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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGíA

LíNEA 9ESTRUCTURA, FUNCiÓN Y MANIPULACiÓN DE PÉPTIDOS y PROTEíNAS

9.1 Aislamiento y caracterización química y funcional de enzimas y de toxinas de venenosde reptiles ponzoñosos

9.2 Purificación y caracterización química de toxinas de venenos de alacranes y de los genesque las codifican

9.3 Aislamiento y caracterización de receptores específicos, mediante el uso de toxinas peptídicas9.4 Caracterización funcional de toxinas peptídicas9.5 Purificación y caracterización del activador del plasminógeno de la saliva de murciélagos

hematófagos, y triatómidos mexicanos9.6 Desarrollo y optimización de métodos y sistemas de purificación de proteínas y péptidos9.7 Producción de anticuerpos monoclonales contra péptidos y proteínas9.8 Ingeniería de proteínas9.9 Estudio de enzimas en condiciones de limitación de agua9.10 Evolución dirigida de péptidos y proteínas9.11 Estructura, función, regulación y evolución de los dominios estructurales de los reguladores

transcripcionales en bacterias9.12 Síntesis de péptidos para control de malaria

PROGRAMA 9.1Aislamiento y caracterización químicay funcional de enzimas y de toxinasde venenos de reptiles ponzoñosos

Los venenos de saurios y ofidios ponzoñosos sonfuentes muy ricas de enzimas. Por medio de cra-matografía de afinidad y métodos convencionalesde purificación, se han obtenido en forma homo-génea una calicreína y dos actividades de plasmi-nógeno del veneno del saurio Heloderma flOrridum,además de una toxina: "Helotermina", con activi-dad hipotérmica. Su caracterización permiteexplicar, a nivel molecular, las relaciones filoge-néticas del Heloderma con otras organismos y suparticipación en la fisiopatología de la intoxica-ción por la mordedura de este animal. Asimismo,se estudian algunos componentes tóxicos delveneno de la serpiente Taipan.

También se realiza un estudio de tamizadopara detectar estas y otras actividades enzimáti-cas en el veneno de una veintena de víboras

endémicas de nuestro país Se explora su poten-cial en investigación básica y aplicación de estasherramientas tan selectivas.

-Aislamiento y caracterización de toxinas del ve-neno de la serpiente OXIJuranus scutellatus scutellatus

F ZAMUDIO, V. CHIAPPINELLI y L. D. POSSANI

1994/I/D/DRM B

-Clonación del gene que codifica para la helo-termina, una toxina del veneno del Heloderma ho-rridum horridum

B. BECERRIL, ). M. MOCHCA, W. D. SCHLEUNING, F BOLlvAR y

L. D. POSSANI

1989/P/S/DRM B/DMM

- Purificación y caracterización de una fosfolipa-sa del alacrán Hadrurus concolourus

R. Cosslo, B. M. BRIAN, F. ZAMUDIO, F. CORONAS y L. D.

POSSANI

INFORME ANUAL 1994

PROGRAMA 9.2Purificación y caracterización química de toxinasdel veneno de alacranes y de los genes quelas codifican

Los venenos de muchas especies de alacranescontienen polipéptidos y proteínas altamentetóxicos para el hombre. El aislamiento y la ca-racterización química de estos componentestóxicos han permitido descubrir el mecanismomolecular de acción de los mismos. Entre losanimales cuyo veneno ha sido ampliamenteestudiado, están las serpientes y los alacranes.Por medio de técnicas cromatográficas y electro-cinéticas se ha podido separar un gran númerode polipéptidos y proteínas neurotóxicas conefecto bloqueador sobre receptores (acetilcoli-na), canales iónicos (Na+, K+, Ca++) y una serieimportante de funciones fisiológicas comosecreción pancreática, hipotermia y liberaciónde neurotransmisores.

Las toxinas han sido purificadas a homoge-neidad y su composición de aminoácidos y lasecuencia primaria ha sido o está en vías dedeterminarse.

-Aislamiento y caracterización química de toxinasdel veneno del alacrán Centruroides noxius Hoffmann

L. D. POSSANI, B. M. MARTlN, A. N. RAMfREZ, F. CORONAS, F.

ZAMUDIO y E. CARBONE

1982/P/S/DRMB

-Aislamiento y caracterización de una toxina delveneno del alacrán Centruroides limpidus limpidusKarsch que afecta a crustáceos

c. BALDERASy L. D. POSSANI

1987/P/S/DRMB

-Aislamiento de genes que codifican para dife-rentes toxinas de alacranes

B. BECERRIL, F. ZAMUDIO, A. VAzOUEZ, M. C. GARCfA, F. BoLí-

VAR, M. CORONA y L. D. POSSANI

1988/P/S/DRMB/DMM-Clonación del gene que codifica para la noxius-toxina a partir de un banco de cDNA del ala-crán Centruroides noxius

F. MARTíNEZ, B. BECERRIL, B. MARTíN, X. SOBERÓN, F. BoLí-

VARy L. D. POSSANI

1993/P/S/DRMB/DMM-Clonación del gene que codifica para una toxi-na de crustáceos del alacrán Centruroides limpidusIimpidus

M. C. GARCíA, B. BECERRIL, C. BALDERAS, F. BOLíVAR y L. D.

POSSANI

1 990/P/S/DRMB/DMM

- Estudios comparativos de las secuencias deaminoácidos de toxinas del veneno de los ala-cranes Centruroides infama tus infamatus y CentruroidesIimpidus Iimpidus

M. D. DEHESA, B. M. MARTIN y L. D. POSSANI

I989/P/S/DRMB/DMM-Aislamiento y caracterización de toxinas simila-res a la Noxiustoxina del veneno de alacranes

A. NIETO, B. M. MARTIN, A. N. RAMíREZ, G. GURROLA, F. ZA-

MUDIO y L. D. POSSANI

1989/P/S/DRMB

- Purificación y caracterización de toxinas del ve-neno del alacrán Tityus bahiensis

L. D. POSSANI, F. CORONAS, B. M. MARTIN, S. LUCAS, V EIKS-

TED y P. L. FLETCHER

1992/P/S/DRMB

-Caracterización de genes que codifican paratoxinas de alacranes del género Tityus

B. BECERRIL, M. CORONA, B. MARTIN, M. C. MElfA, F. BoLí-

VARy L. D. POSSANI

1 993/P/S/DRMB/DMM

PROGRAMA 9.3Aislamiento y caracterización de receptoresespecíficos, mediante el uso de toxinaspeptídicas

Las toxinas peptídicas aisladas a homogeneidad,hasta el momento, son todas componentes quereconocen de manera específica ciertos receptoresde membrana. Por esta razón se han transforma-do en herramientas muy útiles para el aislamien-to y la caracterización químico-funcional de lasmoléculas receptoras. Entre las toxinas aisladasy caracterizadas está la a-toxina de elápidos (Najanaja siamensis), utilizada en el aislamiento del re-

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ceptor a la acetilcolina; la toxina gama de Tityusserrulatus, usada en el aislamiento del canal de so-dio; la noxiustoxina, específica para el canal depotasio, y más recientemente la taicatoxina, blo-queadora de canales de calcio. Todos estos pép-tidos naturales han sido marcados con isótoposradioactivos o cromóforos f1uorescentes para suuso como trazadores biológicos, o se han utiliza-do para la síntesis de soportes para cromatogra-fía de afinidad.

-Caracterización de los sitios de unión de lanoxiustoxina, un péptido del alacrán Centruroidesnoxius, bloqueador de canales de K+

G. GURROLA, y L. D. POSSANI

1990/P/S/DRMB-Caracterización adicional del canal de potasioaislado del axon gigante de calamar, por incor-poración en bicapas lipídicas artificiales

G. PRESTIPINO, A. N. RAMfREZ, A. LIÉVANO, A. DARSZON y

L. D. POSSANI

1989/P/S/DGFMlDRMB- El uso de la toxina 11-10del veneno del alacrán

Centruroides noxius para la caracterización delcanal de sodio del axon gigante de calamar

A. N. RAMfREZ, G. PRESTIPINO, A. LIÉVANO, A. DARSZON y

L. D. POSSANI

1989/P/S/DGFM/DRMB-Clonación de genes que codifican para toxinasdel alacrán Pandinus imperator, bloqueadoras decanales de calcio sensible a la ryanodina

F. ZAMUDIO, R. CONDÉ, B. BECERRIL, B. MARTIN, H. H. VALDI-

VIA y L. D. POSSANI

1993/P/S/DRM B-Clonación del gene que codifica para la fosfoli-pasa del alacrán Hadrurus concolourus

R. CONDE, L. COVARRUBIAS,B. BECERRIL, L. D. POSSANI

1992/P/S/DRMB/DGFM- Expresión del mensajero que codifica para elcanal de potasio "SHAKER" en células de insec-tos para el ensayo de nuevas toxinas de alacrán

F. GÓMEZ y L. D. POSSANI

1994/1/S/DRMB

PROGRAMA 9.4Caracterización funcional de toxinas peptídicas

Los péptidos naturales y sintéticos han sido utili-zados como herramientas en la caracterización deciertas funciones biológicas, desde el punto de vis-ta electrofisiológico, neuroquímico y morfológico.

El estudio del mecanismo de apertura y cierrede canales iónicos de membranas excitables hasido beneficiado con el descubrimiento de lastoxinas peptídicas. De la misma forma, el estu-dio de la liberación de neurotransmisores o elestudio de la pancreatitis experimental se hapodido llevar a cabo gracias al uso de los pépti-dos naturales y sintéticos.

Finalmente, alteraciones morfológicas y loca-lizaciones inmunohistoquímicas se han podidorealizar o visual izar gracias al uso de los pépti-dos mencionados.

-Toxinas purificadas del veneno de los alacranesCentruroides infamatus infamatus y Centruriodes limpiduslimpidus en un modelo de secreción pancreática

M. D. DEHESA, A. DARSZON, P. L. FLETCHER, M. FLETCHER y

L. D. POSSANI

1989tr1S/DGFM/DRMB

- Estudios del efecto de la taicatoxina en el meca-nismo de fertilización de óvulos de erizo de mar

A. DARSZON, l. M. MOCHCA y L. D. POSSANI

1989/P/S/DGFM/DRMB- Nuevas toxinas del veneno de alacranes mexi-canos que afectan los fenómenos de fecunda-ción en erizo de mar

F. ZAMUDIO, L. D. POSSANI, F. CORONAS A. LIÉVANO y A.

DARSZON

1989/P/S/DG FM/DRM B

PROGRAMA 9.5Purificación y caracterización del activadorde plasminógeno de la saliva de murciélagoshematófagos, y de triatómidos mexicanos

IINFORME ANUAL 1994

Desmodus rotundus degrada con gran eficiencia loscoágulos sanguíneos de mamíferos. Se pretendedetallar la bioquímica molecular de esta enzimay explorar su posible utilización como agentetrombolítico. Su alta dependencia de fibrina, suespecificidad y su baja inmunogenicidad permi-ten prever su utilización rutinaria en pacientescon trombosis profundas.

- Purificación y caracterización química de la des-mocinasa, activador del plasminógeno de la sa-liva del vampiro Desmodus rotundus

E. GÓMEZ, B. SOSA, R. MEDELLfN, W. D. SCHLEUNING y A.

ALAGÓN

1985/P/S/DRMB

-Dependencia de fibrina para la acción de ladesmocinasa

B. SOSA, A. ALAGÓN y W. D. SCHLEUNING

I 985/P/S/DRMB

PROGRAMA 9.6Desarrollo y optimización de métodos y sistemasde purificación de proteínas y péptidos

Se pretende desarrollar metodología s tanto ge-nerales como específicas para la purificación depolipéptidos utilizando principalmente técnicasde cromatografía de afinidad, de intercambioiónico, de permeación en gel y de alta resolución,electroforesis y difusión a través de membranas.Asimismo, se trabaja en el escalamiento de lasmetodologías de purificación de péptidos espe-cíficos.

- Utilización de la cromatografía de intercambioiónico para la purificación de las cadenas deinsulina humana producida en bacterias

N. CRUZ, G. GOSSET, M. MORALES y F. BoLfvAR

1989tr1S/DMM

-Separación y purificación en forma simultáneaal proceso de fermentación para la recupera-

ción en línea de anticuerpos monoclonalesmediante cromatografía líquida de afinidad

A. HIGAREDA, L. D. POSSANI y O. T. RAMfREZ

1991trlDBIIDRMB

PROGRAMA 9.7Producción de anticuerpos monoclonalesy policlonales contra péptidos y proteínas

Se desarrollan metodologías de producción deanticuerpos monoclonales dirigidos contra poli-péptidos específicos, que serán utilizados paracuantificarlos, caracterizarlos y purificarlos. Existetambién un proyecto destinado a desarrollar laproducción masiva de anticuerpos monoclonales.

-Producción y caracterización preliminar dehibridomas productores de anticuerpos mono-clonales específicos para la hormona humanaestimulante de tiroides

E. CALDERÓN, A. SALAS y A. ALAGÓN

1988/P/S/D RM B

- Producción masiva de anticuerpos monoclona-les contra péptidos de alacranes

T. RAMfREZ, L. D. POSSANI, E. CALDERÓN, F. ZAMUDIO, G.

GURROLA y A. HIGAREDA

I 989tr1S/DRM B/DBI

-Caracterización inmunológica de péptidos sinté-ticos que corresponden a secuencias de toxinasquiméricas y nativas del veneno de alacranes

E. CALDERÓN, T. OLAMENDI, G. GURROLA, F. ZAMUDIO, A. N.RAMfREZ y L. D. POSSANI

1989/P/S/DRMB

-Caracterización del epítope del monoclonalneutralizante BDF2 a la toxina 2 de Centruroidesnoxius, mediante péptidos sintéticos

E. CALDERÓN, F. ZAMUDIO, T. OLAMENDI, E. YORK, J. STEWART

y L. D. POSSANI

I 994/IIS/DRMB

-Cultivo de hibridomas en reactores agitados parala producción masiva de anticuerpos monoclo-nales contra la hormona humana estimulante detiroides y toxinas del veneno de alacranes

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGíA

T. RAMfREZ, A. ALAG6N, R. HERNÁNDEZ, F. ZAMUDIO y

L. D. POSSANJ

1991tr1DBIIDRMB

PROGRAMA 9.8Ingeniería de proteínas

La comprensión de la relación entre la estructu-ra y la función de las proteínas tiene profundasimplicaciones en la interpretación molecular defenómenos fisiológicos y en la aplicación biotec-nológica de proteínas específicas. En este pro-grama, se pretende abordar, a través de sistemasmodelo, diversos aspectos relacionados con lacomprensión de la relación entre las estructurasprimaria y terciaria de las proteínas y su función.Se intentará aplicar este conocimiento en el di-seño de proteínas mejoradas para diversos fines.Se aplican técnicas de mutagénesis de alta efi-ciencia y métodos de búsqueda simples para laobtención de proteínas variantes.

- Mutagénesis y selección de variantes en la [3-Jac-tamasa: alteración de la constelación catalítica.

J OSUNA y X SOBER6N

1991/P/DMM/USOM

-Mutagénesis y selección de variantes en la [3-lac-tamasa: búsqueda de cambios de especificidad

F RANGEL, J OSUNA y X SOBER6N

I 990/P/DMM/USOM

- Mutagénesis y selección de variantes en la [3-lactamasa efecto de mutaciones en sitios inva-riantes

E. COTA, Y FucHS y X SOBER6N

1989tr1DMM/USOM

-Generación y caracterización de mutantes delsitio de reconocimiento de la endonucleasaEcoRI

H. FLORES, J OSUNA y X. SOBER6N

I 989tr1DMM

PROGRAMA 9.9Estudio de enzimas en condiciones de limitaciónde agua

El campo de la ingeniería enzimática es intere-sante desde el punto de vista de la enzimologíabásica, como una forma de estudiar las relacio-nes estructura-función de la catálisis enzimática.También es interesante desde el punto de vistaaplicativo ya que las enzimas se utilizan en diver-sos procesos a nivel industrial en las áreas deterapéutica, farmacéutica y alimentación.

Los estudios con enfoque aplicado por logeneral tienen como objetivo preparar enzimasque adquieran ciertas características fundamen-tales que las hagan apropiadas para condicionesindustriales como: a) la prolongación de la vidamedia de la enzima, &) el aumento en la termorre-sistencia, e) los cambios en la dirección de lareacción catalítica de la enzima nativa, d) la alte-ración en la selectividad de la enzima para incre-mentar o disminuir su rango de substratos.

Nos proponemos estudiar aspectos de la enzi-mología básica en solventes orgánicos utilizan-do micelas invertidas y una o dos enzimas solu-bles como modelo. Este programa constituyeuna colaboración con investigadores del Institu-to de Fisiología Celular. Con base en los antece-dentes se espera ver cambios en el comporta-miento de la enzima en el sistema micelar conrespecto al agua. La pregunta principal que setratará de responder es: ¿cómo están relaciona-dos estos cambios en la función de la enzimacon la estructura que adquiere ésta en el siste-ma micelar?

Recientemente hemos encontrado que en lossistemas de micelas invertidas los desnaturali-zantes tienen un efecto activador sobre variasenzimas. Debido a lo anterior queremos tambiénestudiar el mecanismo de activación y utilizarlos desnaturalizantes para derivar informaciónsobre la relación estructura-función en estos sis-temas.

INFORME ANUAL 1994

- Relación de la flexibilidad y catálisis con la es-tructura proteica

G. GARZA-RAMOS, G MORENO, X SOBERÓN, A DARSZON y

A GóMEZ-PUYOU

1991/P/S/DGFM/DRMB/IFC

- Relación estructura-función de la triosafosfatoisomeraza en sistemas no convencionales conbajo contenido de agua

M. SEPÚLVEDA, A. GóMEZ-POYOU, M. TUENA DE GÓMEZ-

PUYOU y A DARSZON

PROGRAMA 9.10Evolución dirigida de péptidos y proteínas

La década de los 90 ha traído cambios profun-dos en la metodología disponible para generarproteínas con nuevas propiedades. La mutagé-nesis combinatoria de proteínas es capaz degenerar un repertorio de estructuras enorme, yeste gran repertorio sólo puede ser aprovechadomediante técnicas que permitan el análisis de unnúmero enorme de variantes. El estudio de bac-terias que contienen plásmidos o fagos mutan-tes sólo permite el estudio de alrededor de cienmil mutantes por experimento. Sin embargo, lasnuevas técnicas conocidas como "phage display"(despliegue en fago) permiten el análisis de has-ta 109 de variantes de secuencia proteica expuestaen la superficie del fago M 13, Y asociada al geno-ma de éste. Estos nuevos esquemas de mutagé-nesis masiva y análisis de un alto número demutantes mediante esquemas de selección, sedenomina evolución dirigida de ligandos y pro-teínas. Esta tecnología tiene un alto potencialpara generar nuevas estructuras de proteínas ypéptidos con propiedades definidas con base enun esquema de selección. Recientemente hemosempezado a explorar el uso de sistemas deencapsulamiento en liposomas, los cuales tie-nen el potencial de permitir el análisis de hasta1012 variantes en un solo experimento.

-Evolución dirigida de enzimas que actúansobre ácidos nucleicos utilizando la tecnologíade despliegue en fago y sistemas de encapsula-miento en liposomas

L. M. SALGADO y P.M. LiZARDI

1993/1/DRMB

PROGRAMA 9.11Estructura, función, regulación y evoluciónde los dominios estructurales de los reguladorestranscripcionales en bacterias

En los últimos años se han descrito en detalleun gran número de proteínas reguladoras de latranscripción, tanto de bacterias, como de orga-nismos eucariontes. Una observación general esque este tipo de proteínas están conformadaspor varios dominios estructurales y funcionalesdistintos. Generalmente, la interacción especí-fica con las secuencias regulatorias del DNA selleva a cabo a través de un dominio diferente deldominio involucrado en la activación de la trans-cripción En algunos casos los reguladorestranscripcionales contienen un dominio adi~cional involucrado en la regulación global dela actividad de la proteína. En varios sistemas laconstrucción de proteínas truncadas o híbridasha demostrado la independencia estructural yfuncional de los diferentes dominios. Sin embar-go, nuestro conocimiento sobre la regulación yevolución de los diferentes dominios es muylimitado. Los proyectos que estamos abordan-do tienen como objetivo fundamental entenderalgunos aspectos básicos de la estructura, dela función, de los mecanismos de regulaciónde la actividad y de la evolución de proteínasregulatorias en bacterias. Nuestros modeloscomprenden dos familias de reguladores trans-cripcionales la familia de los activadores quefuncionan con la RNA polimerasa sigma 54(BEBP) y de los reguladores de la familia de "doscomponentes".

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGíA

-Identificación de los motivos estructurales deNifA de R. meliloti involucrados en el control po-sitivo

v. GONZÁLEZ, x. SOBERÓN y E. MOREn

1992/PIDRMB

- Regulación de la actividad de NifA de R. melilotipor oxígeno

K. JUÁREZ,V GONZÁLEZ, L. OLVERA, x. SOBERÓN y E. MOREn

1 993/P/DRMB

- Evolución de los dominios estructurales de lasfamilias "dos componentes" y BEBP

S. DÁVILA, L. SEGOVIA y E. MOREn

1992/P/DRMB

- Regulación de la expresión de la proteína regu-latoria NifA en B. jap0l'licum

H. BARRIOS, R. GRANDE y E. MOREn

1991/P/DRMB

PROGRAMA 9.12Síntesis de péptidos para control de malaria

En los últimos años el estudio de péptidos natu-rales y sintéticos con actividad antimicrobianase ha incrementado de forma exponencial. debi-do a la posibilidad de encontrar nuevos fárma-cos con posibles aplicaciones terapéuticas o in-secticidas. Una de las razones que hacen estospéptidos tan interesantes es el hecho de que

son biodegradables y algunos de ellos son muyespecíficos. Existe una importante especificidada especie, para distintos grupos taxonómicos deanimales. Dos familias importantes fueron des-critas; por un lado están las cecropinas y porotro las defensinas. Ambos tipos de péptidoshan sido estudiados tanto en aspectos de espe-cificidad como de estructura química. Nosotroshemos observado que un péptido sintético, se-mejante a cecropina, se mostró altamente tóxicoal desarrollo del Plasmodium bergei (causante de lamalaria en México) cuando fue administrado enel alimento de mosquitos mantenidos en ellaboratorio. De esta forma un grupo multidisci-plinario que involucra tres laboratorios indepen-dientes del Instituto, el Centro de Paludismo dela Secretaría de Salud en Tapachula, Chiapas, ungrupo del Cinvestav-México y un grupo del EMBL

de Alemania, conjuntaron esfuerzos en el senti-do de estudiar más detenidamente este péptidocon miras a la posible obtención de mosquitostransgénicos, resistentes a la malaria.

-Síntesis de péptidos semejantes a Shiva-3 y suefecto en el desarrollo esporogónico de Plasmo-dium bergei

F ZAMUDIO, M. H. RODRíGUEZ y L. D. POSSANI

1994/l/S/DRMB