherente", tal y como se definenen las guías generales de la OCDE, quede restringido a losensayos realizados de acuerdo a dichas guías generales dela OCDE. Para mas detalles, ver la ISO 15462.

La biodegradación también puede determinarsemediante:

a) Ensayos de simulación

Los ensayos de simulación sirven para de-terminar la biodegradabilidad bajo las condi-ciones ambientales específicas. Se requie-ren modelos validados para representarestas condiciones ambientales. Actualmen-te, los mejores modelos son los de simula-ción de las plantas de tratamiento de aguasresiduales, en los que se estudia la degra-dación de la sustancia de ensayo en condi-ciones de flujo continuo.

b) Otros métodos

Éstos incluyen, por ejemplo, los métodosde ensayo en los que el lote contiene se-dimento y métodos anaeróbicos, en losque se observa la conversión de la sustan-cia de ensayo en CO2 y CH4.

c) Medidas

Básicamente, cabe hacer una distinciónentre los parámetros relacionados con la

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mineralización de la sustancia de ensayo(medida del consumo de oxígeno, medidade la liberación de CO2) y los parámetrosque registran la desaparición de la sustan-cia original y una propiedad característicade la misma, por ejemplo, el efecto de laactividad superficial en el caso de los ten-sioactivos. En casos concretos, porejemplo cuando se trabaja con plaguicidas,los ensayos se centran no solamente en ladegradabilidad de las sustancias propia-mente dichas, sino también en la de losmetabolitos principales presentes en suelo,agua y biota. Cuando se realizan ensayosde degradabilidad de mezclas de sustan-cias y preparados, es conveniente tenerpresente que no pueden alcanzarse con-clusiones acerca de la degradabilidad delos constituyentes minoritarios y aditivos.

Pueden encontrarse mas detalles relativos a larealización y evaluación de ensayos de degrada-ción en, por ejemplo, las normas IRAM 25610,ISO 7827, ISO 11734, ISO 11733, ISO 10707,ISO 9408, ISO 9439, ISO 9887, ISO 9888,ISO 10634, ISO 10708, ISO 14592, ISO 14593e ISO 15462.

11.2 Ensayos de bioacumulación

La bioacumulación puede considerarse como laacumulación de sustancias en los organismosvivos, bien porque dichas sustancias se en-cuentran presentes en el ambiente o porque seingieren con la alimentación. La acumulaciónde sustancias a través de la cadena alimentariarecibe el nombre de biomagnificación. Los pro-cesos bioacumulativos conducen a concentra-ciones finales de sustancias en organismosacuáticos que pueden exceder la concentracióninicial en varios órdenes de magnitud.

La bioacumulación de las sustancias químicasestá influenciada por:

− propiedades lipofílicas de la sustancia;

− solubilidad en agua y propiedades estructu-rales de la molécula;

− la estabilidad de las sustancias químicas enagua; y

− la actividad metabólica en el organismo.

EI parámetro utilizado para evaluar la bioacu-mulación de una sustancia es el factor debioconcentración (FBC). Dicho factor es el co-ciente entre la concentración en el organismo(C1) y la concentración de la sustancia en otromedio (por ejemplo, en el agua, el alimento)(C2) en momentos específicos o en condicio-nes de estado estacionario (FBCest).

2

1

2

1

kk

CC

FBC ==

siendo:

k1 la velocidad de asimilación;

k2 la velocidad de eliminación.

EI estado estacionario se alcanza cuando tresanálisis consecutivos, con intervalos de dos díascomo mínimo, no difieren en más de un ± 20 %.

Es posible realizar una estimación preliminar dela bioacumulación potencial mediante el coefi-ciente de partición n-octanol-agua, Pow igual a logKOw, que constituye una medida de las propieda-des lipofílicas de una sustancia. En el intervalode log KOw comprendido entre 3 y 6, se observacon frecuencia en peces un FBC = 0,1 POw.

El log KOw no es adecuado para estimar la bioa-cumulación potencial en el caso de:

− iones (por ejemplo, metales pesados);

− tensioactivos (subestimación);

− sustancias con pesos moleculares (PM) ma-yores a 700 (sobre estimaciones causadaspor la no biodisponibilidad de moléculas ex-cesivamente grandes);

− sustancias muy lipofílicas (log KOw mayora 6) (sobre estimación, puesto que no semantiene la relación lineal).

NOTA: Los ensayos de acumulación con sustancias muylipofílicas pueden dar lugar a resultados erróneos o estarimposibilitados por definición, dado que aún no se hanestablecido las condiciones de estado estacionario y ladeterminación analítica de la sustancia disuelta en aguaes incierta.

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Generalmente, los resultados de los ensayos debioacumulación son más veraces que las esti-maciones obtenidas mediante las relaciones dellog KOw. Es conveniente no llevar a cabo deter-minaciones del FBC con concentraciones desustancia comprendidas en el intervalo de efec-tos tóxicos para los organismos. Además, nodebe excederse el límite de solubilidad en agua.

En los peces, las sustancias se incorporan ge-neralmente por vía branquial o a través de lapiel. La ingestión por vía alimenticia solamentees, en la mayor parte de los casos, relevantepara las sustancias altamente lipofílicas (logKOw mayor a 5 y, en su mayoría, mayor a 7).

También son factores indicativos para unaevaluación más completa de la bioacumulaciónpotencial:

− las cinéticas de depuración/eliminación,

− la altura de la meseta residual y

− la distribución en órganos específicos.

Si la eliminación sigue un modelo de un com-partimento para una cinética de primer orden,es posible calcular un valor de CT50 (tiemponecesario para alcanzar el 50 % de eliminacióndel compuesto) de acuerdo a:

250 k

2 ln CT =

Con frecuencia se observa una excreción en dosfases, es decir, una eliminación rápida seguidade una fase más lenta de eliminación, debido alas diferentes velocidades de asimilación en losórganos específicos, los procesos metabólicos olas distintas vías de excreción. Para las investi-gaciones de este tipo, las técnicas con indica-dores radioactivos resultan más adecuadas.

Las concentraciones de un ensayo de acumu-lación, generalmente muy bajas (1/100 ó1/1000 del CL50, concentración letal 50), impo-nen exigencias especiales en lo que respecta ala eficiencia de los métodos analíticos queacompañan al ensayo. Para algunos aspectos(como la transformación de las sustancias deensayo) pueden utilizarse sustancias marcadasradioactivamente.

Pueden encontrarse más detalles sobre la de-terminación de la bioacumulación en la Guíageneral 305 de la OECD.

11.3 Ensayos de genotoxicidad

Los ensayos de genotoxicidad/mutagenicidadsirven como medidas preventivas dentro delcontexto de un sistema general de control de lasalud pública. En la actualidad, el conocimientofiable sobre los efectos de las sustancias muta-génicas sobre los sistemas ecológicos acuá-ticos es muy limitado.

La genotoxicidad puede considerarse como laalteración del genoma por la influencia de sus-tancias. En la medida que esos cambios setransmitan a la siguiente generación, es posiblehablar de un efecto mutagénico, modificadordel genotipo. Los efectos genotóxicos desem-peñan un papel esencial en la etiología delcáncer. No obstante, no todas las alteracionesgenotóxicas son heredadas por las células hi-jas, dado que las células tienen sistemascompensatorios de reparación para el ácidodesoxirribonucleico (ADN), que son capaces deanular muchas alteraciones adversas. Además,los efectos drásticos conducen, con frecuencia,a la muerte celular. La inducción de los siste-mas de reparación puede considerarse comouna prueba de la existencia de efectos genotó-xicos. Las mutaciones se dividen en tres tipos:

a) Mutaciones de genes, en las cuales la se-cuencia de bases de un gen se modificacomo consecuencia del intercambio de unabase del ADN (mutación puntual) o comoconsecuencia de la introducción o desapa-rición de una o más bases del ADN(cambios en la lectura del código, mutacio-nes de corrimiento).

b) Mutaciones cromosómicas, en las cualesse modifica la estructura visible del cromo-soma, por ejemplo, por pérdida, transloca-ción o inversión. Las mutaciones de cro-mosomas pueden conducir a pérdidasreconocibles como micronúcleos. La es-tructura de los cromosomas se percibeespecialmente bien durante la metafasedel ciclo celular.

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c) Mutaciones del genoma en las que se modi-fica la cantidad total de cromosomascelulares. En este tipo, puede cambiar lacantidad de cromosomas de las células indi-viduales (aneuploidía) o el juego cromosómi-co completo (poliploidía).

Las mutaciones de cromosomas y del genomapueden observarse únicamente en células deorganismos eucarióticos. Pueden distinguirseprocedimientos de ensayo in vivo e in vitro. Losprocedimientos in vitro son válidos para de-mostrar potencial genotóxico de un lote deensayo y resultan apropiados para minimizarlos ensayos con animales. Sin embargo, dadoque los procedimientos in vitro constituyen sis-temas de ensayo al nivel de suborganismo, suvalor informativo es limitado.

EI mecanismo del efecto genotóxico puede di-ferenciarse por medio de procedimientos invitro. Como regla general, estos procedimientosse llevan a cabo con cultivos celulares de ma-míferos (por ejemplo, células CHO, célulasV79). Su potencial metabólico para xenobióti-cos es relativamente bajo. Por esta razón, seañaden (activación metabólica) enzimas micro-somales (fracción S9), por ejemplo procedentesde tejido hepático con inducción por bifenilospoliclorados (PCBs), como series de ensayo enparalelo. Aunque la fracción S9 puede produciruna reducción de la actividad con algunassustancias, es capaz, sin embargo, de inducirprimero un efecto mutagénico con otras sus-tancias (promutagénico) por biotransformación.

La fracción S9 se añade también en los siste-mas de ensayo bacterianos (procariotas) (porejemplo, en el procedimiento de ensayo Ames)en una serie de ensayo en paralelo. La poten-cialidad de alteraciones del genoma en bacte-rias puede identificarse fácil y rápidamente. Sinembargo, la extrapolación de los resultados aorganismos superiores encierra limitacionessignificativas.

Cuando se llevan a cabo ensayos con bacteriasy células eucarióticas in vitro, lo más apropiadoes trabajar en condiciones estériles. Dado quelas muestras de aguas, y especialmente las deagua residual, casi siempre contienen un ele-vado número de bacterias, es conveniente quelas muestras de este tipo sean filtradas a través

de un filtro de membrana antes de su utilizaciónen la mayoría de los sistemas de ensayo. Lasconcentraciones/diluciones utilizadas no debenproducir daños celulares (citotóxicas). Es con-veniente preparar simultáneamente lotes dereferencia (controles positivos) para verificar lareactividad de las células.

12 EVALUACIÓN

12.1 Generalidades

La evaluación de los resultados del ensayo im-plica primero la revisión crítica de los datos y lapresentación y descripción de los resultados me-diante el empleo de gráficos, tablas y parámetrosestadísticos adecuados, por ejemplo, valoresmedios y desviaciones (parámetros estadísticosdescriptivos).

En muchos casos, este primer paso está seguidopor un procesamiento estadístico más extensoque tiene por objeto determinar las relaciones deconcentraciones o de dosis/respuesta, calcularlos parámetros estadísticos apropiados paradescribir la magnitud de la acción y examinar elnivel de significación estadístico (parámetrosestadísticos de estimación y ensayo). Esta eva-luación estadística más completa es útilsolamente cuando se cuenta con una cantidadsuficiente de datos necesarios para este fin. Estorequiere, como primer paso, el examen crítico delos datos.

12.2 Examen y descripción básica de losdatos

Es conveniente que se inicie toda evaluación conun examen crítico de los resultados obtenidos enel ensayo. Debe verificarse la verosimilitud detodos los datos, ya sean lecturas primarias odatos transformados a partir de las medidas, es-pecialmente en el caso de los valores fuera delintervalo.

NOTA: Es conveniente que los valores considerados fue-ra del intervalo sean objeto del juicio de un experto, antesde ser descartados por el responsable de la evaluación.Los ensayos de invalidación de medidas pueden utilizarsecomo ayudas matemáticas.

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Una representación gráfica, preferiblemente delos valores sin transformar, resulta de ayudapara las consideraciones de verosimilitud. Confrecuencia, es particularmente apropiado elempleo de gráficos semi logarítmicos de losefectos medidos. Cualquier tipo de gráfico debemostrar de forma clara las unidades de con-centración, el número de lotes paralelos y decontrol, y los parámetros relativos al efecto.

Además, la representación gráfica proporcionauna información valiosa en lo que concierne alcomportamiento de los compuestos de ensayo yhasta qué punto es aconsejable determinar unarelación matemática de concentración/respuesta.También puede indicar qué modelo estadísticoes el más adecuado.

En el caso de una evaluación más avanzada, esconveniente dar prioridad, en principio, a losmétodos aritméticos frente a los puramente grá-ficos, dado que los primeros permiten habitual-mente el cálculo de varianzas e intervalos deconfianza. Es conveniente presentar los datos enforma tabulada junto con los valores medios cal-culados, los coeficientes de variación y elnúmero de observaciones independientes obte-nidas a partir de lotes en paralelo (réplicas).

En algunos casos en los que se van a reflejar enel informe del ensayo parámetros simples defini-dos, por ejemplo, diluciones umbral, no haynecesidad de una evaluación estadística másextensa. En estos casos, la evaluación concluyecon el cálculo de los porcentajes de inhibición ycon la decisión de si el efecto medido es mayor omenor que un valor límite dado.

12.3 Evaluación estadística

12.3.1 Generalidades

Los objetivos de la evaluación estadística com-pleta son:

a) presentar una relación matemática entre elefecto medido y la concentración utilizada(relación concentración/respuesta);

b) estimar los parámetros estadísticos quecaracterizan el efecto;

c) llevar a cabo el ensayo estadístico paradeterminar el intervalo de confianza.

Se acostumbra dar concentraciones como pa-rámetros estadísticos, a fin de describir elefecto de una sustancia para la cual se observaun efecto de magnitud determinada (CE: con-centración efectiva, CEx; x: x % de efecto).

Por ejemplo, la CE50 es la concentración a lacual puede observarse el efecto en un 50 % delos animales de ensayo o el 50 % de efecto(por ejemplo mortalidad, inmovilidad) (concen-tración efectiva media, cuantil 50 %). Estosparámetros de cantidad de efecto se derivan dela relación concentración/respuesta.

En algunos ensayos se determina una concen-tración efectiva, por encima de la cual seobserva un efecto estadísticamente significativo,por ejemplo, LOEC (Concentración Mínima en laque se Observa Efecto) y NOEC (Concentracióna la que No se Observa Efecto). Estos paráme-tros pueden determinarse por comparación delos resultados de ensayos realizados a varios ni-veles de concentración con los resultados de loscontroles, utilizando pruebas estadísticas para-métricas, como el análisis de la varianza(ANOVA) o, si no se cumplen los requisitos ne-cesarios, mediante métodos no paramétricos(por ejemplo, test U múltiple, Kruskal-Wallis).

NOTA: Un dato de este tipo es, por definición, una de lasconcentraciones ensayadas. Por otra parte, el LOEC pue-de ser un punto estimado, CEx. El valor de x se determinaa partir de la experiencia práctica con el método delbioensayo en cuestión. En muchas situaciones, una CE10

constituye una estimación adecuada de la LOEC. Paraciertos métodos de ensayo con mayor variabilidad o, másgeneralmente, en situaciones donde los límites de con-fianza en torno a CE10 son mayores, la CE10 puedereemplazarse por la CE20.

El factor decisivo para seleccionar un métodoestadístico adecuado es si el criterio de ensayoestá relacionado con las variables de tipo dis-creto o de tipo métrico continuas. (ver 9.5.3).

12.3.2 Variables discretas

Los métodos aquí recogidos son adecuadospara bioensayos en los que se esta estudiandola variable "mortalidad" o "inmovilidad" (porejemplo, ensayos de toxicidad aguda con pe-

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ces y Daphnia). El método clásico de estima-ción para las variables discretas de este tipo sebasa en el principio de máxima verosimilitud.En el caso de una distribución normal, estoconduce al análisis probit [30], [31], con distri-bución logística el análisis logit [32] y usando ladistribución Weibull al análisis Weibit [33]. En elcaso de las variables discretas, las estimacio-nes de parámetros obtenidas utilizando elprincipio de máxima verosimilitud tienen encuenta la heterogeneidad de la varianza de losvalores medidos. Esto constituye una impor-tante diferencia con respecto a una regresiónno ponderada seguida de linealización de lascurvas concentración/respuesta (por ejemplo,utilizando gráfico en escala gausio-logarítmica,con correspondencia a valores Probit). En estasituación, no se obtienen intervalos de confian-za válidos.

12.3.3 Variables continuas (métricas)

Los métodos de análisis probit, logit o Weibitmencionados anteriormente no son apropiadospara variables métricas. Como regla general,se utiliza el principio de cuadrados mínimos pa-ra estimar los parámetros en regresioneslineales y no lineales. El objetivo es seleccionaruna función que permita un ajuste óptimo delos datos (mínima varianza residual). Si los va-lores de medida revelan diferentes varianzaspara las concentraciones de ensayo individua-les, es conveniente que los análisis de regre-sión se lleven a cabo con los factores de pon-deración adecuados [34].

No es recomendable relacionar los efectos me-didos en los lotes de ensayo con los controles ylos logaritmos de las concentraciones. Estatransformación puede conducir a una heteroge-neidad de las varianzas y, por tanto, implicamayores desventajas con respecto a la evalua-ción estadística. Por esta razón, la evaluacióndebe realizarse con datos sin transformar e in-gresarlos contra los logaritmos de las concentra-ciones.

Las concentraciones efectivas se calculan,cuando es posible, a partir de las funciones con-centración/respuesta. En el caso de las variablesdiscretas (por ejemplo, las del ensayo de toxici-dad aguda con peces o Daphnia), es costumbredar concentraciones CE0, CE50 y CE100, que

también pueden ser denominadas como CL0,CL50 y CL100 (CL: concentración letal).

Estas concentraciones representan:

CE0 la máxima concentración ensayada a lacual no se observa efecto, de acuerdoal criterio de ensayo (CL0: todos los or-ganismos expuestos sobreviven);

CE50 la concentración a la cual se observaefecto sobre el 50 % de los organis-mos expuestos, de acuerdo al criteriode ensayo (CL50: muere el 50 % de losorganismos expuestos);

CE100 la mínima concentración a la cual seobserva efecto sobre el 100 % de losorganismos, de acuerdo al criterio deensayo (CL100: muere el 100 % de losorganismos expuestos).

La CE0 y CE100 son parámetros derivados direc-tamente del experimento y no concentracionesumbral determinadas estadísticamente. La NEC(Concentración para la que No se observa Efec-to) se deriva de la relación concentración/efectoextrapolada para el valor cero.

NOTA 1: Si bien se da la definición C0 y C100, estos son va-lores de escaso uso práctico.

En el caso de las variables métricas, se calcula habitual-mente la CE50 y, a veces, también la CE10 (por ejemplo lavelocidad de crecimiento y producción de biomasa en elensayo de inhibición del crecimiento de algas). Es conve-niente tener presente que, por ejemplo, la CE50 nocorresponde a la concentración media de efecto, comoocurre en el caso de las variables discretas, sino que re-presenta la concentración a la cual la variable métrica es,en promedio, un 50 % menor que en el control.

NOTA 2: La designación CE50 se utiliza a veces tambiénpara los casos en que se produce un 50 % de inhibiciónde una variable con respecto al control (por ejemplo lavelocidad de crecimiento y producción de biomasa en elensayo de inhibición con algas). Con el objetivo de distin-guir estas concentraciones efectivas, determinadas apartir de variables métricas, de aquellas mencionadasanteriormente, algunos autores han sugerido que es con-veniente denominarlas como CIx (concentración inhibitoriacorrespondiente a un x % de efecto).

Los intervalos de confianza pueden calcularseutilizando el método de Fieller [30], [36], [38].

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Si la situación de los datos es tal que no puedeaplicarse ninguno de los métodos citados ante-riormente, puede obtenerse una aproximaciónde la CE50 y de su intervalo de confianza utili-zando métodos alternativos (por ejemplo,Método de la Media Móvil, Trimmed SpermanKarber Method [30, 31]) En algunas circunstan-cias se puede usar un método de interpolaciónsimple utilizando los valores de CE0 y CE100. Sino se obtiene una CE100 con muestras sin diluir,es conveniente incluir en el informe la máximaCE obtenida.

En muchos ensayos de biodegradación, el nú-mero de valores de degradación medidos en lafase estacionaria no es suficiente como parapermitir su tratamiento estadístico. Con fre-cuencia, el último resultado correspondiente ala fase estacionaria no es representativo deesta fase. En estos casos es recomendable in-dicar el resultado del ensayo dentro de unintervalo del 10 %, por ejemplo, nivel de degra-dación correspondiente a una eliminación del70 % al 80 % del COD.

12.3.4 Confirmación estadística de los re-sultados

12.3.4.1 Generalidades

Los análisis estadísticos aquí mencionados seutilizan para determinar si, en general, la sustan-cia sometida a ensayo tiene un efecto significati-vo y a partir de que concentración se observa unefecto significativo. Esta concentración se des-cribe como FCOE/LOEC (Primera/MínimaConcentración para la que se Observa Efecto), yla concentración menor más próxima (que noproduce efecto significativo) como NOEC (Con-centración para la que No se Observa Efecto).

Estos parámetros dependen de:

− la varianza del parámetro medido;

− el número de réplicas para las concentracio-nes de ensayo y controles;

− el número de concentraciones ensayadas;

− la magnitud de los incrementos de los nive-les de concentración.

Por tanto, el diseño del ensayo influye nota-blemente en el resultado. También aquí laelección de un procedimiento estadístico apro-piado depende de si van a examinarse varia-bles discretas o métricas (cuantitativas).

12.3.4.2 Variables discretas

Los métodos aquí mencionados son adecuadospara los ensayos en los que se examina la va-riable "mortalidad" o "inmovilidad" (por ejemplo,el ensayo de toxicidad aguda con peces oDaphnia). Con el objetivo de confirmar estadís-ticamente el efecto observado, resultan adecua-dos los análisis para series nominales de datos.La prueba binomial de Fisher es adecuada paradeterminar la LOEC y/o NOEC.

12.3.4.3 Variables métricas

La elección de un método de ensayo apropiadodepende de si la variable evaluada en el ensa-yo (por ejemplo, biomasas, velocidades decrecimiento, producción de animales jóvenes yvelocidades metabólicas) sigue una distribuciónnormal aproximada y si la varianza es homogé-nea. Entonces, pueden utilizarse los métodosestadísticos paramétricos por resultar más con-fiables.

En el caso de una distribución normal y de ho-mogeneidad de las varianzas, la confirmaciónestadística del efecto específico producido porla sustancia se lleva a cabo utilizando un análi-sis de la varianza simple (ANOVA). La NOEC yLOEC se determinan empleando los tests deDunnett o Williams [35].

Si no se satisfacen estas condiciones iniciales,puede confirmarse el efecto utilizando la prue-ba de Kruskal-Wallis. En este caso, paradeterminar la LOEC y/o NOEC, son adecuadaslas pruebas U múltiple (por ejemplo, segúnBonferroni-Holm [39]).

NOTA 1: La CE0 no puede identificarse con la NOEC. Laprimera se determina directamente a partir de los datos.sin utilizar ningún método estadístico. No obstante, ambasestán condicionadas en gran medida por el diseño del en-sayo (por ejemplo, el número y la magnitud de losincrementos de concentración).

NOTA 2: Actualmente se cuestiona la determinación de laNOEC utilizando los análisis estadísticos anteriormente

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mencionados [40]. La misma está siendo discutida en laactualidad. Alternativamente, se ha propuesto determinar laconcentración a la que no se observa efecto (NEC) a partirde la relación concentración/respuesta [71].

13 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

13.1 Ensayos de toxicidad

Los ensayos de toxicidad proporcionan, segúnel caso, principalmente las concentracionesumbral o las concentraciones efectivas, porejemplo NOEC,LOEC, CE10, CE50 y CE90 o CL(concentración letal). Los datos de concentra-

ción deben expresarse claramente, indicando siestán como concentración iónica, compuesto oporcentaje de dilución.

Cuando sea posible, es conveniente presentarla relación concentración/respuesta junto conlos resultados del ensayo, en forma gráfica, porejemplo tal y como se muestra en la figura 2,en la que se presentan los resultados del ensa-yo y los valores de CEx. Esto permite observaruna imagen clara del carácter de la relaciónentre la concentración y la respuesta observa-da y el ajuste de los resultados con relación almodelo.

Figura 2 - Ejemplo de la curva de respuesta/concentración adaptada a ladistribución normal para inhibición

Se recomienda indicar también el criterio demedición (punto final), el organismo de ensayo,el tiempo de exposición y, cuando corresponda,los intervalos de confianza, por ejemplo para laCE50 (ver 12.3.4).

NOTA: Cuando se ensayen aguas residuales por mediode diluciones escalonadas, debe indicarse la mínima dilu-ción inefectiva (ver Anexo A).

13.2 Ensayos de degradación

La magnitud de la degradación viene dada porla disminución porcentual de la concentraciónde uno (o varios) parámetro(s), tal y como seindicó en 11.1.

Es conveniente describir la cinética de degrada-ción (fase de aclimatación para la adaptación,tiempo de vida media, "ventana de 10 días").

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13.3 Ensayos de bioacumulación

Se recomienda describir por medio de gráficoso tablas la evolución en el tiempo de la con-centración de la sustancia, en todo el cuerpo oen tejidos determinados, para demostrar que seha alcanzado un estado estacionario. Es con-veniente dar al FBC un valor adimensional, conno más de tres cifras significativas.

El FBC debe expresarse indicando en que sebasa, por ejemplo, en cuerpo completo, órganoo tejido, como peso seco o peso húmedo, y eldiseño experimental utilizado (estático, se-miestático o de flujo continuo).

13.4 Ensayos de genotoxicidad

En general, el número de incidencias observa-das (por ejemplo, aberraciones cromosómicas)o capacidades metabólicas adquiridas (porejemplo, inducción de enzimas reparadoras) seindican en relación a concentraciones dadas deuna sustancia o diluciones de una muestra deagua. Este valor está relacionado con un valorcorrespondiente al lote de control. El valor pue-de normalizarse en relación con el número decélulas al final del ensayo. La relación concen-tración/efecto puede evaluarse conforme a loindicado en el capítulo 12. Si se ensayan sus-tancias, el resultado normalmente se indica enforma cualitativa (positivo/negativo).

NOTA: Si se ensayan aguas, el resultado puede expre-sarse como la menor dilución que no produce efecto.

14 INFORME DE ENSAYO

Es conveniente que el informe de ensayo indiquelos siguientes datos:

a) nombre del laboratorio que realizó el ensa-yo;

b) fecha y período de ensayo;

c) referencia al método de ensayo utilizado(número de la norma internacional o nacio-nal);

d) organismo de ensayo (por ejemplo, nom-bre científico, cepa, fuente); pretratamientode aclimatación o terapéutico (si se ha uti-lizado alguno);

e) designación del material de ensayo (núme-ro de lote, origen, fecha y período demuestreo);

f) pretratamiento de la muestra (por ejemplo,preservación, preconcentración, homoge-neización, ajuste de pH, tipo de agente deneutralización, preaireación);

g) datos derivados, condensados o transfor-mados, incluyendo, cuando corresponda,resultados de controles positivos (lote dereferencia);

h) datos físicos y químicos determinados du-rante el ensayo (por ejemplo, temperatura,contenido en CO2, pH, turbidez, precipita-ción, posible cambio en la concentraciónde la sustancia, entre otros);

i) cualquier desviación del protocolo del ensa-yo (naturaleza del agua de dilución, soluciónnutritiva, aireación, temperatura, número deorganismos o densidad de inóculo, númerode réplicas, controles, entre otros);

j) método de evaluación (Iogit, probit, gráfico,informatizado);

k) detalles de los resultados del ensayo;

l) comentario sobre los resultados del ensa-yo, en caso necesario;

m) firma del investigador responsable;

n) firma del responsable de control de cali-dad, si corresponde.

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15 PRINCIPIOS BÁSICOS DEASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ENENSAYOS BIOLÓGICOS

15.1 Generalidades

El término "aseguramiento de la calidad" inclu-ye todas las medidas tomadas para establecere indicar la calidad y los errores potenciales enlos resultados del ensayo. La mayoría de lasmedidas contempladas en una serie de normasinternacionales (Normas ISO 9000, entre otras)introducidas bajo el término "aseguramiento dela calidad analítica" pueden aplicarse también alos métodos biológicos de ensayo.

El aseguramiento de la calidad de un ensayoincluye la planificación del muestreo, medidas yevaluación, la documentación, valoración y re-gistro de resultados.

En función de la importancia del aseguramientode la calidad en el procedimiento, es convenienteincorporar el programa adecuado correspon-diente en la estructura de la organización en suconjunto, considerando que, algunas veces, de-pendiendo del método de ensayo utilizado, espreciso dedicar hasta un 30 % del tiempo de tra-bajo del laboratorio a conseguir un apropiadoaseguramiento de la calidad.

Las medidas encaminadas al aseguramiento dela calidad se pueden dividir en cuatro grupos:

− fase preparatoria;

− fase de control de calidad interno;

− auditorías externas de control de calidad;

− evaluación y documentación.

15.2 Fase preparatoria

15.2.1 Organización y personal del labora-torio de ensayo

Es conveniente que los usuarios de esta normaintenten asegurarse de los siguientes aspectos:

Que el laboratorio de ensayo esté organizadode tal forma que cuente con personal suficientey que éste tenga la experiencia y formación ini-

cial y suplementaria que le permita llevar acabo las tareas asignadas.

Que, normalmente, el director general del labo-ratorio de ensayo sea responsable de losaspectos de organización y administración y,entre otras cosas, capaz de asegurar que secumplan los requisitos relativos al personal yequipamiento necesarios para realizar los en-sayos.

Que el trabajo y funcionamiento estén supervi-sados por un supervisor de bioensayos, quesea responsable de vigilar que el ensayo se lle-va a cabo en forma correcta y apropiada, y quequede documentado en un informe de ensayo.

Que las tareas de aseguramiento de la calidadimpliquen la verificación que el ensayo cumplecon los métodos y criterios expuestos por laNorma Internacional y que los datos han sidocorrectamente registrados y se correspondencon los resultados provistos en el informe.

En laboratorios más grandes puede ser acon-sejable designar, por tiempo completo o parcial,una persona suficientemente capacitada paraverificar el aseguramiento de la calidad. Las ta-reas pueden ser asumidas por una unidadorganizativa independiente.

Que se proporcione formación continua y ade-cuada, tanto al director como a los restantesmiembros del personal del laboratorio.

15.2.2 Equipamiento del laboratorio

Es conveniente que los usuarios de esta normase aseguren de los siguientes aspectos:

Que el laboratorio disponga del equipamientoadecuado para la realización de los ensayos.Además del equipamiento técnico, es conve-niente que el laboratorio disponga de instalacio-nes adecuadas, de una disposición de las habi-taciones y suministros generales (por ejemplo,electricidad, gas, agua potable, filtro de emisio-nes, ventilación, aire acondicionado) que permitacumplir con los requisitos de los ensayos aefectuar. La eliminación de los residuos debecumplir con las normas de seguridad que seande aplicación.

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Es conveniente que la distribución del espaciodentro del área del laboratorio sea tal que evitela contaminación del personal, de la instalación,del equipamiento y de los sistemas de ensayo,por ejemplo, por mezclado de sustancias y me-dios de ensayo. En particular, es convenienteque la zona de cultivo y mantenimiento de losorganismos de ensayo esté separada del lugardonde se hagan las preparaciones y ensayos.

Para los métodos de bioensayos, deben res-petarse los correspondientes permisos legales(por ejemplo, requerimientos de la legislaciónprotectora de los animales y normas para laprotección contra las epidemias) además de lasnormas relativas al equipamiento técnico y delaboratorio.

15.3 Establecimiento de los objetivos decalidad

Los objetivos de calidad se establecen comobase de decisión en la selección del método yde las etapas incluidas en el aseguramiento dela calidad. Los objetivos de calidad incluyentanto los parámetros estadísticos como decla-raciones sobre la selectividad o especificidaddel método de ensayo.

15.4 Descripción del método de ensayo

Es esencial que estén descritas todas las etapasdel método de ensayo utilizado tal y como real-mente se efectúan, qué equipos e instrumentosse utilizan y qué medidas se toman para el ase-guramiento de la calidad. Aquellas etapas que serepitan con frecuencia y que formen parte de to-dos los ensayos de rutina o de un método deensayo determinado, pueden estar escritas co-mo descripciones estándar [procedimientooperativo estándar (POE)], lo que quiere decirque no es necesario mencionarlas específica-mente en cada plan de ensayo. Ejemplos típicosde estos procedimientos son el tratamiento delas muestras, el mantenimiento y calibración delos instrumentos de medición, la limpieza deequipos e instrumentos, la cría y cultivo de losorganismos de ensayo, los dispositivos de emer-gencia y seguridad, entre otros.

Todas las personas implicadas en el ensayo de-ben estar informadas con antelación del objetivo,campo de aplicación, contenido y programación

de tiempo del ensayo. La hoja de trabajo tieneque contener información clara sobre las perso-nas responsables, los objetivos del ensayo, larealización del mismo, los métodos de ensayoutilizados y el tiempo y tipo de medidas a reali-zar.

15.5 Determinación de parámetros de ensayo

Antes de la aplicación práctica de un métodode ensayo, han de establecerse los parámetrosde ensayo relevantes (por ejemplo, desviacio-nes estándar y coeficientes de variación).También es preciso definir los criterios de vali-dación. En caso de métodos normalizados,generalmente los parámetros estadísticos y loscriterios de validación vienen dados por dichoprocedimiento normalizado.

Además, la fase preparatoria incluye la selecciónde una estrategia adecuada de calibración de losequipos instrumentales, la verificación de la ido-neidad de los materiales, y el examen de laadecuación y el método al objetivo propuesto.

15.6 Control de calidad

15.6.1 Control de calidad interno

El control de calidad interno es una parte integraldel método de ensayo en su conjunto. Normal-mente, se aplica en aquellas medidas biológicasde rutina. Incluye medidas para identificar, pre-venir y solucionar errores y es conveniente queconste de las siguientes etapas:

− verificación de las condiciones previas rea-les relativas al personal, muestreo, laborato-rio, equipamiento, organismos de ensayo,instrumentos y métodos analíticos;

− realización de la calibración de los instru-mentos;

− realización de ensayos con sustancias dereferencia;

− mantenimiento de cartas de control;

− determinaciones múltiples;

− control de verosimilitud; y

− validación.

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Todas las medidas y resultados del control decalidad interno deben estar cuidadosamentedocumentadas, presentadas de manera clara yser actualizadas con frecuencia.

15.6.2 Control de calidad externo (auditoría)

Una comparación de resultados de los ensayosy medidas con los de otros laboratorios puedeconstituir una parte importante del control decalidad externo. La participación en ensayosinterlaboratorios que incluyan un amplio núme-ro de participantes sirve para dar un mayorpeso a los resultados y permite también corre-gir faltas menores. La intención de lasauditorías externas es confirmar (o no) queestá funcionando el control de calidad interno.

15.6.3 Evaluación

Es conveniente que la evaluación de los datosobtenidos en las etapas individuales del méto-do de ensayo se realice conforme al método deevaluación documentado. Se recomienda queel funcionamiento del ensayo tenga en cuentalos resultados intermedios y finales, y que secontrole regularmente mediante controles se-lectivos de verosimilitud.

15.6.4 Documentación

Es conveniente disponer de una documenta-ción completa que incluya los registros detodos los documentos, todos los datos rele-vantes e información sobre el curso de losensayos, los resultados y las medidas para elcontrol de calidad analítico y estadístico.

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Anexo A(Informativo)

Mínima dilución inefectiva (MDI)

En los ensayos de toxicidad del agua residual por medio de diluciones definidas (D), la (MDI) expresala mayor concentración ensayada para la que no se observa inhibición, o para la que únicamente sehan observado efectos que no exceden la variabilidad específica del ensayo. D se expresa como elvalor recíproco de la fracción de volumen de agua residual en el lote de ensayo.

EJEMPLO: 1/4 de agua residual (fracción de volumen 25 %) es el nivel de dilución D = 4.

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Anexo B(Informativo)

Bibliografía

En el estudio de esta norma se ha tenido en cuenta el antecedente siguiente:

ISO - INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATIONISO 5667-16:1998 - Water quality - Sampling. Part 16: Guidance on biotesting of samples.

Parte de la bibliografía mencionada en la ISO 5567-16:1998

NOTA: La demás bibliografía citada en la norma ISO 5667-16:1998, se encuentra citada en el capítulo 2.

[1] ISO 6341:1996, Water quality -Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magnaStraus (Cladocera, Crustacea).

[2] ISO 7346-1:1996, Water quality -Determination of the acute lethal toxicity of substances to afreshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan [Teleostei, Cyprinidae]) -Part 1: Staticmethod.

[3] ISO 7346-2:1996, Water quality -Determination of the acute lethal toxicity of substances to afreshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan [Teleostei, Cyprinidae]) -Part 2:Semistatic method.

[4] ISO 7346-3:1996, Water quality -Determination of the acute lethal toxicity of substances to afreshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan [Teleostei, Cyprinidae]) -Part 3: Flow-through method.

[5] ISO 8192:1986, Water quality -Test for inhibition of oxygen consumption of activated sludge.

[6] ISO 8466-1:1990, Water quality -Calibration and evaluation of analytical methods andestimation of performance characteristics -Part 1: Linear functions.

[7] ISO 8466-2:1993, Water quality -Calibration and evaluation of analytical methods andestimation of performance characteristics -Part 2: Non-linear functions.

[8] ISO 8692:1989, Water quality -Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmussubspicatus and Selenastrum capricornutum.

[9] ISO 9509:1989, Water quality -Method for assessing the inhibition of nitrification of activatedludge microorganisms by chemicals and waste waters.

[10] ISO 10229:1994. Water quality -Determination of the prolonged toxicity of substances tofreshwater fish - Method for evaluating the effects of substances on the growth rate of rainbowtrout [Oncorhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)].

[11] ISO 10253:1995, Water quality -Marine algal growth inhibiton test with Skeletonema costatumand Phaeodactylum tricornutum.

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[12] ISO 10260:1992, Water quality -Measurement of biochemical parameters -Spectrometricdetermination of the chlorophi//-a concentration.

[13] ISO 10712:1995, Water quality -Pseudomonas putida growth in inhibition test (Pseudomonascell multiplication inhibition test).

[14] ISO 13829, Water quality -Determination of genotoxicity of water and waste water- Umu test.

[15] ISO/CD 14442: 1997, Water quality -Guidance for algal growth inhibition tests with poorlysoluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

[16] EN 45001: 1989, General criteria for the operation of testing laboratories.

Other publications and guidelines

[17] Finney, D. Y. (1971): Statistical methods in biological assay, 3rd Edition, University Press,London.

[18] Weber, E. (1980): GrundriB der biologischen Statistik, FisCher Verlag, Stuttgart.

[19] Ashton, W. D. (1972): The logit transformation with special reference to its uses in bioassay.Griffin. London.

[20] Christensen, E. R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibullmodel. Water Res. 18, pp. 213-221.

[21] Carrol, R. J. and Ruppert, D. (1988): Transformation and weighting in regression. Chapman andHall, London.

[22] Dunnett, C. W. (1955): A multiple comparison procedure for comparing several treatments witha control Amer. Statist. Ass. J., 50: pp.1096-1121.

[23] Fieller, E. L. (1944): A fundamental formula in the statistics of biological assay and someapplications. Quart. J. Pharm. Pharmacol., 17: pp. 117-123.

[24] Girling, A.E., Whale, G.F., Adema D.M.M. (1994): A guideline supplement for determining theaquatic toxicity of poorly water-soluble complex mixtures using water-accommodated fractions.Chemosphere, 29 (12): pp. 2645-2649.

[25] Morgan, B, J. T. (1992): Analysis of quantal response data, Chapman & Hall, London.

[26] Holm, S. (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6: pp.65-70.

[27] Hoekstra, J. A. and van Ewijk, P. H. (1993): Alternatives for the no-observed-effect level.Environm. Toxicol. Chem. 12: pp.187-194.

[28] OECD 107 Partition coefficient n-octanol/water.

[29] OECD (1997) Report of the OECD Workshop on Statistical Analysis of Aquatic Toxicity Data 4Braunschweig, Germany, Oct. 15-17 1996, Paris March 1997.

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[30] OECD 201 Alga, Growth Inhibition Test -7 June 1984.

[31] OECD 202 Part I Daphnia sp., Acute Immobilisation Test -4 April 1984.

[32] OECD 202 Part II Daphnia, Reproduction Test -Draft 6193.

[33] OECD 203 Fish, Acute Toxicity Test -17 July 1992.

[34] OECD 204 Fish, Prolonged Toxicity Test, 14-day study -4 April 1984.

[35] OECD 209 Activated Sludge, Respiration Inhibition Test -4 April 1984.

[36] OECD 210 Fish, Early-life Stage Toxicity Test -17 July 1992.

[37] OECD 301 A Ready Biodegradability: DOC-Die Away Test -17 July 1992.

[38] OECD 301 A Ready Biodegradability: CO2-Evolution Test -17 July 1992.

[39] OECD 301 C Ready Biodegradability: Modified MITI- Test -17 July 1992.

[40] OECD 301 D Ready Biodegradability: Closed Bottle Test -17 July 1992.

[41] OECD 301 E Ready Biodegradability: Modified OECD Screening Test -17 July 1992.

[42] OECD 301 F Ready Biodegradability: Manometric Respirometry Test -17 July 1992.

[43] OECD 302 A Inherent Biodegradability: Modified SCAS- Test -12 May 1981.

[44] OECD 302 B Inherent Biodegradability: Zahn-Wellens/EMPA- Test -17 July 1992.

[45] OECD 302 C Inherent Biodegradability: Modified MITI- Test (II) -12 May 1981.

[46] OECD 303 A Simulation Test-Aerobic Sewage Treatment: Coupled Units- Test -12 May 1981.

[47] OECD 305 A Bioaccumulation: Sequential Static Fish Test -12 May 1981.

[48] OECD 305 B Bioaccumulation: Semi-Static Fish Test -12 May 1981.

[49] OECD 305 C Bioaccumulation: Test for the Degree of Bioconcentration in Fish -12 May 1981.

[50] OECD 305 D Bioaccumulation: Static Fish Test -12 May 1981.

[51] OECD 305 E Bioaccumulation: Flow through Fish Test -12 May 1981.

[52] OECD 306 Biodegradability in Seawater -17 July 1992.

[53] OECD 471 Genetic Toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay -26 May1983.

[54] OECD 473 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cytogenetic Test -26 May 1983.

[55] OECD 476 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests -4 April 1984.

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[56] OECD 479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells -23 October 1986.

[57] OECD 480 Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay -23 October1986.

[58] OECD 481 Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay -23October 1986.

[59] OECD 482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair/Unscheduled DNA Synthesis inMammalian Cells in vitro -23 October 1986.

[60] OECD (1995): Guidance Document for Aquatic Effects Assessment OECD EnvironmentMonographs No. 92 OCDE/GD(95)18, Paris 1995.

[61] OECD (1995): Aquatic Testing Methods for Pesticides and Industrial Chemical, Paris (DraftFinal Report, March 1995).

[62] American Society for Testing and Materials(1991): Standard guide for collection, storage,characterization and manipulation of sediments for toxicological testing, ASTM E 1391-90.Philadelphia P A.

[63] American Society for Testing and Materials (1993): Standard guide for conducting sedimenttoxicity tests with freshwater invertebrates, ASTM E 1383-93, Philadelphia P A.

[64] American Society for Testing and Materials (1980): Standard practice for conducting acutetoxicity tests with fishes, macroinvertebrates and amphibians. ASTM E 729-80. PhiladelphiaPA.2)

[65] ECETOC (1996): Aquatic toxicity testing of sparingly soluble, volatile and unstable substances,Monograph No.26. pp. 1-67, Brussels.

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Anexo C(Informativo)

El estudio de esta norma ha estado a cargo de los organismos respectivos, integrados en la formasiguiente:

Subcomité Calidad del Agua - Ecotoxicología y Bioensayos (SC3)

Integrante Representa a:

Lic. José ALBERDI UNLU - UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJANDr. Juan Manuel CATOYRA LABORATORIO OPUS PRIMADr. Eliseo CHAVES INTADra. Lucrecia FERRARI ASOCIACIÓN TOXICOLÓGICA ARGENTINALic. Carlos Enrique GÓMEZ INSTITUTO NACIONAL DEL AGUA (INA)Dra. Estela PLANES INTILic. Gustavo BULUS ROSSINI UNLP- UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATALic. Adriana RODOLOSI AGUAS ARGENTINAS.Dra. Alicia RONCO. UNLP - UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATADra. María del Carmen TORTORELLI UNLU UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJANIng. Natalia DRAULT IRAMIng. Agr. Carlos J. FEIGUIN IRAMIng. Laura RENDA IRAMIng. Ignacio STEINBERG IRAMSr. Iván EGLIS IRAM

Comité General de Normas (C.G.N.)

Integrante Integrante

Dr. Víctor ALDERUCCIO Dr. Álvaro CRUZLic. Vicente BIANCHI Dra. Irene DASSODr. José M. CARACUEL Dr. Federico GUITARLic. Alberto CERINI Sr. Ángel TESTORELLIDr. Néstor P. CID Ing. Raúl DELLA PORTA

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IRAM 29012-16:2003

ICS 13.060.45* CNA 00.00

* Corresponde a la Clasificación Nacional de Abastecimiento asignada por el Servicio Nacional de Catalogación del Ministerio de Defensa.