Nuevas estrategias analíticas con MS de alta resolución

Herramientas y Flujos de trabajo

Jaume C. Morales

LCMS Product Specialist

Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo

2

El TOF es un cronómetro que mide el

tiempo que tardan los diferentes iones

en llegar al detector desde que se

disparan en el PULSER.

Los iones más ligeros llegan antes y

los más pesados, más tarde.

Ese tiempo se contrasta con una

calibración del equipo t <-> m/z y

sabemos con exactitud la m/z del ión.

Genéricamente se entiende por masa exacta cuando el error en la medida es menor de 5 ppm.

Los sistemas basados en SQ/QQQ suelen mostrar un error de masa > 150ppm.

(Masa Medida - Masa Calculada)

Masa Calculada

= ppmError en la medida = X 1.000.000

HRMS TOF/QTOF

TOF

QTOF

TOF

Full Scan acquisition

QTOF

Full Scan acquisition

MS/MS spectrum

Tiapride 0.8 ppm

Tiapride 0.8 ppm

5

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

Los equipos de LCMS de alta resolución aportan alta cantidad de información

CUALITATIVA

y

CUANTITATIVA

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

Los equipos de LCMS de alta resolución aportan alta cantidad de información

CUALITATIVA¿Que necesita el analista del HR LCMS?

Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):

• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio elenco de

sospechosos, sin patrón).

• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”

tras un análisis diferencial

tras una síntesis orgánica

Un análisis de estabilidad de un fármac0

¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?

Hay tres informaciones CLAVE que un equipo de LCMS de alta información puede aportar :

• Masa Exacta.

• Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)

• Perfil Isotópico.

• Baja desviación de abundancias relativas (altura, %)

• Espectro de MS/MS de masa exacta.

• Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)

8

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?

Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS

• Masa Exacta. Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)

P.e. La masa exacta de la 3,4Metilen Dioxi Meta-amfetamina

(MDA) es M=179,09463 y el ión [M+H]+= 180,10191

En Este caso la masa medida es = 180,10197

Con un error de 0,00006. Ɛ = 0,25ppm

1ª INFORMACION SUMINISTRADA

9

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?

Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS

• Perfil Isotópico.Baja desviación de abundancias relativas (altura, %)

El perfil isotópico nos permite diferenciar isobáricos.

Se evalúa la abundancia relativa entre los isótopos presentes Y

la masa exacta Ɛ de los mismos.

En Este caso las abundancias relativas y la masa exacta Ɛ de

los isotopos nos dan un Score de : 98 (sobre 100)

2ª INFORMACION SUMINISTRADA

10

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?

Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS

• Espectro de MS/MS de masa exacta. Bajo error en la exactitud de

masa medida (Ɛ, ppm)El espectro MS/MS nos enseña los

fragmentos del compuesto al

someterlos a una colisión con N2 o Ar

en la celda de colisión.

El éxito de esta información es que los

fragmentos den una masa exacta Ɛ

suficiente para poder verificar que

pertenecen al ion “Padre”.

3ª INFORMACION SUMINISTRADA

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):

• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio

elenco de sospechosos, sin patrón).

• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”

tras un análisis diferencial

tras una síntesis orgánica

All Ions MS/MSMayor confianza en la identificación

La mejor solución para screening de compuestos conocidos en alimentación, medioambiente y toxicología

• Único de Agilent:

- Base de datos de masa exacta y perfil isotópico

- Librerías de espectros MS/MS para la identificación de fragmentos

- Innovador “Coelution Score” para confirmar qué fragmentos pertenecen al ión precursor

• Re-interrogación de los datos para desconocidos sin volver a inyectar

• Adición rápida de los desconocidos a la librería de espectros MS/MS e inclusión en el screening

• Creación rápida del método de cuantificación para un target screening multi-compuesto

12

Example for all ions spectraCarbofuran in multi-residue solvent standard

20/11/2015

AccMass_Screening_Pesticides

13

Low energy

spectrum

High energy

spectrum

Example for all ions spectraCarbofuran in multi-residue solvent standard

20/11/2015

AccMass_Screening_Pesticides

14

Low energy

spectrum

High energy

spectrum

Cuantificación dirigida

con confirmación

adicional por fragmentos

All Ions MS/MS Targeted Screening Workflow

Acquisition PCDL Qual Quant

MassHunter Acquisition

Alto/Bajo

Fragmentor

Voltage en TOF

Pesticide

library (~450-

500

compounds

with spectra)

Forensics

/Tox library

(2720

compounds

with spectra )

Alta/Baja

Collision Energy

en Q-TOF

Find by Formula

on MS low

channel

EICs for

fragments on MS

high channel

Correlate qualified

fragments with

target

Find

Extract

Qualify and confirm

fragments

Export

Align EICs of

fragments with

parent EIC

Targets

m/z, ion species

Quant

Report

Qual

Report

15

All Ions MS/MS : Fácil creación del método

El método de MassHunter Acquisition tan sólo necesita programar un canal

de “baja energía” (e.g. Collision Energy=0) y un canal de alta energía (e.g.

CE = 40). NO es necesario programar para cada compuesto como en un

QQQ.

¡El resultado es un método de muy fácil creación!

20 de noviembre de 2015

Customer Presentation

16

New Experiment

# field permite

crear hasta

cuatro diferentes

canales para

cada segmento

de tiempo

All Ions MS/MS : Identificación dirigída por medio de las librerías PCDL Agilent

Las Personal Compound Database and Libraries (PCDLs) contienen

espectros MS/MS. All Ions MS/MS utiliza los fragmentos del product ions

en el espectro para confirmar la identificación a nivel MS. => ¡Menores

falsos positivos!

.

Application PCD PCDL

Forensics / Tox 7360 compounds (w

Marine Biotox)

Adds spectra for 2720

compounds

Pesticides 1609 compounds Adds spectra for 450 to

500 compounds

Veterinary Drugs ~1000 compounds Adds spectra for ~500

compounds

Metabolomics METLIN rev. B.07.00

~220.000 compounds

(Jan 2015)

METLIN rev. B.07.00

(adds spectra for ~9000

compounds)

November 20, 2015

Customer Presentation

17

All Ions MS/MS : Confirmación Cromatográfica de los Product Ions

Sobreposición de los

canales de Alta y Baja

Energía

Curvas de Coelución –

El precursor y los

fragmentos coinciden

exactamante en el

máximo del

Qualitative screening using All Ions MS/MSResults overview

19 WEBEX December 6, 2012

AccMass_Screening_Pesticides

• Carbendazim was found

with 5 valid qualifier

fragments from the PCDL

spectrum

• Overlay of the EICs with the

Coelution Plot shows

excellent agreement

between the products and

precursor ion

Qualitative screening using All Ions MS/MSResults overview

20 WEBEX December 6, 2012

AccMass_Screening_Pesticides

All IONS Acquisition

21 November 20, 2015

Agilent Restricted

Compound results .cef file Quant method

- Accurate mass

EICs for quantifier

and qualifier

- Relative responses

- Retention times

Adduct patternReference pattern library

Import and Build Qual/Quan Method from Qual

22

MH Qual

MH Quant

The Agilent 7200 Series GC-Q/TOF

=+

Quadrupole Time of Flight MS

Time of Flight MS

Triple Quadrupole MS

7890 + 7000 + 6500 = 7200 GC-Q/TOF

Pesticide screening

GC-Q/TOF

7200 Q/TOF Components

7000B TQ6500

Q/TOF

NEW

OpticsNEW

Removable

Ion Source

Two

300 L/s Turbos

Four stages of pumping

Pesticide screening

GC-Q/TOF

Screening LC-Q/TOF vs GC-Q/TOF

Pesticide screening

GC-Q/TOF

LC/MS ESI+GC/MS EI+

Malathion

MWt = 330.0361

CE = OV

La presencia del ión molecular [M]+

es minoritaria

Fragments

[M+H]+ Low energy

CE = OV

High energy

CE > OV

Screening Pesticides with a GC-Q/TOF

• Accurate Mass provides added compound selectivity

- Higher resolution provides added interference selectivity

• TOF mode : Always full spectral data, Non-targeted acquisition

• ‘Unlimited’ number of compounds can be screened (search

accurate mass compound database for identification)

• Sensitivity is the same regardless of number of compounds

screened

• MS/MS (Q/TOF Mode) further assists compound identification

Pesticide screening

GC-Q/TOF

All Ions : Targeted Screening Workflow

1. Acquisition2.

PCDL3. MH Qual SW

4. MH Quant SW

Compound

library

(compounds

with spectra and

RTs)

Quantify target with

additional fragment

ion confirmation

GC-Q/TOF MH Acquisition

Constant

Collision Energy

on Q-TOF (CE=0)

Find by Formula

on MS

EICs for

fragments

Correlate qualified

fragments with

target

Find

Extract

Qualify and confirm

fragments

Export

Align EICs of

fragments

Targets

m/z, ion species

Quant

Report

Qual

Report

Retention Time Locked Method

(optional)

Pesticide screening

GC-Q/TOF

(1)

7200 GC-Q/TOF RTL Pesticide Analyzer CF Method

7890B

GC

PCM

Column (1) : 15m x 0.25mm ID x 0.25um HP-5MSUI (19091S-

431UI)

Column (2) : 15m x 0.25mm ID x 0.25um HP-5MSUI (19091S-

431UI)

Same column configuration and flow rate for 40 minute and 20

minute

methods, only difference is Oven Temperature program

7200

Q/TOF

MMI Inlet

Purged Union

ALS

(2)

Purged ultimate union

1. Acquisition

Mid-Column Back Flush

Pesticide screening

GC-Q/TOF

PCDL : Personal Compound Database Library1. Acquisition 2. PCDL

Pesticide screening

GC-Q/TOF

Accurate mass and Retention time Database + EI Accurate Mass Spectra

• Name

• Mol. Formula

• Mono-isotopic exact mass

• Locked RT

• CAS #

• Accurate mass spectrum

Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS

Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):

• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio

elenco de sospechosos, sin patrón).

• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”

tras un análisis diferencial

tras una síntesis orgánica

Págin

a 31

¿Qué es la Metabolómica?

¿Cuales son las diferencias en

su composición química que se

correlacionan con las

diferencias observadas?

Metabolómica es el estudio sistemático

de las pequeñas moléculas orgánicas

(metabolitos) presentes en un sistema

biológico

Utiliza el análisis estadístico

multivariante para correlacionar: - variaciones en la concentración de metabolitos.

- con distintas propiedades de 2 o más grupos

de muestras comparadas (organismo, órgano,

tejido, célula, fluido, producto, alimento…).

Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras

Análisis

Estadístico

Admite Experimentos:

• Estudios simples (A vs. B) y complejos (n Variables)

• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….

• Clasificación (/ Autentificación) de muestras

Proporciona Muy Potentes Herramientas

Estadísticas y de Visualización Comparación:

• Filtrado simple (test de frecuencia)

• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)

• Análisis de Componentes Principales (PCA)

• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),

• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)

• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)

• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……

• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)

• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.

November 20, 2015

MassHunter Profinder Webinar

33

Four Profinder Windows: Compound centric visualization and editing of results

EIC Sample replicate

overlay

Averaged

Sample Spectra

MassHunter Profinder Workflow solution:So what’s new?

• A one-shot process for untargeted and

targeted feature extraction

• Designed specifically for the needs of

the metabolomics user

• Processes many samples!

• Recursive analysis

• Compound Group Centric: new

manual review and editing

functionalities

• Major reduction in processing time

• It’s FREE!!

November 20, 2015

MassHunter Profinder Webinar

34

MassHunter Profinder

Agilent Metabolomics WorkflowG

CM

SC

E/L

CM

S

Separate &

Detect

CE-LC-TOF/QTOF

CE-LC-QQQ

Feature

Finding

MassHunter QualFind by

Chromatogram

Deconvolution

MassHunter QualMFE,

Find by Formula,

Find by Ion

Alignment &

Statistics

Mass Profiler

Professional

(MPP)

Identify

ID Browser

Mass Profiler

(MP)

Pathways //

Profiling

Pathway

Architect

35

Profiling

ITP 2013

ICP

-MS

GeneSpring Software PlatformStatistical and Visualization Tool with Pathway Analysis

LC/MS

GC/MS

MassHunter

Qual/Quant

Microarrays Feature Extraction

GeneSpring

Platform

Pathway

Architect

• Commitment to the GeneSpring platform systems biology software

36

Abundance

color key

Average compound abundance

by sample group

ITP 2013

Pathway Architect

Map and visualize data from one or two types of -omic data on pathways

Search, browse and filter pathways

Supports biological pathways from publicly available databases

• WikiPathways

• BioCyc

• Supported pathway formats

• BioPAX 3 – Pathway Commons, Reactome, NCI Nature Pathway

• GPML – PathVisio –custom drawing

• Export compound list from pathways

Metabolite Data

Overlay

List of all pathway entities, dynamically

linked to pathway selection

Pathway Architect is an optional

module in MassProfiler Professional

Yeast Omics

37

One of the Stress Activated Pathways in Yeast

Agilent Metabolomics WorkflowG

CM

SC

E/L

CM

S

Separate &

Detect

GC/MSD

GC-QQQ

CE-LC-TOF/QTOF

CE-LC-QQQ

Feature

Finding

MassHunter QualFind by

Chromatogram

Deconvolution

MassHunter QualMFE,

Find by Formula,

Find by Ion

Alignment &

Statistics

Mass Profiler

Professional

(MPP)

Identify

ID Browser

Mass Profiler

(MP)

Pathways //

Profiling

Pathway

Architect

39

Prediction

Model

JAPAN

Country B

Country C

Country A

ITP 2013

Ejemplo 1: Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia

líneas de Arroz y cepas Bacteriales

• TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje• TP309-Xa21 arroz transgénico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada genéticamente: PXO99 (RaxST-).• PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa capaz de generar el péptido AvrXa21.

• PXO99 RaxST- : bacteria modificada genéticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el péptido AvrXa21.• Péptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genéticamente (TP309-Xa21)

PX099

Péptido AvrXa21+

PX099 RaxST -Bacteria salvaje Bacteria transgénica

PXo99

RaxST-

Blanco control tratado

6 (D)

6

6

6 (C)

NA(B)

6

6

6 (A)PXo99

Transgenic

TP309-Xa21

Salvaje

TP309

Condition

(Class)

2 Tipos de Arroz (TP...)

2

tipos d

ebacte

ria (

PX

…)

Blanco control SIN tratar

TP309 TP309-Xa21

2 tipos arroz (TP…)

(A) (B) (C) (D)

Resistente

a la plaga2 tipos

bacterias

Los replicados de muestras de la población son importantes

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)

Página 40

Application Note 5989-6234

Página 41

Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Deconvolución de Cromatogramas LC/MS de Arroz mediante “AgilentMolecular Feature Extractor (MFE)”

MFE deconvoluciona cromatogramas para localizar los tiempos de retención / masa /abundancia de todos los compuestos ionizados. Evalúa isotópos, aductos y coeluciones.

Parámetros utilizados:

- Máx. carga iones = 1

- Umbral Detección en altura (o S/N)

• Iones Positivos: 1000

• Iones Negativos: 500

Número típico de “molecular features”(/compuestos) encontrados:

• Iones Positivos ~ 1500

• Iones Negativos ~ 400

Aprox. 1900 compuestos/muestra

(la gran mayoría desconocidos)

Muestra adquirida con LC/MS-TOF (o QTOF)

MFE Tr, m/z, Int.

Mass Profiler Professional: ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados mediante “Tukey Post-hoc Test”. Modo Iones Positivos

Azul: estadísticamente

equivalentes

Rojo: estadísticamente

diferentes

----- Arroz Salvaje ------

7 C

ondic

iones B

ioló

gic

as C

om

para

das

7 Condiciones Biológicas Comparadas

Infección

ArrocesResisten.

----- Arroz Transgénico ------

A

rro

zS

alv

aje

Arr

oz

Tra

ng

én

ico

Bact. Modif. Gen.

Bact.

Modif.

Gen.

Bact. Salvaje

Bact.

Salv

aje

Bact.

Salv

aje

Bact. Salvaje

Arroces

Resisten.

Infección

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

Página 42

Página 43

Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

MPP: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados: modo Iones Positivos

La comparación mediante ANOVA de 1-vía se realizó para encontrar “molecular features” (/compuestos) de interés biológico.

• Se evaluan 7 condiciones biológicas. De la comparación de resultados se concluye:

- Immunity features: (42) – metabolitos relacionados con la resistancia

- Infected features (22) – metabolitos relacionados con la infección

- Bacterial features (25) – metabolitos producidos por las bacterias

- Rice line features (170) – metabolitos relacionados con diferencias en las líneas de arroz

Diagrama de Venn Comparando

Arroz Infectado Vs. Resistente

GeneSpring MS: Análisis Estadístico Multivariante. Ejemplo

combinación de Análisis de PCA con ANOVA

Proporciona una mucha mejor diferenciación de

clases

3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1

2

3-INF

4

5

6-RES

7-INF

3-INF

7-INF 6-RES

5

2

3-INF7-INF

6-RES

5

2

mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta

ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

Introducción al “Food Profiling”

Preguntas que el análisis tradicional de contaminantes no puede responder :

• ¿Este vino es Cabernet o Pinot noir?

• ¿Este aceite es realmente de Oliva Virgen Extra?

• ¿Este arroz es de Japón o de algún otro sitio?

• ¿Como afecta a mi producto los cambios en el proceso de elaboración o fermentación?

Para poder dar respuesta a estos interrogantes necesitamosFood Profiling

45

Introducción al “Food Profiling”Perfilado en el Campo Alimentario

Perfilado de alimentos(def.) – Procesado de datos de espectros de MS de dos o más muestras de alimentos para discernir los compuestos que tienen una concentración estadísticamente diferencial.

Perfilado de Alimentos

Autenticidad

Degradación

Proceso Producción

Agilent’s Solution:

MassHunter Mass Profiler Professional (MPP)

Agilent Sample Class Predictor (SCP)

Software Solution for

Automated Rule Based

Sample Classification

47

ITP 2013

Introduction to Food ProfilingHow MPP Performs Sample Class Prediction (SCP)

Step 1. Develop a Prediction Model

Test a range of qualified samples to create a prediction model

• Different wine varietals

• Rice grown in different regions

• High quality and low quality or degraded food

November 20, 201548

ITP 2013

SCP - Step 1: Prediction Model Generation

• The front-end of the class prediction model generation is consistent with standard chemometric profiling workflows

• After data is acquired and imported, a class prediction model is built inside MPP

• Each model’s internal parameters can be exported to a sample class prediction model file (.SCP)

Acquisition Feature ExtractionChemometric

Analysis

Model

Prediction Model

Available Class Prediction Algorithms

• Partial Least Squares Discrimination

• Naïve Bayes

• Decision Tree

• Support Vector Machine

• Neural Network

49

ITP 2013

Tests de AutenticidadUso del Sample Class Prediction

Ejemplos de test de Autenticidad:

• Tipo de producto

• Variedad del vino (uva)

• Zumo puro vs. zumo de mezclas

• Punto de Origen (¿En que país o

región ha crecido?)

• Grado de calidad

• Aceite Oliva Virgen Extra vs. Otros…

50

Authenticity: ClassificationVerifying Olive Oil Grade by GC/MS

• Standards exist for classifying Extra Virgin Olive Oil (EVOO)

• Sensory tests are often used to qualify EVOO, but are expensive and subjective

• Prediction model created in MPP based on known EVOO samples

• “Pass/Fail” model set up to accurately determine whether Olive Oil samples could be labeled Extra Virgin

November 20, 201551

Pass/Fail

ITP 2013

Olive Oil Characterization

1. To create a model that could predict

whether olive oil sample would pass

or fail sensory test

2. To find statistically significant olive oil

components that are present at

distinct levels depending on whether

they passed or failed sensory test

7200 Series GC/Q-TOF

• High resolution full acquisition spectra

• Accurate mass measurements

• Fast acquisition of full spectra

• MS/MS mode

- Full spectrum of Product Ions

• With high resolution and accurate mass

• High sensitivity structural elucidation tool

Ideal tool for solving complex analytical problems

EXPERIMENTAL DESIGN

Experimental Design

Pass/Fail

• Olive oil samples had been

subjected to sensory test and

classified as passed or failed.

• Samples were analyzed on the

7200 GC/Q-TOF. Data was

acquired in both EI and PCI

modes.

• MassHunter Qual was used for

deconvolution and Library

Searches.

• Mass Profiler Professional (MPP)

was used for statistical evaluation

of the data including construction of

class prediction model to correctly

predict whether the sample would

pass or fail the sensory test

EI/CI – MassHunter Qual and MPP

MassHunter Qualitative AnalysisDeconvolution and Library Searches

Identification of Compounds using Library Search

Mass Profiler ProfessionalData filtering, PCA, ANOVA, Volcano Plot

• Mass Profiler Professional (MPP) was used for statistical evaluation of the data

including construction of class prediction model to correctly predict whether the

sample would pass or fail the sensory test

RESULTS

EVOOs that Pass Sensory Evaluation

This is why we need powerful data analysis software!

EVOOs that Pass and Fail Sensory Evaluation

442 unique compounds

were distinguished by

chromatographic

deconvolution, most of

which occur only once or

twice and are filtered out by

MPP.

The table shows how many of these 442

compounds were actually found in each sample.

Olive Oil Characterization: Data Filtering

PCA shows how the pass/fail data clusters.The samples that failed the sensory test are marked in red and the ones that passed are blue.

Principal Component Analysis is used to Visualize

failed

passed

The Volcano Plot (on the right) shows fold-change for each entity on the x-

axis and significance on the y-axis.

Compounds accumulated

in the samples that failed

the sensory test.

Fold Change Analysis

Raw Data Verification

It pays to go back to the raw data to visually inspect MPP (multivariate

statistical) results. Here we see the raw data verification of the peak at

27.54 minutes.

Building the Classification Model

Training the model with data:

• Two data classes where established with the compounds

(markers) increased in the failed samples

• Create a model that predicts whether an olive oil sample will

pass the sensory test

x

x

x

x

Testing the Model

All samples correctly predicted. The samples that were not

used for building the prediction model are listed with the training

parameter set as ‘None’.

x

x

x

x

Testing the Model

Commercial unit mass EI spectral libraries can be searched using accurate mass

EI GC/Q-TOF data to identify compounds

Compound spectrum

NIST library spectrum

Compound spectrum

(accurate mass)

EI

Library Searching

C12H17

5.11 ppmC9H11

-3.58 ppm

C8H9

-2.63 ppm

C10H13

0.93 ppm

α-Cubebene, full scan

C15H24

α-Cubebene: MS/MS

Precursor: 204

CE: 10 eV

(replib) α-Cubebene

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 2300

50

100

41

55

69 77

8191

105

119

133147

161

175 189

204

Accurate masses of ion fragments are consistent with molecular formula

MS/MS Analysis

Molecular Structure Correlator

Odor Profile of Compounds Increased in Failed Samples

Searching the flavor company catalogs by CAS number provided

odor profile information on the up-regulated compounds.

1Bedoukian Research2The Good Scents Company

Proposed NIST ID Formula CAS Odor

n-Hexadecanoic acid C16H32O2 57-10-3 Faint Oily1

Octadecanoic acid, ethyl ester C20H40O2 111-61-5 Waxy2

Squalene C30H50 111-02-4 Floral2

α-Cubebene C15H24 17699-14-8 Herbal2

Summary: A model that predicts the classification of extra virgin olive oils was constructed using data from the 7200 GC/Q-TOF and the MassHunter software suite.

High Resolution provides the required

selectivity

Mass Accuracy is essential for

defining compounds

MS/MS is critical of structural

confirmation of unknowns

Comprehensive Software is vital for

turning MS data into pertinent and

relevant results X

Authenticity: Food TypeDetermining Wine Varietal by LC/MS

• 45 red wine samples

used to create a

prediction model

• 15 Cabernet

• 16 Merlot

• 14 Pinot Noir

• Wines sampled

varied in geographic

origin and vintage

• 5 additional wines

which were not part

of the original

sample set were

correctly classified

using model

November 20, 201573

ITP 2013

Application note 5990-8451

Página 74 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Ejemplo de Aplicación de Autentificación de Vinos• 45 Vinos Tintos

• 3 Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)

• 11 países de origen: República Checa, Eslovaquia, Francia,

Italia, Macedonia, Bulgaria, Hungría, Australia, Chile,

Alemania, EE.UU.

• Cosechas: 2004 – 2008

CONJUNTO DE MUESTRAS MUY VARIADO

Página 75 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).

Instrumentación Utilizada

Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

Agilent Technologies6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

Agilent Technologies1200 RRLC system

Jet Stream ESI source

Multimode ion source

Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)

Software de

Análisis Estadístico

Multivariante

?

Página 76 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

?

?

??

?? ? ?

??

???

??

?

???

BLANCO

Procesado de Datos: ejemplo T.I.C.

TIC de Vino y blanco, LC-(ESI+) QTOFMS

???

?

?

?

??

??

?

??

?

?

??

VINO

• Datos muy complejos.

• Compuestos minoritarios enmascarados.

Se requiere software que extraiga y

caracterice todos los compuestos

ionizados.

Los espectros corresponden a

múltiples compuestos coeluyentes

Página 77 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”

Find compound by Molecular

Feature Extractor

M.F.E. extrae 20.506 “features” del

conjunto de todas las muestras (en

las condiciones utilizadas)

Página 78 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Filtro por omisión: la existencia del “feature” en el

100%* de las muestras de al menos en un grupo.

En conjuntos de muestras muy variadas, algunos compuestos importantes podrían ser filtrados ...

Ave

rag

e i

nte

nsit

y

663 “features” de 20.506

Procesado de Datos mediante Agilent Mass Profiler Profesional: Filtración de Entradas por Frecuencia (Incidencia en las Clases)

* Filtrando con el 50%

el nº de “features”

aumenta de 663 a 3600

Página 79 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

PCA de los datos:Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26

CABERNET SAUVIGNON

MERLOT

PINOT NOIR

FILTRACIÓN

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)

Un adecuado

filtrado de los

datos es

esencial para

una buena

clasificación

Página 80 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica

Marzo 2009

Validación del Modelo de Predicción de Clases

• Durante la validación del modelo, 2 MERLOT fueron mal clasificados.

• Todos los Cabernet Sauvignon y Pinot Noir se clasificaron correctamente.

• La fiabilidad de predicción del modelo resuelto ser del 95.6%*

El modelo clasificó correctamente las 5 muestras adicionales evaluadas (2 CS, 1M, 2 PN).

Número de muestras utilizadas en la validación: 45

* ANOVA utilizó para filtrar un p≤0.05.

Agenda

November 20, 201581

Intro evolución ciencias ómicas

Flujos de Trabajo en Metabolomica

Aplicaciones en Ciencias de la Vida

Introducción al perfilado

Autenticidad

Degradación de Alimentos

Desarrollo de procesos

Degradación del alimentoCreación de un análisis dirigido para identificar la degradación

Las condiciones ambientales durante el transporte y

almacenaje de un producto alimentario pueden mermar su

estado y degradarse.

• El análisis de productos degradados permite identificar

compuestos que son Indicadores o Marcadores de la calidad

o degradación.

• Esto permite la creación de un método de análisis dirigido de

los marcadores que permite aceptar o rechazar materia

prima o producto final basado en la calidad.

82

Condiciones experimentales

• La muestra de referencia (control) se

refrigera : Reference

La otra muestra se somete a luz

UV y se analiza tras 1 semana y

otra vez tras un mes de

exposición : Sample

Vial Ambar

Vial Incoloro

November 20, 201583

8x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

+ TIC スキャンSAKE_R_N1.D

1 1

8x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

+ TIC スキャンSAKE_T_1WEEK_N1.D

1 1

8x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

+ TIC スキャンSAKE_T_1MONTH_N1.D

1 1

8x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

+ TIC スキャンSAKE_B_1WEEK_N1.D

1 1

8x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

+ TIC スキャンSAKE_B_1MONTH_N1.D

1 1

カウントvs. 測定時間(min)

7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 23.5 24 24.5 25 25.5 26 26.5 27 27.5 28 28.5 29 29.5 30 30.5 31 31.5 32 32.5 33 33.5 34 34.5 35 35.5 36 36.5 37

Test de deterioro por GC/MS Total Ion Chromatogram

Reference (Stored in the refrigerator)

Brown vial, 1 week

Brown vial, 1 month

Transparent vial, 1week

Transparent vial, 1 month

November 20, 201584

Test de deterioro por GC/MSPCA 3D Score Plot

Transparent vial, 1 month

Brown vial, 1 month

Reference

November 20, 201585

Test de deterioro por GC/MSPCA 2D Score Plot y Loading Plot

Hierarchical Cluster Tree

Classification of entities

(compounds) from hierarchical

cluster tree

November 20, 201586

Test de deterioro por GC/MSFiltrado de compuestos con MPP filters

All Entities 441Entities with 100% frequency at

least one condition 260Entities that have significance by

One-way ANOVA p<=0.05 66

Entities with the Fold

Change>=2.0 between

Reference and 1 Month 24

Reference 1 week 1 month

Los filtros aplicados en MPP reducen el tratamiento de datos

extrayendo tan solo aquellos que son diferenciales.

November 20, 201587

Degradación del alimentoSake (Licor Japonés) por GC/MSUna muestra de Sake de buena calidad se divide en 2 viales

• La muestra de referencia (control) se refrigera

• La otra muestra se somete a luz UV y se analiza tras 1 semana y

otra vez tras un mes de exposición.

• El acido piruvico se identifica como buen marcador de la

degradación.

November 20, 201588

Increasing entitiesDecreasing entities

down up

1 week

1 month

Reference

Compuesto menguante: Pyruvic acid (m/z=174)

ITP 2013

Agenda

November 20, 201589

Intro evolución ciencias ómicas

Flujos de Trabajo en Metabolomica

Aplicaciones en Ciencias de la Vida

Introducción al perfilado

Autenticidad

Degradación de Alimentos

Desarrollo de procesos

Desarrollo del ProductoCaracterización de la Calidad o Propiedades

Algunos productos alimentarios como la cerveza y el vino estan

experimentan cambios con el tiempo “envejecimiento”. Este paso del

tiempo en ocasiones provoca efectos no deseados pero en otros

casos mejora el producto.

• Identificación de los compuestos presentes en el producto

deseado

• Optimización del proceso de producción y almacenaje para

potenciar el efecto deseado y atenuar el NO deseado.

Algunos estudios en alimentación buscan las propiedades genéticas

de un alimento para poder entender sus efectos beneficiosos y los

efectos medicinales que provocan en un organismo.

• Comparación de muestras normales frente a aquellas que

provocan un efecto beneficioso. (Nutracéuticos)

• Examinar diferencias genéticas y realizar una análisis de rutas

metabólicas para entender los mecanismos biológicos

relacionados.

90

Desarrollo del ProductoCaracterización de cerveza por LC/MS

• Los cromatogramas TIC parecen similares a lo largo de los días de envejecimiento

• Un análisis Multivarianteutilizando MPP reveló compuestos que sí variaban durante el envejecimiento

• Si extraemos los EIC de éstos compuestos percibimos cambios de más de > 10x en los compuestos de interés después de 14 días de envejecimiento

91

Day 0

Day 5

Day 2

Day 8

Day 14

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 1

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 1

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 1

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 1

Day 0

Day 2

Day 5

Day 8Day 14

Novel Ion Mobility Technology for LC/MS

Mass Accuracy Does Not Equal Compound Identification: Seven Golden Rules - Oliver Fiehn

Empirical formula is not unique above

mass m/z 100 (searching PubChem)

Number of formula: ChemSpider mass

search at m/z 400.3787

• 1 ppm mass error → 1742 entries

• 0 ppm mass error → 340 entries

Need additional physical information to

identify

• MS/MS spectra

• Physical properties such as:

• Chromatographic retention time

• Ion mobility cross section (size,

charge)

Number of Database Entries

(Assuming Zero Mass Error)

November 20, 2015

93

What Does Ion Mobility Bring to Mass Spectrometry?

Separation

• A new dimension of separation for increased mass spectral purity especially for complex mixture analysis.

• Ion Mobility resolves of many isomeric analytes otherwise impossible to determine by mass spectrometry alone.

Improves Detection Limits

• Ion Mobility dramatically reduces interference from other analytes and background.

• Efficient ion focusing and transfer through the ion optics maximizes sensitivity for the overall system

Confirmation

• Collision Cross Section data gives additional information supporting compound characterization and identification.

November 20, 2015

94

Ion Mobility – A Brief History…

November 20, 2015

95

1905

Ion mobility theory

Paul

Langevin

1969

Transport of Ions in Gases

McDaniel & Mason

1997

Applications to clusters & biomolecules

Clemmer & Jarrold

2006

Synapt Triwave

G2 in 2009

G2S in 2011

2013

Agilent IMS QTOF

1872 - 1946

Mass Spectrograph

Aston & Thomson

1919

Solving Analytical Problems

November 20, 2015

96

Better IM resolution

Higher IM sensitivity

Resolve complex samples

Direct measurement

of Ω

Preserve molecular structures

• Richard Smith

• Erin BakerPNNL

• Cathy Costello

• Joe ZaiaBoston University

• David Russell

• Fred ZinnellTexas A&M

• John McLean, Jody May and Cody GoodwinVanderbilt University

• Al Yergey

• Peter Backlund. NIH

• Agilent LABS R&DAgilent

Drift Ion Mobility for LC-MS

Cross sectional areas

Complex Samples

Shape and Charge

Conformers

Isomers

Chromatography, Mass Resolution &

now Ion Mobility

2013 ASMS Scientific Presentations:

• Disease research

• Proteomics, Metabolomics, Lipidomics

• Natural Products

• Fundamental studies

Ion Mobility

MS

Pacific Northwest

Labs

Texas A&M

VanderbiltUniversity

Boston University

NIH

November 20, 2015

97

Resolution Is Important!

Chromatographic Ion Mobility Mass

~seconds ~60 milli-seconds ~ 100 m seconds

November 20, 2015

98

It’s All About Separation

Chromatography Ion Mobility Mass

~seconds ~60 milli-seconds ~100 m seconds

November 20, 2015

99

IM-QTOF Instrument OverviewNovel Aspects Achieve New Performance Capabilities

DC only drift tube to achieve lowest ion temperatures

System sensitivity optimized using electrodynamic ion funnels

Designed for both high Ion Mobility and Mass Resolution

Ion Fragmentation can be selected using standard QTOF collision cell (CID)

10x increase in data acquisition system to support the additional data rates of adding the 3rd Ion Mobility Dimension

November 20, 2015

100

IM-MS Operational Modes

101

• QTOF Only Mode

• Mobility Separated Precursor Ion Mode

• Mobility Separated All Ions Fragmentation Mode

• Mobility Separated Targeted MS/MS Mode

m/z selectionON/OFF

FragmentationON/OFF

Mobility

separation

IM-QTOF workshop 01/28/14

tdrift

Detector

Analyte

Ions

Gating

Optics

Ion Mobility Cell

t0

VH VL

Electric Field

Stacked ring ion guide gives linear field

𝑣 = 𝐾 𝐸 ∝𝑒 𝐸

𝑃 𝑇 Ω

Basic Operational Principle of Ion MobilityFor Conventional DC Uniform Field IMS

November 20, 2015

102

Resolving Stereoisomers

α-glucose β-glucose

Ion mobility enables separation of glucose stereoisomers

Melezitose

Raffinose

α-glucose b-glucose

Resolving Different type of Isomers

Conformational Space Occupancy of Biomolecules: Class Association by Trend Curves

Size Shape

Charge

Using a Synapt does NOT allow compound class association

Drift tube IMS allows

Class association

Conformational Space Occupancy of BiomoleculesC

oll

isio

n C

ros

s S

ec

tio

n(Å

2)

Mass (Da)

Hypothetical Ordering of

Biomolecular Classes

lipids

carbohydrates

peptides

oligonucleotides

November 20, 2015

106

Lipid nomenclature

Trivial nomenclature Palmitoleic acid Trivial names (or common names) are non-systematic historical names.

Systematic

nomenclature

(9Z)-octadecenoic

acid

Systematic names (or IUPAC names) derive from the standard IUPAC Rules for

the Nomenclature of Organic Chemistry, published in 1979,[1] along with a

recommendation published specifically for lipids in 1977.[2] Counting begins from

the carboxylic acid end. Double bonds are labelled with cis-trans isomerism-

/trans- notation or E-/Z- notation, where appropriate.

Δx nomenclaturecis,cis-Δ9,Δ12

octadecadienoic acid

In Δx (or delta-x) nomenclature, each double bond is indicated by Δx, where the

double bond is located on the xth carbon–carbon bond, counting from the

carboxylic acid end. Each double bond is preceded by a cis- or trans- prefix,

indicating the conformation of the molecule around the bond.

n−x nomenclature n−3

n−x (n minus x; also ω−x or omega-x) nomenclature both provides names for

individual compounds and classifies them by their likely biosynthetic properties in

animals. A double bond is located on the xth carbon–carbon bond, counting from

the terminal methyl carbon (designated as n or ω) toward the carbonyl carbon.

Lipid numbers

18:3; or 18:3, n-6; or

18:3, cis,cis,cis-

Δ9,Δ12,Δ15

Lipid numbers take the form C:D, where C is the number of carbon atoms in the

fatty acid and D is the number of double bonds in the fatty acid. This notation can

be ambiguous, as some different fatty acids can have the same numbers.

Source: Wikipedia

November 20, 2015

107

Lipid classes

Source: Wikipedia

Fatty acids

Glycerolipids

Glycerophospholipids

Sphingolipids

Sterol lipids

Prenol lipids

Saccharolipids

Polyketides

Main classes Examples of Glycerophospholipids

November 20, 2015

108

Cerebrosides

Cerebrosides are glycosphingolipids called

monoglycosylceramides which are important components in

animal muscle and nerve cell membranes.

November 20, 2015

109

Diseases Based on Sphingolipids

Disease Deficient enzyme Accumulated products

Niemann-Pick disease Sphingomyelinase Sphingomyelin in brain and RBCs

Fabry disease α-galactosidase A Glycolipids in brain, heart, kidney

Krabbe disease Galactocerebrosidase Glycolipids in oligodendrocytes

Gaucher disease GlucocerebrosidaseGlucocerebrosides in RBCs, liver and

spleen

Tay-Sachs disease Hexosaminidase A GM2 gangliosides in neurons

Metachromatic

leukodystrophy

Arylsulfatase A or

prosaposinSulfatide compounds in neural tissue

Source: Wikipedia

November 20, 2015

110

Lipid Analysis

Tetraalkylammonium Salts

+2 ions

+3 ions

+1 ions

+4 ions

Ion

Mo

bilit

y D

rift

Tim

e (

ms)

Mass (Da)

0

0

20

40

50

500 1000 1500 2000

10

30

60

70

L-α-phosphotidylethanolamines (PE)

TAA-3

TAA-16

TAA-12

TAA-10

TAA-8TAA-7

TAA-6

TAA-5

TAA-4

November 20, 2015

111

Lipid AnalysisIo

n M

ob

ilit

y D

rift

Tim

e (

ms)

Mass (Da)

0

0

20

40

50

500 1000 1500 2000

10

30

60

70

PE 60:NPE 62:N

PE 64:N

PE 33:NPE 35:N

PE 37:NPE 39:N

PE 41:N

PE 23:NPE 21:N

PE 19:N

PE oligomers (+1)

PE oligomers (+2)

L-α-phosphotidylethanolamines (PE)

November 20, 2015

112

Lipid AnalysisIo

n M

ob

ilit

y D

rift

Tim

e (

ms)

Mass (Da)

0

0

20

40

50

500 1000 1500 2000

10

30

60

70

PE 35:(6-2) PE 37:(8-4) PE 39:(10-6)PE 33:(4-2)

+Na +K

Mass (Da)

740 760 770 780 790750 800 810 820

PE 60:NPE 62:N

PE 64:N

PE 33:NPE 35:N

PE 37:NPE 39:N

PE 41:N

PE 23:NPE 21:N

PE 19:N

PE oligomers (+1)

PE oligomers (+2)

November 20, 2015

113

Agilent Technologies

114

jaume_morales@agilent.com