Nuevos mecanismos de regulación de la reactividad ...multimeros de FvW . Reactividad Plaquetaria...

NUEVOS MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA REACTIVIDAD

PLAQUETARIA EN NEONATOS

F Ferrer-Marín FFM & JRP, ISCIII (PI14/01956)

Valladolid, 24 de Noviembre de 2017

Modelo ideal donde investigar nuevos mecanismos que controlan la reactividad plaquetaria

La hiporreactividad es dependiente de la edad gestacional : > en prematuros

Prematuros y neonatos enfermos: > riesgo de sangrado . 25% de los prematuros con peso <1500g:

HIC en la primera semana de vida (momento de máxima hiporreactividad)

(S.J. Israels 2012)

Neonatos a término

-Hematocrito -Niveles de FvW -VCM -Predominancia multimeros de FvW

Reactividad Plaquetaria

Hemostasia inalterada

Factores del medio

¿Contribuye la hiporreactividad plaquetaria al > riesgo de HIC?

Antecedentes y Objetivos

Identificar nuevos mecanismos que expliquen las diferencias de reactividad entre PN y PA

Objetivo General

Moderador

Notas de la presentación

Diversos estudios han avalado de forma consistente que las plaquetas de los neonatos son hiporreactivas frente a la mayoría de agonistas, haciendo de ellas un modelo idóneo donde investigar nuevos mecanismos de regulación de la reactividad plaquetaria. El estudio de la reactividad plaquetaria durante el desarrollo tambien tiene un especial interés dentro de este grupo de edad infantil. ¿Por qué? Porque a pesar de esta hiporreactividad, los N a término presentan una hemostasia global “normal” como consecuencia de factores del medio que aumentan su capacidad adhesiva. Sin embargo, la hiporreactividad plaquetaria es dependiente de la edad gestacional, mayor en prematuros, precisamente los que tienen > riesgo de sangrado, lo que inevitablemente aumenta la duda sobre si dicha hipo-rreactividad podría ser un factor contribuyente en esta patología de carácter multifactorial.

Objetivos específicos

Objetivo 1:

Análisis comparativo del transcriptoma plaquetario de neonatos vs adultos.

Objetivo 2:

Mecanismos que subyacen a los defectos en la exocitosis granular: maquinaria SNARE y β1-tubulina

Objetivo 3:

Análisis de la expresión y funcionalidad de receptores ITAM/ITIM en plaquetas neonatales .

PI14/01956

Moderador


Lo haremos bajo tres aproximaciones distintas


Objetivo 1:

Análisis comparativo del transcriptoma plaquetario de neonatos vs adultos.

Objetivo 2:

Mecanismos que subyacen a los defectos en la exocitosis granular: maquinaria SNARE y β1-tubulina

Objetivo 3:

.

PI14/01956

Identificar firma genéticas que afecten a la función/biología de las plaquetas

Moderador


La primera de ellas, comparanado el transcriptoma de las PN y PA, lo cual puede ser útil para para identificar firmas de mRNA que afecten a la función plaquetaria.

Materiales y métodos

1 Obtención de muestras

Sangre de Cordón Umbilical (N)

Sangre Periférica de Adulto (A)

2 Aislamiento de Plaquetas “Ultrapuras”

Pall Purecell® PL

autoMACS® Pro Separator Obtención

de PRP Filtración Separación Celular

Magnética con CD45

Lisis Eritrocitos

Plaquetas Ultrapuras

Obtención de proteínas y mRNAs plaquetarios

3

Moderador


plaquetas ultrapuras obtenidas de sangre de cordón umbilical de neonatos a término y sangre periférica de adulto. El PRP, se somete a leucodepleción mediante filtración y separación mágnética con CD45. A continuación se lisan los eritrocitos y las plaquetas ultrapuras (CLICK) resultantes se tratan para obtener de ellas proteínas y mRNA plaquetario.

Integridad y pureza del RNA plaquetario

6 muestras PN y 6 muestras PA 2 pooles de PN y 2 pooles de PA 1 pool N/A 1 pool N/A (Hosuton) (UMU) Array A Array B GeneChipHuma Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix)

Moderador


Tras confirmar la pureza e integridad del RNA plaquetario, realizamos 2 pooles de plaquetas de N y 2 pooles de plaquetas de adulto. Dado el bajo nº de muestras y las limitaciones que ello suponia, por una parte, enviamos cada pareja de pooles (N vs A) a una Lab independiente. (Houston y UMU) en el que se usaba la misma plataforma.

Obj 1: Consistencia y robustez del array de mRNA

PI14/01956

N=2 pool/grupo

E Caparrós et al. Plos One 2017

Moderador


IZQ) Observamos una alta correlacion en la expresión de sondas entre ambos arrays tanto para las muestars de N como para las de A. Un análisis jerárquico no supervisado mostro, en un dendograma que las muestras se agrupaban en función del estadio del desarrollo. DCHA) Comparamos los datos de ambos arrays (ya juntos) con otros previamente publicados de PA. Respecto al más reciente (Gnatenko de 2005) en el que se usa la misma plataforma (GeneChip® HU133 Plus 2,0 array) en una versión previa y por tanto con < nº de sondas, el % de coincidencia entre los 50 genes más expresados alcanza el 70%, siendo 19 de estos 50 coincidentes en TODOS los arrays.

A. Genes comunes con alta expresión

Análisis de enriquecimiento génico

B. Genes diferentemente expresados

Neonates

-1.2 0 1.2 Adults

E Caparrós et al. Plos One 2017

Moderador


Seguidamente realizamos un análisis de enrequecimiento génico. A) Encontramos una alta y significativa correlación (80%) entre los genes altamente expresados en PN y PA, la mayoría relacionados con función plaquetaria (exocytosis, activación-agregación) pero también con respuesta inmune soportando el papel emergente de las plaquetas como células inmunes. B) Encontramos 200 genes DE: 160 sobreexpresados y 40 infraexpresados.

Data obtained in a cohort of array validation (Adults N=16; Neonates N=16) correlate very well with the array data (Fig 6, Panel B).

Pathway Name Enrichment Score

Enrichment p-value

% present genes Genes

Ribosome 13,3 1,67E-06 21,97 MRPL14, MRPS15, MRPS16, RPL5, RPL10A, RPL13, RPL14, RPL18A, RPL21, RPL22, RPL24, RPL26L1, RPL27A, RPL32, RPL34, RPL35A, RPL36, RPL36AL, RPL37, RPL37A, RPL38, RPS4X, RPS6, RPS10, RPS15A, RPS17, RPS17L, RPS28, RPSA

Proteasome 8,3 2,38E-04 27,27 PSMA4, PSMB1, PSMB2, PSMB4, PSMC1, PSMC5, PSMD1, PSMD4, PSMD8, PSMD12, PSME4, SHFM1

p53 signaling pathway 5,4 4,69E-03 19,12 BID, CCNE1, CCNG2, CHEK2, GADD45B, MDM4, PTEN, RRM2, SERPINE1, SESN3, SFN, THBS1, TNFRSF10B

Spliceosome 4,9 7,36E-03 15,38 ALYREF, DDX46, DHX16, HNRNPA1, HNRNPM, ISY1, LSM5, NCBP1, PRPF18, PRPF38A, RBMXL1, SF3B1, SLU7, SNRPA1, SNRPE, SNRPG, SRSF5, SRSF10, THOC2, U2SURP

Cell cycle 4,8 8,50E-03 15,45 ABL1, ANAPC1, ANAPC5, ANAPC10, ANAPC11, BUB1B, CCNE1, CDC14A, CDC14B, CDC27, CDKN1C, CHEK2, E2F2, FZR1, GADD45B, MCM6, SFN, SMC3, TGFB2

mRNA surveillance pathway 3,9 2,09E-02 15,56 ALYREF, CPSF2, CPSF6, CSTF3, GSPT2, MSI2, NCBP1, NXT1, PABPC1, PABPC3, PNN, PPP2R1B, PPP2R5E, RNGTT

RNA transport 3,2 3,93E-02 12,88 ALYREF, CLNS1A, EEF1A1, EIF1, EIF2S3, EIF3B, EIF4G3, FXR1, GEMIN8, KPNB1, NCBP1, NDC1, NUP43, NUP50, NUP153, NUPL1, NXT1, PABPC1, PABPC3, PNN, THOC2

Ubiquitin mediated proteolysis 3,2 4,03E-02 13,33 ANAPC1, ANAPC5, ANAPC10, ANAPC11, CDC27, CDC34, CUL2, CUL5, DET1, FZR1, HERC3, HERC4, SOCS3,

TRIM32, UBA6, UBE2NL, UBE2O, XIAP

B. Genes diferentemente expresados

Neonates

-1.2 0 1.2

Adults

Validación por qRT-PCR N=16/grupo

Moderador


B) Entre los 20 genes sobreexpresados con mayores diferencias de FCg, destacaban genes como PRSX2 (con una diferencia de expresion de mas de 20 veces) que codificauna enzima relacionada con reactividad plaq; genes relacionados con síntesis y degradación de proteinas (como ribonucleoproteinas; RPL5/24) o con el proteosoma (ZFA). Entre los 20 genes infraexpresados con > diferencias, destacan aquellos relacionados con el transporte y metabolismo del Ca (MCUR1); señalización celular y reorganización del citoesqueleto (FAM). Muchos de estos genes (tanto infreaexpresados como sobreexpresados) han sido validados en muestras independientes (16/grupo) por qRT-PCR. Finalmente, aplicando el programa Partek obtuvimos un listado de las rutas biológicas ordenadas por % de genes de la ruta presentes., y lamayoria de ellas se relacionan con sintesis y degradación de proteinas.

Vida media de las plaquetas neonatales

Blood 2014;123:3381-3389

Moderador


La pregunta inevitablemente sería, ¿por qué las rutas más DE están relacionadas con la maquinaria de síntesis de proteinas, si las plaquetas son células anucleadas? Cada vez hay una > evidencia de que las plaquetas, gracias a la maquinaria recibida de los MKs, pueden sintetizar proteinas de novo, especialmente cuando estan activas. Un estudio muy reciente, muestra como, en un modelo murino, el incremento de los contajes de plaquetas durante la vida neonatal y como consecuancia de la masa plaquetaria, esta mediado por una prolongacion de la vida media de las plaquetas, mas que po un aumento enla producción. Se podria especular que este alargamieto de la vida media plaquetaria en la vida fetal/neonatal puede ser consecuencia de DE en los genes relacionados con el metabolismo protéico.

Conclusión Obj 1 • El análisis del transcriptoma a lo largo del desarrollo

soporta el papel esencial de las plaquetas, no solo en hemostasia, sino también en repuesta inmune.

• Nuestros resultados sugieren que diferencias de expresión génica entre PN y PA pueden contribuir a diferencias en su reactividad y/o en su vida media.

Neonates

-1.2 0 1.2

Adults

Objetivos específicos Objetivo 1: Análisis comparativo del transcriptoma plaquetario de neonatos vs adultos

Objetivo 2: Mecanismos que subyacen a los defectos en la exocitosis granular:

maquinaria SNARE y β1-tubulina

Objetivo 3: Análisis de la expresión y funcionalidad de proteínas G.

Objetivo 4: Análisis de la expresión y funcionalidad de receptores ITAM/ITIM en PN .

PI14/01956

Sitaru AG, Platelets 2005

Moderador


Además de hiporreactivas, las PN muestran un descenso en la secreción granular. Sin embargo, se sabe que la ultraestructura de las plaquetas neonatales no difiere a la de los adultos, ni en el número de granulos alpha (los mayoritarios) ni en su contenido. Los mecanismos subyacentes han sido poco estudiados.

Las PN muestran defectos en la secreción granular

La ultraestructura refleja defectos en la exocytosis de las PN

La expresión en superficie de P-Selectina en PN es< que PA

Resting Stimulated

Adult Neonate Adult Neonate

Nº of platelet sections

/sample 100 100 75 75

Platelet section area, µm² 2.7 ± 0.7 2.7 ± 0.2 2.5 ± 0.3 2.8 ± 0.2

Maximum diameter, µm 2.6 ± 0.4 2.9 ± 0.2 1.45± 0.3† 2.5 ± 0.1#∫

Nº of granules/ platelet 8.1 ± 1.6 7.1 ± 0.8 3.2 ± 1.1† 6.7 ± 0.9#

Total Nº of granules in the

indicated sections

713.7 ±

96.0

658.7 ±

108.7

244.7 ±

92.05

465.3 ±

59,4

Nº of granules/ µm² 2.9 ± 0.3 2.6 ± 0.5 1.40 ± 0.6† 2.34± 0.07#

Total Area OCS 0.1 ± 0.06 0.2 ± 0.02 0.01 ± 0.01 0.13 ± 0.02#∫ E Caparrós et al. Throm Hemost 2017

Moderador


Nosotros quisimos aproximarnos a este problema. Lo primero que hicimos fue confirmar, en consonancia con lo publicado, que tras estimulación con TRAP, las PN expresan menos P-selectina en su mb que las de los adutos, aunque la cantidad de P-selectina total en plaquetas en reposo (medida por imnunoblotig) no era diferente entre ambos grupos. Seguidamente, evaluamos los cambios en la morfologia de las PN tras estimulación (con TRAP). Mientras en estado basal, no habia diferencias en la Ultraestructura, tras estimulación, las PA forman pseudópodos, tienden a agregarse y sufren una evidente degranulación. Por el contrario, las PN, mantienen una forma mas esférica, sin tendencia a agregarse, y presentan numerosos gránulos visibles a través de todo el citoplasma, lo que sugería un defecto en el proceso de centralización de gránulos y fusión de mbs. Nuestras observaciones (< nº de gránulos/plaqueta y en la distancia de los gránulos al centroide), fueron confirmadas de forma objetiva y estadisticamente significativa mediante estudios morfométricos con el Software apropiado.

VAMP

Sintaxina

Marks M S Blood 2012;120:2355-2357

Exocitosis plaquetar

Moderador


Basalmente, los gránulos se distribuyen a través de toda la plaqueta. Bajo activación, las plaquetas cambian su forma, produciéndose una centralización de los gránulos (la cual depende de la contracción del anillo microtubular) y un proceso de fusión de membranas entre la mb granular y la mb plasmática. En este proceso de fusión de membranas intervienen unas proteinas llamadas “SNAREs”, las cuales estan presentes tanto en la membrana vesicular (v-SNARE o VAMP) , como en la membrana plasmática (llamadas t-SNARE), de las cuales hay dos tipos (sintaxinas y SNAPs). En la formación del complejo fusogénico interviene una VSANRE(VAMP8) y 2 t-SNARE (SNAP23 y STx 11). Este complejo pasa a un estado conformacional activo a través de un regulador conocido como MUNC18 (de las cuales la isoforma b es la mas importante).

La exocitosis es requerida para estabilizar la adhesión plaquetaria y para el correcto “spreading”

Moderador


La exocitosis es requerida para estabilizar la adhesión plaquetaria y para el correcto “spreading”. Así, plaquetas de pacientes con síndrome de la plaqueta gris (carentes de alpha gránulos), tienen un spreading retrasado. La proteina que conecta exocitosis y speading es una v-SNARE: VAMP7.

Hipótesis

Las diferencias en el patrón de degranulación plaquetario a lo largo del desarrollo pueden deberse, entre otros factores, a cambios en la expresión de proteínas clave del complejo SNARE y de la β1-tubulina. En un medio “libre de plasma”, los defectos en

la secreción granular de las PN pueden asociarse a una menor capacidad de adhesión.

Moderador


b1-tubulina (principal componente de la banda marginal)

Componentes de la maquinaria SNARE estan disregulados en PN

PI14/01956

Expresión de Stx11 y Munc18b

E Caparrós et al Thromb Haemost. 2017 Oct 10;117(11).

Moderador


Mientras no encontramos diferencias en la expresión génica de VAMP8/SNAP23, si observamos menores niveles de STX11 en PN (respecto a las PA) tanto de mRNA como de proteina. Estudimos los niveles de su regulador Munc 18b (su chaperona), y encontramos disminución de los niveles protéicos de Munc 18b, con una correlación significativa entre ambas proteinas , confirmando que sus niveles de exprison parcialmente co-dependientes. También encontramos una correlación positiva significativa entre los niveles de expresión de STX 11 y P-Selectina, lo que orienta hacia una asociación entre exocitosis y secreción granular. Por el contrario, otras sintaxinas no relacionadas con la exocitosis (como STX 4) tenian niveles de expresión similares a las PA.

Las plaquetas neonatales muestran niveles reducidos

de β1-tubulina pero sobreexpresión de otras

isoformas (TUBB2A y TUBB) permitiendo así una banda

marginal normal


Polimorfismo Q43P

Moderador


Dado que la nuestros estudios morfológicos sugerían una limitación en el proceso de centralización granular, dependiente de la contracción de la banda marginal plaquetaria, la cual esta constituida principalmente por la b1-tubulina, evaluamos si los niveles de expresión de ésta en PN vs PA. En consonancia con nuestra hipótesis, demostramos una reducción significativa en los niveles de b1-tubulina tanto de mRNA (TUBB1) como de proteina. Estos menores niveles de b1-tubulina no estaban influenciados por el polimorfismo Q43P (presente en el 10% de la población), dado que ninguno de los sujetos genotipados era portador de este polimorfismo. Estos sujetos homocigotos (PP) para Q43P tienen unos niveles de expresión de TUBB1 semejante a la de las PN, sin embargo mientras en los homocigotos alguna de sus plaquetas no tienen una banda marginal normal, las PN mostraban un anillo microtubular normal, semejante a las de las PA, lo que nos hizo sospechar que otras isoformas distintas a TUBB1 (como son TUBB2A y TUBB) estarían sobreexpesadas. Lo que confirmamos por qRT-PCR.

Defectos de adhesion y retraso en el “spreding” en PN


Moderador


Para examinar si estos defectos en exocitosis tenian consecuencia en la adhesión y spreading de las PN, suspensiones de plaquetas lavadas (libres de medio) fueron colocadas en cubres con polilisina, y evaluamos su cinética de adhesión a distintos tiempos sin ningun estímulo adiional. Mientras en el tiempo 0, el Area Cuberta por IF y el tamaño medio de las plaquetas adheridas era similar entre PN y PA, en todos los tiempos posteriores, ambas variables estaban descendidas en PN respecto a PA, las diferencias son significativas en la ultima parte de la curva, donde tambien observamos un menor nº de plaquetas completamente extendidas entre las neonatales. En resumen, en un medio “libre de palsma”, las PN muestra defectos en la adhesión y retrasos en el spreading, a lo que podría tambien contribiir los menores niveles de VAMP7 en PN.

Fader, C. M., Sanchez, D. G., Mestre, M. B. & Colombo, M. I. TI-VAMP/VAMP7 and VAMP3/cellubrevin: two v-SNARE proteins involved in specific steps of the autophagy/multivesicular body pathways. Biochim. Biophys. Acta 1793, 1901–1916 (2009).

Gross, J. C., Chaudhary, V., Bartscherer, K. & Boutros, M. Active Wnt proteins are secreted on exosomes. Nature Cell Biol. 14, 1036–1045 (2012).

2014 2013

La maquinaria SNARE podría intervenir en la fusión de los CMV

Moderador


Como recientemente se ha publicado que las proteínas SNARE podrían ser las responsables de la fusión de los cuerpo multivesiculares, facilitando así la secreción de los exosomas al plasmá (en un 90% procedentes de plaquetas)

HIPÓTESIS

SNARE implicadas en la biogénesis de

exosomas

Diferencias en niveles plaquetarios de SNAREs

entre las PN y PA

¿Existen diferencias en los exosomas plasmáticos de neonato y adulto?

Moderador


Y dadas las diferencias encontadas en la expresión de proteínas SNAREs entre plaquetas de neonato y de adulto, actualmente estamos investigando si existen diferencias entre los exosomas de plasma de adultos y neonatos.

Adulto Neonato

PI14/01956

Los exosomas plasmáticos de neonato son más pequeños que los exosomas de adulto

Moderador


Nuestros resultados preliminares orientan a que si son diferentes tanto en tamaño

Contenido protéico Huella peptídica MVs A4 A4* A6* N11* A6 N11

Los exosomas plasmáticos de neonato son diferentes a los exosomas de adulto

Moderador


Como en contendio protéico, y que tienen un patrón o huella peptídica también diferente. Estudios que estamos haciendo en la actualidad en colaboración con la Dra I Martinez y A Garcia de Galicia NOTA: La concentración fue determinada por el método del BCA de Pierce en muestras de exosomas de plasma de 3 neonatos y 3 adultos. Se representan los valores correspondientes a cada muestra junto con los valores de Media±DE para cada grupo (*p<0.05).


Objetivo 1: Análisis comparativo del transcriptoma plaquetario de

neonatos vs adultos Objetivo 2: Mecanismos que subyacen a los defectos en la

exocitosis granular: maquinaria SNARE y β1-tubulina Objetivo 3: Análisis de la expresión y funcionalidad de receptores

ITAM/ITIM en PN .

PI14/01956

Gz

A A A A

N N

N

N

* p < 0.001 † p < 0.01

*

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

AUC

†

*

Receptores plaquetarios

Ferrer-Marin, JTH 2011 Israels SJ. “Platelets,” 2º edition

Moderador


Como saben la mayoría de agonistas plaquetarios, salvo colágeno, ejercen su acción en las plaquetas mediante su unión a receptores de 7 dominios transmenbarna (GPCR) acoplados a proteinas G (activadoras e inhibidoras). El caso de la hiporespuesta al colágeno es especialmente interesante porque es uno de los agonistas a los que las PN presentan una > hiporreactividad (tanto en estudios de PRP cpmp de ST). Este se une a dos receptores (la integrina a2b1 y la GPVI). Los niveles de expresión de a2b1 no se han encontrado distintos entre PN y PA y los de GPVI no se han estudiado en PN.

GPVI

(Bergmeier and Stefanini 2013)

CLEC-2

Colágeno CRP

Podoplanina Rodocetina

ITAM-contaning receptors

Receptor de colágeno ¿ Implicación en la hiporreactividad

neonatal al colágeno?

Relevancia en el desarrollo del sistema cerebrovascular

en modelo murino ¿Factor adicional en el riesgo hemorrágico?

Finney et al (2012) Blood

control CLEC-2-/-

Moderador


GPVI pertenece a al grupo de receptores “llamados ITAM (CPVI, CLEC2 y FcyRIIA)”, los cuales juegan un papel esencial no solo en reactividad plaquetaria si no tambien en integridad vascular. Los tres Rc comparten la misma vía de señalización, en la cual destacan dos proteínas clave: la tirosín quinasa del bazo Syk; y PLCy2. El estudio de estos receptores es importante, porque GPVI es el principal Rc del colageno (y no existe información en plaquetas N) y clec-2 (cuyo ligando es la podoplanina) tiene un papel relevante en el mantenimiento de la integridad vascular durante el desarrollo (st en el desarrollo del sistema cerebrovascular). Así, en ausencia de la interacción (CLEC-2 y su ligando endógeno, podoplanina) , los vasos sanguíneos son tortuosos, conduciendo a severas hemorragias cerebrales en los embriones murinos. Mejorar nuestro conocimiento sobre la expresión, funcionalidad y señalización de estos receptores puede ayudar a definir la contribución de la hiporreactividad plaquetaria al sangrado.

Materiales y métodos…

Sangre de CU de neonatos:

Pre-término(26-34 sem) A término (≥37semanas)

Sangre Periférica de Adulto (A)

2º Funcionalidad

CF en sangre total *Expresión de Selectina-P *Unión de fibrinógeno

Rodocetina-CLEC-2 CRP-GPVI

ADP PMA

PAR-1 PAR-4

Plaquetas Humanas Plaquetas Murinas

Pre-natal Post-natal Adulta E17.5 P1-P 14.5

1º Expresión

Humanos: *CF cuantitativa (Biocytex)

GPs Iba, IIIa, Ia GPVI y CLEC-2

Ratón: *CF semicuantitativa

3º Señalización Dosis-respuesta

CRP (GPVI) y RHO (CLEC-2)

Perfil de fosforilación de Syk/PLCY2 mediante inmunoblotting en plaquetas

estimuladas con:

Moderador


Para ello, en plaquetas de cordón umbilical de neonatos pre-término, a término y sangre periférica de adultos sanos; y en plaquetas de ratón a las edades: gestacional, post natal temprana y adulta evaluamos: 1_ La expresión de Gps clásicos y Rc ITAM (byocitex): GPVI y CLEC-2 por CF. 2_La funcionalidad de Rc mediante CF, valorando expresión de Selectina-P y Unión de Fib tras estimular con una bateria de agonistas, entre ellos CRP y RHO.. 3_Por último, solo en plaquetas humanas estudiamos la ruta de señalizacion de GPVI y CLEC-2 valorando la fosforilación de (PLCg2 y (Syk), por immunobloting en lisados de plaquetas activadas con distintas dosis de CRP o rodocetina.

Expresión proteica de Receptores • Citometría de Flujo

*p≤ 0,05 ** p≤0,005

Plaquetas Humanas

Las plaquetas de neonatos pre-término y a término, vs. la de los adultos, presentan una reducida expresión proteica y/o génica de los receptores GPVI y CLEC-2.

Prematuros (n=5); A término (n≥8); Adultos (n≥8)

AT Hardy &V Palma. Sometido

Moderador


Nuestros resultados muestran por primera vez que las PN a termino y en mayor medida pre termino presentan una menor expresión proteica de GPVI y CLEC-2 y de la integrina a2bb3.

Expresión proteica de Receptores

• Citometría de Flujo *p≤ 0,05 ** p≤0,005

Expresión de receptores ITAM en Plaquetas Humanas

Prematuros (n=5); A término (n≥8); Adultos (n≥8)

• Inmunoblotting A término (n=6); Adultos (n=6)

Expresión génica de Receptores ITAM

• qRT-PCR N a término (n=10); Adultos (n=10)

GP6 CLEC1B


Moderador


Idénticos resultados cuando se estudiaba la expresión protéica mediante WB. En consonancia, los niveles de expresión de mRNA fueron tambien menores en PN.

Funcionalidad de Receptores ITAM en plaquetas humanas

*p≤ 0,05 ** p≤0,005

Prematuros (n=5) A término (n=6) Adultos (n=6)

Rc ITAM Rc ITAM


Las PN pre-término y a término presentan una reducida reactividad plaquetaria en respuesta a los agonistas de los receptores ITAM

Moderador


Aunque la unión de fibrinógeno estaba reducida de forma generalizada con todos los agonistas, las mayores diferencias fueron con los agonistas de Rc ITAM y con PAR1. En cambio, la reducción de la expresión de selectina P no fue generalizada, sino que se observó tan solo con CRP /RHO y en menor medida en PAR1. Despues investigar si la ruta de señalización

CRP

--GPV

I Fosforilación de Syk y PLCγ2 inducida con CRP o Rodocetina en plaquetas humanas

La expresión y fosforilación de proteínas de señalización de los receptores ITAM, Syk y PLCγ2 está reducida en las plaquetas durante el periodo neonatal.

A término (n=4); Adultos (n=4) SYK PLCY2

Rodo

cetin

a –C

LEC-

2

Rodo

cetin

a –C

LEC-

2 CR

P --G

PVI


Moderador


Encontramos una menor expresión de las dos proteínas clave de la ruta PLCY2 y Syk en plaq de N a término asi como de su fosforilacion tras activar con distintas dosis de CRP o de Rho, demostrando por primera vez un defecto en la transducción de la señal en plaq neonatales.

Expresión proteica de Receptores ITAM en plaquetas murinas

n≥6

*p≤ 0,05 ** p≤0,005

Las plaquetas de embriones y de neonatos murinos presentan una reducida expresión de GPVI y CLEC-2

Moderador


Y, Al igual que en humanos, observamos un descenso en la expresión de GPVI y CLEC-2 en plaq de embriones y de los ratones en las primeras dos semanas de vida postnatal

Plaquetas murinas

Las plaquetas de embriones y neonatos murinos son

hiporreactivas en respuesta a agonistas de GPVI y CLEC-2

B(i) Expresión de Selectina-P

(ii)

(iii)

Funcionalidad de Receptores A(i)

(ii)

(iii)

CRP

Rodo

cetin

a PA

R4

Unión de Fibrinógeno

n≥3

Down-regulada en el desarrollo en ratones

*p≤ 0,05 ** p≤0,005


Moderador


En los ensayos funcionales, con distintas dosis de CRP RHO Y PAR4 observamos que en plaquetas murinas de edad gestacional y post natal temprana (barras blancas y rojas) hay un descenso en la unión de fibrinógeno inducida con CRP y RHO (no por PAR 4). En cambio, en el caso de la expresión de selectina-P, el descenso fue generalizado con los tres agonistas en plaquetas neonatales, posiblemente debido a la menor expresión de esta proteína en plaquetas de neonatos murinos. A la luz de estos resultados hipotetizamos que la hiporreactividad a GPVI y CLEC-2 podría estar relacionada con la presión que se ejerce en el desarrollo para aumentar los recuentos plaquetarios rápidamente.

Conclusiones Obj 3

• Demostramos, por primera vez que, tanto en humanos como en murinos, la expresión, funcionalidad y/o señalización de los receptores plaquetarios con dominios ITAM, GPVI y CLEC-2, está regulada durante el desarrollo .

• La conocida hiporreactividad al colágeno de las PN, es consecuencia, al menos en parte, a un defecto en la señalización de GPVI.

• Si la deficiente señalización a través de CLEC2 se asocia o no al mayor riesgo de HIC entre los neonatos prematuros necesita más estudios.

Moderador


Especulamos que la hiporreactividad neonatal de GPVI y CLEC2 durante la vida fetal y neonatal podría ser un mecanismo compensatorio para prevenir una excesiva activación plaquetaria durante la angiogénesis de los vasos y durante el desarrollo del sistema linfático/Cerebrovascular, en la cual las plaquetas están expuestas a la matriz de colágeno y a la podoplanina.

Perspectiva final……. • Cada vez existe una mayor evidencia de que los MKs fetales/neonatales (vs MK

adultos) son distintos y producen plaquetas con diferente funcionalidad.

• Nuestros resultados aportan evidencia de nuevos mecanismos que subyacen a la conocida “hiporreactividad” de las PN:

– Expresión génica (transcritoma).

– Expresión protéica de proteinas clave en activación (GPVI), integridad vascular (CLEC2) secreción (STX11-MUC18b; tubulina-β1) y spreading (VAMP7).

– Señalización asociada a Proteinas G (GNAZ –Gαz-); o receptores ITAM (PLCY2 y Syk)

• Postulamos que mientras los neonatos a térmico, disponen de mecanismos compensadores, en situaciones de stress (prematuridad, sepsis), éstos podrían no ser suficientes, condicionando un > riesgo de sangrado.

• En la búsqueda de alternativas a la transfusión de plaquetas tradicional (dependiente de donantes), la producción de plaquetas ex vivo a partir de células progenitoras procedentes de CU o hiPSC es un método emergente y prometedor. Sin embargo, el producto final obtenido in vitro tendría características genéticas y funcionales más cercanas a las PLQ fetal/neonatal que a las del adulto.

Moderador


MEDICINA TRANSFUSIONAL: Ayudar en el manejo transfusional de estos enfermos Búsqueda de alternativas a la transfusión de plaquetas tradicional (dependiente de donantes). Producción de MK y plaquetas ex vivo a partir de células progenitoras procedentes de CU o hiPSCs que bajo estímulos apropiados se convierten en MK y PLQ maduros. El producto final obtenido in vitro tendría características genéticas y funcionales más cercanas a las MK y PLQ fetal/neonatal que a las del adulto

Raúl Teruel Irene Martinez Nataliya Bohdan Eva Caparrós Verónica Palma José Rivera Pozo Constantino Martínez Vicente Vicente

Unidad Materno-Fetal Arrixaca R Guijarro-Campillo Jose Eliseo Blanco

Martha Sola-Visner

Steve Watson Alex T Hardy

MJ López-Andreo

Gracias!!!

FFM & JRP, ISCIII (PI14/01956)

Limitaciones Israel S, J Pediatr 2001 Saxonhouse M, Neonatology 2010

C. Flujo Adultos RN a término Muy inmaduros (<30 sem)

CU SP CU SP

GPIIb-IIIa (CD41a)

55687 ± 18106

45316 ± 15784*

43465 ± 13614*

39752 ± 13680*

39843 ± 10569*

GPIb (CD42b)

40410 ± 11102

35198 ± 10160

37524 ± 12474

35760 ± 12393

34372 ± 10132 Sitaru, Platelets 2005

Moderador


Una potencial limitación es que, debido a las largas cantidades de samgre requeridas, los estudios se hicieron en plaquetas procedentes de CU en lugar de SP de neonato. Sin embargo, estudios previos han mostrado que las PN son hiporreactivas independientemente de que se trata de sangre de CU o SP de neonato. Solo un estudio de PFA ha mostrado diferencias en el PFA entre los estudios con sangre de CU y sangre neonatal, pero los valores de PFA estan muy influenciados por el mas alto HTO en la sangre de CU. Y en cualquier caso el PFA es mas corto en sangre de neonato (tanto de CU com ode SP) que de adulto

El significado funcional de la hiporreactividad neonatal de GPVI aun no está claro. Sin embargo, pensamos que podría ser un mecanismo para prevenir una excesiva activación plaquetaria durante la angiogénesis de los vasos, en la cual las plaquetas están expuestas a la matriz de colágeno.

GPVI

Future insights….

Control CLEC-2-/- Por último, sugerimos que el descenso reactividad mediada por CLEC-2 podría contribuir al elevado riesgo hemorrágico en la etapas iniciales del desarrollo, dada la relevancia que tiene el eje CLEC-2-PODOPLANINA en el desarrollo del sistema cerebrovascular.


Objetivo 1: Análisis comparativo del transcriptoma plaquetario de neonatos vs adultos

Objetivo 2: Mecanismos que subyacen a los defectos en la exocitosis granular:

maquinaria SNARE y β1-tubulina

Objetivo 3: Análisis de la expresión y funcionalidad de proteínas G.

Objetivo 4: Análisis de la expresión y funcionalidad de receptores ITAM/ITIM en PN .

PI14/01956

Obj 3: Evaluación de la expresión y funcionalidad de proteínas G y RGS en Plaq Neonatales

Gs Receptor PGI2

INHIBICIÓN PLAQUETARIA

Gq &G12 Receptores

TXA2, Trombina y ADP (P2Y1)

Gi2 Receptor ADP (P2Y12)

Gz Receptor Epinefrina

ACTIVACIÓN

PLAQUETARIA

Gz

Wettschureck Physiol Rev, 2005

PI14/01956

Moderador


Como saben la mayoría de agonistas plaquetarios, salvo colágeno, ejercen su acción en las plaquetas mediante su unión a receptores de 7 dominios transmenbarna (GPCR) acoplados a proteinas G (activadoras e inhibidoras). Las proteinas G activadoras (Gq) activan a la fosfolipasa C, la movilización de calcio y subsiquiente activación de kinas como PKC. Otras como Gai (acoplada al receptor del ADP, P2Y12) y Gaz (acoplada al receptor de Epi) activan indirectamente inhibiendo la adenilato ciclasa y con ello la síntesis de AMPc. Por su parte las PG inhibidoras como Gaz (GZAZ) promueven la síntesis de AMPc activando la adenilato ciclasa . Como saben, las Proteinas G son heterotrímeros formados por una subunidad a (Ga), con GDP unido en reposo, y dos subunidades betha/gamma que forman un complejo dimérico indisociable. La interacción agonista-receptor provoca el cambio GDP/GTP en Ga, su disociación de bg y la subsiguiente interacción de Ga y bg con sus moléculas efectoras. En los últimos años se han identificado proteínas reguladores de su señalización (denominadas RGS) que controlan la señalización de las Ga acelerando la hidrólisis del GTP a GDP. De la casi 40 tipos de RGS las más abundantes en plaquetas son RGS10 y RGS18. Dada la importancia de las PG y de las RGS en la reactividad plaquetaria, en este apartado del proyecto quisimos evaluar si su expresión es distinta en PN que en PA, de manera que puedan ser un nuevo elemento implicado en la hiporeactividad plaquetaria neonatal

Obj 3: Expresión de Proteínas G en PN y PA

14/01956

Moderador


Los experimentos de Inmunobloting demostraron, que, acorde a la expresión de mRNA, las PN mostraban una menor expresión protéica de Gaq y Gaz pero mayores niveles de Gas y Gai, siendo las diferencias estadísticamente significativas solo para Gas y Gaz

(ii) (i)

Modelo de trombocitopenia inmune α-GPIbα

1º Expresión

GPs Iba, IIIa, Ia GPVI y CLEC-2

CF semicuantitativa

2º Funcionalidad

CF en sangre total *Expresión de Selectina-P *Unión de fibrinógeno

Rodocetina CRP PAR-4

Pre-

Inje

cció

n

Ratón adulto

2-3

días

4-5

días

7-9

día

s

Tras la Injección

Moderador


Para testar la hipótesis, empleamos un ratón adulto en el que inducimos trombocitopenia. En plaquetas generadas antes y hasta nueve días después de la injección, estudiamos la expresión y funcionalidad de los Rc del mismo modo que se explicó anteriormente. Y encontramos que:

A(i) B(i)

(ii) (ii)

(iii) (iii)

Funcionalidad de Receptores__Modelo de trombocitopenia inmune CR

P Ro

doce

tina

PAR4

Unión de Fibrinógeno Expresión de Selectina-P

Following immune depletion, platelets are hyporesponsiveness to

ITAM-containing receptor agonists

Primeros días tras deplección

n≥3

*p≤ 0,05 ** p≤0,005

Moderador


En cambio, en los primeros días tras la depleción (barras blancas y rojas), lo que si se observo fue un defecto en la unión de Fib y expresión de Selectina P de estas nuevas plaquetas con CRP y ligeramente con Rho. La activacino con PAR4 fue normal. Los resultados en el modelo murino podría sugerir que la necesidad de generar plaquetas rápidamente, tanto durante el desarrollo como después de la inducción de trombocitopenia, se alcanza a expensas de la funcionalidad de los receptores ITAM.

Nuevos mecanismos de regulación de la reactividad ...multimeros de FvW . Reactividad Plaquetaria...

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