;OBRE EL UTERO AISLADO DE RATA.

i Gonzalo Wizquez Palacios. i

INTRODUCCION.

Los productos naturales de origen vegetal son recursos con múltiples usos para el hombre. En este sentido sobresale el interes en la investigación de plantas con posibles propiedades medicinales, sea,.como fuente importante de remedios, tanto en la forma de preparación tradicional y empírica, como de principios activos puros.

Según la Organización Mundial de la Salud, más del 70% de la población mundial tiene que recurre a la medicina.tradiciona1, como alternativa para resolver sus principales problemas de salud (22) . Además es importante considerar due cerca del 60% de los fármacos son de origen vegetal, incluyendo hongos y bacterias (37).

México es el 14' país más grande del mundo y el tercero de seis países en megadiversidad. La riqueza de plantas medicinales en México puede ser estimada por el número de especies usadas con propósitos terapéuticos. Desde el período colonial han habido programas para documentar el número de plantas medicinales en México de los cuales resyltaron las publicaciones de Cruz y Badiano, Sahagún y Hernández, que registraron más de 3,000 plantas, que son, al menos, una tercera parte de las conocidas botánicamente hablando, hoy en día. Durante el siglo XIX, el Instituto Médico Nacional inició un amplio inventario y evaluación de productos vegetales usados en la medicina. Hoy existen varios programas estatales y nacionales llevados a cabo por agencias de gobierno y universidades que sugieren que más del 15% de las 21,600 especies de plantas vasculares de México son empleadas con propósitos curativos. Y según la Sección de Plantas Medicinales del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma de Chapingo, sólo 3.,000 están registradas como plantas medicinales ( 3 4 ) .

La importancia de las plantas medicinales en México puede ser evaluada por su frecuencia de uso. Según el Instituto Mexicano del Seguro Social se determinó el empleo de cerca de 200 especies en zonas rurales; en esta "lista básica", las diez especies m6s frecuentemente citadas son nativas y las cinco siguientes son plantas introducidas (39) . Los remedios vegetales son vbndidos en mercados del centro de México, la mayor parte de las veces como mezclas de varias especies. Para cada categoría de padecimientos, la mezcla contiene invariablemente, ingredientes llfundamentalesll que son completados por hierbas adicionales dependiendo de la condición del paciente. Dado el gran número de especies de plantas medicinales y la distribución restringida de muchas de ellas,

diferentes especies comparten el mismo nombre común y son empleadas en los mismos tratamientos. Este es el caso del genero Brickellia, cuyos nombres corgunes: atanasia amarga y hierba del becerro se refieren a las esp-ecies Brickellia tomentella y Brickellia pendula, que son usadas tradicional e indistintamente para dolores o males del estómago (35).

Si bien algunos autores señalan que la posibilidad de obtener medicamentos a partir de productos naturales es muy remota ( 2 4 ) , otros señalan que las posibilidades no están agotadas si se consideran además que las técnicas actuales para el análisis biológico de las nuevas moléculas son ostensiblemente más precisas y confiables que las empleadas en los estudios iniciales (37) . La obtención de nuevas moléculas con potencial utilidad como medicamentos a partir de productos naturales tiene como propósito obtener medicamentos más eficaces y/o más seguros y/o más baratos que los ya existentes, dicha actividad se acepta y est& genuinamente justificada eslos países desarrol.lados y con mayor razón en los países en vías de desarrollo, particularmente cuando estos últimos dependen, en este aspecto, de otras naciones.

El primer paso en la búsqueda de fármacos de origen vegetal con potencial aplicación terapeutica es la selección adecuada de especies para el cernimiento biológico y químico. La mayor ventaja, en este sentido, para nuestro país, es que los remedios tradicionales basados en plantas son usados extensivamente desde la antigüedad. Lo anterior ha generado un amplio conocimiento empírico que representa el camino bioracional seguido durante los programas de investigación fitoquímica dirigidos hacia el aislamento de productos naturales biológicamente activos (38). LOS siguientes pasos en la mencionada búsqueda, incluyen el cernimiento de preparaciones de la planta, seguida por un fraccionamiento por bioensayo-dirigido, que conduce al aislamiento de los constituyentes activos puros de la planta(53) . Idealmente, esta metodologia consiste en la prueba in vivo de la droga tradicional para confirmar su actividad farmacológica. Después de la confirmación experimental de su actividad, se desarrollan los correspondientes métodos in vitro que serdn utilizados para monitorear la actividad de los constituyentes puros activos de la planta. Una vez que esta(s) sustancia(s) activa(s) ha(n) sido identificada ( S ) , la estandarización de una preparación de la planta puede ser desarrollada o los estudios de la relación estructura- actividad pueden ser puestos en marcha por síntesis parcial o total de la(s) sustancia(s) activa(s) de la planta (38,43).

De lo anterior es importante destacar, como puede verse, que para el estudio sistematizado de la actividad biológica de una nue'va sustancia se recurre a los diversos modelos experimentales, tanto in vivo qomo in situ e in vitro, dependiendo de las características de la molécula y del propósito del estudio. Es importante señalar que para comprender el efecto de cualquier sustancia en un organismo se deben considerar los diferentes niveles de organización biológica en los cuales actúa (31).

En el caso del modelo in vivo (animal integro), el efecto farmacológico es el resultado de la interacción del fsrmaco con los diversos niveles fisiológicos de organización, en estas condiciones la respuesta farmacológica depende en gran medida de los procesos farmacocinéticos, lo anterior dificulta la interpretación de los resultados para establecer a que nivel el f6rmaco ejerce la acción biológica. En contraste los modelos experimentales in vitro, como es el caso de las preparaciones de órgano aislado, entre otras, han permitido determinar los elementos que sustentan muchos de los m68 importantes conceptos farmacológicos.

En relación a' los modelos experimentales in vitro y en particular al uso de tejidos aislados para el ,estudio de nuevos fármacos, existen numerosos factores que se deben considerar: los intrínsecos al animal como: la especie, la cepa, la edad, el peso y el sexo, son aspectos que pueden influir de manera determinada en los resultados y puede ser fuente importante de variabilidad (17,421. De igual manera hay que tomar en cuenta ciertos parámetros extrínsecos al tejido como son: la composición iónica de la solución nutriente, la liberación adecuada de oxígeno, el pH y la temperatura, dependiendo del órgano a utilizar, todos ellos determinan las condiciones ambientales que pueden asegurar la viabilidad y la sensibilidad del órgano aislado (17).

En general, cambios específicos en el contenido iónico de la solución nutriente pueden afectar la actividad basal así como la reactividad del tejido. De forma que la presión osmótica alta deprime la actividad marcapaso (32,48). En relación a la adecuada liberación de oxígeno es importante considerar que la actividad basal del músculo liso (12,18) y del cardíaco (4) puede verse afectada por cambios en la presión parcial de oxígeno en el medio. Un ejemplo de lo ant.erior es la respuesta contráctil del músculo liso arterial, que disminuye si decrece la presión parcial del oxlgeno en el baño. Otro parametro a considerar es la temperatura. Si el baño posee una temperatura abajo de 37' C se reduce la

actividad espontánea del útero de rata (2) , en contraste con el tejido cardiac0 que muestra una actividad basal mds estable y es mucho más sensible a los agonistas ( 4 , 5 ) . El pH del baño puede afectar la actividad basal y la respuesta del órgano aislado al entrar esté en -contacto con el medicamento. La actividad espontánea y la velocidad de dicha actividad en la arteria de conejo (30,501, auricula de perro ( 4 7 ) , corazón perfundido de cobayo (36), arteria de rata (33) disminuye cuando decrece el pH del baño. Alternativamente, variaciones en el pH del medio puede alterar la ionización de los ffirmacos al cambiar los grupos quimicos y la unión sobre el receptor, fenómeno que a su vez da lugar a cambios en la respuesta del tejido. En esté sentido y como ejemplos tenemos que la respuesta de la arteria de conejo a la histamina es estable cuando el pH del baño se mantiene entre 7 y 7.6. Sin embargo, a pH menor de 7 la respuesta a la histamina se deprime (30). De manera semejante la respuesta del músculo liso a la histamina permanece estable en un amplio rango de pH ( 7 - 8 . 3 ) pero decrece a un pH menor de 7 ( 4 0 , 4 1 1 . De esta manera la respuesta de la auricula de rata a la noradrenalina se incrementa en un medio alcalino y disminuye en condiciones de acidez (10).

Por otro lado, la elección de la estructura aislada esta directamente relacionada con las características estructurales del fdrmaco de prueba y' de las posibilidades a través de las cuales dicha molécula ejerza su efecto biológico. En este sentido la información disponible ha permitido caracterizar la distribución topográfica de numerosos receptores de diversos órganos en distintas especies animales (colinérgicos, adrenérgicos, serotoninérgicos, histaminérgicos, dopaminérgicos Y peptidérgicos) (31) .

En el caso del músculo liso uterino, esté se caracteriza por su alto grado de actividad espontánea tanto eléctrica como contráctil.

espigas se asocian con la contracción; hay difusión de la excitación célula por célula, pero la conducción eléctrica es lenta y de una naturaleza constante. Los contactos de baja resistencia entre células (uniones brecha) facilitan mucho la diseminación de la excitación (7) . El número de tales uniones está regulado por las hormonas esteroideas y aumenta en los estadios finales del embarazo (6). La mayor frecuencia y duración de la actividad de espigas en las zonas I1marcapasosl1 y la difusión mds amplia de la excitación se asocian con aumentos de la fuerza de contracción. En

Ondas de menor potencial de membrana con actividad superpuesta de :

muchas especies el ingreso de sodio parece desempeñar un papel primario en la despolarización. La disponibilidad de calcio extracelular influye mayoritariamente en la respuesta del músculo liso uterino a qiversos estímulos fisiológicos y farmacológicos (3,14,15).

Como en el músculo cardíaco y esquelético, la interacción de actina y miosina que da como resultado la contracción múscular es favorecida por el calcio (44,45,51,52). Sin embargo, la disposición anatómica y propiedades bioquímicas de las proteínas contractiles son muy diferentes eh el músculo liso, incluyendo el del útero ( 6 ) .

El útero de mamiferos presenta receptores alfa adrenérgicos excitadores cuya función esta mediada por AMPc. Tambign contiene receptores beta-2 adrenérgicos inhibidores (hiperpolarizantes) as€ como receptores excitadores para la oxitocina. Su actividad se ve influida por estrógenos, por presencia de progesterona, que inhibe su actividad (período de gestación), grado de estiramiento y la región del útero considerada (3) . En general, la contracción del músculo liso uterino se ve alterada por cambios locales del potencial de membrana, estimulación hormonal o impulsos nerviosos específicos. Tales características hacen del útero un órgano muy importante y a la 'vez muy útil en la caracterización de las propiedades agonistas o antagonistas sobre algún tipo de receptor específico de nuevos fármacos que eventualmente podrían tener aplicaciones experimentales y clínicas definidas.

Los diterpenos son compuestos biosíntetizados a través del metabolismo secundario de varias familias de plantas. Son compuestos que se originan de acetato de coenzima A y tienen como principal intermediario al geranil geraniol cuya ciclización los origina. En general, puede definirse a los diterpenos como compuestos formados por la unión "cabeza con cola1' de 4 unidades de isopreno que en total suman 20 carbonos, cuyo número es característico de estos compuestos (21).

Los diterpenos presentan diversas conformaciones estructurales. Entre los esqueletos más comunes de diterpenos están los siguientes:

CUlmnO hbbno clerodano b n n o

pimumno

Fig. 2.- Estructuras diterpenicas

La gran diversidad de esqueletos hacen posible la existencia de múltiples estructuras. Efectivamente, estudios recientes han elevado el número de ellos a más de mil, muchos de ellos descubiertos en estudios sobre la flora mexicana.

Muchos dite’rpenos, con estructuras muy diversas, son de gran interés tanto por su comportamiento químico como por sus interesantes propiedades biológicas, entre las que destacan las giberelinas, diterpenos con función fitoreguladora del crecimiento y la germinación (27). Las propiedades tóxicas de los diterpenos taxanicos ( 8 ) y la interesante actividad de los diterpenos oxepínicos del zoapatle (Montagnoa tomentosa), utilizado como emenagogo, galactógeno, diurético, estomáquico y hemostático (35). Los ent-kauranos de la Rabdosia utilizados como citostáticos ( 8 ) . Labdanos como el ácido gríndelico obtenido de la Grindellia squarrosa y G. camporurn, utilizado como antiespasmodico y expectorante ( 8 ) . La forskolina, diterpeno obtenido de la labiada Coleus forskohli Brig., utilizada en la medicina ayurvédica como antihipertensivo ( 8 ) .

En concordancia con lo antes señalado, el sólido grupo de químicos del Instituto de Química de la UNAM, han estado sintetizando por un lado y aislando a partir de plantas por otro, numerosas sustancias nuevas, algunas de las cuales han sido sometidas al análisis farmacológico formal en diversos modelos exerimentales (28,461. En los últimos años obtuvieron una

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sustancia diterpenica, el ácido sálvico. Aislado de la parte derea de la planta Brickellia tomentella (tribu Eupatoriae, fam. compositae), recolectada en San Martin Texmelucan, Puebla, y utilizada tradipionalmente como remedio para trastornos gastrointestinales (fig.1).

Los diterpenos labden son algunos de los diterpenos m6s comunes en plantas superiores. El ácido sálvico y sus derivados han sido encontrados en la tribu Eupatoriae (Compositae) . Para determinar la estequiometría de esta clase de diterpenos han sido generalmente utilizados métodos espectroscopicds (Hnmr, cd/ord, W ) muy precisos y confiables. En los últimos años se reportó el aislamiento del ácido sálvico y su diol, así como su determinación estructural por técnicas espectrales y químicas (26). El problema fue que la estereoquímica propuesta en la literatura para el 6cido s6lvico .(29) fue la opuesta a la que exhibia el diol cuando se redujo con LiAlH, y comparado con el 8 (17) -Labdeno 3Bt7,l5-trio1 aislado de Halium viscosum (16) . El diol corresponde a las series ópticas del ácido eperuico, mientras que el ácido sálvico ha sido nombrado ácido labdanolico. Si bien ambas series se han encontrado en la misma planta (25)' estas son diferentes en cada caso. Existe información que reporta el establecimiento de- la configuración absoluta del ácido sálvico a través de medios químicos, por conversión al metil-dihidroeperuato [ S ] , un compuesto con una estequiometría absoluta conocida (25) (fig.3).

Fig.3 Estructura del Acido Sálvico

El ácido sálvico, posee un punto de fusión de 141-143OC con peso molecular de 321. Ha sido caracterizado como el dcido 7 dihidroxi labd-8 (17)en-15-oicor su microanálisis y su patrón de masa espectral corresponde a la fórmula condensada, C,,H,,O,. El

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espectro infrarrojo del ácido sálvico muestra la presencia de un grupo hidroxilo secundario a 3380 cm” el cual puede ser oxidado a una cetona alfa-beta insaturada con una longitud msxima de 250 nm (29) . Estos datop corresponden a la molécula primeramente aislada de Eupatorium s a l v i a .

Por otra parte, en virtud de que algunos diterpenos muestran actividad sobre el músculo liso intestinal (11) , y que inclusive estudios previos han mostrado que el ácido sálvico inhibe la actividad contráctil del íleo aislado de rata (39), se ha considerado de interés continuar el estudio sistematizado del perfil de actividad biológica de ‘esta molécula, sobre el músculo liso y así determinar la influencia del ácido sálvico sobre la respuesta contráctil inducida por la oxitocina en el músculo liso uterino aislado de la rata. Con fundamento en los antecedentes experimentales y considerando las caracteristicas de la estructura diterpénica del ácido sálvico, podemos inferir que el fármaco modifica las contracciones inducidas por la oxitocina en el útero aislado de la rata.

Fig 1 Brickellia tomentella.

. ..

. .

8.

OBJETIVOS GENERA~ES.

* Realizar el estudio sistematico del perfil de actividad biológica del Acido Sálvico, tanto en modelos experimentales in vitro como in vivo. 4

OBJETIVOS ESPECIFICOS.

* Conocer la importancia de los productos naturales como posible fuente de principios activos con actividad biológica.

* Conocer y manejar las técnicas experimentales de organo aislado.

* Determinar el perfil farmacológico del Acido Sálvico sobre las contracciones inducidas por la oxitocina en el útero aislado de la rata.

* Adiestramiento en la obtención y manejo estadístico de los resultados obtenidos, así como su interpretación.

Se emplearon segmentos de 1.5-2 cm de útero, obtenidos de ratas Wistar hembras adultas de 300-400 g de peso corporal, los animales fueron mantenidos a temperatura constante (22+2 C), en cuarto con ciclo de luz-oscuridad (12h-l2h), provistos de una dieta estandar y agua ad libitum.

Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y el útero fue removido e inmediatamen'te colocado en cajas de petri que contenían solución de Krebs con la siguiente composición ( m M ) : NaCl 118, NaHCO, 25, Glucosa 11, KC1 4.7, MgC1, 1.2, CaC1, 2.5 mM y cloruro de colina O .929. Ajustandose el pH a 7.4. El útero fue separado de grasa, tejido conectivo y de los ovarios, dividiendose cada cuerno transversalmente en dos mitades de la longitud arriba señalada.

Cada segmento de útero fue montado en una c6mara para órgano aislado de 30 m1 que contenía solución de Krebs burbujeada con carbógeno (95% O, 'y 5% CO,) manteniendo una temperatura de 32OC (Fig.4). Cada segmento fue sometido a una tensión de 2 g. La actividad basal y la respuesta contráctil se registraron a tráves de un transductor l?T03D conectado a un polígrafo Grass 79D. La actividad espontánea se registró por 10 min y a continuación se realizó una curva dosis-respuesta (CDR) a la oxitocina (OX) a concentraciones de 5, 50 y 500 pU respectivamente, en presencia del ácido sálvico (AS) a concentraciones de 5 ~ 1 0 - ~ , I x ~ O - ~ y 1 . 5 ~ 1 0 - ~ M, el cual fue adicionado al baño 2 min antes de la adición de la OX, registrando la respuesta durante 10 min. A'continuación se realizó otra CDR a la OX sola, a las mismas concentraciones referidas arriba, registrándose la actividad múscular por 10 min, tomando estos registros como control. Entre cada una de las CDR los tejidos fueron lavados con solución Krebs durante un período de 15 min .

La actividad uterina total (área bajo la curva inscrita por la frecuencia y amplitud de la contracción uterina) (49) fue medida durante los 10 min de registro, usando un método planimetrico, reportándose los resultados como el valor promedio de las dreas bajo la curva f el error estándar de la media (n=9), Los datos fueron sometidos al análisis estadístico de la prueba de t de student considerándose los valores de p<0.05 estadísticamente significativos. Los resultados obtenidos también se sometieron al ANOVA con el mismo nivel de significancia.

ACTIVIDADES REALIZADAS.

4

* Se preparó el material y las soluciones para el montaje de la técnica mencionada. * Se manejó la técnica de útero aislado de rata. * Se midieron por métodos planimétricos los registros obtenidos en la etapa experimental. * Se realizó el andlisis estadistico de los resultados a través de las pruebas mencionadas (t de student y ANOVA). * Se graficaron y discutieron los resultados obtenidos. * Se aprendió y aplicó el manejo de los paquetes de computación Wordperfect 5.1., Harvard Graphics y Statgraphics. * Se preparó y presentó el cartel respectivo en: "1994 Annual MeetingPhytochemical Society of North Americat1 y en el IIConcurso del Cartel Científicoll organizado por el CONACYT y la U.A.M.- Iztapalapa, 1994. Cabe mencionar que el mismo trabajo fue presentado en el XVII Congreso Nacional de Farmacologia. * Se preparó y redactó el informe final del Servicio Social.

A) Se montó y manejó la técnica experimental de organo aislado para útero de rata. B) Se realizó la etapa experimental. C) Se obtuvieron los resultados respectivos. DI Se realizó el andlisis estadístico y la discusión de los resultados obtenidos. E) Se preparó y redactó el informe final.

RE~SULTADOS, DISCUSI~N Y co~c~us~o#~s.

Los resultados indican que el AS antagoniza el efecto contrdctil inducido por .la OX sobre el músculo liso úterino de la rata, dicho fenómeno se manifiesta por el desplazamiento a la derecha de la curva dosis respuesta (CDR) a la OX y disminución de la respuesta m6xima en presencia del AS.

La Fig. 5 corresponde a registros representativos de la CDR del útero aislado de la rata a la OX sola (panel A) en las concentraciones respectivas, que que se indican al pie de la figura (log de la dosis) y a la CDR a la OX en presencia del AS 1 . 5 ~ 1 0 - ~

M(B). Como se observa el AS disminuye significativamente las contracciones inducidas por la OX a las tres concentraciones probadas. Las CDRs a la OX en presencia de las tres concentraciones de AS se muestran en las figs. 6, 7 y 8 , los resultados se expresan como el valor promedio de las dreas bajo la curva (ABC) y las líneas verticales corresponden al error estdndar (n=9) .

Como se indica en la fig.9, la concentración cincuenta se incremento de 7 a 50 pU en presencia de AS 5x10-’ M y a 500 pu en presencia de AS a l~lO-~ M . La CDR a la OX en presencia de la mayor concentración del AS solo alcanzó el 65% de la respuesta mdxima (figs.8 y 9 1. La influencia del AS sobre las contracciones inducidas por la OX en las respectivas concentraciones se hace evidente en la fig. 10, donde observamos una tendencia a la disminución del ABC entre mayor es la concentración del AS.

Por otro lado, recientemente comunicamos que el AS también es capaz de disminuir las contracciones inducidas por acetilcolina en el ileo aislado de rata (39) , más eficazmente que el viguiepinol (46) , otro diterpeno, estructuralmente relacionado con el AS.

Los canales de calcio dependientes de voltaje de tipo L (clasificados por su conductancia y sensibilidad al voltaje) (23) son sensibles a los bloqueadores de canales de calcio. Su selectividad a los efectos farmacológicos de estos bloqueadores se eleva en particular debido a la abundancia de canales tipo L tanto en el músculo cardíaco como en el músculo liso (7).

GRASS 10 fe RECORDING

FT03

Y

Fig 4 ~ MONTAJE

panel A CURVA 'DOSIS-RESPUESTA A LA OXlTICINA LOG

panel B Fig 5 CURVA DOSIS-RESPUESTA A LA OXITOCINA EN PRESENCIA

DE ACIDO SALVICO 1 x 10-4 11

- . ..

. .

Fig 6' CURVA DOSIS-RESPUESTA AL EFECTO CONTRACTIL INDUCIDO -%OR LA OXITOCINA SOLA Y EN PRESENCIA DE ACIDO SALVICO 5x10 M.

50

u S o 20 c,

PI -4

n 5.00

+control 4- 5x10 M -5

0.69 1.69

OXITOCINA Log [vu] 2.69

Fig 7 CURVA DOSIS-RESPUESTA AL EFECTO CONTRACTIL INDUC O POR LA OXITOCINA: Y EN PRESENCIA DE ACIDO SALVICO 1x10 J!í .

50

3 u 3 o *O

O O.

- CONTROL + 1x10 M.

OXITOCINA Log [W]

Fig 8 CURVA DOSIS-RESPUESTA AL EFECTO CONTRACTIL INDUCID4 POR LA OXITOCINA Y EN PRESENCIA DE ACIDO SALVICO 1.5X10 M.

. . *. . * . 50

40

30

20

70

o O .

-CONTROL -4- 1 . 5 X 1 0 -4M.

I O 0 O. 69 1,69 2.69

' OXITOCINA Log [VU]

Fig 9'CURVA DOSIS-RESPUESTA A LA OXITOCINA EN EL UTERO AISLADO DE RATA Y EFECTO ANTAGONICO DEL ACIDO SALVICO.

. . ._ 50

40

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10

n I . ov. O 0 O. 69 1.69

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* l X l O M -4

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2.69

OXITOCINA Log [VU]

Fig'.lO INFLUENCIA DEL ACID0 SALVICO SOBRE LAS CONTRACCIONES INDUCIDAS POR LA OXITOCINA (5, 50 Y 500 VU). N=Q.

o. 00 -3.82 -4.00 -4.30

+OX 50 VU *ox 5 pu

,ACID0 SALVICO Log [M]

Los bloqueadores de los canales de calcio disponibles y otros que estan en desarrollo tienen estructuras químicas muy diversas (deltiazem, nicarpidina, verepamilo, etc.) (23)y muy diferentes a la del AS. En el músculo liso vascular los bloqueadores inhiben los canales de calcio voltaje-dependientes en concentraciones significativamente más bajas que las requeridas para interferir con la liberación de .calcio intracelular o para bloquear los canales operados por receptores (15) .

d

Es bien conocido que muchos tipos de músculo liso son dependientes del flujo transmembranal de calcio para restablecer el tono y la respuesta contráctil normal (13,15,44,45). Mds aún, se considera que la biodisponibilidad de calcio controla el efecto contráctil teniendo un importante papel en esté sentido, las concentraciones adecuadas de calcio intracelular.

Los presentes resultados sugieren que el posible mecanismo de acción del AS en la inhibición de la contráctilidad del músculo uterino e intestinal no esta mediado por receptores específicos sino, posiblemente por el: bloqueo del flujo de calcio en la célula (1,6,15,20), lo que sería una posible explicación se su efecto en dos tipos de músculo liso y con inductores de la contracci6n diferentes (acetilcolina para el ileo y oxitocina para el útero. Si consideramos que el músculo liso tiene un pobre desarrollo del retículo sarcoplásmico, en comparación con el músculo cardíaco y esqueletico, en qu.e esta estructura es fundamental para la provisión de calcio intracelular y su subsiguiente participación en la activación del proceso de excitación-contracción, se debe estudiar el posible rol de los diferentes tipos de canales de calcio celulares para determinar cual de ellos esta involucrado en la iniciación de la contracción y cual de ellos tenga la posibilidad de verse bloqueado por el ácido sálvico, si acaso esté es el posible mecanismo a través del cual esté último produce su efecto.

Si bien son necesarias altas concentraciones de calcio intracelular libre para la formación del complejo calcio- calmodulina y la generación de las subsiguientes etapas del proceso, no es posible , hasta el momento asegurar que el posible mecanismo del ácido sálvico sea el bloqueo del inicio del proceso de contracción, ya que también deben considerarse otras etapas dentro del mismo proceso que pudieran verse alteradas, como la interacción de la calmodulina con el calcio, la generación del complejo Caz+ - Calmodulina- MLCK(miosin-light-chain-kinasa), la fosforilación de las cadenas de miosina, etc. Sin embargo, es una importante aproximación, ya que debemos tomar en cuenta que en el músculo liso, muchos de los iones calcio que causan la contracción

entran a la fibra muscular desde el fluido extracelular en el momento de la generación del potencial de acción. Las fibras del músculo liso son extremadamente pequeñas en relación a las del músculo esqueletico o cardiaco, esos iones calcio pueden difundirse más ampliamente por el músculo liso e iniciar el proceso contrdctil. La causa de la relajación de los elementos contrdctiles del músculo liso es la remoción necesaria de los iones calcio. De ahí la importancia de considerar el bloqueo del flujo transmembranal del calcio como el posible mecanismo en el que se involucra el ácido sálvico.

De corroborarse este hecho, mantendria el interés sobre esta molécula, desde el punto de vista farmacológico. Compuestos suma importancia en el control de diversas patologias, la hipertensión, algunos tipos de arritmias cardíacas y como antianginosos, donde el principal síntoma que se requiere aliviar esta relacionado con la alta tensión del músculo liso ( 2 3 ) . Por lo anterior el AS podría ser una alternativa de interés desde el punto de vista farmacológico.

Es importante destacar, por otro lado que tipícamente los fármacos usados como antiespSsmodicos, son moléculas con efecto anticolinérgico muscarínico obtenidas de plantas solanaceas como la Atropa belladona (atropina) y del Hyoscyamus niger (escopolamina! , ambos alcaloides son esteres organicos formados por la combinaclon del ácido trópico y bases organicas complejas. En base a los estudios de REA (relación estructura-actividad) de estas moléculas, se han diseñado y desarrollado nuevos fármacos que poseen las características antiespásmodicas (2). Cobran relevancia , en este sentido, los diterpenos estudiados ya que no comparten la estructura química de los antiespdsmodicos cl6sicos.

Es necesario continuar con el estudio sistematizado del perfil de actividad biológica del ácido sálvico en otras preparaciones de organo aislado específicamente de músculo liso vascular, sin excluir otras más como esófago, tráquea, etc. Lo anterior es fundamental para dilucidar el posible mecanismo de acción del dcido sálvico en la inhibición de la contractilidad del músculo liso. De manera complementaria se necesitan utilizar diferentes agonistas y antagonistas, así como estudiar sus efectos sobre el flujo de calcio transmembranal y la posible participación de est6 último en el proceso. Es necesario a su vez, llevar a cabo un estudio comparativo entre los efectos de los bloqueadores de calcio

conocidos y los efectos del dcido sálvico, considerando sus diferencias en estructura quimica, a nivel del músculo liso en sus diferentes tipos.

También es importante continuar el estudio sobre preparaciones intactas para determinar las diferencias de la actividad biológica en relación a las observadas hasta el momento, en preparaciones aisladas, donde el fármaco es añadido a concentraciones y tiempos determinados tanto para inducir su efecto como en las etapas de lavado. Ello podria darnos una aproximación a sus posibles parametros farmacocin6ticos y en general para determinar sus posibilidades , si es que las tiene, como futuro medicamento.

Consideramos que los presentes resultados son de importancia porque, por un lado, representan los hallazgos experimentales de una molécula que presenta una especial actividad biológica y por el otro, el hecho de que sea un compuesto aislado de una fuente natural por químicos mexicanos, pone de manifiesto el potencial que representa la flora y los recursos humanos de nuestro país, para la obtención de m6s y mejores sustancias de interés farmacológico y que eventualmente tengan aplicaciones bien definidas.

RECOMENDACIONES.

* Es necesario continuar el estudio sistematizado del perfil de actividad biológica del Acido Sálvico en otras preparaciones de organo aislado, específicament'e de músculo liso vascular. Ademss, para dilucidad el posible mecanismo de acción del &ido s%lvico en la inhibición de la contractilidad del músculo liso es necesario utilizar diferentes agonistas y antagonistas, así como estudiar sus efectos sobre el 'flujo transmembranal de calcio y la posible participación de esté último en el proceso. También es necesario realizar un estudio comparativo de los efectos de los diferentes bloqueadores de los 'canales de calcio en relación a otras tipos de mdsculos lisos, llamense intestinal o uterino, para contrastarlos con la información obtenida sobre el ácido sálvico.

Otra necesidad prioritaria es continuar el estudio sobre preparaciones intactas para determinar las diferencias de la actividad biologica en relación a las observadas hasta ahora en preparaciones aisladas, donde el farmaco es añadido a concentraciones conocidas, en tiempos determinados tanto para inducir su efecto como en las etapas de lavado. Ello podría dqrnos una aproximación a sus posibles parametros farmacocinéticos y en general, para determinar sus posibilidades, si es que las tiene, como futuro medicamento.

I .- . ...-. .

B I B L I W I A .

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