NT-32Rev3

Análisis microbiológico: Documento aclaratorio

NT‐32 Rev. 3 Abril 2012

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Página INDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 1

2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................................................................ 2

3. MÉTODOS DE ENSAYO .......................................................................................................................... 2

4. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MÉTODOS. VALIDACIÓN. .......................................... 3

4.1. Métodos normalizados (Tipo I) ............................................................................................................ 3 4.2. Métodos alternativos (Tipo II) .............................................................................................................. 3 4.3. Métodos basados en métodos de referencia (Tipo III) ........................................................................ 4 4.4. Comprobación del funcionamiento de métodos Tipo I, II y III .............................................................. 4 4.5. Otros métodos (Tipo IV) ....................................................................................................................... 5

5. ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRE......................................................................................................... 5

6. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO ..................................................... 5

6.1. Control interno ..................................................................................................................................... 6 6.2. Control externo (intercomparaciones) ................................................................................................. 6

7. REFERENCIAS ....................................................................................................................................... 7

ANEXO I: CEPAS DE REFERENCIA

1. INTRODUCCIÓN El desarrollo y realización de análisis de control microbiológico es una herramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito de la salud pública, la tecnología alimentaria y el Medio Ambiente. Los laboratorios que realizan estos ensayos trabajan en un entorno de creciente exigencia y responsabilidad, tanto legal como social, que reclama un nivel de calidad y de confianza extraordinarios. Por ello, tanto los métodos de ensayo como los laboratorios que realizan los análisis deben asegurar, al máximo nivel permitido por el desarrollo científico y técnico, la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, además de reunir los criterios técnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantías, que permitan obtener resultados comparables, con independencia del laboratorio que los ejecute. En este sentido, el empleo de métodos de referencia, reconocidos y aceptados, es la herramienta más eficaz para obtener estas garantías En la actualidad, existe una amplia disponibilidad de métodos de ensayo (por ejemplo normas de ensayo que tienen reconocimiento internacional como métodos de referencia) que establecen el estándar científico a considerar, llegando incluso, cada vez con más frecuencia, a convertirse en métodos oficiales al ser invocados en la reglamentación. Por otra parte, los criterios de acreditación de ENAC deben mantenerse siempre en línea con las tendencias que las comunidades científica y tecnológica establecen como más apropiadas, establecidas en este caso por métodos de referencia, como normas y documentos similares. Por esta razón, se considera necesario poner de manifiesto las ventajas que aporta a los laboratorios el uso de métodos de referencia normalizados, como vía principal para garantizar la validez de los métodos y la fiabilidad de los resultados, frente a métodos de elaboración propia que requieren de procesos complejos de validación.



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En la elaboración de este documento han participado la Sociedad Española de Microbiología (SEM), la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN), el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM) y la Asociación de Entidades de Ensayo, Calibración y Análisis‐FELAB – (EUROLAB‐España‐Asociación Española de Laboratorios de Ensayo, Calibración y Análisis / AELI – Asociación Española de Laboratorios Independientes). Asimismo, se ha previsto la posibilidad de incorporar anexos a este documento, relativos a cuestiones técnicas de interés, elaborados en su caso, en colaboración con organizaciones técnicas competentes. 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN El objetivo de este documento es establecer los criterios a utilizar por ENAC para la acreditación de los laboratorios que realizan ensayos microbiológicos. No debe entenderse esta nota como un documento en el que se establece una metodología para la validación de métodos de ensayo sino como unas directrices que faciliten tanto la implantación en los laboratorios de los aspectos aquí recogidos, como su evaluación por parte de ENAC. Asimismo, se incluye un anexo sobre manipulación y conservación de cepas referencia, elaborado en colaboración con la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). 3. MÉTODOS DE ENSAYO La norma UNE‐EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que “El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para el uso previsto”. Por tanto, debe tenerse en cuenta el ámbito de aplicación, tanto por el laboratorio en cuanto a la selección de los procedimientos de ensayo y su validación, como por el organismo de acreditación en las evaluaciones que realice. Además, la norma establece que “cuando el cliente no especifique el método a utilizar, el laboratorio debe seleccionar los métodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales, regionales o nacionales, por organizaciones técnicas reconocidas o en libros o revistas científicas especializados o especificados por el fabricante de equipos”. Por tanto, en el caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, es recomendable que se parta de métodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos y aplicados en el sector. Así pues, debido al marco en que se ubica la aplicación y uso de los ensayos microbiológicos, se podría establecer la siguiente clasificación de métodos, atendiendo al nivel de confianza que aportan y que, por tanto, marcarán el nivel de información adicional que ENAC requerirá relativa a su validez:

Tipo I: Métodos normalizados. Son métodos desarrollados por un organismo de normalización o por otras organizaciones bien establecidas, cuyos métodos son generalmente aceptados por el sector técnico en cuestión (ILAC G 18) (Ej.: ISO, NF, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA etc.)” Nota: Un método normalizado ha sido exhaustivamente estudiado y describe de forma clara y exacta las condiciones de realización del ensayo. Sus características de funcionamiento deben ser acordes con el uso previsto. Estos métodos normalizados son considerados métodos de referencia ya que pueden ser utilizados para evaluar otros métodos desarrollados para la misma determinación (ISO 16140).



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Tipo II: Métodos alternativos. Métodos que han sido validados por comparación con el método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994 etc.) y son generalmente reconocidos por la comunidad científica y tecnológica como equivalentes al método de referencia. Tipo III: Métodos basados en métodos de referencia. Métodos descritos en procedimientos internos del laboratorio, que están basados claramente en métodos de referencia y que no suponen una modificación técnica respecto del método de referencia que ponga en cuestión su validez técnica. Deben mantenerse actualizados en relación con el método de referencia en que se fundamentan.

Nota: En cualquier caso, se consideran modificaciones técnicas respecto del método de referencia, aquellas que pongan en cuestión su validez técnica, como por ejemplo, cambios relevantes en un medio de cultivo, cambios en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura), etc.

Tipo IV: Otros métodos. Son aquellos métodos desarrollados por el propio laboratorio o por cualquier otra parte (un fabricante o proveedor de equipos, de medios de cultivo etc.), y que no disponen del reconocimiento de los métodos de referencia o de los métodos alternativos.

Nota: En los Anexos Técnicos únicamente los métodos del Tipo I reflejarán la norma o documento de referencia. Los métodos englobados en los Tipos II, III y IV figurarán en el Anexo Técnico como Procedimiento Interno. Como parte de los procedimientos de ensayo, se deben incluir también los procedimientos para la preparación de las muestras en relación con el alcance solicitado, pues se trata de un aspecto crítico en determinados alcances (ej.: alimentos). Existen normas reconocidas que regulan la manipulación previa de los objetos de ensayo (ej. serie de normas ISO 6887, UNE‐EN ISO 8261) y que deben ser consideradas como una referencia adecuada. 4. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MÉTODOS. VALIDACIÓN. Los métodos de ensayo presentados para su acreditación deben estar validados. Según la norma UNE‐EN ISO/IEC 17025 “la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto”. Para ello, es necesario conocer las características de funcionamiento del método. Por otra parte, la extensión de las actividades de validación a realizar por el laboratorio dependerá del tipo de método seleccionado:

4.1. Métodos normalizados (Tipo I)

Los métodos normalizados entendidos como de referencia no requieren una validación completa. El laboratorio debe, tal y como establece la norma UNE‐EN ISO/IEC 17025:2005 “confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos”. 4.2. Métodos alternativos (Tipo II) A efectos de validación, los métodos alternativos se tratarán como los métodos de referencia. No obstante, para que ENAC entienda que un método se puede considerar como método alternativo deberá disponer de evidencias de su validación. En caso de que dichas evidencias no estén disponibles será responsabilidad del laboratorio solicitante el aportarlas.



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4.3. Métodos basados en métodos de referencia (Tipo III) Los métodos basados en métodos de referencia no precisan de una validación completa. No obstante el laboratorio deberá realizar la necesaria comprobación de su funcionamiento. 4.4. Comprobación del funcionamiento de métodos Tipo I, II y III El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función del alcance de acreditación y ésta debería basarse en la información tomada de referencias bibliográficas o estándares internacionales (ej.: Anexo B de UNE‐EN ISO 16140, ISO/TS 19036). A continuación se indican las características de funcionamiento que al menos se deben confirmar en el caso de métodos de referencia, alternativos y basados en métodos de referencia teniendo en cuenta la naturaleza del método:

‐ Métodos cuantitativos:

• Recuperación En cuanto a la estimación de la recuperación debería evaluarse a partir de valores de referencia. Estos valores podrían obtenerse por comparación con métodos de referencia, a partir de muestras inoculadas con materiales de referencia o cepas de referencia o a partir de resultados de interlaboratorios.

• Reproducibilidad

Se considera una referencia adecuada las pautas establecidas en el documento técnico ISO/TS 19036:2006. Hay que tener en cuenta que, se debe realizar el cálculo de la precisión (reproducibilidad) en muestras con diferentes niveles de contaminación (ISO 19036:2006 y su modificación). En el caso de muestras con alto nivel de contaminación se deben realizar las correspondientes diluciones decimales para permitir el recuento de las placas, dentro del intervalo que se establece en documentos de referencia (ej. normas ISO 8199 e ISO 7218).

‐ Métodos cualitativos:

• Límite de detección

La estimación del límite de detección requiere del empleo de suspensiones de inóculo con niveles de concentración bajos. El propio intervalo de confianza a estos bajos niveles hace que, desde un punto de vista estadístico, no se pueda conocer de forma exacta si un determinado inóculo contiene o no el microorganismo a detectar. Por tanto, es aceptable comprobar el método con bajos niveles de inóculos de microorganismos diana de forma que se evalúen diferencias entre las distintas matrices, analistas, equipos etc., verificándose la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles y eficaces a estos niveles.



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Asimismo, puede obtenerse información sobre las características de funcionamiento de los métodos de:

- Actividades de control de calidad interno: Los resultados obtenidos en las actividades de control de calidad interno aplicando el método de ensayo a confirmar, pueden ser utilizados en la comprobación del método (ej. verificación de nuevas matrices).

- Participación en Intercomparaciones (Control de calidad externo): Los resultados obtenidos en la

participación en intercomparaciones, también pueden ser utilizados para la comprobación de un método. Para ello, el laboratorio deberá evaluar la idoneidad y calidad del programa de intercomparación, valorando si es adecuado utilizar la información proporcionada por el ejercicio en la comprobación.

Puede tomarse como referencia lo dispuesto al respecto en G‐ENAC‐09 o ISO/TS 19036.

4.5. Otros métodos (Tipo IV) La norma UNE‐EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que el laboratorio debe validar los métodos no normalizados y los métodos que diseña o desarrolla para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. Por tanto, para este tipo de métodos, el laboratorio deberá evaluar su idoneidad para su ámbito de aplicación así como las actividades necesarias a realizar para garantizar su validez técnica.

En este sentido las actividades recogidas en el apartado 4.4 que se han considerado como válidas para asegurar la adecuación al uso, no permiten garantizar de forma completa la validez de los métodos definidos como Tipo IV ni su caracterización ya que éstas deben estar fundamentadas en referencias válidas (ej.: ISO 16140, ISO /TR 13843, UNE‐EN ISO 17994…) ENAC deberá disponer de evidencias completas de que dichos métodos han sido adecuadamente validados. El laboratorio deberá disponer de toda la información sobre el trabajo experimental realizado para la validación del método.

5. ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRE La estimación de Incertidumbre no es de aplicación a métodos cualitativos ni NMP. En el caso de ensayos microbiológicos de recuento en productos agroalimentarios se ha publicado la ISO/TS 19036:2006 que puede utilizarse como referencia. En el caso de análisis microbiológico de aguas existe el documento ISO 29201, el cual está en desarrollo. 6. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO En la norma UNE‐EN ISO/IEC 17025 se establece que el laboratorio debe disponer de un control de calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos.



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En el ámbito de los ensayos microbiológicos, la implantación de actividades de control de calidad adecuadas resulta especialmente importante, dado que no siempre es posible caracterizar de forma completa el funcionamiento de estos procedimientos de ensayo. No obstante, es factible establecer sistemas que permitan garantizar el adecuado control de los procedimientos de ensayo microbiológicos. El aseguramiento de la calidad debe ser tanto interno como externo y puede aplicarse de diferentes formas:

6.1. Control interno

- Control de las condiciones de trabajo: proporciona información sobre la esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizados y en general, sobre la buena práctica en la realización de los ensayos. Deben existir criterios para la desviación permitida.

Ensayos cuantitativos:

- Control de la precisión: muestras naturales sin inocular y/o muestras naturales inoculadas

- Control de recuperación: muestras según lo establecido en el apdo. 4.4 (Recuperación)

Ensayos cualitativos:

- El control de calidad interno debe incluir actividades que garanticen un adecuado control del método a

niveles bajos de contaminación (ver apdo. 4.4 Límite de detección)

Estas actividades de control de calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestras naturales tanto positivas (inoculadas o contaminadas naturalmente) como negativas. 6.2. Control externo (intercomparaciones)

La participación en intercomparaciones permite una evaluación del sesgo de forma que el laboratorio pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de aceptación definidos por normas, reglamentos, por el cliente o por el laboratorio.

Todas las actividades de aseguramiento de la calidad deberán planificarse de forma que, en el tiempo y en función del alcance del método se incluya una adecuada representación de la variedad de matrices con las que trabaja el laboratorio, complementándose así los resultados obtenidos en la validación inicial.

Por último, la periodicidad de las actividades de control de calidad tanto interno como externo deberá establecerse considerando diversos factores como pueden ser:

- La robustez del método utilizado (en función de los controles específicos incluidos en el mismo,

método de referencia o de rutina, pruebas de confirmación, datos de validación, vigencia del método etc.)

- La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos análisis (dado que se debe asegurar que el laboratorio mantiene la destreza en la ejecución del mismo en cuanto a los materiales, equipos y cualificación del personal)

- Los resultados históricos de aseguramiento de calidad, así como la correcta evaluación de los mismos.



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- Los resultados obtenidos en el conjunto de acciones de evaluación de la calidad (ej. siembra por

duplicado de placas, verificación del factor de dilución, interlaboratorios, muestras blancas, control de medios de cultivo, controles ambientales, cualificación del personal etc.)

7. REFERENCIAS • Reglamento (CE) nº 2073/2005, de la Comisión, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios

microbiológicos aplicables a los productos alimenticios. • G‐ENAC‐04 Rev. 1 “Guía para la acreditación de laboratorios de análisis microbiológicos”. • G‐ENAC‐09 Rev. 1 “Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos”.

• ILAC‐G18:04/2010. Guideline for the Formulation of Scopes of Accreditation for Laboratories • UNE‐EN ISO 16140:2003 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo para

la validación de métodos alternativos. • ISO/TR 13843:2000 “Water quality – Guidance on validation of microbiological methods”. • ISO 17994:2004 “Water quality – Criteria for establishing equivalence between microbiological methods”. • ISO 19458:2006 “Water quality ‐Sampling for microbiological analysis”. • ISO 8199:2005 “Water quality – General guidance on the enumeration of micro‐organisms by culture”. • ISO/TS 19036:2006 “Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines for the estimation of

measurement uncertainty for quantitative determinations”. • UNE‐EN ISO 6887‐1:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal.

Preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales”.

• UNE‐EN ISO 6887‐2:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal.

Preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 2: Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos”.

• UNE‐EN ISO 6887‐3:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de

las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 3: Reglas específicas para la preparación de pescados y productos de la pesca”.

• UNE‐EN ISO 6887‐4:2004 y UNE‐EN ISO 6887‐4/AC:2005 “Microbiología de los alimentos para consumo

humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 4: Reglas específicas para la preparación de productos distintos a leche y productos lácteos, carne y productos cárnicos y, pescados y productos de la pesca”.

• UNE‐EN ISO 8261:2002 “Leche y productos lácteos. Directrices generales para la preparación de muestras

para análisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el análisis microbiológico”.



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• UNE‐EN ISO/IEC 17025:2005 “Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de

los laboratorios de ensayo y calibración. • UNE‐ENV ISO 11133‐1:2001. “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para la

preparación y producción de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio”.

• UNE‐ENV ISO 11133‐2:2006. “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para la

preparación y producción de medios de cultivo. Parte 2: Guía práctica para las pruebas de rendimiento de medios de cultivo”.

• ISO 7218: 2007. “Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological

examinations”

• CEN ISO CD 11133: 2009. “Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production environment and water – Preparation, production, storage and performance testing of culture media”.

• ISO 29201. Water Quality – The variability of test results and the uncertainty of measurement of

microbiological enumeration methods. “El presente documento se distribuye como copia no controlada. Puede consultar su revisión en la página web de ENAC o internamente en red”.


NT‐32 Rev. 3 Abril 2012 Anexo I

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CEPAS DE REFERENCIA

1. Número de pases que se pueden realizar a una cepa procedente de CC/BRC (Colección de

Cultivos Microbianos reconocida o Centro de Recursos Biológicos Microbianos):

‐ La reconstitución de la cepa y su primera siembra en medio de cultivo es sólo una activación

y no debe considerarse un pase.

‐ La activación es una etapa necesaria y crítica y debe hacerse en los medios de cultivo

indicados por la Colección. El laboratorio debe conservar registros de dicha etapa.

‐ Los pases que se hayan realizado en la Colección de procedencia no deben ser tenidos en

cuenta por el laboratorio ni afectan al número de pases que puede realizar (los pases

realizados en la Colección forman parte de los “Antecedentes” de la cepa y quedan

registrados en la ficha de cada cepa que la Colección debe mantener actualizada).

‐ El laboratorio debe demostrar que el número de pases que realiza a las cepas no afecta a

sus características (en función de su uso previsto). Debe tenerse en cuenta que a mayor

número de pases mayor riesgo de contaminación y de que se produzcan mutaciones.

2. Verificación de las cepas procedentes de CC/BRC en el laboratorio:

No es necesario que el laboratorio confirme la identidad de la cepa de referencia ya que ésta

viene aportada con el certificado.

Las verificaciones a realizar por el laboratorio dependerán, en cada caso, del uso previsto de la

cepa. Por tanto, el laboratorio deberá confirmar en el laboratorio únicamente las características

(bioquímicas, morfológicas, etc.) que le afecten según el uso de dicha cepa en su laboratorio. Por

otro lado, en cada pase debe evaluarse la viabilidad y la pureza.

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