OBTENCIÓN DE EXTRACTO CRUDO A PARTIR DEL BEJUCO DE ...
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1 OBTENCIÓN DE EXTRACTO CRUDO A PARTIR DEL BEJUCO DE VALERIANA OFFICINALIS, PARA LA INHIBICIÓN DE HELICOBACTER PYLORI. MARIE CATHERINE OCAMPO GUIRAL. 1055023 JULIANA ORDOÑEZ GONZALEZ. 1050608 UNIVERSIDAD SAN BUENAVENTURA CALI FACULTAD DE INGENIERIA PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 2011
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OBTENCIÓN DE EXTRACTO CRUDO A PARTIR DEL BEJUCO DE VALERIANA OFFICINALIS, PARA LA INHIBICIÓN DE HELICOBACTER
PYLORI.
MARIE CATHERINE OCAMPO GUIRAL. 1055023
JULIANA ORDOÑEZ GONZALEZ. 1050608
UNIVERSIDAD SAN BUENAVENTURA CALI
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
2011
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OBTENCIÓN DE EXTRACTO CRUDOS A PARTIR DEL BEJUCO DE VALERIANA OFFICINALIS, PARA LA INHIBICION DE HELICOBACTER
PYLORI.
MARIE CATHERINE OCAMPO GUIRAL
JULIANA ORDOÑEZ GONZALEZ
TRABAJO DE GRADO
PARA OPTAR AL TITULO DE
INGENIERIO AGROINDUSTRIAL
DIRECTOR
RAUL CUERVO MULET
BIOLOGO
UNIVERSIDAD SAN BUENAVENTURA CALI
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
2011
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PAGINA DE ACEPTACION
Aprobado por el Comité de Grado en cumplimiento de los requisitos exigidos por la Universidad San Buenaventura para optar por el título de Ingeniero Agroindustrial.
Mcs. RAUL CUERVO MULET
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DEDICATORIA
A nuestros padres y hermanos que con su apoyo y amor incondicional nos dieron la fuerza para continuar y no desfallecer en momentos difíciles.
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AGRADECIMIENTOS
A nuestros padres por cada día que nos regalaron de sus vidas y por hacernos mejores personas.
A nuestros maestros que con su paciencia nos trasmitieron todos sus conocimientos, llenándonos de sabiduría y preparándonos para el futuro.
Y para nuestros amigos incondicionales, por acompañarnos en este camino hasta lograr el éxito.
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TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. GLOSARIO 12 2. INTRODUCCION 15 3. JUSTIFICACION 16 4. ANTECEDENTES 18 5. PROBLEMA 21 6. OBJETIVOS 22 6.1. OBJETIVO GENERAL 22 6.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 22 7. MARCO TEORICO 23 7.1. DESCRIPCION Y CLASIFICACION TAXONOMICA 24 7.2. VALERIANA OFFICINALIS L. 24 7.2.1. Aplicación y propiedades de la Valeriana officinalis L. 24 7.2.2. Composición del extracto crudo de Valeriana officinalis L. 25 7.2.2.1. Esteres Iridoides 25 7.2.3. Constituyentes químicos 25 7.2.3.1. Aceites esenciales 25 7.2.3.2. Alcaloides 28 7.2.3.3. Irinoides 29 8. HELICOBACTER PYLORI 30 8.1. TIPOS DE GASTRITIS 32 8.1.1. Aguda 32 8.1.2. Crónica 32 9. OBTENCION DE EXTRACTOS CRUDOS 33 9.1. EXTRACCION SOLIDO - LIQUIDO 38 9.2. EXTRACCION LIQUIDO - LIQUIDO 39 9.3. FILTRACION 41 9.3.1. Tipos de filtros 41 9.3.1.1. Filtros de gravedad 41 9.3.1.2. Filtros de vacío 42 9.3.1.3. Filtros de presión 43 9.3.1.4. Filtros centrífugos 43 10. METODOS TRADICIONALES DE LIQUIDO-LIQUIDO Y SOLIDO-
LIQUIDO 44
10.1. EXTRACTOR SOXHLET 44 10.2. EXTRACCION POR AGITACION CON ULTRASONIDOS
(SONICACION) 47
11. DETERMINACION DE HELICOBACTER PYLORI POR PRUEBAS BIOQUIMICAS
49
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11.1. PRUEBAS BIOQUIMICAS 49 11.1.1. Coloración de Gram 49 11.1.2. Esporas 49 11.1.3. Cápsula 50 11.1.4. Mc conkey 50 11.1.5. TSI 50 11.1.6. Lisina descarboxilasa 51 11.1.7. Citrato de Simmons 51 11.1.8. MRVP 52 11.1.8.1. Reacción rojo de metilo 52 11.1.8.2. Ensayo de Voges Proskauer 52 11.1.9. Caldo nitrato 52 11.1.10. Agar gelatina 52 11.1.11. Agar almidón 53 12. METODOLOGIA 54 12.1. MATERIAL BIOLOGICO 54 12.2. LUGAR DE TRABAJO 54 12.3. METODOS 54 13. CRECIMIENTO BACTERIA HELICOBACTER PYLORI 56 14. PRUEBAS BIOQUIMICAS 57 14.1. COLORACION DE GRAM 57 14.2. ESPORAS 57 14.3. CÁPSULA 57 14.4. MC CONKEY 58 14.5. TSI 58 14.6. LISISNA DESCARBOXILASA 59 14.7. CITRATO DE SIMMONS 59 14.8. CALDO MRVP 60 14.8.1. Reacción rojo de metilo 60 14.8.2. Ensayo de Voges Prouskauer 60 14.9. CALDO NITARTO 61 14.10. AGAR GELATINA 61 14.11. AGAR ALMIDON 62 15. ESTERILIZACION DE TODOS LOS MEDIOS 63 16. PREPARACION DE EXTRACCTOS CRUDOS POR FILTRACION
AL VACION 60
16.1. PREPARACION DE AGAR NUTRITIVO CON EXTRACTO DE VALERIANA OFFICINALIS L. ( BEJUCO) Y HELICOBACTER PYLORI
64
16.2. DISEÑOS ESTADISTICO 65 17. RESULTADOS 67 17.1. CRECIMIENTO DE LA BACTERIA 67
8
17.2. CORROBORACION DEL CRECIMIENTO DE HELICOBACTER PYLORI
67
18. RESULTADOS DE LOS DISEÑOS ESTADISTICOS 70
19. CONCLUSIONES 20. RECOMENDACIONES 21. BIBLIOGRAFIA
73 74 75
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LISTA DE TABLAS Pág.
Tabla 1. Principales solventes aromáticos. 33
Tabla 2. Principales solventes de acetato 34
Tabla 3. Principales solventes de cetona. 35
Tabla 4. 36
Tabla 5. Principales solventes alifáticos 37
Tabla 6. Pruebas Bioquímicas para H. pylori. 68
Tabla 7. Pruebas Bioquímicas realizadas al coco gran negativo. 71
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LISTA DE IMÁGENES Pág.
Imagen 1. Helicobacter pylori vista desde un microscopio 31
Imagen 2. Esquema de extracción antes y después 38
Imagen 3. Diagrama general de fases solida y liquida 39
Imagen 4. Extracción ideal 40
Imagen 5. Filtro prensa 43
Imagen 6. Partes principales de un sonicador 48
Imagen 7. Agar sangre con helicobacter pylori sembrado 55
Imagen 8. Pruebas bioquímicas sembradas con helicobacter pylori cepa (ATCC # 22925).
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Imagen 9. Extracción mediante filtración al vació. Equipo. Universidad de san buenaventura- Cali. Laboratorio de biología.
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Imagen 10-11. diseños estadísticos 65
Imagen 12. Crecimiento colonial de helicobacter pylori en medio agar sangre.
67
Imágenes 13-14-15. 68
Imagen 16. hongo filamentosos de color negro posible contaminante en cámara de anaerobiosis
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Imagen 17. Crecimiento en caja de Petri del contaminante ambiental, la cual pertenecía a un coco gran negativo, sin esporas y sin cápsulas.
70
Imagen 18. caja de Petri con agar y extracto de valeriana donde se muestra la ausencia del crecimiento de helicobacter pylori, comparada con agar sin extracto donde crece la bacteria
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LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructuras de los componentes principales aislados. 27 Figura 2. Estructuras principales de los valepotriatos aislados de diferentes tipos de valeriana *A/V= (CH3)2 CHCH (OAc) CO (a-Acetoxisovaleril)
28
Figura 3. Estructuras de alcaloides aislados de la valeriana officinalis. 29 Figura 4. Estructuras principales de la degradación de los productos de los valepotriatos.
30
Figura 5 42 Figura 6. Estructuras principales de la degradación de los productos de los valepotriatos.
42
Figura 7. Principios de filtración y separación centrífuga. 44 Figura 8. Partes de un extractor soxhlet 46
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1. GLOSARIO
1. Agar: Gelatina de origen vegetal marino. El medio de cultivo es un polisacárido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas rojas de los géneros Gelidium, Euchema y Gracilaria entre otros actuando como pigmento que da un color característico a cada una.
2. Agar nutritivo: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
3. Agar sangre: Combinación entre agar base (agar nutritivo) con el agregado
de 5 % de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: alfa: halos verdosos beta: halos incoloros gamma: inexistencia de halos.
4. Anaeróbico: Término técnico que significa vida sin aire (donde "aire"
usualmente es oxígeno); es opuesto a aeróbico
5. Anoxicas: Pobre en oxígeno libre; sin oxígeno libre.
6. Antófitos: Grupo taxonómico con categoría de división. Antófitos significa "plantas con flores".
7. Asa de Henle: Instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en aro o en punta.
8. Autoclave: Recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua.
9. Cámara de anaerobiosis: Cabina herméticamente cerrada de plástico, metal, fibra de vidrio o polivinilo, con un sistema de intercambio, dos puertas interna y externa y que puede llenarse de gas libre de oxígeno,
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lleva además soportes con guantes incorporados para realizar manipulación de muestras en el interior.
10. Cepa: Cconjunto de especies bacterianas que comparten, al menos, una
característica.
11. Cultivo: Método para la multiplicación de microorganismos, tales como
bacterias , hongos y parásitos, en el que se prepara un medio óptimo para
favorecer el proceso deseado.
12. Cristal violeta: Nombre dado a un grupo de compuestos químicos
empleados como indicadores de pH y colorantes.
13. Esterilización: Proceso de eliminación de toda forma de vida, incluidas las
esporas. Se utiliza para eliminar la contaminación microbiana de productos
sanitarios, formas farmacéuticas estériles, equipos de producción de formas
farmacéuticas estériles, etc.
14. Extracto: Sustancia obtenida por extracción de una parte de una materia
prima, a menudo usando un solvente como etanol o agua. Los extractos
pueden comercializarse como tinturas o en forma de polvo.
15. Fitoextracto: Tinturas madres de extractos vegetales sin dilución,
potenciando los efectos medicinales de las mismas.
16. Helicobacter Pylori: Bacteria que ataca la mucosa del epitelio estomacal
humano. Muchas úlceras y algunos tipos de gastritis se deben a infecciones
por H. pylori.
17. Inoculo: Suspensión de microorganismos vivos que se han adaptado para
reproducirse en un medio específico.
18. Lugol: Disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua
destilada. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y
antiséptico, para la desinfección de agua en emergencias y como un
reactivo para la prueba del yodo en análisis médicos y de laboratorio.
19. Monocotiledóneas: Clase de plantas fanerógamas angiospermas, con los
embriones de las semillas presentando un solo cotiledón u hoja inicial.
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20. Patógeno: Dañino, perjudicial.
21. Safranina: Colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de
Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+
y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología.
22. Siembra por estría: Técnica utilizada para el asilamiento bacteriano
23. Siembra en profundidad: Técnica utilizada para hacer recuento a partir de
diluciones. Con este método de siembra es más fácil observar reacciones
bacterianas, tales como: lipolisis, proteólisis, y fermentaciones.
24. Sulfato de cobre: Compuesto químico derivado del cobre que forma
cristales azules, solubles en agua y metanol y ligeramente solubles en
alcohol y glicerina.
25. Tinción diferencial: técnica para para diferenciar de manera más explícita
los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales,
que se componen de más de una sustancia tintórea.
26. Valeriana officinalis: Panta herbácea perenne, perteneciente a la familia
de las Valerianáceas.
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RESUMEN
Hoy en día, los extractos vegetales son muy usados para eliminar dolencias en los
seres humanos aprovechando la diversidad de flora que se encuentra en nuestro
país o más específicamente en el Valle del Cauca.
Este trabajo busca que las personas empiecen a utilizar medicinas alternativas de
origen natural y asi cuidar nuestro sistema gastrointestinal sin tener que exponerlo
a mas daños con los medicamentos de origen químico.
Inhibir Helicobacter pylori a partir de extracto vegetal de Valeriana officinalis L. es
el objetivo de este proyecto el cual consiste en realizar un diseño estadístico
donde muestre y se compruebe que el extracto vegetal de Valeriana funciona para
la inhibición del microorganismo.
Para obtener los componentes de la planta existen diferentes métodos, para este
se utilizaron métodos tales como la extracción liquido-liquido y solido-liquido ya
que los componentes necesarios se encuentran en el citoplasma de la célula.
Este proyecto arrojo resultados positivos, donde mostro que el extracto vegetal de
Valeriana officinalis L. inhibe Helicobater pylori a unas condiciones de temperatura
de 37,6 ° C por un periodo de 8 días.
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ABSTRACT
Today, the plant extracts are very used to eliminate ailments in humans taking
advantage of the diversity of flora that is found in our country, or more specifically
in the Valle del Cauca.
This work seeks to ensure that the people begin to use alternative medicines of
natural origin and thus take care of our gastrointestinal system without having to
expose them to more damage with medicines of chemical origin.
Inhibit Helicobacter pylori from plant extract of Valeriana officinalis L. is the
objective of this project which consists of doing a statistical design where showing
and verify that the plant extract of Valerian works for the inhibition of the micro-
organism.
To obtain the components of the plant there are different methods for this were
used methods such as liquid-liquid extraction and solid-liquid already that the
necessary components are in the cytoplasm of the cell.
This project has yielded positive results, which showed that the plant extract of
Valeriana officinalis L. inhibits Helicobacter pylori to conditions of temperature of
37.6 °C for a period of 8 days.
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2. INTRODUCCION
Latinoamérica tiene una prevalencia de Helicobacter pylori que oscila entre el 80%
y el 90%, asociada generalmente con condiciones sanitarias e higiénicas
deficientes. Se ha demostrado que en Colombia, de cada 100 pacientes con
diagnostico de gastritis, entre un 70% y 80% es por causa de Helicobacter pylori, y
entre un 20% y 30% reinciden en la infección después del tratamiento, que,
generalmente, esta basado en el suministro de tres antibióticos: omeprazol,
eritromicina y metronidazol.
Valeriana officinalis L., comúnmente llamada valeriana común, valeriana de las boticas o valeriana medicinal, es una herbácea perenne, perteneciente a la familia de las Valerianáceas.
Nativa de Europa y algunas partes de Asia, ha sido introducida en América del Norte. Es bastante común en los bosques húmedos y al borde de corrientes de agua, desde las llanuras hasta las zonas submontañosas.
En farmacología y fitoterapia se utilizan los órganos subterráneos (rizomas, raíces y estolones) o habitualmente sus fitoextractos.1
Debido a esta problemática es necesario realizar estudios científicos que corroboren dichas causas tales como: desórdenes alimenticios, aguas contaminadas, estrés, consumo de alcohol y cigarrillo, pero siendo la principal y con mas desconocimiento en la sociedad, Helicobacter pylori y de esta forma encontrar la manera de controlar la bacteria
En este proyecto se pretende la obtención de extractos crudos de Valeriana officinalis L a partir del bejuco para la inhibición de Helicobacter pylori. La gastritis causada por esta bacteria es un problema que afecta a más del 60% de la población mundial, y del 80% de la población Colombiana. Es por esto, que al percibir que muchos medicamentos comerciales comunes no surge mayor efecto en las personas, o tornándose resistentes a estas, se quiere a partir de extractos crudos de plantas, en este caso la nombrada anteriormente se pretende realizar uno inhiba Helicobacter pylori, de forma natural.
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3. JUSTIFICACION
Desde épocas remotas, se han conocido las propiedades medicinales de las
plantas, llegándose a convertir hoy en día en uno de los sectores de mayor
importancia en la industria de la farmacología. Estas plantas se utilizan tanto para
la producción de drogas como para la medicina alternativa siendo de interés para
los investigadores como para el sector productivo.
Un ejemplo de esto es el (Tríbulos terrestres) produce una disminución de la síntesis de prostaglandinas inhibiendo la actividad de la ciclooxigenasa 2 (COX2) en más del 80%.
Estudios han demostrado que el principal principio activo del Tríbulus terrestris –la Pro-todioscina- es un precursor de la Dehidroepiandrosterona (DHEA), hormona que, a su vez, es precursora de la síntesis de Testosterona y Estrógenos.
Tríbulus terrestris ofrece otros interesantes efectos terapéuticos: mejora la perfusión del músculo cardíaco, disminuye los niveles de colesterol, tiene leve efecto diurético y evita la litiasis de las vías urinarias.2
Una de las enfermedades de mayor prevalencia en el hombre a nivel mundial es la gastritis (65%) , la cual cuando no es tratada a tiempo puede convertirse en un problema mayor que puede llevar a la muerte del individuo en forma de ulcera gástrica profusa. Esta enfermedad esta influenciada por los hábitos alimenticios, estrés, enfermedades del sistema inmunológico, entre otras, lo cual hace difícil su tratamiento y control.
Helicobacter pylori bacteria gram (-) causante y responsable principal de la gastritis crónica en algunos casos severa, fermentadora encontrada habitualmente en el intestino, el cual es tratada hoy en día con antibióticos muy fuertes que causan descompensación en la flora microbiana nativa del intestino, trayendo como consecuencia problemas digestivos, de absorción de nutrientes, entre otros, generalmente después de un tratamiento prolongado con estos tipos de antibióticos.
En este proyecto se pretende hacer uso de una planta nativa (Valeriana officinalis) para tratar y evitar así cualquier tipo de molestias o dolencia intestinal en el ser humano sin alterar su normal función o su flora intestinal, solo atacar la bacteria; en este caso, la planta a utilizar será Valeriana officinalis L, que aun no han sido totalmente experimentada para el tratamiento de la gastritis, teniendo en cuenta sus propiedades y composición para controlar espasmos intestinales ( como dice en la literatura encontrada y darle un valor agregado a plantas que consideramos maleza como lo es la elegida en este proyecto). Con esto obtener un mayor provecho de manera agroindustrial, realizando su transformación en varias etapas
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hasta obtener un extracto crudo para la inhibición de Helicobacter Pylori, principal generador de la gastritis.
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4. ANTECEDENTES
Existen numerosas especies vegetales que han sido utilizada para el control de la gastritis, sin embargo, el tipo de planta y la cantidad de sus principios activos varían de especie en especie, siendo la planta Valeriana officinalis L. ( bejuco) una de las más usadas para el tratamiento de dolencias intestinales, siendo posiblemente efectiva para el control de la gastritis..
Esta planta fue utilizada antiguamente por los griegos y hasta el siglo XVI en el tratamiento de problemas digestivos como la flatulencia y náuseas. Además se utilizó como diurético y para propiciar el descenso de las menstruaciones.
En el siglo XVIII fue utilizada por los herbalistas para diversos trastornos nerviosos. Durante el siglo XIX fue especialmente popular en el tratamiento de la menopausia y en las crisis de pánico.3
“Valeriana officinalis, se utiliza desde hace algún tiempo en Europa y se ha popularizado en los EE.UU para el tratamiento de la ansiedad y el insomnio”, siendo la ansiedad junto el estrés el responsable del 20%, mientras que el 80% restante es causado por Helicobacter pylori siendo el mas importante en la aparición de la gastritis.
Se han realizado algunos estudios para atacar la gastritis con diferentes tipos de extractos crudos a partir de plantas, uno de los reportes más interesantes mencionados es el de el extracto de Brassica oleracea demostró que posee efecto antibacteriano contra el Helicobacter pylori.”4
Otro caso puntual a destacar fue el realizado Buenos Aires Argentina en el año (2009) para verificar la inhibición del Helicobacter pylori con la planta Maytenus Ilicifolia de comprobada actividad antiácida y anti gástrica ; para este se hizo un screening in vitro sobre 40 sepas de Helicobacter pylori, muchas de ellas resistentes a antibióticos (por ejemplo claritromicina resistentes), con la muy grata sorpresa de descubrir una inhibición de crecimientos en discos de agar entre 70 y 95 % en la casi totalidad de las cepas probadas.5
“Según Romero et al. (2007), se han venido utilizando desde hace miles de años, extractos vegetales y aceites esenciales con actividad antibacteriana. En algunos alimentos, también se ha demostrado la existencia de actividad inhibitoria contra el crecimiento in vitro de Helicobacter pylori, como por ejemplo en el vino tinto, los brotes de guisantes, el té verde y el zumo de arándanos entre otros. En la mayoría de los casos, esta actividad antibacteriana ha estado asociada al contenido de compuestos fenólicos y, en particular, a los flavonoides, como el resveratrol y los taninos hidrolizables. Aunque el mecanismo por el que
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los compuestos fenólicos afectan al crecimiento de Helicobacter pylori es aún desconocido, se proponen diferentes teorías:
que inhibe la actividad ureasa
que se adhiere al mucus gástrico humano
por desintegración de la membrana externa
por inhibición de la actividad de la citotoxina VacA que causa el desarrollo de inflamaciones y úlceras en pacientes.
Sin embargo, otros estudios in vitro con productos como el ajo, el extracto de canela, el brócoli y el zumo de arándanos arrojaron negativo en la erradicación de la infección producida por Helicobacer pylori. No obstante, siendo conscientes de estos resultados, los investigadores recomiendan el consumo de estos alimentos como agentes preventivos o bien, en combinación con antibióticos, para erradicar la infección bacteriana (Romero et al., 2007).
En el estudio de Romero et al. (2007) se analizaron los efectos de los distintos compuestos del aceite de oliva virgen sobre tres cepas de Helicobacter pylori procedentes de colecciones de cultivos, así como otras cinco cepas procedentes de aislamientos de origen clínico. Los investigadores detectaron una elevada actividad bacteriana in vitro frente a Helicobacter pylori. En concreto, se ha demostrado que los compuestos fenólicos del aceite que pasan al jugo gástrico simulado in vitro, son las sustancias responsables de la fuerte actividad frente a Helicobacter pylori, en particular la forma dialdehídica de la aglucona de ligustrósido (Ty-EDA), presente en la mayoría de aceites de oliva vírgenes en concentraciones superiores a 240 mg/mL, junto con otro, la forma dialdehídica de la aglucona de oleuropeína (Hy-EDA). Ambos han sido identificados como los principales compuestos con actividad anti Helicobacter pylori en el aceite de oliva virgen.
No obstante, en las condiciones in vitro de incubación establecida para simular su comportamiento en los jugos gástricos (4 h de incubación a 37º C) estos compuestos permanecían estables. Esto demuestra que dichos compuestos fenólicos resisten las condiciones ácidas del estómago, con PH 2 y pepsina, por lo que podrían ejercer este efecto bactericida in situ. Este aspecto es importante ya que el hábitat que ocupa Helicobacter pylori se encuentra por debajo del mucus adherido a la mucosa gástrica, lo que dificulta la acción bactericida.
En dicho estudio, también se ha determinado que la concentración necesaria para eliminar al Helicobacter pylori mediante compuestos fenólicos procedentes de otros alimentos, es mucho mayor que la cantidad encontrada para Ty-EDA. En concreto, se ha visto que son necesarias bajas concentraciones de Ty-EDA (<1,5 mg/mL) para eliminar las células de Helicobacter pylori in vitro.
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Aunque la concentración requerida de los antibióticos claritromicina y amoxicilina para eliminar a la bacteria es menor que la determinada para los compuestos fenólicos, el aceite de oliva no se trata de una medicina y por ello puede aconsejarse su ingesta como medida preventiva o bien, junto con estos antibióticos.”
En un estudio anterior de Medina et al. (2006) descubrieron la elevada actividad antimicrobiana de los polifenoles del aceite de oliva frente a un amplio espectro de patógenos transmitidos a través de los alimentos, como por ejemplo Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Shigella sonnei y Salmonella enterica entre otros; por lo que estos expertos sospecharon que la misma actividad podría existir contra Helicobacter pylori. Anteriores estudios habían demostrado que el consumo de aceite de oliva ayuda a disminuir la secreción de ácidos en el tracto gastrointestinal y estaba también asociado con la reducción de úlceras pépticas; pero nunca se había relacionado con una acción bactericida contra Helicobacter pylori.6
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5. PROBLEMA
¿Es posible a partir de extracto crudo obtenido de la planta (Valeriana officinalis L.) la inhibición de (Helicobacter pylori) cepa ATCC # 22925 generador de la gastritis?
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6. OBJETIVOS
6.1. OBJETIVO GENERAL
Obtener un extracto crudo a partir de la planta (Valeriana officinalis L.) para inhibir Helicobacter pylori cepa ATCC # 22925 generador de la gastritis
6.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Obtener y replicar las cepas puras de Helicobacter pylori cepa ATCC # 22925, ubicadas en el cepario del Centro Cancerológico del Valle del Cauca.
Obtener el material vegetal (Valeriana officinalis L.) para la obtención de los extractos biológicos.
Implementar un procedimiento experimental que permita determinar las propiedades inhibitorias del extracto de valeriana officinalis L. sembrando Helicobacter pylori.
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7. MARCO TEORICO
Desde hace mucho tiempo la humanidad viene sufriendo de diversas molestias y males, que afectan de manera trascendental nuestro comportamiento con el entorno y nuestra calidad de vida, entre estas se encuentra una de las mas conocida la gastritis. Tratada con miles de medicamento tanto farmacológicos como medicinales (medicina alternativa), diversas plantas entre estas la Valeriana oficinales, donde solo de ella se sabe que es una planta muy utilizada para el control de espasmos intestinales, teniendo en cuenta su composición y comparándola con diversos fármacos se encontró que posee propiedades que estos contienen y que puede ser un referente para producir algún extracto para el objetivo que se esta buscando.
En Colombia, el porcentaje que padece este mal es aproximadamente del 80%, llegando a convertir esta enfermedad en una preocupación tanto para los médicos como para las personas que la padecen.
Existen varios medicamentos para este mal, pero algunas personas no tienen como adquirir estos medicamentos o sencillamente no les gusta por su sabor, olor, su apariencia lo hace desagradable o es difícil de ingerir.
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7.1. DESCRIPCIÓN Y CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.
7.2. Valeriana officinalis L.
Nombre científico, Valeriana officinalis L., comúnmente conocida como Valeriana de la división de los antófitos, clase monocotiledoneas, del orden de los rubiales y de la familia de las Valerianáceas. Es una planta perenne de 1-2m de altura, de tallo erguido. Hojas de color verde claro, opuestas; pennadas y dentadas. Las flores pequeñas, pueden ser rosadas o blancas y se agrupan formando inflorescencia en umbela: Fruto en aquenio ovalado. Su raíz vertical, rizomas.
7.2.1. Aplicaciones y propiedades Valeriana officinalis L.
La valeriana es una de las plantas medicinales más importantes que se conocen para el tratamiento de las afecciones nerviosas; estos usos podrían remontarse a épocas anteriores a la Edad Media. Su nombre en latín valere que significa "estar bien", es indicativo del aprecio que se le daba a esta planta desde el punto de vista terapéutico. La raíz, que es la parte más activa de la planta, contiene un aceite esencial (hasta 1%) rico en taninos, alcaloides, jugos amargos, ésteres de ácidos orgánicos, valérico, isovalérico, pineno y canfeno. Algunas de estas sustancias tienen una eficacia muy relevante en el tratamiento del sistema nervioso. Los remedios (cambiar palabra) a base de valeriana son de gran utilidad utilizándolos como calmantes, sedantes y para tratar Insomnio, asma, calmar los nervios, espasmos estomacales, calambres y trastornos cardíacos o digestivos de origen nervioso.
Además de su propiedad terapéutica principal contra las afecciones nerviosas, una infusión o maceración en frío de valeriana también posee virtudes antiparasitarias, La valeriana se suele preparar en infusión, maceración, y tintura o extracto fluido.7
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7.2.2. Composición del extracto crudo de Valeriana officinalis L.
En la composición del extracto de Valeriana se encuentra un número complejo de componentes, entre los cuales tenemos:
7.2.2.1. Esteres iridoides
Valepotriatos o valtratos, baldrinal. Aceite esencial: contiene entre un 0,5 y un 1,5%. Es bastante complejo conteniendo hidrocarburos monoterpénicos y sesquiterpénicos como el alfa pineno, fencheno, camfeno, beta pineno, limoneno, beta bisabolol, alfa curcumeno, valleno, y el criofielno. También encontramos cetonas, ácido hesperético también llamado isoferúlico, aldehídos, alcoholes y ésteres terpénicos como valeranona y valerenona, isovalerianato de bornilo y valerenal. El aceite esencial se encuentra en mayor concentración en las raíces secundarias que en la principal. Alcaloides: se encuentran entre un 0,05 y un 0,1%.
Caben destacar los siguientes: actinidina, isovaleramida, valerina, valerianina, chatinina, y pirril-alfa-metilcetona. Cuando está seca se forma el ácido isovaleriánico que es el responsable de su característico olor.8
7.2.3. Constituyentes químicos
Las investigaciones químicas de la familia de las Valerianaceae están concentradas sobre los dos grupos mayores de constituyentes, los serquiterpenos y los iridoides.
7.2.3.1. Aceites esenciales Aceite esencial volátil (0.5-1%) compuesto por:
monoterpenos (canfeno)
sesquiterpenos (azuleno, beta-cariofileno)
monoterpenoles (borneol, geraniol )
esteres terpenicos (acetato, butirato, formiato e isovalerianato de bornilo), estos últimos son considerados los principales constituyentes de este aceite esencial.
Sesquiterpenonas como (valerenal, valeranona, faurinol)
Sesquiterpenos ácidos como, (ácido valerianico, ácido valerenico, ácido valerico, ácido isovalerenico y ácido acetoxivalerenico).
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El Ester del ácido valeriánico se saponifica al desecarse la planta transformándose en ácido isovalerianico, confiriéndole el particular aroma fuerte de la planta, luego de ser arrancada la raíz.
Iridoides (0.5 y 2 %) conocidos como; Valepotriatos (isovaltratos, homovaltratos, dihidrovaltrato, valeclorina y otros)
Alcaloides (0.01-0.05%): como (valerianina, chatinina, alfa, metil pirrolilcetona, actinidina, y naftiridilmetilicetona)
Lignanos: como (hidroxipinoresinol) Se trata de sustancias líquidas, aromáticas y volátiles situadas en cualquier parte del vegetal, (cavidades, células, pelos o canales secretores) conformadas por un grupo heterogéneo de sustancias orgánicas (alcoholes, aldehídos, ésteres, cetonas.). Su margen terapéutico es corto sin embargo algunos de estos atraviesan la barrera hematoencefálica actuando directamente sobre el sistema nervioso central. Las esencias pueden ser producidas por tejidos, anexos secretorios, mientras que en otros casos se encuentran como enlace glucosídico en el interior de la planta como ocurre con la Valeriana, en la que sólo aparece el aroma al secarse la raíz y no en estado fresco. El aceite consiste de una mezcla de monoterpenos y derivados de sesquiterpenos. El primer tipo de los constituyentes del aceite volátil que fue aislado fueron los kesanos (2) del japonés Valeriana Officinalis, variedad latifolia; los compuestos más importantes fueron aquellos que estaban libres de los grupos esterificados de hidróxidos sobre diferentes carbonos:
alcoholes kessilicos (2a-2c) y sus correspondientes acetatos (2d-2f). Stoll et al investigó la composición de la Valeriana officinalis Europea aislando e identificando 12 monoterpenos y 17 sesquiterpenos.
Las estructuras de los componentes principales aislados se muestran en la Figura 1. Los constituyentes presentes en grandes cantidades fueron el acetato de bornil (3) y el isovalerato (3a). Otros sesquiterpenos incluyeron el ácido valerico (4), el ácido hidroxivalerico (4a), el ácido aectoxivalerico (4b), valerenal (4c), valetanona (5) y elemol (6).
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Figura 1: Estructuras de los componentes principales aislados.
Fuente:http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S025329482003000200007&script=s abstract
Por lo tanto los sesquiterpenos mayores presentes en la especie de la Valeriana son de tres tipos de estructuras basados en los esqueletos del Kessano, valeranona y el ácido valerico. La razón entre estos compuestos varía considerablemente dentro de la misma especie; se encontraron en la misma área tres razas químicas caracterizadas principalmente por la presencia o ausencia del alcohol kessilico (2a) y por variación de las cantidades de valerenol (4c), la valeranona (5) y elemol (6). Trabajos similares muestran que tales variaciones fueron independientes de las diferencias morfológicas de las plantas examinadas. Hansel y Schultz investigaron el contenido de los ácidos valerenicos y encontraron que estos compuestos estaban presentes solamente en la Valeriana officinalis s.1 La falta de correlación entre los contenidos del aceite volátil y la actividad biológica estimularon la investigación para encontrar otros constituyentes. En los años sesentas, mientras estudiaba la Valeriana wallichii, Thies, aisló tres iridoides no glicosidatados llamados valtrato 87), 1-acevaltrato (7a), dihidrovaltrato (8) y les dio el termino general de “valepotriatos”,
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Figura 2: Estructuras principales de los valepotriatos aislados de diferentes tipos de valeriana
*A/V= (CH3)2 CHCH (OAc) CO (a-Acetoxisovaleril)
Fuente:http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S025329482003000200007&script=s abstract
El descubrimiento de estos compuestos considerados inmediatamente después en ese tiempo como los principios activos, estimuló la investigación de otras valerianáceas, incluyendo por supuesto Valeriana officinalis. Se han encontrado varios valepotriatos subsecuentemente. Las variaciones entre los diferentes valepotriatos se debe a diferencias que sustituyen tres ácidos que esterifican los grupos hidróxidos de la parte terpenica, el número doble de uniones, la presencia o ausencia del grupo epóxido y la presencia o ausencia de unidades de azúcar.
Los valepotriatos se emplean en algunos países, sobre todo en Alemania, como ansiolíticos y antidepresores. Aunque se destruyen por la acidez gástrica, sus productos de degradación (baldrinal y derivados) conservan cierta actividad. No se puede atribuir la actividad de los preparados de valeriana a estos principios ya que, como se comentó anteriormente, la mayor parte de las preparaciones de valeriana no contienen valepotriatos o únicamente trazas de los mismos.9
7.2.3.2. Alcaloides
Torsell et al aisló dos alcaloides de la Valeriana officinalis en las cantidades de 0.015% y 0.001% Figura 3 (12) (12a) la estructura de anillo de los compuestos muestra a uno de los iridoides presentes en la planta. Un compuesto similar, la valeranina (13) fue aislado en 1970 lo mismo que la conocida alcaloide actinidina (13a), que tiene una actividad excitante interesante; se encontró que estos alcaloides eran inhibidores de colinesterasa potentes en vitro, pero la actividad
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tiene que ser verificada en vivo. Una revisión completa de este trabajo ha sido proporcionada por Houghton. Figura 3: Estructuras de alcaloides aislados de la valeriana officinalis.
Fuente:http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S025329482003000200007&script=s abstract
7.2.3.3. Irinoides Su importancia desde el punto de vista farmacológico, esta basado en el desempeño como marcadores quimiotaxonómicos. Entre las principales especies destaca la Valeriana con abundante presencia de valepotriatos en raíz y rizoma. Gracias a este conocimiento de sus activos se puede aseverar que la valeriana presenta una comprobada acción hipnosedante. El contenido de valepotriatos varia grandemente entre las especies hasta 14% en las raíces frescas de Valeriana thalictroides hasta 1.2% en la Valeriana officinalis. Las partes subterráneas normalmente contienen la cantidad más alta de valepotriatos, pero se encuentran cantidades pequeñas en la parte aérea de la planta. Muchos de los compuestos relacionados con el valepotriato descritos en Los últimos 20 años pueden ser artefactos, ya que estas sustancias son altamente inestables en solventes y se degradan rápidamente por ácidos o bases. Las estructuras de tres productos de la degradación baldrinal (10), homobaldrinal (10b) y valtroxal (11) se muestra en la Figura 4. Varios métodos se estudiaron para aislar los valepotriatos intactos, incluyendo el uso de fluidos supercríticos (CO2) Más aún la falta de respuestas seguras
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biológicas en la sedación y el encuentro de toxicidad celular redujo la importancia de esta clase de compuestos en los últimos diez años.10
Figura 4: Estructuras principales de la degradación de los productos de los valepotriatos.
Fuente:http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S025329482003000200007&script=s abstract
8. HELICOBACTER PYLORI Los miembros del género Helicobacter, descrito en 1989, colonizan el estómago e intestino de humanos y algunas especies animales. El número de especies en este género se ha expandido desde 1983, cuando se describió Helicobacter pylori. El género incluye más de 20 especies. En humanos, descrita en 1983, es reconocida como la principal causa de gastritis crónica, úlceras gástricas y duodenales y algunos tipos de cáncer gástrico.
Helicobacter spp. Son bacilos Gram negativos, catalasa, oxidasa y ureasa positivos, miden de 2,5 a 3,5 mm de largo por 0,5 a 1 mm de diámetro, son microaerofílicos, curvados o espirilares con uno a varios flagelos envainados polares, localizados en uno de los extremos de la bacteria y al menos tres especies tienen fibras periplásmicas.
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Imagen 1: HELICOBACTER PYLORI VISTA DESDE UN MICROSCOPIO
Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Helicobacter_pylori
Los estudios epidemiológicos revelan que la infección con Helicobacter pylori es más común en países en desarrollo que en los desarrollados, debido a muchos factores del ambiente como hacinamiento, disponibilidad de agua potable, nivel económico, contaminación fecal y otros factores del hospedero y del agente como la edad. Aunque este agente es sensible a muchos antimicrobianos in vitro, es difícil de erradicar del estómago, debido a su nicho ácido y su localización extracelular, pues reside en la capa de muco del estómago y desarrolla resistencia a los antibióticos que usualmente se utilizan en su tratamiento, especialmente el metronidazol, una droga supresora de la secreción ácida. Estos hechos inducen a buscar nuevas terapias y la entomedicina representa un vasto campo milenario de conocimiento, en el cual la búsqueda de extractos de plantas con acciones antibacterianas ha ganado nuevo ímpetu.11
Helicobacter Pylori también puede estimular el estómago para que produzca más ácido. Las causas que llevan a que ciertas personas desarrollen úlceras o síntomas relacionados de infección por Helicobacter Pylori aún no se conocen
Después de infectarse con Helicobacter Pylori, la mayoría de las personas desarrolla gastritis, lo cual consiste en una inflamación del revestimiento del estómago. Sin embargo, la mayoría de las personas nunca tienen síntomas o problemas relacionados con la infección.12
Los investigadores todavía no conocen las causas que llevan a que ciertas personas desarrollen úlceras o síntomas relacionados con el Helicobacter pylori.13
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8.1. Tipos de gastritis
Los principales tipos de gastritis son:
8.1.1. Aguda
Tienen un inicio relativamente rápido, poco tiempo de evolución, presenta la mayoría de los síntomas arriba descritos, se calma con los alimentos y por lo general es curable, aunque se presentan frecuentes recaídas.
8.1.2. Crónica
Es más duradera y tiene muy pocos síntomas, que por lo general pasan desapercibidos. Este tipo de gastritis no se cura a menos que se modifiquen los hábitos de vida y se respete el tratamiento.
De no tratarse una gastritis a tiempo esta puede complicarse, por ejemplo, una aguda puede hacerse crónica, mientras que la crónica puede transformarse en un proceso que se llama "metaplasia intestinal" y terminar en un cáncer de estómago.
El cáncer gástrico y el linfoma de MALT (linfoma de la mucosa asociada al tejido linfoide) han sido relacionados con H. pylori, por lo que esta bacteria ha sido clasificada dentro del grupo I de carcinógenos por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer. Mientras que la asociación de estas enfermedades con Helicobacter pylori está apoyada por sospechas razonables, no está totalmente claro que haya una relación causal involucrada.14-15
Los antiácidos de venta sin receta, como magnesium hydroxide (Phillips’ Milk of Magnesia®), aluminum hydroxide (Amphojel®), calcium carbonate (Tums®) y la combinación magnesium-aluminum hydroxide (Mylanta®, Maalox®), ayudan a aliviar los síntomas de la gastritis. Los antagonistas de los receptores H2 de histamina, como cimetidine (Tagamet®), ranitidine (Zantac®) y famotidine (Pepcid®), también son útiles.
El tratamiento con medicamentos de venta con receta puede incluir antibióticos para eliminar la infección por Helicobacter pylori, como amoxicillin (Amoxil®), clarithromycin (Biaxin®), metronidazole (Flagyl®) y tetracycline (Sumycin®), en combinación con inhibidores de la bomba de protones como lansoprazole (Prevacid®) y omeprazole (Prilosec®). También puede emplearse bismuth subsalicylate (Pepto Bismol®).16
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9. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS.
Para la obtención de extractos es necesario realizar dicho procedimiento con
algún tipo de solvente, como por ejemplo:
Tabla 1: Principales solventes aromáticos.
Aromáticos
Solvente
Características
Usos y aplicaciones
Tolueno
Llamado también metilbenceno, líquido de olor parecido al benceno, incoloro e inflamable; es un componente importante en el alquitrán de hulla, se obtiene en el racionamiento del petróleo.
Se utiliza para elevar el octanaje de gasolina (gas avión); para la producción de benceno y fenol como solvente para la elaboración de pinturas, resinas, recubrimientos, gomas, detergentes, químicos (ácido benzoico), perfumes, medicinas, sacarinas, etc.
Xileno
Dimetilbenzol tiene tres isómeros (orto, meta y para; líquido inflamable de olor semejante al del benceno incoloro; se encuentra en el alquitrán de hulla. Se utiliza como disolvente u como diluyente.
Sus usos principales son: solventes para resinas, lacas, esmaltes, caucho, tintas, cuero, gasolina para aviación, agente desengrasante, producción de resinas epóxicas, elaboración de perfumes, producción de insecticidas y repelentes.
Fuente: http://www.quiminet.com/ar2/ar_vcdvcdadddsaarm-tipos-de-solventes-y-sus-aplicaciones.htm
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Tabla 2: Principales solventes de acetato
Acetatos
Solvente
Características
Usos y aplicaciones
Acetato de
Acetilo
Líquido incoloro, fácilmente inflamable, hierve a 74-77˚C, se obtiene por destilación del alcohol con ácido acético.
Se recomienda su uso en laboratorios de fármacos. Se ocupa para la extracción liquida de antibióticos, en la industria de pinturas se ocupa como solvente activo para disolver las resinas sintéticas ocupadas en la formulación de estas. Otros usos son en la industria de fragancias, tintas, saborizantes, etc.
Acetato de
Butilo
Líquido incoloro, fácilmente inflamable, hierve a 126.5˚C.
Se recomienda como disolvente y para aumentar el número de octanos.
Fuente: http://www.quiminet.com/ar2/ar_vcdvcdadddsaarm-tipos-de-solventes-y-sus-aplicaciones.htm
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Tabla 3: Principales solventes de cetona.
Cetonas
solvente
Características
Usos y aplicaciones
Acetona
Liquido aromático, incoloro, inflamable, es la cetona más sencilla, importante como solvente y medio de extracción.
Se emplea principalmente como disolvente en la fabricación de acetato de celulosa, pinturas, lacas y adhesivos, colorantes de la serie de la difenilamina, isopreno, piel artificial, mezclas adhesivas de nitrocelulosa, lubricantes, perfumes, productos farmacéuticos, plásticos, cementos ahulados, extracción de grasas y aceites, tónicos, purificación de parafinas, etc.
Metil Isobutil
Cetona
Líquido incoloro, inflamable y tóxico de olor parecido al de la acetona y el alcanfor. Es parcialmente soluble al agua, miscible en alcohol.
Se emplea en síntesis orgánicas, solventes de gomas, resinas, lacas de nitrocelulosa, producción de recubrimientos y adhesivos.
Metil Etil Cetona
Olor parecido a la menta (fragante y moderadamente penetrante), líquido incoloro, brillante, muy volátil y altamente inflamable, insoluble en agua.
Es utilizado en la producción de disolventes para revestimiento, adhesivo, cintas magnéticas, separación de la cera de los aceites lubricantes, tintas de imprenta, cuero sintético, papel transparente, papel aluminio, lacas, quita grasas, extracción de grasas, aceites, ceras y resinas sintéticas y naturales.
Fuente: http://www.quiminet.com/ar2/ar_vcdvcdadddsaarm-tipos-de-solventes-y-sus-aplicaciones.htm
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Tabla 4: Principales solventes de alcohol
Alcoholes
Solvente
Características
Usos y aplicaciones
Metanol
Líquido incoloro de olor característico soluble en acetona, esteres. Arde con llama débilmente luminosa y es miscible con agua en todas las proporciones.
Se usa como solvente industrial, fabricación de formol, acetato de metilo y plastificantes. Como aditivos para gasolina. Solvente en fabricación de colesterol, estreptomicina, vitaminas y hormonas, desnaturalizante para alcohol etílico. En la industria en general se usa como solvente en la fabricación de lacas, películas, plásticos, jabones, textiles, cuero artificial. En la preparación de removedores de pinturas, barniz, para soluciones anticongelantes.
Isopropanol
Líquido incoloro de olor característico al alcohol, parecido al alcohol etílico, pero más tóxico, sustituyente del alcohol en preparados de cosmética y es importante como disolvente de lacas y como conservante.
Se emplea en linimentos, lociones para la piel, tónico para el pelo, preparación en ondulados permanentes, como solventes en procesos de extracción, anticongelantes, jabones líquidos, limpiadores y adelgazadores para pinturas, en la producción de glicerol, acetato de etilo, acetona, resinas, síntesis orgánicas, etc.
Fuente: http://www.quiminet.com/ar2/ar_vcdvcdadddsaarm-tipos-de-solventes-y-sus-aplicaciones.htm
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Tabla 5: Principales solventes alifáticos
Alifáticos
Solvente
Características
Usos y aplicaciones
Gas Nafta
Líquido incoloro aromático muy poco soluble en agua.
Como solventes para pinturas y diversos usos industriales, como desmanchador en tintorerías.
Nafta
Deodorizada
Líquido incoloro aromático muy poco soluble en agua.
Como solventes para pinturas, ceras para calzado, diversos usos industriales y como principal uso, desmanchador en tintorerías de lavado en seco.
Gasolina Blanca
Líquido incoloro de olor a petróleo, insoluble en agua. .
Se emplea principalmente como solvente para esmaltes alquidalicos, asfalto, barnices y para resinas naturales. Como agente limpiador y desengrasante, es solvente para grasas y aceites. Su función principal como combustible.
Thinner Standard
Líquido incoloro de olor a petróleo, insoluble en agua.
Se emplea principalmente como adelgazador de pinturas automotrices, selladores, lacas para madera y primarios. Como limpieza y desengrasante de piezas mecánicas, limpieza de carburadores, etc.
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Fuente: http://www.quiminet.com/ar2/ar_vcdvcdadddsaarm-tipos-de-solventes-y-sus-aplicaciones.htm
40
Para la obtención de estos extractos crudos debemos conocer qué tipo de operaciones unitarias existen y cuál es la apropiada para la realización del proyecto.
Se llama operación unitaria a una parte indivisible de cualquier proceso de transformación, sea físico, químico o de naturaleza biológica, de una materia prima en otro producto de características diferentes.
Existen dos tipos de operaciones como: la extracción solido-líquida y la extracción liquido-líquido se explica cada una para diferenciar la de mayor importancia para este trabajo como es la liquido-liquido.
9.1. Extracción solido – liquido
Operación unitaria de transferencia de masa por medio de la cual se retiran uno o varios componentes valiosos de un sustrato, el cual es sólido, empleando un líquido (llamado solvente) que disuelve preferentemente a dichos componentes. Campos de aplicación de esta operación básica son, por ejemplo, la obtención de aceite de frutos oleaginosos o la lixiviación de minerales. En la práctica, al término de la extracción, la fase portadora sólida siempre contendrá todavía una parte del soluto en el sólido. Además, una parte del disolvente permanecerá también ligada de forma adsorbato a la fase portadora sólida. Imagen 2: Esquema antes y despues de extraccion
http://www.fihu-diagnostico.org.pe/revista/numeros/2003/enefeb03/23-37.html
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A una sustancia sólida, se agrega un líquido (el solvente), que disuelve uno o varios de sus componentes. Finalmente se separan dos fases:
MISCELA, líquido rico en sustancias valiosas.
SOLIDO AGOTADO o TORTA, la cual contiene una pequeña porción de sustancias valiosas y está humedecida con miscela.
Imagen 3: Diagrama general de fases solida y liquida.
http://www.fihu-diagnostico.org.pe/revista/numeros/2003/enefeb03/23-37.html
Para conseguir una extracción lo más rápida y completa posible sólido, se tiene que ofrecer al disolvente superficies de intercambio grandes y recorridos de difusión cortos. Esto se puede lograr triturando el sólido a extraer. Un tamaño de grano demasiado pequeño puede causar, por el contrario, apelmazamiento que dificulta el paso del disolvente.18
9.2. Extracción liquido – líquido
Se separa un componente de una mezcla líquida, con ayuda de un disolvente, que preferentemente lo disuelve. Campos de aplicación son, por ejemplo, la separación de vitaminas de soluciones acuosas o la separación de aromáticos de fracciones de petróleo. En el caso más sencillo participan tres componentes: El soluto A El disolvente B El líquido portador C
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El soluto A forma parte de la mezcla de partida junto con el líquido portador C (alimento). Si la mezcla de partida y el disolvente B se mezclan entre sí, el soluto A pasa al disolvente B. Ha de cumplirse la condición de que la solubilidad del componente A en el disolvente B sea mayor que la del líquido portador C. A su vez, el líquido portador C debería ser prácticamente insoluble en el disolvente B. Imagen 4: Extracción ideal
http://www.gunt.de/download/extraction_spanish.pdf
La ilustración representada como ejemplo parte del planteamiento ideal en el que el soluto A es absorbido en su totalidad por el disolvente. En realidad queda siempre un resto del soluto en el líquido portador. Además se admite la insolubilidad total del líquido portador en el disolvente. En la práctica siempre se encontrarán partes de cada una de las sustancias en la otra fase. El resultado es que en el proceso de separación real se forman dos fases después de la decantación: La fase de extracto (principalmente A y B, restos de C) La fase refino (principalmente C, restos de A y B).19
La separación mecánica de las fases se puede hacer por: 1. Filtrado 2. Escurrido 3. Soplado 4. estrujado.
43
9.3. Filtración Se entiende por filtración a la operación por la cual se separan los sólidos finamente divididos de los fluidos en cuyo seno están suspendidos, utilizando una superficie permeable a los fluidos. El fluido puede ser un líquido o un gas.
9.3.1. Tipos de filtros Para que el precipitado atraviese la torta y el medio filtrante se debe ejercer una presión que venza esa resistencia. De acuerdo a la forma de aplicar esa presión los filtros se pueden clasificar en:
9.3.1.1. Filtros de gravedad
La presión es la derivada de la carga hidrostática del líquido sobre el medio filtrante. Consiste en un depósito de doble fondo, el primero de los cuales es perforado. Sobre éste se coloca el material filtrante que es una serie de capas de arena de distinta granulometría, aumentando ésta desde arriba hacia abajo; siendo la inferior de canto rodado o pedregullo que evita la pérdida de la arena superior como lo muestra la figura 5. El líquido se desplaza por gravedad a través del material filtrante. Son de bajo rendimiento y se usan para filtrar grandes volúmenes de líquido con pocas impurezas, tal como ocurre en la producción de agua potable. Estos filtros se deben lavar periódicamente en contracorriente para desobstruir la arena. En algunos casos se utiliza carbón en lugar de arena como medio filtrante y se agregan al líquido sustancias coagulantes tales como el sulfato de aluminio que hacen que las partículas difíciles de retener por el lecho sean adsorbidas por éstas que a su vez son fácilmente retenidos por el filtro.
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Figura 5: diagrama filtro de gravedad
Fuente: http://www.directindustry.es/prod/graver-water-systems/filtros-coalescentes-agua-aceite-21726-49571.html
9.3.1.2. Filtros de vacío
La Filtración al vacío es un método físico que se utiliza para separar mezclas heterogéneas de un sólido en un solvente o mezcla de reacción líquida. La mezcla se vierte en un embudo a través de un papel filtro, el sólido de la mezcla queda en el filtro y el líquido es atraído hacia un recipiente colocado abajo, gracias al vacío que se le aplica a éste con una bomba de vacío. Lo que interesa recolectar en este tipo de filtración es el sólido cristalizado que queda en el papel filtro, el líquido filtrado se desecha (ver figura 6). El sólido se cristaliza gracias a que el efecto de vacío que causa la bomba, enfría la solución.19
Figura 6: Filtración al vacio, el embudo Büchner se coloca con la ayuda de un tapón sobre un kitasato que se conecta por su tubuladura lateral a una trompa de vacío.
Fuente: http: //www.quiminet.com/pa.htm
45
9.3.1.3. Filtros de presión
Funcionan aplicando presión sobre el líquido a filtrar. Los principales son los filtros
prensas. Pueden ser de cámaras o de placas y marcos.
Imagen 5: Filtro prensa
Fuente: http: //www.quiminet.com/pr3/Filtro%2BPrensa.htm
9.3.1.4. Filtros centrífugos
Utilizan la fuerza centrífuga para aplicar presión. Se utilizan cuando la cantidad de
sólidos es muy alta o muy chica. En el primer caso se llaman escurridores o
hidroextractores y se utilizan en la industria textil para el escurrido de las telas o en
la industria azucarera. En el segundo caso se llaman clarificadores. Pueden ser
centrífugas de eje horizontal o vertical; continuo o discontinuo.20
46
Figura 7: Principios de filtración y separación centrífuga. a) Recipiente estacionario. b) Sedimentación en recipiente giratorio no estacionario. c) Filtración en cesto giratorio perforado
Fuente:http://www.fing.uncu.edu.ar/catedras/opunitarias/archivos/separacion%20de%20fases2010.pdf
10. MÉTODOS TRADICIONALES DE EXTRACCIÓN LIQUIDO-LÍQUIDO O
SOLIDO-LIQUIDO “Existen fundamentalmente dos grupos:
extractor Shoxlet sonicación (agitación mediante ultrasonidos).
10.1. El extractor Soxhlet: El extractor de tipo Soxhlet se aplica a analitos que no se pueden separar por volatilización (en fase gas) pero sí son extraíbles empleando un disolvente orgánico adecuado. La gran ventaja del Shoxlet es la eficacia en el proceso de remojo de la fase sólida.
El esquema del instrumento es sencillo (ver figura 8):
Un matraz de base redonda que contendrá el disolvente orgánico volátil.
Un contenedor intermedio de vidrio en el cual se coloca la muestra dentro de un cartucho que está abierto en su parte superior siendo poroso al disolvente y a la posterior disolución del analito (se vende comercialmente).
Refrigerante
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El matraz es calentado con una manta calefactora hasta que el disolvente orgánico se evapora, el vapor de disolvente atraviesa el cartucho que contiene la muestra ascendiendo por el contenedor hasta el refrigerante. Cuando el vapor de disolvente llega al refrigerante este condensa y cae en forma líquida de nuevo en dirección al matraz pero, en su camino, este golpea con la muestra disolviéndola (para que esto ocurra la muestra debe estar perfectamente seca y finamente dividida).
El analito disuelto en disolvente orgánico pasa por un sifón el cual, al llenarse y desbordar, descarga sobre el matraz redondo.
Ventajas del extractor Soxhlet
El disolvente y la muestra están en contacto íntimo y repetido. De manera que se mejora muchísimo la extracción porque siempre se emplea un disolvente limpio.
El disolvente proviene de una condensación luego es líquido y está caliente. Favorece la solubilidad del analito.
No se requiere filtración posterior. El disolvente orgánico se evapora quedando sólo analito.
Gran capacidad de recuperación. Instrumentación simple.
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Figura 8: Partes de un extractor soxhlet
Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Extractor_Soxhlet
1. buzo / agitador / granallas o esferas 2. balón 3. brazo para ascenso del vapor 4. cartucho de extracción o cartucho Soxhlet 5. muestra (residuo) 6. entrada del sifón 7. descarga del sifón 8. adaptador 9. refrigerante (condensador) 10. entrada de agua de refrigeración 11. salida de agua de refrigeración
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10.2. Extracción por agitación con ultrasonidos (sonicación)
Los ultrasonidos son sonidos cuya frecuencia es inaudible para el oído humano y de magnitud muy alta. Constituye una manera barata, simple y eficaz de producir una disolución en muestras sólidas.
Las ondas sonoras son ondas de presión que se transmiten a través de un medio material, en ausencia de este es imposible su transmisión. Precisamente por ello las ondas sonoras provocan la contracción y posterior expansión del medio en el cual se propagan.
Cuando este medio es un disolvente pueden formarse burbujas o cavidades en el líquido que terminen por explotar en un proceso que se conoce como cavitación. Estas burbujas explotan violentamente produciendo un incremento local de presión y temperatura muy notable que no es perceptible en el sistema como un conjunto debido al pequeño tamaño de las burbujas. Además, estos incrementos de energía locales, provocan la formación de radicales en el disolvente (p. ej. el Hidroxilo o el peróxido de hidrógeno).
Debido al aumento de temperatura el proceso de sonicación favorece la solubilidad donde se produce la explosión de la burbuja, además, el aumento de presión produce una mejor penetración del disolvente al interior del sólido y la formación de un medio reactivo que ataque a la muestra.
En el laboratorio observamos dos familias:
Un baño de agua donde se colocan las sustancias a extraer.
Una sonda de ultrasonidos que se introduce en el matraz directamente.”21
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Imagen 6: Partes principales de un sonicador
Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Sonicator.jpg
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11. DETERMINACION DE HELICOBACTER PILORY POR PRUEBAS BIOQUIMICAS
11.1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Estas pruebas bioquímicas se realizan con el fin de corroborar y comprobar que la bacteria obtenida es Helicobacter pylori.
11.1.1. Coloración de Gram “La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.”22
11.1.2. Esporas Las esporas son relativamente resistentes a los agentes físicos y químicos y no se colorean con facilidad. En métodos de coloración de rutina como la coloración de Gram, aparecen como cuerpos retractiles no coloreados. Por lo general, métodos especiales de coloración se requiere el calor para permitir la penetración del colorante en las esporas.
La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:
Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
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Las endoesporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con
agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo
colorante.
11.1.3. Cápsula
La cápsula de las bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de las células, y por eso exige el empleo de métodos de coloraciones especiales. Algunos están destinados a colorear la célula y el fondo, pero no la capsula, de manera que la envoltura se aprecia por contraste, como el método de Anthony. Otros procedimientos producen un efecto colorante diferencial, cuando la cápsula admite un contra colorante. Otro procedimiento utiliza el principio de la coloración negativa como el método de la tina china.
11.1.4. MC CONKEY “Para la realización de las pruebas bioquímicas se comenzó con un sembrado de la bacteria en medios de cultivo agar Mc conkey, el cual es un medio diferencial que permite diferenciar las bacterias que hidrolizan lactosa de las que no lo hacen. Esta hidrolisis produce ácidos orgánicos y las colonias que forman adquieren un color rojizo.
11.1.5. TSI Medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácidos y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre
Bacterias fermentadoras de la glucosa
Bacterias fermentadoras de la lactosa
Bacterias fermentadoras de sacarosa
Bacterias aerogenicas
Bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
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11.1.6. LISINA DESCARBOXILASA
“Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.”23
11.1.7. CITRATO DE SIMMONS
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
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11.1.8. MRVP
11.1.8.1. Reacción de rojo de metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixto.
Algunos géneros bacterianos como E. coli y Edwarsiella sp son capaces de fermentar los ácidos y disminuir el PH por debajo de 4.3.
11.1.8.2. Ensayo de Voges proskauer
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
En esta prueba la acetoina es producida a partir de caldo MRVP. Es esta prueba se diferencian los géneros como klebsiella sp, Enterobacter sp y E. coli
11.1.9. CALDO NITRATO Se inocula la bacteria elegida en un caldo con nitrato, después de la incubación se determina la producción de nitrito a partir de nitrato, mediante el acido naftilamina sulfanilico. Esta reacción es típica en enterobacterias
11.1.10. AGAR GELATINA Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas Enterobacterias. La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la solidificación.
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11.1.11. AGAR ALMIDÓN
Hidrolisis del almidón
Los polisacáridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados
al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos
polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para
crecer.
La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa.
Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón
intacto forma un complejo púrpura.”24
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12. METODOLOGIA
12.1. MATERIAL BIOLÓGICO
La bacteria Helicobacter pylori cepa (ATCC # 25922) fue donada por el centro cancerológico de la Universidad del Valle.
La planta Valeriana officinalis L. fue adquirida en un almacén cadena (14 de la Pasoancho) de la ciudad de Cali (Valle del cauca).
12.2. LUGAR DE TRABAJO
Las pruebas macroscópicas de tinción diferencial (tinción de Gram; esporas y capsula) para corroborar la identificación del género y de crecimiento de Helicobacter pylori cepa (ATCC # 22925), se realizaron en el laboratorio de microbiología de la Universidad de San Buenaventura de la ciudad de Cali (Valle del Cauca), así mismo las pruebas de extracto de la planta Valeriana officinalis L. Fueron realizados en el laboratorio de química de la Universidad de San Buenaventura.
12.3. MÉTODOS
Para los diferentes cultivos realizados para la bacteria Helicobacter pylori, se utilizaron los medios descritos a continuación:
“Medio crecimiento: para el crecimiento de la bacteria se utilizó el medio sugerido por la Este medio contenía los siguientes reactivos:
Agar sangre, es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: alfa: halos verdosos beta: halos incoloros gamma: inexistencia de halos.”25
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Imagen 7: Agar sangre con Helicobacter pylori sembrado
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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13. CRECIMIENTO BACTERIA HELICOBACTER PYLORI
Debido a que la bacteria necesitaba CO2 se recurrió a diferentes métodos para proporcionarle dicho gas. La bacteria creció en un medio de cultivo específico (medio de cultivo agar sangre) y en condiciones anoxícas (medio ambiente saturado de CO2) para lo cual se realizó el siguiente procedimiento:
1. Dentro de la cámara de anaerobiosis se ubicó la bacteria sembrada por estrías en medio de cultivo agar sangre, posteriormente se eliminó el contenido de oxígeno presente al interior de la cámara y se procede a suministrar el CO2 requerido para el crecimiento bacteriano. Se debe anotar que la cámara se encontraba completamente cerrada y no se presenta flujo de aire que pudiese intervenir el experimento.
2. Una vez se determinó el crecimiento de colonias bacterianas sobre el medio
de cultivo se retiró las cajas de Petri del embase y se procedió a realizar las pruebas bioquímicas para confirmar la identificación de Helicobacter pylori (ATCC# 22925)
Esta metodología se realizó 6 veces para cada método un total de 12 repeticiones en un lapso de 96 días. En los métodos anteriormente mencionados se realizó una previa esterilización tanto a la cámara como a los elementos que se utilizaban al momento de realizar los procedimientos.
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14. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Las pruebas bioquímicas se realizarón con el fin de corroborar y comprobar que la bacteria obtenida es Helicobacter pylori (ATCC # 22925)
14.1. Coloración de Gram Se realizó un extendido con un asa de Henle adicionando una gota de agua destilada junto con el microorganismo a observar, se realizó una fijación con un mechero colocando el portaobjetos encima de la llama de este, se agregó cristal violeta tiempo de 1 minuto, se lavó con agua destilada y posteriormente se adicionó lugol por 1 minuto, se lavó con alcohol cetona y se agregó Safranina durante 1 minuto. Finalmente se lavó con agua destilada. Se lleva al microscopio y se observa en 100X
14.2. Esporas
Se inició con extendido realizado con aza de henle poniendo una gota de agua destilada sobre el portaobjetos con el microorganismo, realizando una fijación que se efectúa con papel filtro y empapándolo con verde de malaquita, se retiró el papel, se lavó con agua destilada, se agregó safranina por 1 minuto y se finalizó Lavando con agua destilada. Se llevó al microorganismo y se observó en 100X
14.3. Cápsula Se comenzó con el extendido, fijamos al aire para evitar la eliminación de la cápsula, agregamos sulfato de cobre durante 5 minutos, se lava con agua destilada y posteriormente se agrega safranina por 1 minuto. Finalmente se lava con agua destilada y se lleva al microscopio y se observa en 100X. Para la realización de las pruebas bioquímicas se comenzó con un sembrado de la bacteria en agar Mc conkey, el cual es un medio diferencial que permite distinguir las bacterias que hidrolizan lactosa de las que no lo hacen. Esta hidrolisis produce ácidos orgánicos y las colonias que forman adquieren un color rojizo.
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14.4. Mc Conkey
Se necesitó 3 cajas de petri, es decir 2 pruebas y 1 control con Agar Mc conkey; en el recipiente donde viene el Agar indica que para 50 gr de Agar se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada caja de petri se necesitan 20 ml de agua es decir 60 ml para 3 cajas, se hace una regla de 3 y para esto se necesitan 3 gr de Agar Mc conkey. Posteriormente este se llevó en un beaker de 200 ml (los 60 ml de agua destilada y los 3 gr de Agar Mc conkey), todo junto se coloca en una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para obtener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. Posteriormente se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se dosificó en las tres cajas de petri de tal forma que quedaran bien repartidos los 60 ml, se dejó solidificar bien el Agar para no tener problemas a la hora de realizar la siembra.
Esta siembra se realizó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, se tomó una muestra del microorganismo que creció en la caja de Petri del tratamiento y con el asa se realizó la siembra por estrías, se selló la caja de petri con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por un periodo de ocho (8) días.
Además se continuaron con las siguientes pruebas bioquímicas:
14.5. TSI Para esta prueba fueron necesarios 3 tubos, es decir 2 pruebas y 1 control con Agar TSI; en el envase indica que para 64,3 gr de Agar se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua, 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se necesitan 0,643 gr de Agar TSI. Posteriormente este se llevó en un beaker de 50 ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,643 de Agar TSI), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para que tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. Posteriormente se pasó a un frasco tapa azul y se llevo a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se dosificó en los 3 tubos de tal forma que queden bien repartidos los 10 ml, se dejó solidificar bien el Agar para no tener problemas a la hora de realizar la siembra.
Cuando se realizó la siembra, se hizo con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo punzando con el asa recta en profundidad y en estría en la superficie, se tapó y el tubo se selló con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por ocho (8) días.
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14.6. Lisina descarboxilasa
Para esta prueba se necesitan 3 tubos, es decir 2 pruebas y un control con Agar TSI; en el envase indica que para 34,5 gr de Agar son necesarios 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua lo que sería 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se necesitaron 0,345 gr de Agar TSI. Posteriormente este se llevó en un beaker de 50 ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,345 de Agar TSI), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta lograr ebullición. A continuación se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se repartió en los 3 tubos de tal forma que queden bien dosificados los 10 ml, se dejó solidificar bien el Agar para no tener problemas a la hora de realizar la siembra.
Esta siembra se realizó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo punzando con el asa recta en profundidad y en estría en la superficie, se tapó y se selló con papel parafilm el tubo y se llevó a incubadora a 37,6°C por ocho (8) días.
14.7. Citrato de Simmons Para esta prueba se necesitó 3 tubos, esto para 2 pruebas y un control con Agar Citrato de simmons; en el envase indica que para 23 gr de Agar se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua es decir 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se necesitaron 0,23 gr de Agar Citrato de Simmons. Posteriormente este se llevó en un beaker de 50 ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,23 de Agar Citrato de Simmons), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. A continuación se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se repartió en los 3 tubos de tal forma que queden bien dosificados los 10 ml, se dejó solidificar bien el Agar para no problemas a la hora de realizar la siembra.
La siembra se realizó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo solo en superficie, se tapó, se selló el tubo con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por un periodo de ocho (8) días.
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14.8. CALDO MRVP
14.8.1. Reacción de rojo de metilo
Para esta prueba se necesitó 3 tubos, esto para 2 pruebas y un control con caldo MRVP; en el envase indica que para 17 gr de caldo se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua es decir 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se requirieron 0,17 gr de caldo MRVP. A continuación esto se llevó en un beaker de 50ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,17 de caldo MRVP), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. Posteriormente se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45
minutos, después se tomó el frasco con el caldo y se repartió en los 3 tubos de tal forma que quedaran bien repartidos los 10 ml.
Al realizar la siembra, esta se efectuó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo introduciendo el asa en el caldo MRVP con Helicobacter Pylori cepa (ATCC #22925) en ella, se tapó, se selló el tubo con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por periodo de ocho (8) días.
14.8.2. Ensayo de Voges proskauer
Para esta prueba se necesitó 3 tubos, esto para 2 pruebas y un control con caldo MRVP; en el envase indica que para 17 gr de caldo se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua es decir 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se requirieron 0,17 gr de caldo MRVP. A continuación este se llevó a un beaker de 50ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,17 de caldo MRVP), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. Posteriormente se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomo no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el caldo y se repartió en los 3 tubos de tal forma que quedaran bien repartidos los 10 ml.
Al realizar la siembra, esta se efectuó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo introduciendo el asa en el caldo MRVP con Helicobacter Pylori cepa (ATCC #22925) en ella, se tapó, se selló el tubo con papel parafilm y se lleva a incubadora a 37,6°C por periodo de ocho (8) días.
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14.9. Caldo nitrato Para esta prueba se emplearon 3 tubos, esto para 2 pruebas y un control con Caldo nitrato; en el envase indica que para 16,5 gr de Caldo nitrato se necesitan 1 L de agua destilada, pero para cada tubo se necesitan 3 ml de agua es decir 10 ml para 3 tubos, se hace una regla de 3 y para esto se requieren 0,165 gr de Caldo nitrato. Subsiguientemente esto se llevó en un beaker de 50 ml (los 10 ml de agua destilada y los 0,165 de c), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. Posteriormente se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización a 15 PSI en el autoclave, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomo el frasco con el Caldo nitrato y se repartió en los 3 tubos de tal forma que queden bien dosificados los 10 ml.
La siembra se realizó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, la siembra se hizo introduciendo el asa en el Caldo nitrato con Helicobacter Pylori cepa (ATCC #22925) en ella, se tapó, se selló el tubo con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por un periodo de ocho (8) días.
14.10. Agar Gelatina Para esta prueba fueron necesarias 3 cajas de petri, esto para 2 pruebas y un control con Agar gelatina; para la preparación de este agar se requiere la mezcla de cuatro (4) Agares, agar levadura, triptófano, gelatina y agar, repartidos de la siguiente manera:
Levadura……………………… 0.45 gr
Triptófano…………………….. 0.75gr
Gelatina………………………. 0.6gr
Agar………………………….. 2.05gr
Todo esto en 150 ml de agua destilada. Posteriormente este se llevó a un beaker de 200 ml (los 150 ml de agua destilada y la suma de los 4 agares para así formar el agar gelatina), todo junto a una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para que tener una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. A continuación se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización en el autoclave a 15 PSI, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se repartió en las tres cajas de petri de tal forma que quedaran bien repartidos los 60 ml, se dejo solidificar bien el Agar para no tener problemas a la hora de realizar la siembra.
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la siembra se hizo con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, se efectúo por estrías, se selló el tubo con papel parafilm la caja de petri y se llevó a incubadora a 37,6°C por un periodo de ocho (8) días.
14.11. Agar Almidón
Se utilizarón 3 cajas de petri, 2 pruebas y un control con Agar almidón; para la preparación de este agar se requiere la mezcla de tres (3) agares, agar extracto carne, almidón soluble y agar, repartidos de la siguiente manera:
Extracto carne…………………… 0.45 gr
Almidón soluble………………….. 0.3gr
Agar………………………………. 2.25gr
Todo esto en 150 ml de agua destilada. Posteriormente esto se llevó en un beaker de 200 ml (los 150 ml de agua destilada y la suma de los 3 agares), todo junto en una plancha de calentamiento y agitación con un magneto para que haya una mezcla homogénea entre los dos componentes hasta obtener ebullición. A continuación se pasó a un frasco tapa azul y se llevó a esterilización al autoclave a 15 PSI, proceso que tomó no menos de 45 minutos, después se tomó el frasco con el Agar y se repartió en las tres cajas de petri de tal forma que quedaron bien dosificados los 60 ml, se dejó solidificar bien el Agar para no tener problemas a la hora de realizar la siembra.
Al realizar la siembra esta se realizó con dos mecheros y asa de Henle para evitar la contaminación, se hizo por estrías, se selló la caja con papel parafilm y se llevó a incubadora a 37,6°C por un periodo de ocho (8) días.
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Imagen 8: Pruebas bioquímicas sembradas con Helicobacter pylori cepa (ATCC #
22925).
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
15. Esterilización de todos los medios
La esterilización es un proceso que se debe llevar a cabo antes de agregar todos los agares y caldos en los tubos y cajas de petri donde se va a sembrar el microorganismo que es requerido, esto se realizó en el autoclave a una temperatura de 121°C a 15 PSI en frascos tapa azul, en estos frascos se ponen cada uno de los agares y caldos, esto con el fin de que cada agar quede libre de microorganismos contaminantes y no afecte el crecimiento con microorganismos no deseados.
16. PREPARACIÓN DE EXTRACTO CRUDO POR FILTRACIÓN AL VACIO
En un beaker de 500 ml se pusieron 300 ml y 133,14 gr de bejuco de valeriana officinalis usando como disolvente de agua destilada ya que al utilizarse agua normal esta por sus diferentes componentes puede afectar o contaminar el extracto crudo, por un tiempo de 2 horas, tiempo suficiente para que salga el extracto crudo.
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Imagen 9: Extracción mediante filtración al vacio. Equipo. Universidad de San buenaventura- Cali. Laboratorio de biología.
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
Extracto crudo obtenido (254 ml) fue fraccionado en las muestras de 1 ml para 30 pruebas y el resto fue almacenado a – 20 C para realizar procedimientos futuros.
Posteriormente se realizó una extracción sólido líquido con un kitasato, utilizando papel filtro de 0.2 obteniendo así los 254ml de extracto.
16.1. Preparación de agar nutritivo con extracto de bejuco de valeriana y Helicobacter pylori.
Se hicieron 30 pruebas, cada una con 2 repeticiones y un control que consisten:
20 ml de agar para cada caja de petri; se realizó el cálculo; el recipiente indica que para 28 gr de agar corresponden 1000 ml, es decir (19 ml de agua destilada x 30 cajas de petri, esta es lo que se necesita en agua destilada; ya que para cada caja eran 20 ml se redujo 1 es decir a 19 ml para adicionar 1ml de extracto) 570ml, son 19,18 gr de agar nutritivo.
30 ml de extracto de valeriana, 1 ml para cada caja de petri.
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Estas cajas se dejan por un periodo de 8 días.
Pasado este tiempo se observan y se elije la caja a la cual se le observe algún crecimiento.
16.2. DISEÑO ESTADÍSTICO
En esta fase se realizaron tres (3) tipos de tratamientos:
Tratamiento # 1: Agar nutritivo + Helicobacter pylori
Tratamiento # 2: Agar nutritivo + Helicobacter pylori + extracto
Tratamiento # 3: Agar nutritivo + extracto De cada diseño realizaron 2 cajas de petri, cada una con su debido control. Estas cajas se dejaran durante 8 días a una temperatura de 36,8°C Imagen 10-11: Diseños estadísticos
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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Estos diseños estadísticos se repitieron en dos ocasiones; para comprobación de los resultados.
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17. RESULTADOS 17.1 CRECIMIENTO DE LA BACTERIA La Bacteria Helicobacter pylori fue obtenida en el centro cancerológico de la Universidad del Valle y crecida en un medio líquido (caldo Nutritivo) y posteriormente le fue comprobada la pureza mediante un crecimiento en medio Agar Sangre. Para este objetivo fue necesario crecer los cultivos en presencia de dióxido de Carbono, puesto que la bacteria es anaeróbica y requiere de altas concentraciones de carbono. En este medio se obtuvo un crecimiento colonial típico de la bacteria en cuestión, mostrando colonias redondas, pequeñas y de bordes bien definidos, tal como se puede observar en la imagen 12. Imagen 12: crecimiento colonial de Helicobacter pylori en medio agar sangre.
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
El recrecimiento bacteriano se realizó en los laboratorios de Biología y Química de la Universidad de San Buenaventura, para ello se creció en medio Agar Sangre, dentro de una cámara de anaerobiosis y se insufló Bióxido de Carbono, lo cual permitió crecer la bacteria en sus condiciones ideales. 17.2 CORROBORACIÓN DEL CRECIMIENTO DE HELICOBACTER PYLORI. El crecimiento de Helicobacter pylori en el medio mencionado anteriormente, fue corroborado mediante tinción de Gram, tinción de cápsula y tinción de esporas. Estas coloraciones fueron realizadas con el objetivo de determinar y corroborar si realmente el crecimiento era de Helicobacter Pylori y posteriormente fueron sustentadas por las pruebas bioquímicas (ver tabla 6)
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Tabla 6: Pruebas Bioquímicas para Helicobacter pylori.
PRUEBA
RESULTADO
EXPERIMENTAL
RESULTADO
BIBLIOGRAFICO
1. TSI A/A A/A
2. Voges Proscaver Negativo Positivo
3. Rojo de Metilo Positivo Positivo
4. Agar Citrato Simmons
Negativo Negativo
5. Agar Mc conkey Negativo Negativo
6. Agar lisina Negativo K/K
7. Agar Almidón Positivo Indiferente
8. Agar Gelatina Negativo Negativo
9. Agar Nitrato Positivo Positivo
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
Las coloraciones mostraron un bacilo gran negativo, sin cápsula y sin esporas, lo cual corresponde a la bibliografía cuando se refieren a este tipo de microorganismo. Estas coloraciones se pueden apreciar en las imágenes 13-14 -15: Coloraciones diferenciales de Gram, cápsula y esporas, obtenidas por microscopía de luz a 100 X. Imágenes 13-14-15: Coloraciones diferenciales
Coloración Gram Coloración Cápsula Coloración de Esporas Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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Sin embargo, es de anotar que cuando la bacteria creció en cámara de anaerobiosis, se encontró un hongo filamentoso de color negro, al cual se le realizó la prueba de impronta fúngica, dando como resultado Aspergillus niger, posiblemente un contaminante ambiental que puede crecer en ausencia de Oxígeno al interior de la cámara de anaerobiosis. Ver imagen 16 Imagen 16: Hongo filamentosos de color negro posible contaminante en cámara de anaerobiosis. Micelio A. niger Hifas y esporangio A. niger
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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18. RESULTADOS DE LOS DISEÑOS ESTADISTICOS. Se realizaron tres tratamientos experimentales, los cuales eran respectivamente: T1: Agar Nutritivo y Helicobacter Pylori. T2: Agar nutritivo, Helicobacter Pylori y Extracto Vegetal. T3: Agar Nutritivo y Extracto Vegetal. Estas siembras se dejaron crecer por un período de 8 días, a 37,6 °C y posteriormente se determinó su crecimiento o no. Los resultados arrojaron que las cajas de petri correspondiente al tratamiento 1, presentaban una colonia regular y pequeña correspondiente a Helicobacter Pylori. Las cajas correspondiente al tratamiento 2 mostraron que no creció Helicobacter pylori, sin embargo, se encontró un contaminante al cual se le realizaron las pruebas correspondientes, dando como resultado una bacteria de morfología coco, gram negativo y sin esporas. Esta bacteria no poseía un crecimiento colonial parecido al de Helicobacter Pylori corroborando que podría tratarse de un contaminante ambiental. (Ver imagen 17) Imagen 17: Crecimiento en caja de petri del contaminante Ambiental, la cual pertenecía a un coco gran negativo, sin esporas y sin cápsulas.
Crecimiento en Caja Coco gram negativo Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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Al coco contaminante se le realizaron pruebas bioquímicas para comprobar que no se tratase de la bacteria experimental además de eliminar cualquier duda. Estas pruebas mostraron que efectivamente lo que se pensaba a partir de las tinciones era cierto. No era Helicobacter pylori. (Ver tabla 7) Tabla 7: Pruebas Bioquímicas realizadas al coco gran negativo.
PRUEBA
RESULTADO
EXPERIMENTAL (COCO)
HELICOBACTER
PYLORY
1. TSI A/A A/A
2. Voges Proscaver negativo Positivo
3. Rojo de Metilo PH desciende a 4.4 Positivo
4. Agar Citrato Simmons
Negativo Negativo
5. Agar Mc conkey Negativo negativo
6. Agar lisina Negativo K/K
7. Agar Almidón Negativo Indiferente
8. Agar Gelatina Negativo Negativo
Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
De otro lado en el tratamiento 3 correspondiente a Agar nutritivo y extracto Vegetal crecieron 4 tipos coloniales correspondientes a hongos filamentosos, sin embargo, no se apreció crecimiento de Helicobacter Pylori. Estos datos obtenidos de la experimentación muestran que posiblemente el extracto de valeriana sea un inhibidor eficiente de Helicobacter Pylori, sin embargo, se necesitan más trabajos de investigación para poder determinar la concentración específica requerida de extracto que inhiba a la bacteria. Además, se necesitan trabajos complementarios que corroboren los datos preliminares aquí mostrados. (Ver imagen 18)
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Imagen 18: Caja de petri con agar y Extracto de Valeriana donde se muestra la ausencia del crecimiento de Helicobacter Pylori, comparada con agar sin extracto donde crece la bacteria
No crecimiento de H. pylori Crecimiento H. pylori. Fuente: Ocampo, M.K; Ordoñez, J. 2010
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CONCLUSIONES
1. Al momento de querer replicar la bacteria Helicobacter pylori cepa ATCC #22925 se buscaron diferentes tipos de métodos para replicarla, uno de estos fue la cámara de anaerobiosis, eliminando el oxigeno y suministrando CO2, sin obtener los resultados esperados.
2. Debido a las dificultades para el crecimiento y replicación de la bacteria Helicobacter pylori cepa ATCC #22925 por falta del material necesario como lo era el CO2 que requería la bacteria para que esta pudiera crecer en óptimas condiciones, se solicito la colaboración del Centro Cancerológico de la Universidad del Valle y esto donaron la bacteria.
3. Para la obtención del material vegetal (Valeriana officinalis L.), en un principio se compró a un proveedor que la tenía como maleza en su finca, pero se decidió adquirirla en un almacén de cadena ya que venía mas higiénica y con menor carga microbiana.
4. Al realizar los tratamientos experimentales, se demostró que el extracto crudo de Valeriana officinalis L. inhibe satisfactoriamente Helicobacter pylori cepa ATCC #22925, a condiciones de temperatura de 37,6°C por ocho (8) días.
5. Los blancos o controles de el tratamiento principal (Helicobacter pylori cepa ATCC #22925 + extracto + agar), mostraron el crecimiento de otro tipo de microorganismos, como Aspergillus niger (aflotoxina cancerígena).
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RECOMENDACIONES
1. Buscar otro tipo de agar o método con el cual se pueda replicar la bacteria más fácilmente, sin la necesidad o el requerimiento de CO2.
2. Realizar más tratamientos experimentales, aunque sabemos que el extracto crudo de Valeriana officinalis L. inhibe Helicobacter pylori cepa ATCC #22925, sería de gran utilidad saber cuál sería la cantidad exacta para inhibir el microorganismo y así mismo saber la durabilidad en el organismo y la efectividad del extracto.
3. Continuar con la investigación, ya que debe ser probada en animales y posteriormente en humanos, para ver su eficacia.
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Anexos
AGARES
AGAR NUTRITIVO
Medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias dificilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente (w/v):1
0.5 % Peptona 0.3 % extracto de carne/extracto de levadura 1.5 % agar 0.5% [[NaCl] Agua destilada pH casi neutro (6.8) a 25 °C.37
CALDO NUTRIENTE
Composición:
Extracto de carne, 3g Peptona, 5g Agua destilada hasta 1000 ml
Preparación:
Se disuelven extracto de carne y peptona en una parte de agua por calentamiento hasta que la solución sea transparente. Añadir el agua restante agitando hasta ebullición. Ajustar el pH a 7 y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC. 38
AGAR SANGRE
La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para el aislamiento y cultivo de una amplia variedad de microorganismos, adicionado de sangre es útil para el cultivo de microorganismos fastidiosos. Este medio también es conocido como BAB por sus siglas en inglés.
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La Base de Agar Sangre generalmente es suplementada con sangre de carnero, conejo o caballo al 5-10% para aislar cultivar y estudiar reacciones hemolíticas de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos patógenos.
En 1919 Brown experimentó con formulaciones de agar sangre para observar el efecto hemolítico de las colonias de neumococcos. La Base de Agar Sangre es una modificación del medio “Hormone” de Huntoon con una ligera composición ácida.
Este medio está especificado en los Métodos Estándar para el análisis de alimentos.
La infusión de músculo de corazón y la peptona de caseína proporcionan la fuente de nitrógeno, carbono, aminoácidos y proteínas. El extracto de levadura provee vitaminas y aminoácidos esenciales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es usado como agente solidificante. Este medio está relativamente libre de azúcares reductores los cuales interfieren en las reacciones hemolíticas de estreptococos. El patrón de las reacciones hemolíticas puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.
Infusión de Músculo de Corazón 2.0 Extracto de Levadura 5.0
Cloruro de Sodio 5.0 Aagar Bactereologico 15.0
Digerido Pancreático de Caseína 13.0 Bacteriológico 15.0
pH 7.3 ± 0.2
Método:
Suspender 40 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión). Enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y añadir, de preferencia, sangre de carnero estéril y desfibrinada al 5%.
Homogeneizar y vaciar en placas Petri estériles.
Procedimiento:
1. Procesar las muestras y sembrarlas en las placas por el método de estría. Encajar varias veces el asa en el medio para depositar a los estreptoccos beta hemolíticos debajo de la superficie del medio.
2. Incubar las placas a 35-37 °C por 18-24 y 48 horas en condiciones de aerobiosis, anaerobiosis o bajo atmósfera parcial de CO2 de acuerdo con los 2 procedimientos establecidos por el laboratorio.39
