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Nuevos ensayos sobre contaminación seminal

IV JORNADA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: “ESTÁNDARES DE CALIDAD EN INSEMINACIÓN” 18 OCTUBRE 2017

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La pesadilla de la contaminación bacteriana

-Disminución del periodo de conservación de las dosis espermáticas (<48 h) -Presencia de aglutinaciones espermáticas

Motilidad -Acrosomas dañados -Aumento de la incidencia de cerdas con retorno regular a celo. -Presencia de descargas vaginales a partir de los 5-17 días de la inseminación.

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Herramientas de diagnóstico

Método Detección Identificación Antibiograma

Cultivo en placa 24-48h - 72 horas

Laminocultivos 24-48 h - -

PCR 4 h*** 4h*** -

Citometría 10 min - 1 hora

Kits rápidos 24 h 24h 18 h

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Citometría

Coste pocillo Coste mano de

obra

Coste total

análisis

3€ 2-3 € 5-6 €

Inversión:

Citómetro:25000-80000 €

Ventajas:

-Rapidez: contaminación en 20 minutos, antibiograma en 90

minutos

-Fácil de utilizar

-Preparación rápida

-Precio por muestra bajo

-Permite otros muchos análisis en el semen

Desventajas:

-Inversión inicial alta

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Preparación de la muestra

• Mezcla de fluorocromos en cada pocillo

• Incubación 10 minutos a 37ºC

• Lectura : recuento del número de bacterias por mL.

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Lectura

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Citometría: antibiograma

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Preparación de la muestra

• Tomamos 24 microlitros de semen y lo diluimos en 2,4 ml de tampón.

• Repartimos 200 microlitros en cada pocillo (200 x12=2400 microlitros)

• Cargamos cada fila con un eyaculado diferente

• Cada columna contiene un antibiótico diferente

• La primera columna es el control (sin antibiótico)

Control

Sin ATB

Dosis o eyaculado 1

ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11

Dosis o eyaculado 2

Dosis o eyaculado 3

Dosis o eyaculado 4

Dosis o eyaculado 5

Dosis o eyaculado 6

Dosis o eyaculado 7

Dosis o eyaculado 8

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Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz

Pocillos control (sin ATB)

Pocillos con ATB no eficaz la población de

bacterias activas se mantiene intacta

(Bacteria antibio-resistente)

Pocillos con ATB eficaz

(Bacteria sensible)

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Pocillo Concentración

bacteriana

20 min

(x108UFC/ml)

Incremento

Concentración

bacteriana

50 min

Incremento

Concentración

bacteriana

150 min

Control sin ATB

(n=6)

0,27a +0,5% +21,8%

ATB no eficaz

(n=15)

0,25a +10,5% +2,2%

ATB eficaz (n=6) 0,34a -35,7% -55,3%

Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)

• 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas

antibióticas (108UFC/ml)

• Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90

µg/ml , Neomicina 50 µg/ml , Cefalexina 150 µg/ml,

Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml)

• Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min

• Comparativa con antibiograma tradicional y kit rápido

Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz

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Interacciones antibiótico-bacteria

Pocillos control (sin ATB)

Pocillos con ATB no eficaz la población de

bacterias activas se mantiene intacta

(Bacteria antibio-resistente)

Pocillos con ATB eficaz

(Bacteria sensible)

Activas

Las bacterias vivas se pueden

dividir en bacterias activas e

inactivas

Inactivas Muertas

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Pocillo Ïndice de

actividad

bacteriana

20 min

Ïndice de

actividad

bacteriana

50 min

Ïndice de

actividad

bacteriana

150 min

Control sin ATB

(n=15)

7,4% a 7,5%a 8,0%a

ATB no eficaz

(n=15)

5,7%a 3,5%a 3,0%b

ATB eficaz (n=6) 3,1%b 2,9%a 2,8%b

Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)

• 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas

antibióticas (108UFC/ml)

• Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90

µg/ml , Neomicina 50 µg/ml , Cefalexina 150 µg/ml,

Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml)

• Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min

• Comparativa con antibiograma tradicional

Interacciones antibiótico-bacteria

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Kits rápidos de pruebas bioquímicas

Coste Kit Coste mano de

obra

Coste total

10-30 € 2-3 € 12-33 €

Inversión:

Estufa:400-800 €

Autoclave: 4000-6000 €

Ventajas:

-Rapidez: identificación 24-48 horas, antibiograma 14 horas

-Fáciles de utilizar

-Bacterias responsables de contaminación seminal

-Preparación rápida

-Inversión baja

Desventajas:

-Límite mínimo de detección alto (103 a 105 UFC/ml)

-Antibióticos utilizados en otros ámbitos clínicos

-Coste fungible puede ser elevado

-Inexactitud

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Preparación de muestra

37ºC

37ºC

H)

V)

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Identificación bacteriana

>105 UFC/ml

• E Coli

• Grupo PPM (Proteus, Providencia)

• Grupo KES (Klebsiella, Enterobacter,

Serratia)

• Pseudomona

• Enterococos

• Estafilococos

• Candida

>5 x103 UFC/ml

• E Coli

• Enterobacterias

• Pseudomona

• Estreptococos

• Estafilococos

• Enterococos

• Micoplasma

H) V)

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Antibiograma

Antibiograma

• Cloxacilina,

• Amoxicilina + ac. Clavulánico,

• Ampicilina + Colistina,

• Cefalexina,

• Cefoperazona,

• Ceftiofur,

• Cefquinoma,

• Gentamicina,

• Espiromicina,

• Tilosina,

• Marbofloxacino,

• Penicilina + Estreptomicina,

• Sulfonamidas + Trimetroprim,

• Tetraciclina + Neomicina + Bacitracina

Antibiograma

• Amikacina - 32 μg / mL

• Gentamicina - 8 μg / mL

• Tobramicina - 8 μg / mL

• Piperacilina-Tazobactam - 128/4 μg / mL

• Fosfomicina - 200 μg / mL

• Cefoperazona - 64 μg / mL

• Cefotaxima - 64 μg / mL

• Ceftazidima - 32 μg / mL

• Ampicilina / Sulbactam - 32/16 μg / mL

• Ácido nalidíxico - 32 μg / mL

• Ciprofloxacina - 4 μg / mL

• Levofloxacina - 8 μg / mL

• Amoxicilina / Ácido clavulánico - 32/16 μg / mL

• Co-trimoxazol - 8 μg / mL

H) V)

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verraco UFC/ml E Coli H Proteus Providencia HPseudomona HGrupo KES H Enterococos HEstafilococos HE Coli V Pseudomona VEnterobacterias V Estreptococos VEstafilococos VEnterococos V

86 6,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0

1443 25,00 0 PP 0 KES 0 0 0 0 0 0 0 Enterococo

1613 25,00 0 0 Ps 0 Enterococo 0 0 0 Enterobact 0 Estafilococo 0

1613 30,00 0 0 Ps 0 Enterococo 0 0 0 Enterobact 0 Estafilococo 0

1443 100,00 0 PP 0 KES 0 0 0 0 0 0 0 Enterococo

1603 100,00 Coli PP 0 KES 0 0 0 0 Enterobact 0 0 0

1726 100,00 Coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1603 100,00 0 0 0 0 0 0 0 0 Enterobact 0 0 0

1726 100,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1442 150,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0

1712 150,00 0 PP Ps 0 0 0 0 Ps 0 0 0 0

1609 150,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo 0

1442 150,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0

1712 150,00 0 PP Ps 0 0 0 0 Ps 0 0 0 0

1609 150,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo 0

86 156,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0

1612 250,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1510 250,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps 0 0 0 0

1612 250,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1510 250,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps 0 0 0 0

1610 250,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo

1610 300,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo

1713 300,00 Coli PP Ps 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 Estafilococo Enterococo

1506 300,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1616 300,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1617 300,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1713 300,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 Estafilococo Enterococo

1456 350,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 Estreptoc Estafilococo Enterococo

1606 350,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo

1616 500,00 0 PP Ps 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1506 700,00 0 PP Ps 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1606 700,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo

1617 750,00 0 PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1707 750,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 0

1505 750,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 0 0

1707 750,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 0

1449 750,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo 0

1456 1000,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 Estreptoc Estafilococo Enterococo

1449 1000,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo 0

Identificación bacteriana

H) V)

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verraco UFC/ml

Sensibilidad Kit H

Sensibilidad Kit V

Sensibilidad Kirbi-Bauer

86 6,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO

1442 150,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO

1443 25,00 NINGUNO AMP CFP CN NINGUNO

1449 1000,00 NINGUNO AMP+ COL, CFP, CN NINGUNO

1456 1000,00 NINGUNO CFP NINGUNO

1505 750,00 AMP CFP CN CN NINGUNO

1506 300,00 AMP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO

1510 250,00 CN AMC AMP+COL NINGUNO

1603 100,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN CN

1606 350,00 NINGUNO AMC AMP NINGUNO

1609 150,00 NINGUNO AMP, CFP, CN CN

1610 250,00 NINGUNO CFP CFP

1612 250,00 AMP AMC CN AMP AMC CFP NINGUNO

1613 25,00 CN CFP CN NINGUNO

1616 500,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN

1617 300,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN

1707 750,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO

1712 150,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO

1713 300,00 AMP CFP AMP AMC CFP CN NINGUNO

1726 100,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO

Antibiograma (AMC, AMP, CFP, CN)

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Nuevo kit rápido para antibiograma • Basado en detectar la actividad metabólica de las bacterias

• Cuadro de antibióticos que ofrecen no es específico del ámbito de la inseminación porcina

Control

Sin ATB

Dosis o eyaculado 1

ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11

Dosis o eyaculado 2

Dosis o eyaculado 3

Dosis o eyaculado 4

Dosis o eyaculado 5

Dosis o eyaculado 6

Dosis o eyaculado 7

Dosis o eyaculado 8

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Preparación de la muestra

• Tomamos 1 ml de semen y lo

diluimos en 1 ml de tampón.

• Filtramos para eliminar

espermatozoides

• Repartimos 100 microlitros en cada

pocillo

• Cargamos cada fila con un

eyaculado diferente

• Cada columna contiene un

antibiótico diferente

• Añadimos 200 microlitros de medio

de crecimiento y dos gotas de

aceite de paradina en cada pocillo

• Incubamos a 37ºC

• Lectura:

• ROSA: actividad metabólica o

RESISTENCIA

• AZUL: ausencia de actividad

metabólica o SENSIBILIDAD

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Resultados

Control

Sin ATB

Dosis o eyaculado 1

ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11

Dosis o eyaculado 2

Dosis o eyaculado 3

Dosis o eyaculado 4

Dosis o eyaculado 5

Dosis o eyaculado 6

Dosis o eyaculado 7

Dosis o eyaculado 8

• Cambio de color hasta en un mínimo de 30 minutos con concentraciones bacterianas superiores a 107 UFC/ml

• Para contaminaciones inferiores a 105 UFC/ml los cambios de color son más lentos y difíciles de valorar a ojo (colorímetro)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14

Tt(Horas)

Log10 UFC/ml N=22 muestras x 5 ATB muestra

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¿Relación con otros métodos?

La presencia de coloración rosa se relaciona con la actividad metabólica medida por citometría.

Pocillo Ïndice de actividad

bacteriana

20 min

Ïndice de actividad

bacteriana

50 min

Ïndice de actividad

bacteriana

150 min

Control sin ATB

(n=6)

7,4% a 7,5%a 8,0%a

ATB no eficaz

(n=14)

5,9%ab 4,8%ab 4,5%b

ATB eficaz (n=16)

2,2%b 1,9%b 1,6%b

Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)

En este contexto, su coincidencia con el antibiograma (Kirbi-Bauer) dependerá de la

bacteria, el antibiótico y el tiempo de incubación.

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Conclusiones

• A la espera de la generalización de otras técnicas (MALDI-TOF, PCR, secuenciación de ARN ribosomal) la

identificación bacteriiana que proporcionan los kits comerciales es insatisfactoria.

• Los antibiogramas de kits comerciales se basan en la detección de reacciones metabólicas y la inhibición del

metabolismo bacteriano no es lo mismo que la actividad bactericida que mide el método estándar (Kirbi-Bauer

)

• El citómetro permite determinar en 20 minutos la cantidad de bacterias del eyaculado o dosis y en 90-150

los antibióticos efectivos frente a esas bacterias

• La citometría puede ser una herramienta fundamental de trabajo para los CIAs en la era post-antibiótica

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