Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las · NIVEL BAJO DE SOSPECHA Y DETECCIÓN DE CASOS...

Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las Rickettsiosis

Dra. Isabel Jado GarcíaLaboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales

Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III

NIVEL BAJO DE SOSPECHA Y DETECCIÓN DE CASOS

DEFICIENCIAS EN SU ESTUDIO

No existen métodos comerciales de detección directa

Patógenos zoonósicos bacterianos emergentes :

‐ Son agentes de difícil diagnóstico

Necesidad de una tipificación más detallada

‐ Organismos de cultivo fastidioso

‐ Producen cuadros clínicos inespecíficosAlteraciones hematológicas y bioquímicas (TCP, leuc y enz hep ↑ )

‐ Enfermedades de baja incidencia

Diagnóstico de las rickettsiosis

1 Grupos de Medioambiente

Estudio de la dinámica de vectores y reservorios

(Entomólogos, Zoólogos, Veterinarios, Biólogos)

Obtención de muestras para su estudio

3 Grupos de Laboratorio

(Microbiólogos, Biólogos Moleculares, Taxónomos)

Desarrollo de metodología de detección y caracterización Estudio de muestras recogidas.

2 Grupos Clínicos

Identificación y estudio de casos humanos y animales

(Médicos y Veterinarios)

Obtención de muestras para su estudio

Necesidad de un abordaje multidisciplinar

Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas

CLÍNICA

EPIDEMIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA

Los principales signos clínicos varían de la especie implicada, los daños tienen un mismoorigen y derivan de la vasculitis generalizada por la multiplicación bacteriana en lascélulas endoteliales.

Casos graves con afectación del SNC son relativamente frecuentes.R. conorii (subsp. conorii) 5‐6% formas severas y 2,5% † en pacientes diagnosticados

Diagnóstico: Aspectos Clínicos

ExantemaVasculitisEscara de inoculación

Una erupción febril inexplicada del adulto en veranoPresencia de lesiones cutáneas necróticasDespués de mordedura de garrapata si aparece:

‐Meningoencefalitis (con serología de borreliosis negativa) ‐ Fiebre a la vuelta de un país tropical o mediterráneo‐ Fiebre resistente a betalactámicos‐ Eritema crónico atípico

Además de las fiebres inexplicadas asociadas con neutropenia, trombopenia o elevaciónde las transaminasas, se debe sospechar una rickettsiosis:

Evaluación del riesgo

FACTORESCLIMÁTICOS

DISPONIBILIDADDE ALIMENTOS

DENSIDAD DE MICROMAMÍFEROS

MANTENIMIENTODE IXÓDIDOSINFECTADOS

El riesgo de que una garrapata transmita una rickettsia y la prevalencia de una determinadainfección depende de varios parámetros:

1. La prevalencia de garrapatas infectadas53,4 % de D. marginatus de Madrid infectados con R. raoultii0,4 % de I. ricinus del PV infectados con R. monacensis

2. La afinidad de las garrapatas para picar a humanosPrevalencia de FB en países mediterráneos 50/100.000: R. sanguineus ↓Amblyomma spp ↑↑↑

3. La abundancia de garrapatas en la zona: factores climáticos y ecológicos

LA DISTRIBUCIÓN DE UNA DETERMINADA ESPECIE

COINCIDE CON LA DISTRIBUCIÓN DE LA GARRAPATA VECTOR

Diagnóstico: Aspectos Epidemiológicos

IMPORTACIÓN ILEGAL DE ANIMALES AVES MIGRATORIAS

LA CIRCULACIÓN DE ESTOS PATÓGENOS SIGUE UN PATRÓN DINÁMICO

VECTORES

RESERVORIOS

CASOS HUMANOS

R. conorii R. japonicaR. conorii subsp. israelensis R. conorii subsp. caspiaR. sibirica R. africaeR. australis R. honeiR. prowazekii R. sibirica subsp. mongolotimonaeR. typhi R. slovacaR. rickettsii R. heilongjiangensisR. akari R. aeschlimanii

R. parkeriR. massiliaeR. marmioniiR. felis

Especies de Rickettsia patógenas hasta 1984

Nuevas especies de Rickettsia patógenasentre 1985 y 2004

Las rickettsiosis son enfermedades emergentes

R. parkeri

R. conorii (caspia)

R. japonica

R. honei

R. heilongjiangensis

R. sibirica mongolotimonaeR. helvetica

R. africaeR. aeschlimannii

R. sibirica mongolotimonae

R. slovacaR. aeschlimannii

R. sibirica mongolotimonaeR. helvetica

R. monacensis

¡ 11 especies de rickettsias emergentes !

¡ 11 especies de rickettsias emergentes !

R. conorii conorii

R. conorii israelensis

R. conorii caspia

R. sibirica mongolotimonae

R. aeschlimanni

R. Slovaca

R. helvetica

R. massiliae/Bar29

R. monacensis y

otras relacionadas

R. raoultii

R. felisR. typhi

PATÓGENAS

SITUACIÓN EN EUROPA A PARTIR DE 2008

Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756

Diagnóstico

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

‐ Sarampión

‐Meningococemia

‐ Sífilis secundaria

‐ Dengue

‐ Toxicodermias

CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO(SIM) EN 2009

‐ AISLAMIENTO

‐ DETECCIÓN DE AG/GENOMA

‐ SEROCONVERSIÓN (IFI)

Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132

MUESTRA RecogidaTransporte Tiempo y Temperatura

Conservación Tiempo y Temperatura

PRUEBA DIAGNÓSTICA

NOTA

Suero Tubo con tapón de rosca

<24 h, 2‐8 C +24h, ‐20 C IFI1

Sangre con EDTA

Recoger en tubo con EDTA

< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐20 C PCR2 El EDTA3

dificulta el cultivo

Sangre citratada

Recoger en tubo con citrato

< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)

PCR, Cultivo4

Sangre heparinizada

Recoger en tubo con heparina

< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)

Cultivo La heparina5

puede inhibir la PCR

LCR Recoger en tubo estéril

< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐20 C PCR

Biopsia cutánea (escara de la picadura, piel del exantema, pápulas/máculas/vesículas)

Se recomienda asepsia en la toma de la muestra. Colocar el tejido en un tubo o frasco estéril con suero fisiológico estéril para prevenir la desecación

<24 h, 2‐8 C +24 h, ‐20 C Microscopía6

PCRMuestra de la escara de inoculación

Muestras

Tomado del Procedimiento en Microbiología Clínica (SEIMC): ”Diagnóstico microbiológico de las infeccionespor patógenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei. 2007

Procesamiento de las muestras

MÉTODOS BASADOS EN PCR

INMUNOFLUORESCENCIATINCIÓN

DE GIMÉNEZ/ GIEMSA

CULTIVO CELULAR EN SHELL‐VIALSSEROLOGÍA

INMUNODETECCIÓN

ARTRÓPODOSBIOPSIA CUTÁNEA

(4°C 3 días)

SANGRE

ANTICOAGULANTE

EDTA CITRATO

SUEROPAPELFILTRO

LCR

Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132

El método serológico de referencia es la IFI. Permite el seguimiento de la respuesta inmuneespecífica y conocer la prevalencia de anticuerpos en un área determinada.

Existen portaobjetos comerciales sólo para ciertas especies.

Necesidad de sueros pareados para demostrar la seroconversión que puede tardar variassemanas o no producirse.

FB: sensibilidad 46% (sueros 5‐9 días) y del 100% (sueros después de 29 días)

En DEBONEL/TIBOLA y en infecciones por R. sibirica mongolotimonae se han descrito casos(PCR/aislamiento) con serologías negativas.

En R. africae se detectan anticuerpos 3‐4 semanas después del inicio de síntomas y la serologíanegativa en caso de instauración temprana de tratamiento antibiótico.

Diagnóstico serológico

Inconveniente: reacciones cruzadas entre las diferentes especies

Western blotting (absorción de los sueros con antígenos)

Diagnóstico serológico

NO absor absor absor R. conorii R. africae

conorii

conorii

conorii

africae

africae

africae


El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento e identificación de la especie a partir delcultivo (días‐semanas)

Cultivo en células vero‐E6 ⇒ efecto citopático no es muy característico ni especie‐específico (5‐7 días)

Diagnóstico mediante cultivo

Cultivo en shell‐vial

7 días

VARIOS PASES(20 días)

GiménezIFIPCR

Procedimiento muy laborioso, poco sensible y retrasa la emisión de resultados

El cultivo es la técnica diagnóstica más específica, fundamental para la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antibióticos

¡CULTIVO EN LABORATORIO BSL3!

Las muestras deben cultivarse el día de la extracción o congelarse a ‐80°C

No existen técnicas comercializadas.

Los genes más frecuentemente analizados son rOmpA, rOmpB y gltA.

PCR‐RLB del espacio intergénico 23S‐5S rRNA permite la identificaciónde la especie implicada sin necesidad de secuenciación. Este método esválido para muestras clínicas como ambientales.

Cuando se precisa mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas.

Diagnóstico molecular

Dianas más utilizadas

* En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo

Proteína externa de membrana A(ompA)

Citrato sintetasa (gltA)Todas las especies

(ompA)

Todas las especies excepto GT

Genes utilizados y especies Oligonucleótidos Método Muestra Referencia

PCR Biopsia cutánea Roux V. et al.Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1997

“PCR suicida”* Suero Raoult D. et al.N Engl J Med 2001

Fournier P.E. et al. J Clin Microbiol 2004

PCR Biopsia cutánea Fournier P.E. et al. Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1998

“PCR suicida”* Suero

*En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo y los oligonucleótidos sólo se usan una vez.


Dianas más utilizadas

Citrato sintetasa (gltA)Todas las especies

Genes utilizados y especies Oligonucleótidos Método Muestra Referencia

PCR Biopsia cutánea Roux V. et al.Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1997

PCR Biopsia cutánea Fournier P.E. et al. Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1998

Proteína externa de membrana B(ompB)(Todas las especies excepto

PCR Biopsia cutáneaGarrapatas Roux V. et al.

Int J Syst Evol Microbiol 2000

Gen D (mayoría de las especies)

Gen que codifica la proteina de 17 kDa (todas las especies SFG)

PCR Biopsia cutánea Sekeyova Z. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2001

PCR Biopsia cutánea Nested Suero Sangre

Garrapatas

Tzianbos T. et al. J Cin Microbiol 1989


Filogenia

R. africaeRickettsia sp. “strain S”R. parkeriR. sibirica sibiricaR. sibirica mongolotimonaeR. conorii conoriiR. conorii indicaR. conorii caspiaR. conorii israelensisR. slovacaR. rickettsiiR. honeiR. japonica

R.

rickettsii

GRUPO

R. massiliaeR. massiliae Bar29R. rhipicephaliR. aeschlimanniiR. montanensis

GRUPOR. massiliae

R. helvetica GRUPO R. helvetica

R. canadendisAB bacteriumR. belli

GRUPOAncestral

R. australis GRUPO R. akari

gltA ompA ompB gen D


AY125017-R_helvetica TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125014-R_Bar29 TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125013-R_massiliae TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125012-R_conorii TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125011-R_conorii TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125015-R_honei TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAABW01000001-R_sibirica TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125009-R_slovaca TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125008-R_slovaca TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAU11022-R_rickettsii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125016-R_aeschlimannii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAR_australis TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCATATGGTGTTAAAFE01000001-R_akari TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCGTATAGTGTTAR_felis TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAU11015-R_bellii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACACATGTATATAGTGTTTAY125019-R_typhi TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTGTATATGCATATAGTGTTAU11018-R_prowazekii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTATATATGCATATAGTGTTA *********** ************** **** * *** *** *****

SGR-TAGCTCGATTGRTTTACTTTG

ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA PARCIAL DE LOS GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA

CAGCTTTATCAACTAATAAAGATGTTGTTGCATGACTA--ATGTCATAT- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATA TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATA TAGTTTTATCAACTTATTAAAATGTTATTGCATAACTA--ATTTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATATTATACT TAGCTTTATCAATGAATAAAGATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTCAT TAGCTTTATCAATGAATAAACATGTTGTTGCACAGCTA--ATAGTGTCAT TAGCTTTACCAATGAATAAAAATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTTAT TAGCTTTATCAACTAATAAAG-TGTTGTTGCATGATTGTCATCCCGTGGC TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT- TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-

----------CATGGCTTGATCCACGGTA----TCCAGTAAAA---ATTA----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAG-AAAA---ATTA----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAGCAAAA---ATTAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA----------TGTAGCCTTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTT----------TGTAGTCCTG-CAACGATA----TCCAGCGAAA---ATTAGTA-------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCCAGCAAAA---ATTACT--------CGTGGCTTGA-CCACAGTA----TCTAG---C----AGTAGT--------CGTGGCTTGA-CCAC---------------------AGTAAC--------CGTGGTCCCG-CCAC---------------------GGTATTTATTTATATGTCATTCCTGCGAAAGCAGGAGTCTAGTAAAATATAATG----------CACGATTTGA-CCGTAA-GA---TC-------------------------TACGATTTGA-TAGTAA-AG---TTTTG--------ATCT

R_helBar29R_massR_conR_conR_honR_sibR_sloR_sloR_rickR_aeschR_ausR_akaR_felR_bellR_tyR_prow

DISEÑO DE SONDAS ESPECÍFICAS EN GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S

103 pb

224 pb

318 pb

374 pb

152 pb

F1 R1

F2 R2

F3 R3

R4F4

F5 R4

DNA sintético de R. prowazekii


Reacción de ligación

Shock térmico

Selección de transformantes

Purificación de plásmidos

Secuenciación

CLONACIÓN

Semi‐NESTED MUESTRAS CLÍNICAS 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-810-3 10-4 10-5 10-6 -7 -

Copias 103 102103 102 10 1Dilución


SG-TG-wt GTTATTCTATCGTTTTATGTYACGSG-TG-mut1-GAATAACATACGAAAATAGAATCG (cambiadas A y T)

S-PROW- TACGATTTGATAGTAAAGTTTTGS-PROW-mut1-ATCGTAAAGTATGATTTGAAAAG (cambiadas A y T)

SG-Rick TAGCTCGATTGRTTTACTTTGSG-Rick-mut- TAGCTCCCATTAGTTCGGGTG (cambios en negrita)

GATAGGTCGGGTGTGGAAGCACAGTAATGTGTGTAGCTAACCGATACTAATAGCTCGATTGRTTTACTTTGCTGTGAGA

TTATATATGCATATAGTGTTAATTATATAAGTATTTAAGCATCAATTTGTAAATTATAATTTTAATGTTAAATTAGCTT

TATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTTTATGTYACGATTTGATAGTAAAGTTTTGATCTTTCTTTAAGATATTG

TAGACAATTGTATATTATACCTTGCTTAAGAATAATATAATAGCATTAACAGCATATTATAATACAACCTATTTTGTTA

AATTTGTATTGCTAGCTTGGTGGTCATAGCATGAGTGAAACACACGATCCCATCCCGA

CONTROL POSITIVO: Clon mutado de R. prowazekii

Comparativa entre 23S‐5S rRNA y rOmpA

rOmpA

10‐3 10‐4 10‐5 10‐3 10‐4 10‐5 10‐6

1ª PCR nested

Dilución

427 pb532 pb

23S-5S rRNA

Copias

10‐610‐510‐410‐3 C‐10‐610‐510‐410‐3C‐

1 10 102 103

Dilución

1ª PCR seminested

10 VECES MAYOR SENSIBILIDAD!!!

374 pb

Fournier P.E. et al. Int J Syst Bacteriol 1998

Revelado de la reacciónC

B Incubación con productos de PCRA Fijación de las sondas

DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE IMPLICADA (SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN)

Diagnóstico molecular en el Lab de Espiroquetas y Patógenos Especiales

PCR‐HIBRIADCIÓN EN FASE REVERSA (RLB) del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA

SONDASO

RG

AN

ISM

OS-CI2SG-RICKSG-SFGS-AESCHS-AKA3S-AUSS-BELLS-CONS-FELS-HELVS-RI/SIS-SLOSG-TGS-PROWS-TYPHIS-CI2

R. a

esch

liman

nii

R. a

kari

R. a

ustra

lisR

. bel

liiR

. con

ori

R. f

elis

R. h

elve

tica

R. r

icke

ttsii

R. s

ibiri

caR

. slo

vaca

R. p

row

azek

iiR

. typ

hiN

egat

ive

Con

trol

ESPECIFICIDAD

S-PHAS-CHAS-EWIS-MCOS-ALS

S-BACIS-BOV

S-CLARS-DOSHS-ELIZ

S-GRAH2S-HENSS-KOEHS-QUINS-SCHOS-TAY

S-TRIBS-VIN-A1S-VIN-A2S-VIN-BSG-BOR3

S-IS1111S-TUL

SG-RICKSG-SFGSG-TGS-CI2

Bruc

ella m

ellite

nsis

Chlam

ydia

pneu

mon

iaeC.

psit

taci

Esch

erich

ia co

liLe

gion

ella p

neum

ophi

laLe

ptos

pira

inte

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copl

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a pne

umon

iaeOc

hrob

actru

m an

tropi

Orien

tia ts

utsu

gam

ushi

Pseu

dom

onas

aeru

gino

saSa

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ella e

nter

ica Ty

phi

Stre

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occu

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icinu

sDe

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ento

r mar

gina

tus

Ripi

ceph

alus s

angu

ineu

sAp

odem

us sy

lvatic

usADN humano

Control negativo

SONDAS

OR

GA

NIS

MO


APLICACIONES

10 B

LOO

D39

BLO

OD

135

SK

IN13

5 B

LOO

D17

2 PL

469

RBC

469

PL47

3 R

BC36

2 BC

362

RBC

226

PL22

6 LE

U17

5 BC

175

SER

SG‐RICKSG‐SFGS‐AESCHS‐AKA3S‐AUSS‐B29S‐BELS‐FEL

S‐HELVS‐CONS‐HONS‐RI/SIS‐SIBS‐SLOSG‐TG

S‐PROWS‐TYPHI

FIEBRE BOTONOSA

AY125019-R typhi

R typhi

U11018-R prowazekii

AY125009-R slovaca

AY125008-R slovaca

AY125015-R honei

AY125012-R conorii

AY125011-R conorii

U11022-R rickettsii

AY125014-R Bar29

AY125013-R massiliae

AY125016-R aeschlimannii

AY125017-R helvetica

362 BCR felis

R australis

U11015-R bellii

99

100

99

98

94

77

49

50

50

99

49

79

79

43

0.05

23S‐5S rRNA

Agente causal: R. conoriiVector: R. sanguineus

Nuevos patógenos humanos: R. monacensis

Rickettsia spp.

Detección de un patógeno diferente de R. conorii en un paciente con un cuadro similar a una fiebre botonosa

Identificación de R. monacensis mediante filogenia

Primera vez que se describe a esta especiecomo patógeno humano

rOmpA

gltA

Nuevos patógenos humanos: R. monacensis

CASO 1 ‐ Junio 2007:

• Mujer 67 años con fiebre, mialgias y lesión en cuero cabelludo de 10 días de evolución. Al ingreso: fiebre, confusión,adenopatías retroauriculares y exantema maculopapular en tronco y extremidades

• NO LINFANGITIS• Analítica: Hiponatremia, enzimas hepáticas ↑. Tratamiento: doxiciclina con buena respuesta• PCR de la escara de inoculación POSITIVA. PCR en sangre NEGATIVA• IFI con antígeno de R. sibirica mongolotimonae IgG:1/160 IgM: 1/50 (no suero de fase convaleciente)• Actividad de riesgo: jardinería

Descripción de 3 casos de R. sibirica mongolotimonae en Elche

CASO 2 ‐ Septiembre 2008:

• Varón 32 años con fiebre, escalofríos, mialgias y cefalea de 10 días de evolución• A la exploración escara en cara interna de muslo derecho con lifadenopatía regional y linfangitis. Analítica:

Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas• Tratamiento con azitromicina, a las 24h exantema en extremidades, palmas y plantas• PCR del aspirado de la adenopatía POSITIVA• Serología (fase aguda y convaleciente) NEGATIVA• Actividad de riesgo: trabajar en un campo de golf

CASO 3 ‐ Abril 2010:

• Varón 33 años con fiebre, mialgias de 5 días de evolución. A la exploración escara necrótica en regiónpretibial derecha y linfangitis con adenopatía inginal.

• Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas• NO EXANTEMA• Tratamiento: doxiciclina con buena evolución• PCR de la escara positiva• Serología (fase aguda y convaleciente): NEGATIVA• Actividad de riesgo: pasear por el campo

CASO

1CA

SO 2

CASO

3R. con

orii

R. con

orii

SG‐RICK‐

SG‐SFG‐

S‐SIB‐

SECUENCIACIÓN


caso 1‐ NOcaso 2‐ HQ710799caso 3 ‐HQ710800

caso 1‐ HQ728350caso 2 ‐HQ728351caso 3 ‐HQ728352

23S‐5S rRNA

rOmpA

rOmpA Nested

CASO

1

CASO

2

CASO

3

Confirmación de Casos de Tifus Murino en GC

SG‐RICK‐MSG‐RICK SG‐SFGSG‐TG

S‐PROWS‐CON

S‐AESCHS‐SIBS‐SLO

HOSPITAL UNIVERSITARIO MATERNO INFANTILLAS PALMAS DE GRAN CANARIA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

PARA LA CONFIRMACIÓN DE CASOS

DE TIFUS MURINO (2006)

EN GRAN CANARIAS

Estudio de vectores en Madrid

Estudio de garrapatas de erizo en Barcelona

• Tamaño muestral: 99 garrapatas de erizos

• Especies analizadas: Ixodes exagonus, Hyalomma lusitanicum,

Rhipicephalus spp. R. pusillus y R. turanicus

• Positivas: 34%

• Especies: R. conorii (1), R. massiliae y R. massiliae Bar 29 (2:1)

Colaboración con Elena ObonCentre de Recuperació de Fauna de TorreferrussaSanta Perpètua de Mogoda (Barcelona)Generalitat de Catalunya

EXISTE UN CICLO SILVESTRE DE R. massiliae Bar29 EN LA NATURALEZA

ESTUDIO DE VECTORES Y RESERVORIOS EVALUACIÓN DEL RIESGO

“ESTAMOS FRENTE A AGENTES CON UNA AGRESIVIDAD QUE ES IMPORTANTE IDENTIFICAR, PREVENIR Y TRATAR”

Antes...

Cuadros clínicos

autolimitados

Ahora...

Cuadros de evolución GRAVE

(neurológicos)

CONOCER LA DINÁMICA TEMPORAL DE ESTOS AGENTES EN LOS VECTORES

ESTABLECER ALERTAS Y PREVENIR RIESGOS POSTERIORES

MEJORAR EL NIVEL DE SOSPECHA CLÍNICA

La metodología disponible hasta ahora carecía de sensibilidad en muestras clínicas

Un proceso febril tras la picadura de una garrapata infectada, con resultados negativos por PCR en sangre es un hallazgo frecuente

HEMOS DISEÑADO UN MÉTODO VERDADERAMENTE GENÉRICO QUE AMPLIFICA CUALQUIER ESPECIE

PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN

RESULTA 10 VECES MÁS SENSIBLE QUE OTROS MÉTODOS

CONCLUSIONES

MAYOR RAPIDEZ EN EL DIAGNÓSTICOMEJOR PRONÓSTICO PARA LOS PACIENTES

MEJOR CONOCIMIENTO DE LAS ESPECIES QUE CIRCULAN LOCALMENTE

DISPONEMOS DE CAPACIDAD PARA IDENTIFICAR LA CIRCULACIÓN DE CLONES NO AUTÓCTONOS

(IMPORTADOS/LIBERACIÓN INTENCIONADA)

CONCLUSIONES

DESCRIPCIÓN DE NUEVOS PATÓGENOS/DETECCIÓN DE PATÓGENOS EMERGENTES

Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos EspecialesCentro Nacional de Microbiología

Majadahonda. Madrid

¡ GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN!

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