ObjetivosCaptulo 4 : Microscopa y Preparacin de muestrasAl finalizar la segunda semana de clases, los estudiantes estarn capacitados para:Conocer los equipos y procedimientos bsicos empleados en la Microbiologa.Reconocer mediante simulaciones tcnicas comunes empleadas en la Microbiologa.Conocer las condiciones ptimas para cultivar microbios.

Mtodos y Equipo de la Microbiologa I. Tipos de Microscopios:A. Compuesto: 1. Usa luz visible como fuente de iluminacin.2. Posee 2 tipos de lentes: lentes de los objetivos ( 10x, 40X, 100X y lente del ocular(10X).3. La magnificacin total para los tres lentes:100x, 400X y 1,000x respectivamente.

Microscopio Compuesto Componentes importantes:Condensador: series de lentes que concentra la luz hacia el espcimen. Diafragma: regula la cantidad de luz deseada.

Trayectoria de la luz: La luz es concentrada en el condensador.De ah pasa al espcimenLa luz entra al lente objetivalLa luz pasa a travs de primas y espejos, finalmente al ocular.

Enlace para estudio: Microscopiohttp://www.bact.wisc.edu/MicrotextBook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=82

Partes del microscopio

Otros microscopios comunes Contraste de Fase: Clulas vivas pueden observarse sin teir. No requiere que las muestras sean teidas.Condensador y diafragma especial convierte diferencias de fase en diferencias de brillantez .

Fluorescencia: maestros son iluminadas con luz ultravioleta. Emplea tintes fluorescentes llamados fluorocromos. til para demostrar complejos antgenos-anticuerpos. Ej. Detectar bacterias en un tejido.

Otros microscopiosCampo oscuro: Para observar muestras finas y delicadas . El fondo es oscuro gracias a condensador especial que bloquea los rayos centrales. Los flagelos , las espiroquetas y otros microbios pueden ser observados.

De Rastreo: producen imgenes tridimensionales de alta resolucin. Magnifica 10,000 o ms.

Transmisin Electrnica: Usada para revelar la estructura interna de clulas o virus. Magnifica 200,000 o ms. Usa electrones en lugar de luz visible.

Preparacin de Especmenes vistos bajo el microscopioI. Tcnicas para determinar movilidad microbianaA. Montura Hmeda:Gotas del lquido conteniendo el microorganismo es colocado en laminillas con un portaobjeto encima. B. Gota pendiente: se coloca una muestra del lquido en un portaobjeto y luego se transfiere a una laminilla con depresin.

TincionesDefinicin de tintes: son sustancias qumicas que se adhieren a clulas o a estructuras de la clula microbiana.Tipos de Tintes:Bsicos: la mayora de los microbios tienen atraccin a stos por estar ligeramente cargados negativamente.cidos: Las bacterias repelen el tinte. Solo se tie el fondo. Las clulas se ven claras.

Procedimientos de tincionesTinciones simples: Usan tintes bsicos. Todas las clulas absorben el color del tinte. Se prepara el frotis y se aplica un solo tinte. Se procede a lavar, secar y se observa bajo el microscopio.Tinciones Diferenciales: Se emplean para distinguir entre diferentes tipos de microbios.Gram: Desarrollada por Christian Gram en el 1884. Divide las bacterias en dos(2) grupos:Gram positivas: retienen el tinte primario y lucen prpuras bajo el microscopio.Gram negativas: son decolorizadas por el etanol , pierden el complejo cristal violeta-iodo y lucen rosadas bajo el microscopio.

Procedimiento de laTincin de Gram:

Una vez preparamos el frotis en laminillas se procede a aplicar los siguientes tintes y sustancias qumicas:

Violeta de Genciana ( cristal violeta): 1 minutoLavada con agua destiladaMordante: Iodo al 2%: 1 minutoLavada con agua destiladaDecolorizacin: etanol al 95% o con alcohol y acetona: segundosLavadaSecar laminillaObservacin bajo el microscopio.

Enlaces y Simulacioneshttp://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=89

http://www.biologia.edu.ar/animaciones/index.htm

Tinciones especiales:

Acidos Resistentes: Acid-fast staining: Para reconocer en muestras clnicas a Micobacteria. Ej. El bacilo tuberculoso. Las Micobacterias no son decolorizadas con el alcohol cido, retienen el carbol fuchsin y por eso se ven rosadas. Otras bacterias se en azules.Leifson: para observar flagelos en bacteriasSchaeffer-fulton: Para observar esporas bacteriales. Emplea la malaquita verde y la safranina.

Tincin para Micobacterias

http://www.rlc.dcccd.edu/mathsci/reynolds/micro/lab_manual/AF_stain.html

Empleada para detectar al bacilo tuberculoso en muestras de esputo en los pacientes con pneumona.

Tcnicas bsicas de cultivoImportancia de aplicar tcnicas aspticashttp://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=3Uso de desinfectantes a las superficies.Uso de mecherosInstrumentos esterilizados http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=7

Video interacciones en un laboratorio de Microbiologahttp://www.youtube.com/watch?v=nXlRhXarucg&feature=related

Mtodos de Diluciones: til para aislar clulas deseadasSembrado por estras:http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=6Verter en platos Pour Plates: Se diluye la muestra y se mezcla con agar. Permite cuantificar el nmero de bacterias por ml o por gramo. B= D x C D= factor de dilucinC= # de colonias

Estudio del siguiente enlace

http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=8

Verter en platos

http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=106

Diluciones y contajeshttp://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=103http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=106

Tipos de medios nutritivosMedio definido: Tambin llamado medio mnimo. Se prepara de qumicos puros. Util para microbios no fastidiosos o poco exigentes a nivel nutricional. Bacterias como Escherichia coli crece sin dificultad.Medio Complejo: Se prepara de extractos de carne d e res, de sangre, casena ,levaduras, soya entre otros. Contiene ingredientes enriquecidos que estimulanel crecimiento de organismos deseados a nivel clnico. El caldo nutritivo es un buen ejemplo de este medio.

Meido Selectivo- DiferencialEmpleados para estimular el crecimiento de organismos patgenos. Se le incorporan antibiticos, tintes o sales para inhibir el crecimiento de microbios no deseados y observar colonias con diferentes colores.Ejemplos:Agar Mac Conkey: contiene cristal violeta y sales de bilis. Permite aislar Gram negativos.Agar Salmonella- ShigellaThayer-Martin: Para las Neisserias

Medio EnriquecidoUsado para para aislar un microbio en particular dentro de una gran poblacin que puede incluir flora normal del cuerpo y patgenos.Ejemplos: aislar bacterias patgenas del tracto gastrointestinal.Aisla bacterias patgenas del tracto respiratorio.

Medios enriquecidos y selectivos

Medio DiferencialSe emplean para ver diferencias en el crecimiento colonial.Ejemplo: la adicin de sangre permite diferenciar entre los diferentes Streptococcus.Streptococcus alfa hemolticos: colonias con decoloracin verdosa son aquellos que hemolizan parcialmente los eritrocitos.Streptococcus beta hemoltios: colonias con halos son aquelloss que hemolizan totalmente los eritrocitos.Ej. Streptococcus pyogenes.

Condiciones ptimas para el cultivo de microbiosTemperatura: En trminos generales la mayora de las bacterias crecen alrededor de los 40 grados centgrados. En los laboratorios y hospitales lasmuestran se cultivan en incubadoras calibradas a 37 grados centgrados.pH: La mayora de las bacterias cecen ptimamente en un pH con un rango entre 6.5-7.5. Los hongos en cambio crecen entre ph de 4.5-6.0

Oxgeno: Los microbios responden diferente al oxgeno. Podemos clasificarlso en: Aerbicos estrictos: no pueden reproducirse sin oxgenoAnaerbicos facultativos: pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno.Anaerbicos estrictos: No pueden crecer con oxgeno.Microaeroflicos: necesitan oxgeno pero toleran solo pequeas concentraciones.

Cultivo de bacterias anaerbicasMuchos microbios patgenos son difciles de cultivar en el laboratorio por que son muy sensitivos al oxgeno.En la Microbiologa se emplean sistemas comeriales como el GAS PAK que elimina el oxgeno liberando dixido de carbono e hidrgeno con un cataltico que permite la formacin de agua.De forma casera, tambin podemos colocar los cultivos como los platos petri y tubos de ensayo con las muestras clnicas de los pacientes en jarras con una vela encendida que suple el dixido de carbono necesario para cultivar los microbios anaerbicamente.

Gas Pak para anaerbicos

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