Obtención de insulina humana mediante un cultivo de raíces

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA

“Expresión de insulina y proinsulina humana en raíces

transformadas de Brassica oleracea var itálica (Brócoli)”

T E S I S

Que presenta

BERENICE GARCÍA REYES

Para obtener el grado de

DOCTORA EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. Graciano Calva Calva

Ciudad de México, Septiembre, 2018

M. en C. Berenice García Reyes

Biotecnología y Bioingeniería

CINVESTAV – IPN

ii

DECLARACIÓN

“Expresión de insulina y proinsulina humana en raíces transformadas de

Brassica oleracea var itálica (Brócoli)”†

Yo certifico que el contenido de esta tesis es el resultado de mi propio trabajo, excepto

donde se dan las debidas referencias a otros autores como parte complementaria de una

parte del trabajo. Esta tesis no ha sido presentada previamente en ninguna forma en este

Centro de Investigación y de Estudios Avanzados ni en ninguna otra institución de

enseñanza.

BERENICE GARCÍA REYES

† El presente trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del

Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

(CINVESTAV-IPN), bajo la dirección del Dr. Graciano Calva Calva, con el apoyo del

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para una Beca de Doctorado

(203726) y del proyecto CONACyT 47678-Z.



CINVESTAV – IPN

iii

Comité Tutorial

Director de Tesis:

Dr. Graciano Calva Calva. CINVESTAV-DBB

Asesora:

Dra. Emma Gloria Ramos Ramírez CINVESTAV-DBB

Asesora:

Dra. Ma. Del Carmen Montes Horcasitas CINVESTAV-DBB

Asesor:

Dr. Fernando José Esparza García CINVESTAV-DBB

Asesor:

Dr. Armando Ariza Castolo CINVESTAV-DQ

Asesora:

Dra. María Luisa Villarreal Ortega CIB UAEM



CINVESTAV – IPN

iv

A MI HIJO

Miguel Ángel

Por ser la luz de mi vida………

A MIS PADRES

Alejandra y Ángel

Por que sin ellos, sería nada……..

Y A MI ABUELITA CONCHITA

Por que su amor inundó mi vida en todo momento………



CINVESTAV – IPN

v

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Graciano Calva Calva por su dirección y asesoría en el

desarrollo de este trabajo

A los asesores; Dra. Emma Gloria Ramos Ramírez, Dra. Ma. Del

Carmen Montes Horcasitas, Dr. Armando Ariza Castolo y Dr. Fernando José

Esparza García por sus oportunas y valiosas aportaciones para el desarrollo

de este trabajo.

Al Q.B.P. Octavio Gómez Guzmán por sus invaluables enseñanzas

A mis compañeros del laboratorio 19

A Dios por cada día concedido



CINVESTAV – IPN

vi

RESUMEN En este trabajo se presentan los resultados de la expresión y purificación de insulina

y proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica oleracea var.

italica con el cDNA del gen Ins que codifica para el péptido de la insulina humana.

El vector pDNR-Lib-Ins que lleva el cDNA del gen Ins y el gen de resistencia a

cloranfenicol se caracterizó por cortes con enzimas de restricción que flanqueaban el

cDNA. Varias regiones fueron amplificadas mediante primers denominados "preproinsulina

y proinsulina", específicamente diseñados para agregar las secuencias de restricción de Nco

I y Bgl II al cDNA del gen Ins. Por otro lado, el vector binario pCAMBIA 1105.1 fue

recuperado de una cepa de E. coli y después cortado con las enzimas de restricción

correspondientes para producir extremos cohesivo entre el vector y los fragmentos de

cDNA de la preproinsulina y proinsulina. Los productos de ligación (preproinsulina-

pCAMBIA 1105.1 y proinsulina-pCAMBIA 1105.1) se transfirieron a E. coli DH5α por

electroporación. La cepa de E. coli transformada con éxito fueron cultivadas en medios de

cultivo con estreptomicina para la selección de las transformantes adecuadas. Las

construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr, se confirmaron por PCR y se clonaron en

Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 para la inducción de líneas raíces de brócoli

transformadas con el respectivo fragmento del gen Ins. Por otro lado, semillas de brócoli

fueron germinadas en medio B5 semisólido. Plántulas mostrando gran número de raíces se

utilizaron para establecer cultivos de raíces transformadas en medio líquido. Para la

inducción de raíces pilosas, varias plantas de 1-2 semanas de edad fueron infectadas con las

cepas Agrobacterium rhizogenes, LBA9402, pC1105.1 por punción y llevando las

construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr. Las raíces surgiendo del punto de punción se

propagaron en medio semisólido SH. Las líneas de raíces propagadas se utilizaron para

establecer cultivos en medio SH en presencia de Higromicina y para probar la actividad β-

glucuronidasa. Se establecieron tres cepas de raíces transformadas con la construcción

pCpINS-bgr para el estudio de la expresión de la proteína correspondiente.



CINVESTAV – IPN

vii

ABSTRACT In this work the results for the expression and purification of the human insulin and

the proinsulin from hairy root cultures of Brassica oleracea var. italica (Broccoli), which

has been considered as a system model for the expression of some heterologous proteins

such as the human growth hormone and the HPV L1 protein, are presented.

The pDNR-Lib-Ins vector carrying the Ins cDNA and the chloramphenicol

resistance gene was restricted with enzymes flanking the cDNA. Several regions were

amplified using primers named ―preproinsulin and proinsulin‖ specifically designed to add

the restriction sequences of Nco I and Bgl II to the Ins cDNA. On the other hand, the binary

vector pCAMBIA 1105.1 was recovered from a strain of E. coli and cut with the

corresponding restriction enzymes to produce complementary ends between the vector and

the amplified preproinsulin and proinsulin cDNA. The ligation products (preproinsulin-

pCAMBIA 1105.1 and proinsulin-pCAMBIA 1105.1) were then cloned in E. coli DH5α by

electroporation. The E. coli strain successfully transformed were grown in culture media

added with streptomycin for selection. The constructs pCppINS-bgr and pCpINS-bgr, once

confirmed by PCR, were cloned in Agrobacterium rhizogenes for induction of hairy roots

of Broccoli transformed with the Ins cDNA gene. On the other hand seeds of Broccoli were

germinated in semisolid B5 mineral medium, and some seedlings showing great number of

roots were used to establish cultures of untransformed roots in liquid medium. For the hairy

roots induction, several 1-2 weeks old seedlings were infected by puncturing with the

Agrobacterium rhizogenes, LBA9402, pC1105.1, pCppINS-bgr and pCpINS-bgr strains.

From the puncture site hairy roots emerged and were propagated in semisolid SH medium.

The propagated tissue was used to establish cultures in liquid SH medium in presence of

hygromycin and test the β-glucuronidase activity. Three strains of hairy roots useful to

study the corresponding protein were established in liquid culture with the construct

pCpINS-bgr.



CINVESTAV – IPN

viii

Tabla de Contenido

i

RESUMEN ....................................................................................................................... vi

ABSTRACT ..................................................................................................................... vii

1 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1

2 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 3

2.1 Insulina ................................................................................................................ 3

2.1.1 Características generales proteína-hormona ................................................... 3

2.1.2 Biosíntesis y modo de acción ........................................................................ 5

2.1.3 El receptor de insulina ................................................................................... 8

2.2 Diabetes ............................................................................................................. 11

2.2.1 Características generales ............................................................................. 11

2.2.2 Incidencia en la población ........................................................................... 12

2.3 Métodos de producción de insulina..................................................................... 16

2.3.1 Métodos tradicionales ................................................................................. 17

2.3.2 Métodos biotecnológicos ............................................................................. 18

2.4 Cultivo de raíces transformadas como modelo de producción de compuestos

biológicamente activos ................................................................................................. 22

2.4.1 Medio de cultivo ......................................................................................... 23

2.4.2 Reguladores del crecimiento vegetal ........................................................... 24

2.5 Brassica oleracea var. italica (Brócoli) como modelo de expresión ...................... 27

3 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 31

4 HIPÓTESIS .............................................................................................................. 32

5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 32

5.1 GENERAL ......................................................................................................... 32

5.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 32

6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ........................................................................... 33

7 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 34

7.1 Material Biológico ............................................................................................. 34

7.1.1 Cepas bacterianas ........................................................................................ 34

7.1.2 Material Vegetal .......................................................................................... 34

7.2 Material para experimentos de Biología Molecular ............................................. 34

7.3 Reactivos generales, medios de cultivo y kits ..................................................... 35

7.4 Equipos .............................................................................................................. 36

7.5 Inducción de raíces transformadas ...................................................................... 36

7.6 Experimentos con explantes ............................................................................... 37

7.7 Determinación de la transformación por GUS .................................................... 38

7.8 Estudios para evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de

explantes de brócoli ...................................................................................................... 38

7.9 Cinéticas de crecimiento a nivel de matraz ......................................................... 39

7.10 Investigación de la presencia del cDNA en el DNA genómico del tejido vegetal 40

7.11 Extracción y cuantificación de proteína total soluble .......................................... 41

7.12 Inmunoensayo de ELISA para cuantificación de proteína ................................... 41

7.13 Ensayos de electroforesis (PAGE) ...................................................................... 41

7.14 Concentración de proteína en extractos proteicos................................................ 42



CINVESTAV – IPN

ix

7.15 Purificación de las proteínas heterólogas ............................................................ 42

7.16 Western Blot para proteínas purificadas por FPLC ............................................. 43

8 RESULTADOS ........................................................................................................ 45

8.1 Efecto de reguladores de crecimiento sobre diferenciación de explantes y

formación de raíces....................................................................................................... 45

8.1.1 Explantes de raíz ......................................................................................... 45

8.1.2 Explantes de hipocotilo ............................................................................... 49

8.1.3 Explantes de hoja ........................................................................................ 52

8.2 Cinético crecimiento y formación de proteína ..................................................... 54

8.2.1 Crecimiento................................................................................................. 54

8.2.2 Variación en la acumulación de proteína total soluble (PTS) ....................... 56

8.2.3 Variación en la proteína liberada el medio de cultivo ................................... 57

8.3 Establecimiento de nuevo protocolo para inducción de raíces transformadas ...... 58

8.4 Extracción y cuantificación de proteína .............................................................. 62

8.4.1 Por método de Bradford .............................................................................. 62

8.4.2 Por método de ELISA ................................................................................. 64

8.5 Purificación de la proteína heteróloga ................................................................. 65

8.5.1 Perfil proteico mediante electroforesis en gel de poliacrilamida ................... 65

8.5.2 Fraccionamiento, concentración y desalado de extractos proteicos .............. 67

8.5.3 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR POR FPLC .......... 70

9 DISCUSIÓN GENERAL .......................................................................................... 74

10 CONCLUSIONES .................................................................................................... 76

11 RECOMENDACIONES PARA INVESTIGACIONES FUTURAS .......................... 78

12 PRESENTACIONES EN CONGRESOS .................................................................. 79

13 ARTÍCULOS ........................................................................................................... 80

TITULO ........................................................................................................................... 80

REVISTA .......................................................................................................................... 80

AÑO ................................................................................................................................. 80

―Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica

(broccoli)‖ ........................................................................................................................ 80

CENIC Ciencias Biológicas.............................................................................................. 80

Vol. 41, 2010.................................................................................................................... 80

Issn: 0253-5688 ................................................................................................................ 80

2010 ................................................................................................................................. 80

―Cultivos de Raíces de Brassica oleracea var italica (Brócoli) transformadas con el cDNA

del Gen de la Preproinsulina Humana‖ ............................................................................. 80

XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, VII Congreso Internacional de

Ingeniería Bioquímica, VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología

Molecular. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero (México). 28, 29 y 30 de marzo 2012. Abstract

BML510GRA20120131 ................................................................................................... 80

. ........................................................................................................................................ 80

2012 ................................................................................................................................. 80

―Purificación de proinsulina a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica

oleracea var italica (Brócoli)‖ .......................................................................................... 80

2014 ................................................................................................................................. 80



CINVESTAV – IPN

x

―Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces

transformadas de Brassica Oleracea Var (brócoli)‖ .......................................................... 80

CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, pp. 434-439, 2015 ................................................. 80

Issn: 2221-2450 ................................................................................................................ 80

2015 ................................................................................................................................. 80

14 REFERENCIAS ....................................................................................................... 81



CINVESTAV – IPN

xi

Indice de Figuras

Figura 1. Secuencia de aminoácidos de la insulina humana . ........................................................... 3 Figura 2. Estructura tridimensional de la insulina humana.. ............................................................ 4 Figura 3. Procesamiento postraduccional de insulina. ..................................................................... 7 Figura 4. Arriba, insulina acoplada al receptor de insulina. ............................................................. 9 Figura 5. Complejidad de señales por la acción de insulina acoplada al IR. ................................... 10 Figura 6. Distribución geográfica de la prevalencia de diabetes en el año 2017. ............................ 13 Figura 7. Defunciones en México en el 2015. ............................................................................... 15 Figura 8. Entrada a la empresa Genentech. ................................................................................... 19 Figura 9. Ternera Patagonia. ........................................................................................................ 20 Figura 10. Lechuga, tabaco y semilla de cártamo. ......................................................................... 22 Figura 11.Brócoli (Brassica oleracea var. italica). ......................................................................... 28 Figura 12. Matriz de 25 tratamientospara evaluar el efecto de los reguladores............................... 47 Figura 13. Matriz de 25 tratamientos, en la segunda semana. ........................................................ 48 Figura 14. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 48 Figura 16. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 50 Figura 17. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 51 Figura 18. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 52 Figura 19. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 ........................................................... 53 Figura 20. Cinética de crecimiento de raíces de brócoli no transformadas. .................................... 55 Figura 21. Proteína total soluble por gramo de peso fresco ........................................................... 56 Figura 22. Cinética de proteína total soluble presente en el medio de cultivo. ............................... 57 Figura 23. Cultivos de raíces de brócoli no transformadas (A) y transformadas ............................. 58 Figura 24. Nuevo protocolo para la inducción de raíces transformadas . ....................................... 59 Figura 25. Reacción de PCR utilizando los primers para la amplificación . ................................. 62 Figura 26. Curva tipo de método Bradfford. ................................................................................. 63 Figura 27. Curva tipo de prueba de ELISA para INS humana ....................................................... 64 Figura 28. Condiciones de SDS-PAGE para observar el perfil proteico......................................... 66 Figura 29. Fraccionamiento con tubos Amicon. ............................................................................ 67 Figura 30. Fraccionamiento con tubos Amicon de 10 y 3 kDa ...................................................... 68 Figura 31. Calibración de pesos moleculares para la columna de filtración en gel ......................... 71 Figura 32. Perfil de elución de la muestra 30-3 kDa p14 y propuesta final ................................... 72 Figura 33. Fracciones de proteínas obtenidas por exclusión molecular mediante FPLC ................. 72

Indice de Tablas Tabla 1. Incidencia de diabetes en el mundo y proyección al 2040 ................................................ 12 Tabla 2. Diferencias en la secuencia de aminoácidos de insulinas de mamíferos ........................... 18 Tabla 3. Efecto de los reguladores de crecimiento sobre la diferenciación de tejido ...................... 39 Tabla 4.Tratamientos del diseño experimental para evaluar el efecto ............................................ 46 Tabla 5. Factor de elongación de raíces en cultivo in vitro ............................................................ 60 Tabla 6. Rendimiento y pureza de DNA genómico de raíces ......................................................... 61 Tabla 7. Rendimiento de proteína en cada línea de cultivo establecida .......................................... 63 Tabla 8. Fracciones obtenidas de la línea p14 .............................................................................. 69 Tabla 9. Marcadores de peso molecular utilizados para FPLC ...................................................... 70

1 INTRODUCCIÓN La proinsulina es el precursor natural de la insulina y se ha investigado como un

neuroprotector y para el tratamiento de la retinitis pigmentaria, que actúa sobre

degeneración de los fotorreceptores, la conectividad sináptica y la actividad funcional de la

retina. La preproinsulina es el precursor de la proinsulina y es un polipéptido de 110

aminoácidos con peso de 12 kDa que se produce en las células β de los islotes de

Langerhans en el páncreas como resultado del proceso de transcripción de la región

codificante del DNA del gen de la insulina (Cuadro 1). y Está constituido de cuatro partes:

una secuencia señal de 24 aminoácido y la molécula de proinsulina de 86 aminoácidos de la

cadena B (30 aa), péptido C (34 aa) y la -cadena A (21 aa). La insulina, por otra parte, es

una proteína de actividad hormonal cuya función principal es regular los niveles de glucosa

en la sangre (Malgor and Valsecia 2000; IDF 2010). La deficiencia en su modo de acción

produce el padecimiento conocido como diabetes (Shepherd and Khan 1999; Malgor and

Valsecia 2000; IDF 2010), la cual está reportada como primera causa de muerte en México

(IDF 2017). Su biosíntesis está descrita desde 2 precursores, preproinsulina y proinsulina,

anteriormente estos precursores únicamente estaban descritos como pro hormonas, pero en

la última década se ha confirmado la participación de proinsulina en procesos de desarrollo

y regeneración de tejido en el tratamiento de retinosis pigmentosa. La proinsulina e insulina

humana recombinante se ha expresado en diversos organismos, incluyendo bacterias,

levadura, hongos, células y órganos de animales y plantas transgénicas (Nykiforuk, Boothe

et al. 2006). No obstante que su producción comercial se ha limitado a microorganismos

como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, los sistemas basados en plantas ofrecen

varias ventajas respecto a producción, bioseguridad y economía (Deckers, Moloney et al.

1999). Debido a ello, se ha propuesto como alternativa de producción el uso de plantas

transgénicas o sus cultivos de células, tejidos y órganos, biotecnologías que desde hace

tiempo representan una opción real y económicamente viable (Deckers et al., 1999, Li et

al., 2006, Tzfira y Citovsky 2006). Estas tecnologías, tanto de células en suspensión como

cultivos de órganos, como el de raíces transformadas, pueden establecerse a nivel de

biorreactores o usarse para regenerar plantas transgénicas productoras de proteínas

terapéuticas con aplicaciones biotecnológicas (Carvalho et al., 1997, Bais et al, 2001, Kim



CINVESTAV – IPN

2

et al., 2002b, Choi et al., 2006, Wilhelmson et al., 2006). En este trabajo se presentan los

resultados sobre la expresión de la proinsulina e insulina humana en cultivos de raíces

transgénicas con el objetivo de coadyuvar a la creciente demanda de estas proteínas debida

al aumento de la población que presenta problemas de diabetes. Como modelo de expresión

se utilizó Brassica oleracea var. italica debido a la disponibilidad de la metodología para

su transformación y su alta capacidad natural de acumular proteína (Cardoza and Stewart

2004). Como antecedente directo del presente trabajo se debe mencionar que en el proyecto

de Maestría se propuso una metodología para establecer cultivos de raíces de brócoli

transformados con los fragmentos prepro- y proinsulina. En continuación, en este trabajo

se estudió la capacidad de expresión y producción de la proinsulina e insulina humana en

dichos cultivos en respuesta a la composición del medio de cultivo con el fin de proponer

alternativas de producción de estas proteínas usando como plataforma cultivos de raíces a

nivel laboratorio.



CINVESTAV – IPN

3

2 ANTECEDENTES

2.1 Insulina

2.1.1 Características generales proteína-hormona

La insulina es un polipéptido con actividad hormonal formado por 51 residuos de

aminoácidos (Figura 1). Fue la primera estructura primaria de proteína que se determinó, la

primera proteína sintetizada y la primera obtenida por DNA recombinante al final de los

70`s (Bliss 1982, Shah et al., 1997). Su peso molecular es de aproximadamente 6 kDa,

dependiendo de la especie de la cual se obtenga (5.8 kDa para la humana) y está compuesta

por dos cadenas de aminoácidos (A y B) unidas por puentes disulfuro. La cadena A tiene 21

aminoácidos, y la cadena B 30 (Bell, Swain et al. 1979). Están unidas entre sí por 2 puentes

disulfuro se ubican entre los aminoácidos A-7/ B-7, y A-20/ B-19 (Tager and Steiner 1974).

Además la cadena A, tiene también un puente disulfuro interno entre los aminoácidos A-6/

A-11 (Chan, Keim et al., 1976; Lomedico, Chan et al., 1977; Shields and Blobel 1977). La

integridad tridimensional de la molécula es indispensable para ejercer sus acciones

farmacológicas. Las cadenas A o B, separadas luego de la destrucción de los puentes

disulfuro, carecen completamente de acción fisiológica (Malgor and Valsecia 2000). La

secuencia de amino ácidos de la insulina humana indicada en la Figura 1 fue determinada

por D. S. H. W. Nicol y L. F. Smith en 1960 (Nicol and Smith 1960) en base a la secuencia

de otras insulinas de seis especies reportadas anteriormente, encontrando que las

variaciones en las secuencias de estas, con la humana, son muy pocas.

Figura 1. Secuencia de aminoácidos de la insulina humana (Nicol and Smith 1960).



CINVESTAV – IPN

4

La estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de varias especies de insulina ha

sido estudiada desde 1969 (Adams 1969, Vinther 2012). Hay una serie muy amplia de

reportes, tanto de su forma nativa como de diversas mutantes que han sido obtenidas y

estudiadas para dilucidar su función específica. La cadena A (Figura 2), posee en su

estructura secundaria 2 alfa hélices (H1 y H2), así como un puente disulfuro intramolecular

entre aminoácidos de la misma cadena A. Dos puentes disulfuro, indicados en color

amarillo en la Figura 2, unen la cadena A con la B, la cual posee una alfa hélice (H1) y una

hoja beta, de manera que al acoplar ambas cadenas, se puede apreciar la estructura terciaria,

conocida como forma T. Sin embargo, cuando la hélice H1 de la cadena B va del

aminoácido B1 al B22 es conocida como forma R.

Esta hormona normalmente se encuentra en el torrente sanguíneo en forma dimérica

y monomérica, que es su forma de actuar biológicamente (Adams 1969), pero también se le

puede encontrar en forma de dímeros (por interacciones hidrofóbicas entre alfa hélices de

las cadenas B) y hexámeros (por interacciones con iones Zinc y Calcio).

Figura 2. Estructura tridimensional de la insulina humana. Arriba-izquierda estructura secundaria de la cadena A. Abajo izquierda Estructura secundaria de la cadena B. Derecha estructura terciaria de la insulina

humana, en color rojo se aprecia la cadena B, en color morado la cadena A (Adams et al., 1969).



CINVESTAV – IPN

5

2.1.2 Biosíntesis y modo de acción

El gen que codifica para la insulina humana fue secuenciado en 1980 (Bell, Picket

et al., 1980). Se encuentra localizado en el extremo distal del brazo corto del cromosoma 11

(Harper, Ullrich et al. 1981). Al realizar el proceso de transcripción de la región codificante

del DNA da como resultada un mRNA maduro que no necesita de corte y empalme, es

decir, es la secuencia que da lugar a la molécula de cDNA (DNA complementario). Cuando

ese mRNA es traducido por los ribosomas adheridos al retículo endoplásmico se obtiene

una secuencia de aminoácidos denominada preproinsulina (Cuadro 1), la cual tiene un peso

de 12 kDa y consta de cuatro péptidos (Bell, Swain et al. 1979). En color amarillo se

muestra la secuencia que codifica para un péptido señal D de translocación a retículo

endoplásmico. En color gris se marca la secuencia de un péptido C que junto con las

cadenas A y B dan lugar a la proinsulina que es la molécula precursora de la insulina

conformada por la unión de las cadenas A y B después de removerse C.

Cuadro 1. Secuencia de aminoácidos de los cuatro péptidos de la preproinsulina

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERG

FFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS

LYQLENYCN

* Péptido señal D. Utilizado para la traslocación del péptido desde el citoplasma

al lumen del retículo endoplásmico rugoso a través del traslocón Sec 61 del retículo

endoplásmico rugoso en las células β del páncreas.

* Péptido de la cadena B de 31 aminoácidos. Cadena B de la insulina.

* Péptido C. Cadena removida por modificaciones postraduccionales para dar

lugar a las cadenas A y B unidas por un puente disulfuro. La longitud y secuencia de

esta cadena es muy variada entre especies. Va de 26 a 31 residuos de aminoácidos.

* Cadena A de 20 aminoácidos.



CINVESTAV – IPN

6

Una vez que es translocado el péptido preproinsulina de 12 kDa al lumen del

retículo endoplásmico rugoso el péptido señal D es removido por una peptidasa (Figura 3)

localizada en ese sitio y degradado rápidamente en las células β (Steiner, Dochcrty et al.,

1984; Schwartz 1990). El péptido resultante, denominado proinsulina, con un peso de 9

kDa contiene las cadenas A, B y el péptido C, es entonces translocado al aparato de Golgi

para su procesamiento postraduccional (Figura 3a). La proinsulina, aún en estado lineal, es

plegada formado alfa hélices en las cadenas A y B que al mismo tiempo son orientadas para

la formación intramolecular de dos puentes disulfuro en la cadena B y uno en la cadena A,

dando lugar a la estructura terciaria nativa de la proinsulina (Orci, Ravazzola et al., 1986;

Orci, Ravazzola et al., 1987). Esta molécula es transportada al aparato de Golgi, donde es

empaquetada junto con iones Zn+2

y Ca+2

en vesículas de secreción y transformada a

insulina nativa mediante la remoción del péptido C por la acción de enzimas proteolíticas:

las prohormonas convertasas PC1 y PC2 así como una exoproteasa carboxipeptidasa E

(Hutton 1994). La acción de dichas enzimas se ve favorecida por la formación de dímeros

de proinsulina debida a interacciones entre los sitos hidrofóbicos de las cadenas B y

posteriormente con los iones Zn+2

y Ca+2

para formar tetrámeros por unión de dos dímeros

y hexámeros por unión de tres dímeros (Figura 3b). Esta forma hexamérica

(Zn2+

)2(Ca2+

)(Proin)6 es una especie muy estable que deja expuesto al péptido C de cada

monómero de proinsulina facilitando así su escisión para dar como resultado el péptido C

libre y la especie (Zn2+

)2(Ca2+

)(In)6 que es un hexámero de insulina (Figura 3b). Este

hexámero es inactivo y puede formar cristales. Es la forma en que se almacena la insulina

en las células. Así, el proceso de procesamiento postraduccional empieza en el retículo

endoplásmico, continúa en la región cis del aparato de Golgi y finaliza hasta las vesícula de

secreción en la región trans del mismo en las células beta localizadas en los islotes de

Langerhans del páncreas en donde se almacena en vesículas hasta su secreción cuando lo

requiere el organismo (Moore, Walker et al., 1983).

http://es.wikipedia.org/wiki/Islotes_de_Langerhans

http://es.wikipedia.org/wiki/Islotes_de_Langerhans



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Figura 3. Procesamiento postraduccional de insulina. A) acción de enzimas proteolíticas en sitios específicos

de la proinsulina para dar lugar a la insulina y el péptido C libre. B) Formación de los dímeros, tetrámeros y

hexámeros de la insulina por la acción de iones Zn+2, Ca+2 y regiones hidrófobas de la cadena B.

PROINSULINA Cadena B

Cadena A

Péptido C

INSULINA

Péptido C

Monómero

Dímero

Tetrámero

Dímero

PC1 PC2

cpE

Hexámero



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Los monómeros activos de insulina son la clave en el control del metabolismo

intermediario (Peter, Shepherd et al., 1999). Tiene un profundo efecto sobre el metabolismo

de los carbohidratos (glucosa) y lípidos. También significativa influencia en el

metabolismo proteico y mineral. La insulina estimula el hígado para acumulación de

glucosa en forma de glucógeno. Los desajustes en su acción tienen amplios y devastadores

efectos sobre órganos y tejidos. En su ausencia, varios tipos de células del cuerpo se tornan

incapaces de captar glucosa y comienzan a usar fuentes alternativas de energía como los

ácidos grasos. También, cesa la síntesis del glucógeno en el hígado.

2.1.3 El receptor de insulina

Los receptores de otras hormonas proteicas y los receptores para insulina están en la

membrana plasmática (Malgor and Valsecia 2000). El receptor para insulina es una

glucoproteína transmembrana de cuatro subunidades. Tiene dos subunidades alfa y dos

subunidades beta unidas por uniones disulfuro (Figura 4). Las cadenas alfa son

enteramente extracelulares mientras que las beta son extracelulares, transcelulares

(membrana) e intracelulares. La insulina se une a la porción N-terminal de la subunidad

alfa y al hacerlo ocasiona un cambio conformacional de la subunidad beta, cambio que

estimula la actividad cinasa del receptor.

El receptor es una tirosinocinasa. En otras palabras, funciona como una enzima que

transfiere grupos fosfato desde el ATP hacia los residuos tirosina en las proteínas blanco

intracelulares. La unión de la insulina a las subunidades, causa que las subunidades beta se

fosforilen a sí mismas (autofosforilación en 6 residuos de tirosina), activando de éste modo

la actividad catalítica del receptor.

El receptor activado (IR-insulina) fosforila un número de proteínas intracelulares

que alteran la actividad, generando respuestas biológicas en las vías del metabolismo

celular. Estas respuestas biológicas o cascada de señales que actúan en los diversos eventos

celulares, es tan compleja como se muestra en la Figura 5.



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Figura 4. Arriba, insulina acoplada al receptor de insulina.

Abajo, fosforilación del receptor de insulina y desencadenamiento de señales.



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Figura 5. Complejidad de señales por la acción de insulina acoplada al IR.

De lo anterior, un déficit de insulina, bien porque se secrete poco (células β

alteradas) o por una respuesta baja de las células blanco (IR), suprime el efecto

hipoglucemiante. Como consecuencia, aparece la diabetes mellitus. Así, la diabetes puede

producirse por 3 causas principales:

1. Disminución de la insulina plasmática

2. Mutaciones que inactivan el receptor de insulina

3. Fallos en las vías de señalización intracelular (disminución del efecto biológico)



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2.2 Diabetes

2.2.1 Características generales

La diabetes es una enfermedad crónica, de etiología aún no claramente conocida,

generalmente hereditaria, caracterizada por una predisposición genética recesiva, y

consiste, en esencia, en una alteración global del metabolismo, especialmente demostrable a

nivel del metabolismo de carbohidratos, debido primariamente a una deficiencia absoluta o

relativa de insulina (Shepherd and Khan 1999; Malgor and Valsecia 2000). Se caracteriza

por la existencia de hiperglucemia y glucosuria, y en su evolución provoca importantes

alteraciones del metabolismo de las proteínas, lípidos y electrolitos.

Es una afección crónica y para toda la vida que exige un monitoreo y control

riguroso (Malgor and Valsecia 2000). De no controlarse adecuadamente, puede ocasionar

altos niveles de azúcar en sangre. Éstos van asociados a largo plazo a lesiones del

organismo y al fallo de varios órganos y tejidos. Las complicaciones pueden ser:

Enfermedad cardiovascular, que afecta al corazón y vasos sanguíneos y puede llegar

a causar complicaciones letales, como enfermedad coronaria cardiaca que

provocaría infarto de miocardio y derrames cerebrales

Enfermedad renal o nefropatía diabética, que puede llegar a desencadenar una

insuficiencia renal total y la necesidad de diálisis o transplante de riñón

Enfermedad nerviosa o neuropatía diabética, que puede acabar por generar la

ulceración y amputación de los pies y las extremidades inferiores

Enfermedad visual o retinopatía diabética, caracterizada por lesiones de la retina del

ojo, que puede generar pérdida de visión



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2.2.2 Incidencia en la población

La incidencia poblacional de diabetes, es trascendental a nivel mundial y nacional.

Es por eso que un gran número de organizaciones y grupos de apoyo han sido creados

alrededor del mundo para propagar información y métodos de tratamiento (IDF 2007)

2.2.2.1 Nivel mundial

De acuerdo con la Federación Internacional de Diabetes (Tabla 1), más de 425

millones de personas en el mundo viven con diabetes. Aun con iniciativas conjuntas para

combatir la enfermedad, se estima que llegarán a 629 millones en 2040 (Tabla 1). El 20 de

diciembre de 2006, la Asamblea General de las Naciones Unidas aprobó la Resolución

61/225 (IDF 2007) que reconoce la diabetes como ―enfermedad crónica, debilitante y

costosa que tiene graves complicaciones, conlleva grandes riesgos para las familias, los

países y el mundo entero‖. Es la primera vez que se reconoce que una enfermedad no

contagiosa representa una grave amenaza para la salud mundial, de igual forma que las

epidemias de enfermedades infecciosas como la malaria, la tuberculosis y el SIDA.

Tabla 1. Incidencia de diabetes en el mundo y proyección al 2040

POBLACIÓN 2010 2017 2040

Población total en el mundo (mil millones) 7.0 7.5 9.5

Adultos de 29-79 años (mil millones) 4.3 4.8 6.4

Personas con diabetes entre 29-79 años (millones) 285 425 629

Prevalencia mundial de diabetes en personas entre 29-79 años (%) 6.6 8.8 9.9

Tomada de: Internacional Diabetes Federation (IDF 2017).



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2.2.2.2 Nivel nacional

México se encuentra entre los países con una prevalencia de diabetes estimada para

el año 2030 mayor al 12 % (Olaiz, Aguilar et al., 2007). Esto es, se encuentra entre los

países con mayor incidencia (Figura 6). Desde 1940 la diabetes ya se encontraba dentro de

las primeras 20 causas de mortalidad en México con una tasa de 4.2 por 100 000 habitantes.

Pese a ello, se le consideraba una enfermedad poco frecuente (1% de la población adulta).

Sin embargo, las consecuencias de la enfermedad crecieron a partir de 1970, cuando ocupó

el 15º lugar como causa de muerte. Diez años después ocupó el noveno lugar y para 1990

alcanzó el cuarto lugar como causa de mortalidad general (Salud 1995).

Figura 6. Distribución geográfica de la prevalencia de diabetes en el año 2017.

A partir del 2000 en México, la diabetes es la primera causa de muerte en mujeres y

la segunda en hombres, después de la cardiopatía isquémica, enfermedad resultante muchas

veces de la diabetes (Salud 2002). Contrario a lo observado con otras afecciones, como la

cirrosis hepática, la tasa de mortalidad por diabetes mellitus aumentó desde el año 2000 al

2003. En 2003, la diabetes representó 12.6% de las muertes ocurridas en el país y la edad

promedio al morir fue de 66 años. También genera un considerable efecto en los sistemas



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de salud, dado que fue la undécima causa de ingreso a hospitales de la Secretaría de Salud

durante el año 2000, sólo superada por factores de ingreso relacionados con embarazo,

accidentes, problemas perinatales y algunas de las infecciones o procedimientos quirúrgicos

más comunes (Salud 2002).

Asimismo, los periodos de hospitalización (6.1 días contra 3.5 días en personas con

y sin diabetes) y la elevada letalidad de la enfermedad elevan el costo de su atención.

Además, la diabetes fue la causa más frecuente de ceguera, insuficiencia renal terminal,

amputaciones no traumáticas e incapacidad prematura en México (Salud 2001). Como

causa de morbilidad, la diabetes mellitus tipo 2 produjo 287180 casos nuevos en el año

2000, ocupando el décimo segundo lugar dentro de las veinte principales causas de

enfermedad en el país (Salud 2003). Las cifras preliminares del INEGI publicadas en 2015

respaldan los reportes de las instituciones de salud pública en el país, teniendo a la diabetes

mellitus como la primera causa de muerte en México (Figura 7), con un 15% que se

traduce a 85 mil mexicanos (IDF 2017).

Los costos derivados para la atención de los pacientes diabéticos en los ámbitos

ambulatorio y hospitalario junto con la pérdida de productividad de la población afectada,

coloca a la diabetes mellitus dentro de las enfermedades de mayor costo social y carga

financiera para las instituciones de salud México. El tratamiento de las personas con

diabetes a base de terapia con insulina da por ende un enorme mercado. Tomando como

base un tratamiento estándar de 50 Unidades de Insulina por día (1500 U al mes), en

estados unidos, para el año 1996, a un precio de $18.10 U.S. dlls por vial de 10 ml (1000

U) , se generarían $330 U.S. dlls anuales ($ 6,105 pesos hoy en día) (Stern and Levy 1996).

Utilizando la misma base de cálculo, Kanakis y colaboradores reportan que para el año

2002 e insulinas de acción rápida (obtenidas de manera heterologa) un intervalo de $720 -

$1,164 U.S. dlls anuales ($ 13,320 - $ 21,534 pesos hoy en día) dependiendo de la

variedad de producto que se utiliza (Kanakis, Watts et al., 2002).

Entonces, se puede estimar que de acuerdo a la prevalencia pronosticada para el año

2040, para poder suplir la demanda de la insulina de los 629 millones de personas con

diabetes, el mercado anual mínimo estaría oscilando en aproximadamente $315 mil

millones de dólares. Para finales del año 2017 las tres compañías farmacéuticas líderes en

la producción de insulina son Novo con un 47%, 12% Aventis y 10% Lilly del mercado



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global, y reportaron un crecimiento del 24 %, 100 % y 200% respectivamente, para sus

ventas de insulina comparados con el año 2016, así como un aumento los precios de venta.

Con lo anterior queda establecida la importancia que tiene la producción de insulina

para el tratamiento de la diabetes mellitus, puesto que es necesario mejorar todas las

técnicas existentes y crear otras nuevas, que lleven la insulina en sus diferentes

presentaciones al mercado, así como la reducción de los costos de producción el cual

repercute en el costo de venta al público y así hacerla accesible a una mayor cantidad

población que padece esta enfermedad.

Figura 7. Defunciones en México en el 2015 (INEGI 2017).



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2.3 Métodos de producción de insulina

A través del tiempo la producción de insulina ha atravesado por diversas facetas que

van desde la extracción de tejido pancreático animal y síntesis o semisíntesis química hasta

la tecnología del DNA recombinante en sistemas procariontes, en animales y en vegetales.

Originalmente el método clásico de obtención era mediante la extracción directa a partir de

mamíferos; específicamente de ganado porcino y bovino (Bliss 1982), lo cual tenía grandes

implicaciones en cuanto a metodología, costos y sobre la actividad terapéutica de la

hormona. Sin embargo, investigaciones realizadas en las últimas décadas para conocer y

aplicar proteínas terapéuticas para el tratamiento de variadas afecciones han creado una

revolución en el campo de la biotecnología utilizando las técnicas del DNA recombinante,

con las cuales la mayoría de los genes pueden ser expresados en múltiples organismos, ya

sea microbianos, animales o vegetales.

El mayor problema de las biotecnologías basadas en DNA recombinante es

determinar cuál plataforma de expresión ofrece mayores ventajas respecto a seguridad,

producto biológicamente activo y costos de su producción (Meena and Harish 2001). Como

se ilustrará en las siguientes secciones, el uso de microorganismos permite producciones a

grandes escalas pero frecuentemente tiene la desventaja de dar productos que difieren

notablemente de los productos nativos y requieren por tanto de procesamientos posteriores

que en la mayoría de los casos iguala o supera en costo total de producción los sistemas

animales (Meena and Harish 2001). Los sistemas de células animales para expresar genes

de mamífero tienen la ventaja de formar productos idénticos a los de origen natural, no

obstante el cultivo de estas células solo se puede llevar a escalas limitadas de producción y

generalmente es muy costoso. De igual manera la utilización de animales transgénicos

como modelo de expresión de estos genes posea tanto la misma ventaja como el mismo

inconveniente en costos de mantenimiento (Meena and Harish 2001).

Los sistemas vegetales pueden ser atractivos y reales porque los costos de producción

pueden ser relativamente bajos, por ejemplo para el cultivo de las plantas transgénicas, las

cuales en algunos casos pueden utilizase directamente con fines terapéuticos al ingerirlas,

como en el caso de las denominadas vacunas comestibles. Además, la producción pueda

ser escalada a los niveles necesarios según la demanda del mercado. Además, al igual que



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los sistemas microbianos se pueden cultivar sus células, tejidos u órganos en biorreactores

de diferentes niveles (Meena and Harish 2001). En el caso de la insulina se podrían

establecer procesos de células, tejidos y órganos vegetales o la producción de plantas

transgénicas.

A continuación se detalla un poco más los métodos más utilizados en la producción

de insulina.

2.3.1 Métodos tradicionales

En enero de 1922 (en la Universidad de Toronto), la insulina bovina que difiere en 3

aminoácidos de la humana fue la primera suministrada a los seres humanos por inyección y

como aún no estaba pura produjo ámpulas de 7.5 cm en el lugar de la aplicación (Bliss

1982; Shah, Joshi et al., 1997). Esto último debido a que la proteína se obtuvo por

extracción de células pancreáticas y las técnicas de purificación no eran lo suficientemente

avanzadas. Sin embargo, más tarde se logró mejorar los procesos de purificación y se tornó

más segura, aunque finalmente esta insulina bovina fue sustituida por la porcina, la cual

solo difiere en un aminoácido comparada con la humana. No obstante, la calidad de la

insulina administrada en ese momento no se comparaba con la calidad de los productos de

hoy. También debido a las diferentes impurezas a menudo había reacciones de

hipoglucemia y se tenían reportes de dolor e inflamación en el lugar de la inyección. A

partir de 1922, debido a la demanda de nuevos medicamentos se concedió a varias

empresas licencias para la fabricación de Insulina. Se siguió trabajando con diferentes

formulaciones del extracto no puro de insulina animal para mejorar la respuesta en los

pacientes y obtener insulinas de acción prolongada, lenta y rápida. Para 1974, las técnicas

cromatográficas de purificación permitieron la producción de insulina de origen animal

con menos de 1 pmol/l de impurezas. El producto fue nombrado monocomponente MC por

la empresa Novo y Single Peak Insulin y Iletin II, por Eli Lilly. Antes de esto, la insulina

bovina y porcina en ocasiones causaban alergias y lipoatrofia (Teuscher 1974). Hoy, sin

embargo, no existen grandes diferencias entre la pureza de las insulinas animales y la

humana (Tabla 2).



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Tabla 2. Diferencias en la secuencia de aminoácidos de insulinas de mamíferos

ESPECIE POSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN LA

CADENA A

8 9 10

Res Ala Ser Val

Cerdo, Espermatozoide de Ballena Thr Ser Ileu

Ballena Ala Ser Thr

Oveja Ala Gly Ileu

Caballo Thr Gly Ileu

Fuente: (Nicol and Smith 1960).

Después de varios años, entre 1963-1966, la insulina humana fue sintetizada

químicamente en Alemania, por Meienhofer (Meienhofer, Schnabel et al., 1963), en China

por Kung (Kung, Da et al., 1966) y en los Estados Unidos por Katsoyannis (Katsoyannis,

Tometsko et al., 1966). Sin embargo, por razones económicas la producción química a gran

escala no ha sido posible. No obstante, se han establecido estrategias comerciales para la

semisíntesis a partir de la proteína porcina, cambiando el residuo del aminoácido Ala del

extremo del C-terminal de la cadena B por Thr, resultando la secuencia de aminoácidos

correspondiente a la secuencia de la insulina humana.

2.3.2 Métodos biotecnológicos

2.3.2.1 Biotecnología bacteriana

En 1978, la empresa Genentech de San Francisco, California reportó la producción

a nivel laboratorio de insulina humana transgénica o heteróloga utilizando E. coli como

sistema de expresión (Figura 8). Sin embargo, la carrera para la producción en masa

utilizando estas tecnologías fue ganada por Eli Lilly en 1982 (Chan, Weiss et al., 1981),



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19

cuando la FDA aprobó la Humulina R (rápido) y la Humulina N (NPH) para el mercado de

los Estados Unidos de Norteamérica. Esto fue seguido por la producción de insulinas

semisintéticas por las empresas de Novo, Actrapid HM y Monotard HM. Estos procesos

eliminaron la dependencia de las insulinas bovina y porcina y son los que se utilizan en la

actualidad para la obtención de insulina humana. Así, de 1996 a la fecha, se han introducido

en todo el mundo varios análogos de la insulina. Algunos de esos productos son Humalog

(Lilly), Lantus y Apidra (Aventis), Levemir y NovoRapid (Novo Nordisk), y otro número

de análogos que están actualmente a nivel de pruebas clínicas las llamadas insulinas basales

de nueva generación.

Figura 8. Entrada a la empresa Genentech de San francisco, California. Derecha, bacterias recombinantes de

E. Coli productoras de insulina humana.

Otro de los modelos competitivos para la producción heteróloga de insulina humana

son los producidos en sistemas de expresión como las levaduras Saccharomyces cerevisiae

(Thim, Hansen et al., 1986) y Pichia pastoris (Wang, Liang et al., 2001). No obstante estos

sistemas de expresión junto con E. coli, presentan ciertos inconvenientes para la

productividad así como la actividad de biológica de la insulina, como por ejemplo el

plegamiento correcto de la proteína. Aun así estos son los sistemas que se utilizan

actualmente para la producción industrial de insulina humana.



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20

2.3.2.2 Biotecnología animal

En busca de sistemas alternativos para la producción industrial, la insulina humana

también ha sido expresada en su forma de proinsulina (con algunas mutaciones en la

secuencia de la aminoácidos en la proteína) en cultivo de células de riñón de mono

(Yanagita, Nakayama et al., 1992). En este sistema se ha reportado que las células secretan

al medio de cultivo hasta un 60% del péptido activo. Del mismo modo se han obtenido

vacas (BioSidus 2007), capaces de producir un precursor de la insulina humana en células

de tejido mamario y secretarla junto con la leche de donde puede ser extraído, purificado y

modificado enzimáticamente para obtener el péptido activo (Figura 9). El uso de estas

técnicas puede reducir los costos de procesamiento postraduccional necesarios en los

sistemas de biotecnología bacteriana, puesto que las modificaciones posteriores que sufre el

producto en biotecnología animal son pocas o nulas. Sin embargo el costo total de proceso,

sobre todo en el mantenimiento de los cultivos de células animales así como del animal

completo está en desventaja con respecto los costos de biotecnología microbiana.

Figura 9. Ternera Patagonia I nació el 27 de febrero del año 2007 y estará produciendo leche con el péptido

proinsulina, el precursor de insulina a fin de este año (BioSidus 2007).



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2.3.2.3 Biotecnología vegetal

La biotecnología vegetal es un conjunto de tecnologías con potencial real para la

producción de proteínas heterólogas, especialmente aquellas con requerimientos

postraduccionales complejos (Ferl and Paul 2000). Se fundamenta en inducir el crecimiento

de células, tejidos y órganos vegetales in vitro en medios de cultivo definidos y bajo

condiciones controladas y asépticas (Calva and Rios 1999). Estas técnicas tienen como

fundamento el principio de la totipotencialidad de la célula vegetal, es decir, que cada

célula de una planta, independientemente de su posición en ella cuenta con una copia

completa del genoma de la planta madre, por lo que tiene la capacidad de regenerar una

planta completa con toda funcionalidad. Debido a ello, desde tiempo atrás se ha reconocido

que los sistemas basados en plantas transgénicas completas, o el cultivo in vitro de sus

célula tejidos y órganos ofrecen potencial, seguridad, economía, y capacidad para la

producción de proteínas heterólogas además de otro tipo de biofármacos basados en

metabolitos secundarios vegetales (Deckers, Moloney et al., 1999), representando una

opción real y económicamente viable para la producción de ambos tipos de compuestos.

Entre las ventajas de la biotecnología vegetal están que las plantas transgénicas ofrecen

estabilidad física, fisicoquímica y nutricional suficiente para poder llegar a cualquier parte

del mundo y entregar al receptor final los compuestos o proteínas transgénicas respectivas

en estado activo. Además este uso farmacéutico de plantas transgénicas es bien aceptado

por la sociedad, lo que contrasta con los temores y políticas en la población cuando el

objetivo es utilizarlas como alimentos transgénicos (Calva, Esparza et al., 2002; Calva and

Pérez 2005).

Con lo que respecta la insulina, haciendo uso de la biotecnología vegetal, se ha

reportado la expresión en cultivos de hoja de papa, en niveles del 0.05 % de la proteína

soluble total, ya sea como proteína independiente o de fusión con rendimientos del 0.1 %

de la proteína soluble total (Arakawa, Yu et al., 1998). También se ha logrado la expresión

de proinsulina como proteína de fusión a la sub-unidad B de la toxina del cólera (CTB-

Pins) en líneas de cultivos de células de hojas de tabaco y lechuga transformadas a nivel de

cloroplastos (Li, O’Leary et al., 2006) con un rendimiento del 16 % y 2.5 % de la proteína



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22

soluble respectivamente . De la misma manera esta proteína se ha expresado en semillas de

Arabidpsis thaliana, como proteína de fusión que se acumula en los cuerpos oleosos de las

semillas con rendimientos de hasta el 0.13 % de la proteína total (Nykiforuk, Boothe et al.,

2006). Con esta tecnología la empresa canadienses de biotecnología SemBioSys Genetics

Inc., ha anunciado haber logrado plantas transgénicas de cártamo productoras de insulina

humana con rendimientos de hasta el 1.2% de las proteínas acumuladas en semillas (Figura

10), niveles que permiten una explotación comercial viable. No se encontraron

antecedentes sobre la producción de insulina por raíces transformadas de plantas, Así, con

el objetivo de explorar el potencial de esta tecnología en la producción de proteínas

heterólogas, en el grupo de trabajo se establecieron cultivos de raíces Brassica oleracea

var. italica transformadas con el cDNA del gen de la insulina humana que es el antecedente

directo de este trabajo.

Figura 10. Lechuga, tabaco y semilla de cártamo acumuladoras de insulina humana (Nykiforuk, Boothe et al.,

2006).

2.4 Cultivo de raíces transformadas como modelo de producción de compuestos biológicamente activos

Los cultivos de raíces transformadas son desde hace tiempo una tecnología

ampliamente explotada, para la obtención de compuestos biológicamente activos,

principalmente de metabolitos secundarios de interés y de manera más reciente para la

producción de proteínas heterólogas de interés farmacéutico. Este es un sistema estable, el

tejido crece de manera acelerada comparado con las raíces normales sin necesidad de

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://bp1.blogger.com/_MbpZ44iWpr0/RvFPRG8q6BI/AAAAAAAAAPo/yERfoswdNhI/s400/lechuga-1.jpg&imgrefurl=http://freealfin.blogspot.com/2007/09/receta-tortilla-de-lechuga.html&h=365&w=343&sz=59&hl=es&start=1&um=1&tbnid=TWEVcG-fX0tpxM:&tbnh=121&tbnw=114&prev=/images%3Fq%3Dhojas%2Bde%2Blechuga%26um%3D1%26hl%3Des%26sa%3DG



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23

reguladores de crecimiento y es capaz de ofrecer productos en rendimientos considerables.

Para ello cada tipo de cultivo y especie requiere de la optimización de sus parámetros

nutricionales y de proceso. Algunos a considerar son: en cuanto al medio de cultivo, el tipo

y concentración de fuente de carbono, nitrógeno y fosforo (Norton and Towers 1986;

Christen, Aoki et al., 1992; Taya, Yakura et al., 1994; Wilhelmson, Hakkinen et al., 2006),

fuerza iónica del medio (Toivonen, Laakso et al., 1992), algunos parámetros de proceso

como pH, luz y temperatura (Hirata, Horiuchi et al., 1991; Hilton and Rhodes 1994; Yu,

Murthya et al., 2005) , reguladores de crecimiento (Rhodes, Parr et al., 1994; Bais, George

et al., 2001) y las condiciones del inoculo (Bhadra and Shaks 1995; Jeong, Park et al.,

2004).

2.4.1 Medio de cultivo

Un medio de cultivo, principalmente consiste en una solución de sales que proveen

de macro y micro elementos necesarios para el crecimiento de la planta completa junto con

vitaminas, aminoácidos y fuente de energía que usualmente es sacarosa. Los cultivos

vegetales para el crecimiento y desarrollo, generalmente, también dependen de la adición

de reguladores de crecimiento al medio (George, Hall et al., 2008).

El material vegetal puede ser cultivado tanto en medio liquido como en un medio

parcialmente solidificado con un agente gelificante. Dependiendo del tipo de cultivo y del

objetivo. El medio semisólido, es utilizado para el establecimiento de cultivos de explantes;

también se utilizan para el cultivo de callos u órganos de plantas, y para el mantenimiento

de cultivos por largos periodos. Los cultivos que crecen en medio sólido, solo una

superficie del explante, órgano o tejido se encuentra en contacto con el medio. Esto

significa que a medida que avanza el crecimiento puede ser que existan gradientes de

nutrientes, factores de crecimiento y productos de desecho del metabolismo, entre el medio

y el tejido (George, Hall et al., 2008).

El medio líquido se utiliza esencialmente, para los cultivos en suspensión, y son

preferidos para los experimentos críticos acerca de la nutrición, crecimiento y

diferenciación celular. También son utilizados en algunos trabajos de micropopagación.

Algunos órganos y tejidos, pequeños y grandes, también crecen bien sin soporte en medio



CINVESTAV – IPN

24

líquido, cuidando que se encuentren con aireación mediante agitación o movimiento

(George, Hall et al., 2008).

El medio de cultivo para tejidos vegetales, no solo provee de estos nutrientes

inorgánicos, si no que usualmente un carbohidrato (comúnmente la sacarosa) remplaza el

carbón que la planta normalmente fija de la atmosfera mediante la fotosíntesis. Para

mejorar el crecimiento, algunos medios también incluyen cantidades traza de algunos

compuestos orgánicos, especialmente vitaminas, y reguladores de crecimiento vegetal

(George, Hall et al., 2008). En la literatura los medios más utilizados para el mantenimiento

y propagación de cultivos de diferentes Brassicae son el medio Murashige y Skoog (MS),

Gamborg (B5) y Schenck y Hildebrandt (SH).

Los cultivos vegetales para el crecimiento y desarrollo, generalmente, también

dependen de la adición de reguladores de crecimiento al medio. Los reguladores de

crecimiento vegetales son compuestos, los cuales, a concentraciones muy bajas, son

capaces de modificar el crecimiento o la morfogénesis de la planta. Los reguladores de

crecimiento frecuentemente necesitan ser alterados de acuerdo a la variedad de la planta, o

a diferentes etapas de cultivo, mientras que el medio básico puede estar sin cambiar. Por lo

que es preferible que los componentes nutricionales y de regulación sean tratados de forma

separada (George, Hall et al., 2008).

2.4.2 Reguladores del crecimiento vegetal

Los reguladores del crecimiento vegetal son compuestos que en combinaciones

específicas (tipo y concentración) pueden regular la diferenciación de los tejidos vegetales

en distintas direcciones (brotes, raíces, callos). Se clasifican en: auxinas, citocininas,

giberelinas, ácido abscísico y etileno (George, Hall et al., 2008).

Dentro de las giberelinas se encuentra el ácido giberelico (GA), cuyo efecto es

promover el crecimiento y elongación celular cuando se utiliza en concentraciones de 0.01

a 10 mg/l. Su efecto se debe a que:

Estimula la elongación del tallo

Estimula la floración

Ayuda a romper la dormancia de las semillas



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25

Puede iniciar el desarrollo de frutas sin semilla

Puede retrasar la senescencia en hojas de cítricos

Dado que se ha reportado que en raíces transformadas, solo y en combinación con

auxinas, promueve la acumulación de biomasa mediante la elongación y crecimiento de la

raíz primaria y el desarrollo de raíces secundarias, en concentraciones que varían de

acuerdo a la especie vegetal y línea celular de raíces transformada, en este trabajo se

evaluará el efecto de este compuesto en combinación con varias auxinas. Estas últimas

promueven la elongación celular (George, Hall et al., 2008). En orden ascendente de

potencia son el ácido indolacético (IAA), el ácido naftalenacético (NAA) y el ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4-D). Este último suprime fuertemente la organogénesis y se usa

para:

Estimular la iniciación de raíces y desarrollo de raíces secundarias

Estimular el crecimiento de flores

Suprimir la senescencia de hojas

Las raíces transformadas muestran una alta sensibilidad a las auxinas. Utilizando

únicamente auxinas se reporta una desorganización de la morfología radicular, sin embargo

la combinación y balance de auxina-citocinina puede conducir a un aumento en la biomasa.

Por otro lado, la adición de auxinas únicamente puede incrementar la biomasa en cultivos

de raíces transformadas.

Las citocininas promueven la división y diferenciación celular. Entre las más

comunes están la cinetina (Kin) y la benzilaminopurina (BAP). Su efecto se debe a que:

Estimulan división celular

Estimulan morfogénesis

Estimulan la expansión de hojas

En cultivos de raíces transformadas estos reguladores promueven una

desorganización celular cuando se utilizan solas; sin embargo en combinación con auxinas

pueden promover la acumulación de biomasa (George, Hall et al., 2008).

Se han utilizado combinación de auxinas y citocininas en la inducción de formación

y propagación de cultivos de tejidos; por ejemplo, explantes de Brassica nigra en un medio

con NAA 0.5 mg/l y 2.0 mg/l BAP o 2.0 mg/l Kin los cuales produjeron abundantes raíces



CINVESTAV – IPN

26

pilosas. La mejor respuesta fue con la combinación de NAA 0.5 mg/l y Kin 2.0 mg/l. Las

raíces tuvieron una apariencia algodonosa (Das, Chandra et al., 2010).

En estudios para establecer cultivos de embriones de Brassica napus a parir de

explantes de hipocotilo en medio MS, una combinación de varias concentraciones de 2,4-D

y 2 mg/l de BAP produjo embriones somáticos, mientras 1-2 mg/l IBA y 1 mg/l BAP o

solamente 2mg/l de BAP produjo callos (Chamandosti, Majd et al., 2006). Partiendo de

explantes de cotiledones en medio MS se probaron siete diferentes brassicas (campestri,

nigra, oleracea, hirta, carinata, juncea y napus) encontrándose que los efectos

predominantes son el tipo de auxina, sus concentraciones y la especie utilizada. El rango

para la formación de callos se encuentra utilizando 1 mg/l de 2,4-D y las raíces son

inducidas preferentemente utilizando de 2-5mg/l NAA (Murata and Orton 1987). Por otro

lado, partiendo de raíces transformadas generadas de explantes de hoja y peciolo

transformadas con la cepa de A. rhizogenes A4T se regeneraron plantas transgénicas de B.

oleracea y B. campestri, generando brotes a partir de estas utilizando 5 mg/l BAP y 5 mg/l

NAA en medio LS-N, y co-cultivandolos hasta llegar a plantas de invernadero (Christey,

Sinclair et al., 1997).

Específicamente para variedades de Brassica oleracea se tiene reportado que

partiendo de protoplastos de coliflor (var. botrytis) utilizando medio B5 con 0.02 mg/l de

NAA y 2 mg/l BAP se producen raíces que con después de varias resiembras forman brotes

(Delpierre and Boccon-Gobad 1992). Para esta misma variedad se ha utilizado para su

propagación in vitro medio MS con BAP y GA3 (Bhalla and Weerd de 1999). Otra variedad

de oleracea (costata DC) utiliza medio liquido MS con 2 mg/L BAP y 0.1 mg/L NAA para

obtener brotes a partir de explantes de segmentos internodales, 1µM de GA3 para cultivo de

raíces y 1-2 mg/l 2,4-D en medio MS para obtener callos (Taveira, Pereira et al., 2009).

Específicamente para Brócoli se reporta que partiendo de explantes de cotiledones e

hipocotilo en medio MS suplementado con 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BAP se

inducen brotes/callos y en medio MS con 0.2 mg/l NAA se inducen raíces (Qin, Li et al.,

2007).

Con lo anterior es remarcable el uso del medio de cultivo adecuado y la

combinación de los reguladores de crecimiento para promover la acumulación de biomasa y

producción de proteínas de interés como en el caso de este proyecto la producción de



CINVESTAV – IPN

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insulina, en cultivos de raíces transformadas. Estas condiciones de cultivo pueden ser

escaladas a distintos niveles, ya sea cultivo en matraz o en biorreactores a nivel laboratorio

(en este caso), planta piloto o industrial.

En el caso de los cultivos en matraz Erlenmeyer, es difícil modificar el ambiente de

cultivo con estos matraces y se utilizan solo para cultivos de pequeña escala debido a las

limitaciones de aporte de aire. Un biorreactor equipado con fuente de aire, pH, temperatura,

es utilizado principalmente para el cultivo de raíces transformadas a gran escala (Choi, Kim

et al., 2006).

2.5 Brassica oleracea var. italica (Brócoli) como modelo de expresión

Brassica oleracea var. italica (Brócoli), es una crucífera muy semejante a la coliflor, pero

más alta y de inflorescencia verde (Figura 11). Presenta un mayor número de hojas, rígidas

y estrechas y es menos exigente en suelos y clima. Las hojas son de hasta 50 cm de

longitud y 30 cm de ancho, y varían en número, de 15 a 30, según el cultivar. Presentan

pecíolo más desarrollado que el repollo, alcanzando un tercio de la longitud total de la hoja.

La lámina es entera, de borde fuertemente ondulado y presenta un tono verde-grisáceo. En

la base de la hoja puede dejar a ambos lados del pecíolo pequeños fragmentos de lámina. El

tallo principal termina en la inflorescencia primaria, conformada por flores dispuestas en un

corimbo principal o primario, denominado pan o pella, que corresponde a la parte

comestible.

A partir de ramificaciones de las yemas axilares puede desarrollar inflorescencias

laterales secundarias, de menor tamaño que la principal. Los corimbos son verde claro a

púrpura, según el cultivar. Mantienen la estructura compacta por poco tiempo, hasta que se

elongan los pedúnculos y maduran las flores. La silicua protege la formación de más de

diez semillas, las que son redondas, de color pardo oscuro a rojizo y pequeñas (Cardoza

and Stewart 2004).



CINVESTAV – IPN

28

Por ser originaria de una región sub-húmeda templada, está adaptado para soportar

condiciones de temperaturas moderadas, con agua fácilmente disponible, humedad relativa

media a alta y luminosidad moderada. La planta tolera heladas suaves, pero al estar la

inflorescencia presente se produce congelación y posterior pudrición de flores.

Por otra parte, ha sido calificado como la hortaliza de mayor valor nutritivo por

unidad de peso de producto comestible. Su aporte de vitaminas, principalmente C, B2

(riboflavina) y pro-vitamina A, es elevado; además suministra cantidades significativas de

minerales como Ca, K y especialmente P (Peirce 1987). Algunas variedades del género

Brassica, como brócoli y coliflor, contienen cantidades sustanciales de isotiocianatos (la

mayoría en su forma de sus precursores glucosinolatos) algunos de los cuales son muy

potentes inductores de enzimas de fase 2, estas enzimas son de desintoxicación y protegen

contra cáncer, mutaciones y otras formas de toxicidad como las formas reactivas del

oxígeno (Fahey, Zhang et al., 1997).

Figura 11.Brócoli (Brassica oleracea var. italica) (Peirce 1987).

En los últimos 30 años se ha realizado mucho trabajo para la mejora genética del

brócoli utilizando los métodos de tradicionales de selección y los de tejidos y células

vegetales. Se ha obtenido transgénicos de B. oleracea por varios métodos con

Agrobacterium reportados por varios grupos de investigación (David and Tempé 1988), La

mayoría de los autores, sin embargo, han informado de dificultades en una o varias de las

etapas de la transferencia de genes y la regeneración, lo que complica seleccionar uno de



CINVESTAV – IPN

29

los protocolos como método de elección para la transformación de B. oleracea. No obstante

se han implementado una serie de mejoras en las etapas cruciales de transformación con

Agrobacterium rhizogenes, especialmente usando coadyuvantes como la arginina,

manopina y acetosiringona (Henzi, Christey et al., 2000). Dentro del grupo de trabajo se

han establecido diversos cultivos de raíces transformadas de brócoli, para el estudio de su

potencial para la producción de proteínas heterólogas como la hormona de crecimiento

humano, la insulina humana y la proteína L1 del virus del papiloma humano (García Lopez,

2008; García Reyes, 2009; Jimenez Antaño 2009). En el caso de la insulina, dichos

cultivos son el antecedente directo de este proyecto. Se establecieron cultivos de raíces de

Brócoli transformadas con el cDNA del gen Ins. El gen se aisló del vector pDNR-Lib-Ins

que lleva el cDNA del gen In.. Este vector que también lleva el gen de resistencia a

cloranfenicol fue extraído y sometido a restricción con las enzimas correspondientes que

flanquean el cDNA. Se amplificaron varias regiones del vector usando juegos de oligos

denominados preproinsulina y proinsulina, diseñados específicamente para añadir la

secuencia de las enzimas Nco I y Bgl II al cDNA del gen Ins. Por otra parte se recuperó el

vector binario pCAMBIA 1105.1 de una cepa de E. coli y se realizó la restricción con las

enzimas correspondientes para obtener extremos complementarios entre el vector y los

amplificados preproinsulina y proinsulina. Se realizó la ligación entre ellos (preproinsulina-

pCAMBIA 1105.1 y proinsulina-pCAMBIA 1105.1). Los productos de ligación fueron

clonados en E. coli DH5α por electroporación. Las cepas de E. coli transformadas se

crecieron en presencia de estreptomicina y las clonas resultantes se utilizaron para la

amplificación de los constructos pCppIns-bgr y pCpINS-bgr. Estos constructos una vez

caracterizados por PCR fueron clonados en Agrobacterium rhizogenes para la inducción de

raíces aéreas de Brócoli transformadas con el cDNA del gen Ins.

Por otro lado, se germinaron semillas de Brócoli en medio mineral semisólido B5 y

las plántulas que mostraron mayor cantidad de raíces fueron utilizadas para establecer

cultivos de raíces no transformadas en medio líquido. Para la inducción de raíces

transformadas, varias plántulas de 3-4 semanas de edad fueron infectadas por punción con

las cepas Agrobacterium rhizogenes; LBA9402, pC1105.1, pCppINS-bgr y pCpINS-bgr.

Del punto de punción se obtuvieron explantes con raíces transformadas que se propagaron



CINVESTAV – IPN

30

en medio SH. El tejido propagado se usó para establecer cultivos en medio líquido, en

ausencia o presencia de higromicina y evaluar la reacción de GUS según el caso. Así se

obtuvieron líneas de raíces transformadas con distintos fragmentos del cDNA del gen Ins

las cuales mostraron propiedades de interés para estudiar la producción de insulina

modificando el medio de cultivo y las condiciones de proceso, tanto a nivel matraz como a

nivel biorreactor.



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3 JUSTIFICACIÓN

De lo anterior, es claro el potencial de la biotecnología vegetal en la producción de

proteínas con actividad terapéutica y la necesidad de incrementar la producción de insulina

para hacerla accesible a toda la población que la requiera. Aunque los métodos de

producción usando Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae han experimentado un

considerable refinamiento y optimización en las últimas décadas (Nykiforuk, Boothe et al.,

2006), estos no han alcanzado los niveles de producción para atender las necesidades de

toda la población con diabetes (IDF 2007; Olaiz, Aguilar et al., 2007). En este sentido, la

biotecnología vegetal ofrece la posibilidad de coadyuvar a esos niveles de producción y de

hacer llegar el producto a cualquier parte del mundo, incluyendo poblaciones marginadas

(Deckers, Moloney et al., 1999; Calva, Esparza et al., 2002; Calva and Pérez 2005). Otra

ventajas es que tanto los cultivos de células, tejidos y órganos en suspensión, como plantas

transgénicas completas pueden ser escalados a niveles industriales y usarse como fuente de

esta y otras proteínas terapéuticas (Gutierrez, Taylor et al., 1998; Hoshino and Mii 1998;

Perez and Ochoa 1998; Deckers, Moloney et al., 1999). En el trabajo de Maestría (García

Reyes 2009) se establecieron cultivos de raíces de Brassica oleracea var. italica (Brócoli)

transformadas con el cDNA del gen de la insulina humana. Así, en el presente proyecto se

investigará el potencial de estos cultivos sobre la expresión y producción de esta proteína

así como las condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento y desarrollo del

tejido transformado. Dadas las propiedades de las células vegetales en la biosíntesis de

proteínas heterólogas con requerimientos postraduccionales se espera que la proteína

heteróloga sea fisiológicamente activa.



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4 HIPÓTESIS

Las raíces transformadas de Brassica oleracea var itálica expresan los polipéptidos

de proinsulina e insulina bajo condiciones de cultivo apropiadas para su crecimiento

y desarrollo

5 OBJETIVOS

5.1 GENERAL

Establecer un proceso para la expresión de proinsulina e insulina humana

por cultivos de raíces transformadas de Brassica

oleracea var itálica

a nivel laboratorio

5.2 Objetivos Específicos

1) Evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de explantes de

brócoli para el establecimiento de cultivos de raíces

2) Establecer y seleccionar líneas de raíces transformadas con el cDNA del gen Ins

humano completo y el de la fracción codificante para la proinsulina

3) Evaluar la presencia de insulina y proinsulina en raíces transformadas

4) Integrar los resultados para proponer condiciones básicas de cultivo para expresar la

proinsulina e insulina a partir de cultivos de raíces transformadas



CINVESTAV – IPN

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6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

El plan de trabajo planteó dos temáticas a desarrollar para alcanzar los objetivos del

proyecto (Esquema 1).

Esquema 1. Estrategia Experimental. Como primera etapa se plantean las actividades correspondientes al

establecimiento de los cultivos. En la segunda etapa, se pretende caracterizar los cultivos (sus condiciones

nutricionales y de proceso) y la caracterización parcial de la proteína.

En una primera etapa, fue necesario caracterizar los cultivos, es decir, las condiciones

nutricionales y de proceso básicas para el desarrollo de los cultivos, tales como medio de

cultivo semisólidos y líquido, efecto del balance de fitohormonas reguladoras del

crecimiento, aireación y agitación constante, Lo anterior con respecto a las cinéticas de

crecimiento. Trabajando a nivel matraz. La segunda y paralela etapa abarcó los detalles

correspondientes al estado molecular de transformación de los cultivos con el cDNA del

gen INS humana, así como la expresión, purificación y parcial caracterización de las

proteínas de interés. Lo anterior dio paso a las dos vertientes que constituyen las bases para

establecer un proceso de producción a nivel matraz en laboratorio.



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7 MATERIALES Y MÉTODOS

7.1 Material Biológico

7.1.1 Cepas bacterianas

Clona 3950204 (Open Biosystems, USA) de E. coli llevando el cDNA del gen de la

insulina humana (Ins) insertado en el plásmido pDNR-Lib.

Cepa de E. coli DH5α para mantener y propagar los plasmidos correspondientes.

Cepa de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 la cual contiene el plásmido pRi-1855

del tipo agropina (Spano, Pomponi et al., 1982; Tzfira and Citovsky 2006).

Clonas de E. coli pCppINS-bgr, E. coli pCpINS-bgr, E. coli pCAMBIA 1105.1, A.

rhizogenes pCppINS-bgr, A. rhizogenes pCpINS-bgr, y A. rhizogenes 1105.1. Las cuales

contienen las construcciones de interés.

7.1.2 Material Vegetal

Los explantes fueron obtenidos de plántulas de Brócoli germinadas a partir de

semillas adquiridas de la casa happy flower.

7.2 Material para experimentos de Biología Molecular

El plásmido pDNR-Lib que contiene el cDNA del gen de la insulina humana (Ins)

fue obtenido de Open biosystems. El vector binario pCAMBIA 1105.1 fue obtenido de la

casa Cambia. Los siguientes oligos directo y reverso fueron diseñados previamente en el

trabajo de Maestría:

UNIVERSALES M13 extendidos

M13D: 5 ́TGGTCTCTCATGGGTAAAACGACGGCCAGT 3´

M13R: 5 ́TGGTCTCCGATCTCAGGAAACAGCTATGAC 3´

PREPROINSULINA

ODEINS: 5 ́TTTGGTCTCTCATGGAGCCCTCCAGGACAGGC 3´

OREINS: 5 ́TTTGGTCTCTGATCTGTTGGTTCAAGGGCTTT 3´

PROINSULINA

ODESPINS: 5 ́TTTGGTCTCTCATGGTTTGTGAACCAACACCT 3´

OREINS: 5 ́TTTGGTCTCTGATCTGTTGGTTCAAGGGCTTT 3´



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T4 DNA ligasa (Invitrogen 15224-025), para las ligaciones .

Enzimas de restricción EcoR I, Xho I, Nco I, Bgl II, Eco31 I (New England ).

Construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr, que contienen los fragmentos

preproinsulina y proinsulina integrados al vector binario pCAMBIA1105.1. Generadas en

el proyecto de maestría.

7.3 Reactivos generales, medios de cultivo y kits

SOLVENTES

Agua α, Fenol, Cloroformo, Etanol

VARIOS

NaHPO4, Triton X-100, EDTA, DMF, 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronido

(X-Gluc), NaOH, Nitrógeno líquido, Tris-HCl, DTT, PVPP, PMSF, ZnSO4,

CaSO4, MgSO4, Reactivo de Bradfford (Sigma-Aldrich B6916), Insulina

comercial (NOVO®)

MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS

Medio LB (Luria-Bertani), para crecer las cepas de Escherichia coli DH5α y

Agrobacterium rhizogenes LBA9402, las clonas 3950204 de E. coli, E. coli

pCppINS-bgr, E. coli pCpINS-bgr, E. coli pCAMBIA 1105.1, A. rhizogenes

pCppINS-bgr, A. rhizogenes pCpINS-bgr, y A. rhizogenes 1105.1

Agar, como agente solidificante

MEDIOS DE CULTIVO VEGETAL

Gamborg´s B5 (Sigma-Aldrich G5768), para germinar semillas de Brocoli

Vitaminas (Sigma-Aldrich M7150), adicionadas al medio B5 y MS

Schenck y Hildebrandt conocido como SH (Sigma-Aldrich S6765), para

cultivar explantes

Vitaminas (Sigma-Aldrich S3766), adicionadas al medio SH

Murashige and Skoog (MS) modificado o libre de NH4 (Sigma-Aldrich

M8280), para experimentos de diferenciación

Fitagel o gelrite, como agente solidificante para medios vegetales



CINVESTAV – IPN

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REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL

NAA (Sigma-Aldrich N0640), BAP (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich 3408),

GA3 (Sigma-Aldrich G7645)

ANTIBIOTICOS

Estreptomicina , Ampicilina, Kanamicina, Cloranfenicol, Cefotaxima,

Higromicina

KITS

PureLinkTM

(Invitrogen K2100-10) basado en la técnica de Birman y Dolly, para

extracción plasmidica

PlatinumR Super Mix High Fidelity (Invitrogen 12532-016) para amplificación

por PCR

Kit de ELISA

7.4 Equipos

Espectrofotómetro CAMSPEC (mod. M330)

Termociclador TECHNE (mod. TC312) PlatinumR Super Mix High Fidelity

(Invitrogen 12532-016)

Electroporador y cubeta de electroporación de 2mm

FPLC

7.5 Inducción de raíces transformadas

El objetivo fue proveer de manera constante material vegetal nuevo para actividades

posteriores. El material vegetal consistió en plántulas de Brócoli obtenidas mediante la

germinación de semillas en medio mineral semisólido (1.8 g/l fitagel) Gamborg´s B5

(Sigma-Aldrich G5768) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) pero sin

reguladores de crecimiento. Las plántulas de 3-4 semanas de germinación y sin hojas

verdaderas se usaron para la transfección por punción en hipocotilos por la generación de

una herida que desencadena las señales químicas entre planta-Agrobacterium promoviendo

así la transfección del TRi-DNA del plásmido bacteriano al genoma de la planta (Tzfira and



CINVESTAV – IPN

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Citovsky 2006) con las cepas antes mencionadas (Agrobacterium rhizogenes LBA9402,

Agrobacterium rhizogenes pC1105.1, Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y

Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr).

Para generar las líneas de raíces transformadas, después de una semana de la

infección se tomaron explantes de 1-1.5 cm de largo de los sitios de punción los cuales

fueron resembrados (de 2 a 3 veces) para propagar las raíces en medio mineral semisólido

(1.8 g/l fitagel) Schenck y Hildebrandt SH (Sigma-Aldrich S6765) adicionado con

vitaminas (Sigma-Aldrich S3766) y cefotaxima (400, 300 y 100 µg/ml en las distintas

resiembras) para eliminar la bacteria e higromicina como presión de selección (100 µg/ml)

de raíces transformadas. Las raíces transformadas se cultivaron en frascos con medio

mineral SH adicionado con vitaminas y adicionado con 1.8 g/l de fitagel. Se resiembra 1 g

de tejido meristemático para la conservación de las líneas.

Para cultivos en medio líquido, las líneas de raíces transformadas se resembraron

periódicamente, de dos a tres semanas, en medio mineral SH adicionado con vitaminas e

higromicina (100 µg/ml) en matraces de 125, 250 y 500 ml de volumen de operación con

¼ del volumen de medio mineral e inoculados con 1, 3 y 6 g de biomasa respectivamente.

Las raíces resultantes son sometidas a tinción histoquímica por la prueba de GUS

(descrita en la sección 7.2) y aquellas positivas a esta reacción fueron establecidas en

cultivo sumergido a nivel matraz en medio mineral SH (Sigma-Aldrich S6765) adicionado

con vitaminas (Sigma-Aldrich S3766), y cefotaxima para eliminar la bacteria (100 µg/ml).

7.6 Experimentos con explantes

Plántulas mayores a un mes y con hojas verdaderas se usaron para la obtención de

explantes de raíces, hojas e hipocotilo para el establecimiento de cultivos de raíces sin

transformar pare estudiar el efecto de reguladores del crecimiento sobre la diferenciación de

explnates. Se utilizó medio mineral SH (Sigma-Aldrich S6765) o Murashige and Skoog

(MS), según lo indicado en cada experimento.



CINVESTAV – IPN

38

7.7 Determinación de la transformación por GUS

Este ensayo se realizó con el objetivo de comprobar la transformación de las raíces

con la proteína reportera, la cual está regida por el mismo promotor que la insulina. Para

ello a todas las líneas de raíces se les realizó la tinción histoquímica para detectar la

actividad de GUS para comprobar la transformación genética. Para ello se colocó un

fragmento de tejido radicular (1 cm) en 120 µl de buffer de tinción (50 mM NaHPO4 pH 7,

0.5 % Triton X-100, 10 mM EDTA) y 5 µl X-Gluc (20 mM X-Gluc en DMF). Se sometió

al vació por 1 hr, se incubo a 37 ºC toda la noche y se observo la tinción del tejido bajo

microscopio óptico a 25, 100, 160 y 200 X según el caso (Jefferson 1987; García 2009). El

sustrato para la tinción histoquímica de la actividad de β-glucuronidasa en tejidos y células

es 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronido (X-Gluc). Este sustrato forma un precipitado azul

en el sitio de actividad enzimática. La actividad enzimática de la glucuronidasa sobre el X-

gluc que es el ácido glucurónico (Karcher 2002), no es coloreado, por ello se usa un

producto derivado: el indoxil que reacciona con el oxigeno y produce, mediante una

dimerización oxidativa, el colorante insoluble índigo 4,4-dicloro-5,5-dibromoindigo

(Jefferson 1987; Karcher 2002).

7.8 Estudios para evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de explantes de brócoli

Con el objetivo de investigar el comportamiento de los explantes de brócoli ante el

estímulo de reguladores de crecimiento para la formación y propagación de raíces normales

y transformadas de Brócoli se ejecutó un diseño de cuadrados latinos de tres factores a

cinco niveles cada uno, produciendo 25 tratamientos con tres repeticiones con tres

explantes de hoja, hipocotilo y raíz (Tabla 3). Se prepararon 2.5 litros de medio de

regeneración, Murashige and Skoog (MS) modificado o libre de NH4 (Sigma-Aldrich

M8280) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) para los 25 tratamientos. Las

soluciones stock para cada regulador de crecimiento se llevaron a un volumen de 25 ml y

una concentración de 1 mg/ml para cada uno; NAA (Sigma-Aldrich N0640) usando como



CINVESTAV – IPN

39

diluyente agua α y como solvente NaOH 1N, BAP (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich 3408)

diluyente agua α y como solvente NaOH 1N y GA3 (Sigma-Aldrich G7645) diluyente agua

α y como solvente etanol.

Tabla 3. Efecto de los reguladores de crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja,

cotiledones y raíz de plántulas de brócoli

Medio MS

(3% sacarosa, 1.8 g/l fitagel)

NAA (Auxina) mg/L

0 0.05 0.5 5.0 10.0

B

A

p

(CITOCININA)

mg/L

0 A B C D E

0.05 B A E C D

0.5 C D A E B

5.0 D E B A C

10.0 E C D B A

GA3: A = 0, B = 0.05, C = 0.5, D = 5, E = 10 mg/l.

Teniendo como variables de repuesta (cualitativas) diferenciación de tejido formación

de callo, raíz y brote; (cuantitativas) peso fresco y peso seco.

7.9 Cinéticas de crecimiento a nivel de matraz

Este experimento se realizó con el objetivo de investigar el comportamiento sobre el

crecimiento de cultivos no transformados y transformados así como el consumo de

nutrientes del medio SH y el efecto del ácido naftalenacético (NAA) sobre la producción de

proteína total soluble (PTS) por las raíces transformadas. Igualment, con este experimento

se determinó el momento adecuado para la extracción de la proteína heteróloga. Cada

cinética se realizó con 30 unidades experimentales (matraces de 125 ml) con un inoculo de

4 y 13 g peso fresco/L (raíces no transformadas de brócoli y raíces transformadas con 1105

respectivamente) con y sin 0,05 mg/l de NAA. Se determinó acumulación de biomasa por

peso fresco y peso seco, cantidad de proteína total soluble tanto en medio de cultivo como

en biomasa, y están por determinarse consumo de nutrientes (fuente de carbono, amonio,

nitrato y fosfato) así como la actividad de proteínas como proteasas y glucuronidasa.



CINVESTAV – IPN

40

7.10 Investigación de la presencia del cDNA en el DNA genómico del tejido vegetal

Con el objetivo de investigar la inserción del cDNA de insulina en el

genoma vegetal, se realizó la extracción de DNA genómico del tejido de cada línea de

raíces transformadas mediante la técnica reportada por K. Edwards (Edwards, Johnstone et

al., 1991) con algunas modificaciones. El tejido vegetal fresco (100 mg) se maceró en un

eppendorf de 1.5 ml con una espátula de 15-20 s, se añadieron 500 µl de Buffer de

Extracción (200 mM Tris HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA y 0.5% SDS), se agitó

en un vortex por 5 s y se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 h. Después se

centrifugó a 13000 rpm por 2 min, se recuperó el sobrenadante en un nuevo tubo y se

añadió 1 ml de isopropanol (2:1) se mezcló por inversión y se dejó reposar en frío 1 h, se

centrifugó a 13 000 rpm por 5 min, se eliminó el sobrenadante y se secó el pellet al vacio,

finalmente se resuspendió en 25 µl de TE y se determinó su concentración y pureza

haciendo una dilución 10:1000 fragmento-agua α y midiendo absorbancia en un

espectrofotómetro Camspec (mod. M330) a 260 nm y 280 nm respectivamente. Los

resultados de la amplificación se analizaron por electroforesis en gel de agarosa.

El DNA genómico se utilizó como templado para PCR utilizando un

termociclador TECHNE (mod. TC312) con el kit Taq DNA polimerasa recombinante

(Invitrogen 11615-010) en una mezcla de reacción con concentraciones finales de Buffer

1x, 0.2 mM de dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM de cada oligo, 1 U Taq y 100 ng de

templado en un volumen total de 25 µl. Estas mezclas de reacción de sometieron a

condiciones de PCR de; 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 30 s de alineamiento y 72

ºC 30 s de extensión, en 40 ciclos. Esto para los amplicones de preproinsulina y

proinsulina observando los resultados por electroforesis en gel de agarosa. Para el amplicon

de 800 pb de pCAMBIA 1105.1 se utilizó el mismo kit Taq DNA polimerasa recombinante

(Invitrogen 11615-010) y las concentraciones ya mencionadas bajo condiciones de PCR

de; 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 30 s de alineamiento y 72 ºC 20 s de extención,

en 35 ciclos.



CINVESTAV – IPN

41

7.11 Extracción y cuantificación de proteína total soluble

Se maceró en un mortero el tejido radicular (1 g) en presencia de nitrógeno líquido

hasta obtener un polvo fino, se colocó en tubos falcon de 50 ml y añadiendo 3 ml de buffer

de extracción (25mM Tris-HCl pH 7, 2mM EDTA, 1mM DTT, 1.5 % peso/vol PVPP, 1.6

mM PMSF y Triton X-100 (0.25 % vol/vol) por gramo de peso fresco de tejido, se agito en

baño de hielo por 1 hr y se centrifugó a 10 000 rpm por 20 min y se recuperó el

sobrenadante para determinar cantidad de proteína total soluble por el método de Bradfford

(Sigma-Aldrich B6916).

7.12 Inmunoensayo de ELISA para cuantificación de proteína

Con el objetivo de estimar la cantidad de proteína heteróloga presente en los

extractos proteicos de raíces, tanto en biomasa como en el medio de cultivo, se

implementaron ensayos de ELISA utilizando un kit de Invitrogen KAQ1251. Las

microplacas fueron leídas en un espectrofotómetro a 450 nm en un lector 680 de Bio-Rad.

El Kit utilizado detecta Insulina Humana sin reacciones cruzadas con proinsulina o

con otras proteínas debido a que está compuesto por tres anticuerpos monoclonales que

detectan distintos epítopes de insulina. Las muestras y estándares son colocadas en las

microplacas impregnadas con los anticuerpos se añade un segundo anticuerpo (que

reconoce a los anteriores) marcado con peroxidasa de rábano (HRP), se incuba y

posteriormente se lava, para añadir finalmente el sustrato (tetrametilbenzidina TMB-H2O2).

La reacción se detiene con HCl, y el producto de reacción un sustrato colorido que se lee

espectrofotométricamente donde la intensidad de color es directamente proporcional a la

cantidad de insulina.

7.13 Ensayos de electroforesis (PAGE)

Con el objetivo de investigar la presencia de las proteínas heterólogas en los

extractos de raíces transformadas y establecer condiciones experimentales para evaluar la



CINVESTAV – IPN

42

expresión de proteínas heterologas en los extractos se realizaron Ensayos de electroforesis

en geles de poliacrilamida (PAGE). Las muestras de extractos proteicos se cargaron en

geles de poliacrilamida (16.5% T; 6% C; 6 M de urea) en condiciones desnaturalizantes-

reductoras (SDS-PAGE) y no desnaturalizantes (PAGE) con un buffer de Tris-Tricina y

bajo condiciones reportadas en la literatura (Schägger and Von Jagow 1987; Schägger

2006); las cueles favorecen resolver proteínas de 1-100 kDa con buena resolución de

bandas. Esta técnica nos permite observar el perfil proteico de los diferentes extractos

obtenidos de cultivos transformados y sin transformar así como la expresión en los cultivos

correspondientes de proteína heteróloga con una sensibilidad entre µg hasta 500 ng para el

caso de tinción con Coomasie o incluso hasta los 100 ng por tinción con nitrato de plata.

7.14 Concentración de proteína en extractos proteicos

Para concentrar los extractos proteicos previos al proceso de purificación, las

muestras fueron fraccionadas de acuerdo al peso molecular y desaladas pasando los

extractos proteicos a través de tubos Amicon Ultra. Las presencia y cantidad de proteínas se

monitoreó por PAGE. Los tubos Amicon Ultra utilizados fueron UFC900324, UFC901024

y UFC903024 (Millipore) compuestos por membrana de celulosa regenerada que por con

ultrafiltración tangencial rinden tamaños de corte de 3, 10 y 30 kDa, respectivamnte, con

respecto a proteínas globulares bajo condiciones de 12 ml de muestra por 25 min a 4ºC y

5000 g para un corte de 10 y 30 kDa y por 45 min para un corte de 3 kDa.

A las fracciones, tanto retenidas (concentradas) como filtradas (diluidas), se les

determino concentración de proteína total soluble por el método de Bradford, concentración

de proteína heteróloga por inmunoensayo de ELISA (Invitrogen KAQ1251) y se analizó

perfil proteico por SDS-PAGE (reductor) como se describió en secciones anteriores.

7.15 Purificación de las proteínas heterólogas

Se estableció un proceso de recuperación y purificación de las proteína heterólogas

por FPLC, equipado con una columna de exclusión molecular para resolver la mezcla de

proteínas contenidas en la fracción de 30-3 kDa. Se utilizó el equipo ÄKTApurifier (UPC



CINVESTAV – IPN

43

900 GE) con sistema de control UNICORN realizando la detección a 254 nm utilizando la

lámpara de Hg; este equipo fue acoplado a una columna de filtración en gel Superdex 75

10/300 GL (17-5174-01 GE) con un volumen de columna de 24 ml, límite exclusión de 1 x

105, un rango de separación optimo de 3-70 kDa para proteínas globulares, un rango de

flujo recomendado de 0.5-1.0 ml/min máximo 1.5 ml/min, una presión máxima de 1.8 MPa,

volúmenes de muestra de 25-500 µl. Las condiciones de elución fueron bajo un gradiente

isocrático, 1.5 volumen de columna con un buffer de fosfatos 50 mM, 0.15 M NaCl, pH

7.0, un flujo de 0.4 ml/min y 300 µl de volumen de muestra.

Los marcadores de peso molecular empleados fueron: A) Transferrina (80 kDa) 1

mg/ml, Apomioglobina (17 kDa) 1 mg/ml, Ribonucleasa A (13.7 kDa) 1 mg/ml y

Citocromo C (12.4 kDa) 1 mg/ml; B) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml, Lisozima (14.3 kDa) 0.5

mg/ml y Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml; C) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml, Insulina (5.8 kDa) 1

mg/ml y Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml. Así como la muestra de 30-3 kDa de la línea p14

transformada con el cDNA de proinsulina. Lo anterior en un volumen total de 300 µl.

Colectando fracciones de 1 ml en cada corrida.

7.16 Western Blot para proteínas purificadas por FPLC

Con el objetivo de detectar las proteínas heterólgas en las fracciones purificadas por

FPLC se realizaron ensayos de Western Blot utilizando un anticuerpo primario precedido

de una separación en geles de acrilamida, según lo reportado previamente por García López

(2014).

Las muestras se cargaron en geles de poliacrilamida (16.5% T; 6% C; 6 M de urea)

en condiciones desnaturalizantes- no reductoras (SDS-PAGE) como se mencionó antes. La

electro transferencia a membrana de PVDF se realizó a 253 mA, por 60 min. 4ºC. Se

bloqueó la membrana con 5% de leche libre de grasa durante toda la noche y

posteriormente se incubó por 1 hr a temperatura ambiente con el anticuerpo primario a una

dilución 1:2000, según lo recomendado por el proveedor del anticuerpo, así como con el

anticuerpo secundario (dilución 1:15000 recomendado) marcado con HRP. Para el revelado

y detección se añadió el sustrato LUMINATA FORTE (WBLUF0100 de Millipore) y se



CINVESTAV – IPN

44

visualizó la quimioluminiscencia por revelado en las placas fotográficas Kodak (MXB

6040331).



CINVESTAV – IPN

45

8 RESULTADOS

8.1 Efecto de reguladores de crecimiento sobre diferenciación de explantes y formación de raíces

Con el objetivo de investigar si con el uso de reguladores de crecimiento se podía

favorecer el establecimiento de raíces transformadas en los cultivos, mediante un diseño de

cuadrados latinos (Tabla 4), se evaluó el efecto de tres reguladores del crecimiento (BAP,

NAA y GBA) a cinco niveles sobre la diferenciación de explantes, específicamente hacia la

formación de raíces a partir de explantes de raíz, hoja e hipocotilo (Figuras 12-19). Los

tratamientos se realizaron aleatoriamente por triplicado colocando los tres tipos de

explantes en cada unidad experimental (Cajas de Petri de 12 cm con 15 ml de medio de

cultivo MS suplementado con 30 g/l de sacarosa) y los resultados sobre la diferenciación de

tejido hacia la formación de callo, raíz y brotes se evaluaron a la primera (Figuras 12) y

segunda (Figura 13) semana de incubación. A las dos semanas de iniciado el experimento

las observaciones sobre la diferenciación fueron más evidentes, observándose respuestas

diferentes para cada tipo de explante. Estas observaciones sobre el efecto de los reguladores

sobre la diferenciación de explantes se apreciaron con más detalle produciendo graficas de

contorno (Figuras 14, 16, 18) y superficie de respuesta (15, 17, 19). En general, la zona que

favorece la formación de raíz a partir de explantes de raíz (Figura 14A), corresponde a las

concentraciones de 0 y 5 mg/l de BAP combinada con 0.05-5.0 mg/l de NAA. A

continuación se presentan los resultados en detalle para cada tipo de explante.

8.1.1 Explantes de raíz

En los tratamientos con explantes de raíces (Figuras 12 y 13), se observó que en los

tratamientos 2 (0.05 mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 3 (0.5 mg/l NAA - 0

mg/l BAP – 0.5 mg/l GA3 ) se favoreció la ramificación del tejido radicular, mientras que

en los tratamientos 6 (0 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 7 (0.05 mg/l

NAA – 0.05 mg/l BAP – 0 mg/l GA3 ) se favoreció sólo la elongación del explante. Como

se aprecia en las figuras 12 y 13, en ambos casos no se observó la formación de callos.



CINVESTAV – IPN

46

Tabla 4.Tratamientos del diseño experimental para evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre

el crecimiento y diferenciación de tejido en explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli

Medio MS

(3% sacarosa,1.8 g/l fitagel)

NAA (Auxina) mg/L

0 0.05 0.5 5.0 10.0

BAP

(CITOCINA)

mg/L

0 TI

A

100 ml MS

0 NAA

0 BAP

0 GA3

T2

B

99.99 ml MS

5 µl NAA

0 BAP

5 µl GA3

T3

C

99.9 ml MS

50 µl NAA

0 BAP

50 µl GA3

T4

D

99 ml MS

500 µl NAA

0 BAP

500 µL GA3

T5

E

98 ml MS

1 mL NAA

0 BAP

1 ml GA3

0.05 T6

B

99.99 ml MS

0 NAA

5 µl BAP

5 µl GA3

T7

A

99.99 ml MS

5 µl NAA

5 µl BAP

0 GA3

T8

E

98.45 ml MS

50 µl NAA

5 µl BAP

1 ml GA3

T9

C

99.445 ml MS

500 µl NAA

5 µl BAP

50 µl GA3

T10

D

98.495 ml MS

1 mL NAA

5 µl BAP

500 µL GA3

0.5 T11

C

99.9 ml MS

0 NAA

50 µl BAP

50 µl GA3

T12

D

99.445 ml MS

5 µl NAA

50 µl BAP

500 µL GA3

T13

A

99.9 ml MS

50 µl NAA

50 µl BAP

0 GA3

T14

E

98.45 ml MS

500 µl NAA

50 µl BAP

1 ml GA3

T15

B

98.945 ml MS

1 mL NAA

50 µl BAP

5 µl GA3

5.0 T16

D

99 ml MS

0 NAA

500 µL BAP

500 µL GA3

T17

E

98.495 ml MS

5 µl NAA

500 µL BAP

1 ml GA3

T18

B

99.445 ml MS

50 µl NAA

500 µL BAP

5 µl GA3

T19

A

99 ml MS

500 µl NAA

500 µL BAP

0 GA3

T20

C

98.45 ml MS

1 mL NAA

500 µL BAP

50 µl GA3

10.0 T21

E

98 ml MS

0 NAA

1 ml BAP

1 ml GA3

T22

C

98.945 ml MS

5 µl NAA

1 ml BAP

50 µl GA3

T23

D

98.45 ml MS

50 µl NAA

1 ml BAP

500 µL GA3

T24

B

98.495 ml MS

500 µl NAA

1 ml BAP

5 µl GA3

T25

A

98 ml MS

1 mL NAA

1 ml BAP

0 GA3

Los 25 tratamientos se realizaron aleatoriamente por triplicado y tres explantes de cada uno de los tres tipos

explantes (hoja, hipocotilo, raíz) colocados en cada unidad experimental (Cajas de Petri de 12 cm con 15 ml

de medio de cultivo MS suplementado con 30 g/l de sacarosa.

A diferencia de los anteriores tratamientos, en todos los demás se observó primero

la formación de callo y enseguida diferenciación a raíz. Este comportamiento fue muy claro

después de dos semanas en los tratamientos donde la concentración de NAA fue de 5-10

mg/l y de 0.05-0.5 mg/l, donde se observó la formación de callo de manera abundante

(Figura 13). Esto se apreció más claramente en las gráficas de contorno y dispersión para la

diferenciación de explantes de raíz (Figura 14). En esas gráficas se puede apreciar que el

GA3 no influyó de manera significativa la formación de raíz a partir del tejido radicular del

explantes. Esto sugiere que el efecto principal de diferenciación podría ser producido por la

BAP, debido al rango más amplio de concentración de ese compuesto donde las que se

favorece la formación de raíz.



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47

Figura 12. Matriz de 25 tratamientos, en la primera semana, para evaluar el efecto de los reguladores de

crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli.

De la superficie de respuesta y dispersión para la diferenciación de explantes de raíz

a raíz (Figura 15), se observan dos máximos un de respuesta del 100% (color naranja) para

formación de raíz en las concentraciones de BAP y NAA mencionadas arriba, donde dado

la dispersión de los tratamientos (Figura 15B y 15D) se confirma que el GA no ejerce un

efecto significativo.

Con respecto a la formación de brotes, se pueden apreciar que se ve favorecida en

las zonas de más baja concentración de las res hormonas (Figura 13 y color morado en la

Figura 14), y la de callos a concentraciones ligeramente mayores que la de inducción de

brotes (color azul). Estos resultados se podrían utilizar para establecer cultivos de callos

embriogénicos provenientes de las líneas de raíces transformadas o de la planta completa.



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Figura 13. Matriz de 25 tratamientos, en la segunda semana, para evaluar el efecto de los reguladores de

crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli.

Figura 14. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de raíz para la formación de

brotes, callos y raíces.



CINVESTAV – IPN

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Figura 15. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de raíz para la formación de tejido

radicular.

Estos resultados sobre la reacción de explantes de raíz a distintas concentraciones

BAP, NAA, y GA indican las zonas que promueven de manera favorable el crecimiento y

proliferación de raíz, En general, la zona que corresponde a las concentraciones de 0 y 5

mg/l de BAP combinada con 0.05-5.0 mg/l de NAA; el GA no es necesario. Estas

observaciones fueron consideradas en experimentos posteriores para mejorar la producción

de biomasa por las líneas de raíces transformadas.

8.1.2 Explantes de hipocotilo

Para los tratamientos con explantes de hipocotilo, en ambas semanas se observó

elongación y engrosamiento de los explantes y la formación de callo en ambos extremos

del corte del tejido en todos los tratamientos (Figuras 12 y 13). Dependiendo del

tratamiento estos callos se diferenciaron a la inducción de raíz o a la formación de más



CINVESTAV – IPN

50

biomasa en los callos; sin embargo, a diferencia de lo observado con explanes de raíz, en

ningún tratamiento se observó la formación de brotes. Estos resultados sobre la inducción

de callo son similares a los reportados por Qin et al., (2007), pero en ese trabajo reportan la

formación de brotes/callo cuando se utilizaron 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BA (Qin,

Li et al., 2007). Estas diferencias podrían ser debidas al cultivar de brócoli utilizado en cada

estudio.

En el análisis de los resultados de los tratamientos con explantes de hipocotilo por

gráficas de contorno, dispersión y superficies de respuesta (Figuras 16 y 17), se observó

una respuesta natural del tejido a la acción del corte manifestándose en formación de tejido

calloso en el tratamiento T1 (Figura 13), el cual no fue sometido a la acción de ninguno de

los reguladores de crecimiento. La formación de callo (zona color morado) a partir de estos

explantes tuvo lugar en tres zonas: las máximas con 5-10 mg/l de NAA, las zonas mínimas

con 0 mg/l de BAP, en la zona máxima de BAP (10 mg/l) combinada con todas las

concentraciones de NAA y en la zona de 5 mg/l de NAA combinada con todas las

concentraciones de BAP. Sin embargo, a diferencia de los explantes de raíz, en este caso no

se apreció la formación de brotes aún a la segunda semana de cultivo bajo ningún

tratamiento; sin embargo, en estas gráficas también se confirmó lo observado en los

cultivos (Figuras 12 y 13), que bajo cierta combinación de reguladores del crecimiento, una

vez que se forma el tejido calloso en la zona de corte de los explantes, se inicia de manera

preferente la formación de raíz.

Figura 16. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hipocotilo para la formación de




CINVESTAV – IPN

51

Observando el grafico de contorno de porciento de formación de raíz a partir de

explantes de hipocotilo (Figura 16A) y la gráfica de dispersión (Figura 16B), muestran que

la a concentraciones bajas de NAA ( 0.05-0.5 mg/l) combinadas con concentraciones de 0-5

mg/l de BAP y otra zona que abarca concentraciones de 8-10 mg/l de NAA, se promueve la

formación de raíz a partir del tejido de hipocotilos sin efecto por el GA (Figura 16B), con

la observación de que primero se aprecia aparición de tejido calloso. Analizando

únicamente la respuesta para la formación de raíces a partir de explantes de hipocotilo

(Figuras 13 y 14) y con apoyo de las gráficas de superficie de respuesta (Figura 17), se

puede observar que solo la zona que abarca concentraciones de 0-0.5 mg/l de NAA y de 0-

5mg/l de BAP favorece al cien por ciento la formación de raíz. En esta zona (naranja) y con

apoyo del gráfico de dispersión (Figura 17B), se confirma que no el GA no afecta la

formación de raíz.

Figura 17. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hipocotilo para la formación de

tejido radicular.



CINVESTAV – IPN

52

Estos resultados con explantes de hipocotilo concuerdan parcialmente con lo

reportado por Qin et al., (2007), quien encontró que a partir de este tipo de explantes en

medio MS suplementado con 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BA se inducen brotes/callos

(Qin, Li et al., 2007), a diferencia del presente trabajo donde en esa región se encontró

como respuesta la formación de raíz.

8.1.3 Explantes de hoja

Finalmente, en los tratamientos con explantes de hoja la principal respuesta fue la

presencia y crecimiento acelerado de tejido calloso, en algunos tratamientos acompañado

con la formación de raíces (Figuras 12 y 13). Al igual que la respuesta con los explantes de

hipocotilo, se observó primero la formación de tejido calloso y posteriormente,

dependiendo del tratamiento, generación de raíz a partir del tejido calloso o aumento del

tamaño del mismo. El análisis de estos resultados por gráficas de contorno, dispersión y

superficies de respuesta (Figuras 18 y 19), confirmó una respuesta natural del tejido de hoja

en formación de tejido calloso en el sitio de corte. Al igual que la respuesta con los

explantes de hipocotilo, no se observó respuesta de formación de brote en ninguno de los

tratamientos, además de que se apreció la misma zona para la muerte del tejido (color

naranja en la Figura 18A) y tampoco se detectó un efecto significativo de GA en el gráfico

de dispersión (Figura 18B).

Figura 18. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hoja para la formación de




CINVESTAV – IPN

53

Figura 19. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hoja para la formación de

tejido radicular.

Analizando la respuesta para la formación de raíz a partir de explantes de hoja se

observa que esto sucede en un 100 % a concentraciones bajas de NAA y en combinación

con concentraciones bajas de BAP (Figura 19). Nuevamente, el GA no influyó de manera

significativa en la formación de raíz (Figura 20B). Según la gráfica de superficie de

respuesta (Figura 19A), esto sucede a concentraciones de 0.05-00.5 de NAA y muy bajas

de BAP, sin aparente influencia por el GA (Figura 19B).

Es necesario mencionar que hasta la fecha no encontraron reportes en la literatura

respecto al efecto de reguladores de crecimiento sobre la diferenciación y promoción de

raíces a partir de este tipo de explantes.

En resumen, la diferenciación depende del tipo de explante y de la concentración y

tipo de reguladores del crecimiento (Figuras 12 y 13). Para la formación de raíces a partir

de explantes de raíz (Figuras 14 y 15), se requieren 0.05 mg/l de NAA, 0 mg/l de BAP, y



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54

0.05-0.5 mg/l de GA; aunque con 0 – 0.5 mg/l de NAA, 0.05 mg/l de BAP y 0-0.05 mg/l de

GA se favorece la elongación de este explante. Por otro lado, para la formación de raíces a

partir de explantes de hipocotilo, se requieren 0-0.5 mg/l de NAA y 0-5mg/l de BAP

(Figuras 16 y 17). Finalmente, para la formación de raíz a partir de explantes de hoja se

requieren de 0.05-00.5 mg/l de NAA y 0-0.05 mg/l de BAP (Figuras 18 y 19). La presencia

de GA parece ser no requerida para la formación y mantenimiento de raíces a partir de estos

explantes.

De estos resultados se determinó que la concentración a utilizar de NAA, para

cultivos de raíces no transformadas y transformadas, fuera de 0.05 mg/l, sin BAP ni GA.

8.2 Cinético crecimiento y formación de proteína

El objetivo de este experimento fue investigar el comportamiento cinético del

crecimiento y contenido de proteína intracelular y extracelular de los cultivos de raíces

transformadas en comparación con los de raíces no transformadas. De los resultados

anteriores se determinó que la concentración a utilizar de NAA fuera de 0.05 mg/l, sin BAP

ni GA, tanto para cultivos de raíces no transformadas como para los de raíces

transformadas. Para el experimento se incluyeron cultivos de raíces de brócoli no

transformadas (BR) y transformadas por infección de plántulas con la cepa de A.

rhizogenes, la cual lleva el plásmido pRi-1855 del tipo agropina, transformada con el vector

binario pCAMBIA 1105.1 (1105), en ausencia (1105 y BR) o presencia (1105-NAA y BR-

NAA) de 0.05 mg/l de NAA.

8.2.1 Crecimiento

Por lo que respecta a la cinética de crecimiento (Figura 20), la acumulación de

biomasa fresca mostró que todos los cultivos presentaron la curva sigmoide típica, con fase

lag antes de los 3 días, exponencial entre los 2y 9 días y estacionaria entre los 9-15 días

(Figura 20). La mayor cantidad de biomas en los cultivos de raíces transformadas con

respecto a las no transformadas pudiera deberse en parte a la mayor cantidad de inóculo en

los cultivos de raíces transformadas, lo cual concuerda con lo reportado por Jeong et al.,

(2004) para cultivos de raíces transformadas de Panax ginseng, las raíces de brócoli



CINVESTAV – IPN

55

transformadas (1105), en presencia o ausencia de NAA, notablemente presentan mayor

velocidad de crecimiento y duplican la biomasa inicial después de tres días de cultivo,

mientras que el tiempo de duplicación de raíces no transformadas (BR) fue alrededor de los

seis días, es decir tardan el doble de tiempo que los cultivos transformados. Esto concuerda

con lo reportado en la literatura que indica que las raíces transformadas presentan

velocidades de crecimiento mayores que las no transformadas (Kim et al., 2002a, b, Jeong

et al., 2004, Srivastava y Srivastava 2007, Das et al., 2010).

La presencia de NAA afectó positivamente el crecimiento de ambos tipos de raíces.

El cultivo de raíces transformadas suplementado con NAA muestra una mayor acumulación

de biomasa al llegar a la fase estacionaria que supera los 30 g biomasa fresca/l, superior en

un 20 % al cultivo de raíces transformadas sin NAA. Debe notarse que los cultivos de

raíces transformadas acumuló 3 veces más biomasa que los cultivos de raíces no

transformadas (Figura 20).

Figura 20. Cinética de crecimiento de raíces de brócoli no transformadas y transformadas inducidas con la

cepa silvestre de A. rhizogenes, la cual lleva el plásmido pRi-1855 del tipo agropina, transformada con el

vector binario pCAMBIA 1105.1, en ausencia (1105 y BR) o presencia (1105-NAA y BR-NAA) de 0.05 mg/l

de NAA.



CINVESTAV – IPN

56

8.2.2 Variación en la acumulación de proteína total soluble (PTS)

En cuanto a la producción PTS en biomasa (Figura 21), todos los cultivos muestran

un periodo de adaptación de entre 3 y 5 días, donde la producción de proteínas muestra una

tendencia general a disminuir; posteriormente, la producción de proteína se mantiene en

promedio contante en valores de 35 µg PTS/g biomasa fresca.

La presencia de NAA, al igual que en la acumulación de biomasa, afectó

positivamente la acumulación de PTS. En los cultivos suplementados con NAA (BR-NAA

y 1105-NAA), se observó un incremento de PTS durante la fase estacionaria, en 100% y

15% respectivamente, respecto a los no suplementados con NAA. Esto puedes ser debido lo

reportado de que al NAA puede actuar promoviendo el procesamiento de transcritos a

proteínas durante el proceso de transcripción (George et al., 2008a, b), favoreciendo así la

formación de tejido meristemático, el cual se encuentra en las partes apicales de las raíces y

es el metabólicamente más activo dentro del tejido radicular (Rhodes et al., 1994, Gerge et

al., 2008). Es decir, al promover el NAA la formación de tejido meristemático con mayor

actividad metabólica se favorece la formación de proteínas.

Figura 21. Proteína total soluble por gramo de peso fresco. Los cuatro cultivos de raíces muestran un periodo

de adaptación de 3-5 días donde posteriores a ello la producción de proteína se mantiene constante resaltando

que los cultivos suplementados con NAA muestran un incremento en la producción notable desde el día 9,

comparados con los no suplementados.



CINVESTAV – IPN

57

8.2.3 Variación en la proteína liberada el medio de cultivo

Con lo que respecta al contenido de proteína en el medio de cultivo, se observó que

en todos los cultivos acumulan cantidades lineales creciente con respecto al tiempo (Figura

22). Se aprecia que este incremento en la proteína extracelular empieza desde el periodo de

adaptación de 3 días para las raíces transformadas y de 6-7 para las normales, y no se

detecta una fase exponencial, pero si se vislumbra un decaimiento en la velocidad de

acumulación entre los 1-15 días , cuando los cultivos se encuentran en la fase estacionaria.

Debe notarse que las raíces transformadas muestran el doble de proteína respecto a las no

transformadas. Siguiendo el razonamiento expresado en la sección anterior para la proteína

intracelular, esto debe ser inherente a su acelerado crecimiento y por ende mayor actividad

metabólica en comparación con las normales.

Nuevamente el NAA afecta positivamente la cantidad de proteína extracelular, pero

el efecto es más claro en los cultivos de raíces no transformados. Entre las raíces no

transformadas se observa una diferencia del 10 % mayor de exudados proteicos cuando se

adiciona NAA; mientras que en los cultivos de raíces transformadas no se aprecia una

diferencia significativa ni un comportamiento diferente en el perfil de acumulación de

proteína cuando están o no adicionadas con NAA.

Figura 22. Cinética de proteína total soluble presente en el medio de cultivo. Se observó para todos los

cultivos el aumento en la cantidad de exudados proteicos con respecto al tiempo observándose un

comportamiento exponencial para todos los casos. De igual manera hay un doble de actividad en los cultivos

transformados en comparación con los normales.



CINVESTAV – IPN

58

8.3 Establecimiento de nuevo protocolo para inducción de raíces transformadas

Con los resultados anteriores, el objetivo de esta sección fue el establecimiento de

un protocolo mejorado respecto al usado en la tesis de Maestría para la inducción de

cultivos de raíces transformadas de brócoli (Figura 23). Para fines de control y comparación

se estableció también el protocolo para el establecimiento de cultivos de raíces no

transformadas (Figura 24A). Varias de las actividades de este bloque experimental se

realizaron paralelamente a las anteriores y al mantenimiento de los cultivos, tanto de raíces

no transformadas. , como transformadas con A. rhizogenes LBA9402 y con A. rhizogenes

pCAMBIA1105.1 (Figura 24B-C), obtenidos a partir de los protocolos establecidos en el

trabajo de Maestría. De estos cultivos fue posible generar biomasa suficiente para los

estudios sobre las cinéticas de crecimiento y efecto de la presencia de NAA descritos en la

sección anterior.

Figura 23. Cultivos de raíces de brócoli no transformadas (A) y transformadas con Agrobacterium rhizogenes

LBA9402 (B) o con Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1 (C) utilizando el protocolo de Maestría y

mostrando sus diferencias morfológicas y pilosidad (panel medio), resistencia a higromicina (leyenda) y

niveles de expresión de GUS (panel inferior). Las micrografías tomadas se realizaron a 100X.



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59

Figura 24. Nuevo protocolo para la inducción de raíces transformadas. Mediante la punción de hipocotilos de

plántulas de brócoli de 1 semana de edad, con una jeringa infestada con A. rhizogenes (A = 0.8-1), se obtienen

raíces aéreas en el punto de punción e 1-2 semanas. Las raíces se propagan en medio SH semisólido y/o

líquido con vitaminas y Cefotaxima (100 µg/ml). Las positivamente transformadas con el plásmido

pCAMBIA1105.1 o construcciones derivadas de este deben dar respuesta positiva a la reacción de β-

Glucuronidasa (GUS) y mostrar resistencia a higromicina.

El protocolo desarrollado en el proyecto de Maestría para el establecimiento de

cultivos de raíces transformados a partir de la infección de hipocotilos de brócoli fue

mejorado sustancialmente por el uso de plántulas de una semana de edad en vez de

plántulas de 2-4 semanas (Figura 24): la eficiencia de transformación del tejido radicular

pasó de un 50 % a un 100 % en el protocolo actual sin necesidad del uso de agentes

estimulantes como la acetosiringona remendad por otros autores como Henzi, Christey et

al., (2000). Se atribuye el aumento en la eficiencia de transformación a que las plántulas

más jóvenes, que aunque su hipocotilo es más endebles y pueden tender a romperse

fácilmente, son más propensos a la infección, quizá porque el tejido es menos diferenciado

que los usados en los eventos anteriores donde se utilizaban plántulas de 2 a 4 semanas de

edad.

Utilizando el nuevo protocolo, aunque con rendimientos variables, se obtuvieron

líneas transformadas por infección con la cepa silvestre A. rhizogenes LBA9402 (9402), y

la misma transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105), y con las construcciones



CINVESTAV – IPN

60

pCppINS (pp11) que lleva el cDNA codificante para preproinsulina, y la pCpINS (p14),

que lleva el cDNA codificante para proinsulina. Estas líneas de raíces presentaron

velocidades de crecimiento (medidos como factor de elongación FE) adecuadas y

produjeron resultados positivos a la reacción de β-Glucuronidasa (Tabla 5). Por lo tanto

deben llevar el T-DNA del plásmido pCAMBIA con los fragmentos de cDNA codificante

para los fragmentos de la preproinsulina y proinsulina.

Tabla 5. Factor de elongación de raíces en cultivo in vitro

LINEA F. E.

cm/d

Reacción

β-Gluc

Wt 0.2 -

9402 0.3 -

1105 0.4 +

pp11 0.3 +

p14 0.4 +

Las líneas de raíces se establecieron de acuerdo a la metodología descrita

en la Figura 13a partir de plántulas de brócoli (WT) y raíces aéreas

generadas en los sitios de punción de plántulas infectadas con A. rhizogenes

LBA9402 (9402), A. rhizogenes LBA9402 transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105), con la construcción pCppINS (pp11) que lleva el

cDNA codificante para preproinsulina, y con la construcción pCpINS (p14)

que lleva el cDNA codificante para proinsulina.

Debe mencionarse que las líneas de raíces transformadas con el plásmido

pCAMBIA y las construcciones derivadas de este, llevan el gen GUS, por lo que deben dar

reacción positiva para la expresión de esta enzima β-glucuronidasa, la cual en estos cultivos

se pudo observar tanto en el tejido, a lo largo del tejido radicular o sólo en algunas zonas

específicas del tejido donde se observan precipitados azules localizados (Figuras 23 y 24),

como en el medio de reacción (panel inferior en la Figura 24). Esto indica claramente que

esta enzima es intracelular y además puede ser excretada al medio de cultivo cundo se

cultiva en medio líquido.



CINVESTAV – IPN

61

Varias líneas de raíces transformadas fueron probadas posteriormente para evaluar

el rendimiento y pureza de su DNA genómico (Tabla 6). Los rendimientos de DNA, si bien

fueron muy variables, produjeron cantidades suficientes para utilizar ese DNA como

templado para amplificar el DNA foráneo por reacciones de PCR, aun cuando las purezas

rindieron valores de 0.7 – 1.1. Debe mencionarse que los valores de pureza para considerar

un DNA altamente puro van de 1.8 – 2.0.

Tabla 6. Rendimiento y pureza de DNA genómico de raíces no transformadas (Wt) y

transformadas de Brócoli* utilizadas en este estudio

El DNA fue extraíido de raíces no transformadas (Br-Wt) y de raíces ransformadas con A. rhizogenes LBA

9402 (Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402 transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (Br-

pC1105) y con las construcciones pCpINS (línea p14, Br-pCpINS). Las claves corresponden a los carriles de

la Figura 25.

Finalmente, utilizando estos DNA genómicos como templado, mediante PCR

utilizando los primers para la amplificación del fragmento de 365 pb del cDNA de la

proinsulina a partir de DNA del genoma de línea de raíces no transformadas de brócoli (2.

Br-Wt), raíces de brócoli transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (3, Br-9402-1), A.

rhizogenes LBA 9402 transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (4, Br-pC1105)

y con las construcciones pCpINS (línea p14, Br-pCpINS) en comparación de la reacción de

PCR utilizando como templado el vector pCAMBIA1105 (6, pC1105) y el plásmido

comercial pDNR-LIBins, el cual lleva el cDNA del gen Ins completo, se comprobó la

generación de los fragmentos esperados para demostrar la presencia de los respectivos T-

DNA en las raíces transformadas. Como se esperaba, solo la línea p14 (carril 5) debería

amplificar igual que el control positivo del carril 1.

LINEA RENDIMIENTO

ng DNAgv/mg biomasa

PUREZA

A269/A280

DNAg

Wt 55 0.8 Br-Wt

9402-1 120 1.1 Br-9402-1

1105-1 55 0.7 Br-pC1105

pp11 65 1.0 Br-pCppIns

p14 90 0.9 Br-pCpINS



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Figura 25. Reacción de PCR utilizando los primers para la amplificación del fragmento de 365 pb del cDNA de la proinsulina a partir de DNA del genoma de línea de raíces no transformadas de brócoli (2. Br-Wt), raíces

de brócoli transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (3, Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402

transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (4, Br-pC1105) y con las construcciones pCpINS (línea

p14, Br-pCpINS) en comparación de la reacción de PCR utilizando como templado el vector pCAMBIA1105

(6, pC1105) y el plásmido comercial pDNR-LIBins, el cual lleva el cDNA del gen Ins completo. Como se

esperaba, solo la línea p14 (carril 5) debería amplificar igual que eñ control positivo del carril 1. Las claves de

los carriles corresponden con los de la tabla 6.

8.4 Extracción y cuantificación de proteína

8.4.1 Por método de Bradford

Con el objetivo de determinar la cantidad de proteína total soluble (PTS) en los

cultivos de raíces se preparó una curva tipo utilizando el método de Bradford (Figura

26). La regresión lineal de los datos generó una R2 de 0.98 y una ecuación Y=0.60x +

0.0474. Con esta relación se determinó posteriormente la cantidad de PTS en los

cultivos de raíz (Tabla 7). Se encontró que independientemente del tipo de cultivo, se

obtiene en promedio 0.5 mg de PTS por gramo de peso fresco de tejido. Dado el

protocolo de extracción que se aplica se tiene diluido en tres volúmenes de solución con

respecto a un gramo tejido, por lo que el contenido real es 0,15 mg de PTS/ml en

promedio.



CINVESTAV – IPN

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Figura 26. Curva tipo de método Bradfford. Realizando por triplicado la curva tipo para determinar

cantidad de proteína total soluble, se obtuvo una ecuación de la recta con R2 de 0.98.

Tabla 7. Rendimiento de proteína en cada línea de cultivo establecida

La proteína total soluble fue extraída y utilizada para determinar los rendimientos de proteínas

heterólogas en las líneas de raíces correspondientes; las no transformadas (Br-Wt) y de raíces transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402

transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (Br-pC1105) y con las construcciones

pCpINS (línea p14, Br-pCpINS). Las claves corresponden a los carriles de la Figura 25.

LINEA F. E.

cm/d

Rx

GU S

PTS INSh

ELISA

mg/g mg/ml µg/ml

Wt 0.2 - 0,38 0,13 0.00

9402-1 0.4 - 0,36 0,12 0.04

1105-1 0.4 + 0,51 0,17 0.09

p14 0.4 + 1.03 0,34 0.25



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64

8.4.2 Por método de ELISA

Con el objetivo de cuantificar la producción de proteínas heterólogas se utilizó un

método ELISA mediante un kit que se utilizó asegura la detección de insulina sin reacción

cruzada con otras proteínas como proinsulina. Para ello se preparó un curva tipo y la

ecuación de la línea correspondiente en µUI/ml y en µg/ml, ambas con un coeficiente R2 de

0.96 (Figura 27).

Figura 27. Curva tipo de prueba de ELISA para INS humana. En base a los datos de estas curvas se

determinó la cantidad de Insulina humana en el extracto de la línea de raíces transformadas p14, en relación a

extractos negativos, sin insulina, obtenidos de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402

silvestre (Wt, 9402) o transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105). La detección está en el orden de los 8 ng/ml y 250 µUI/ml como máximo.

Se debe recordar que nuestros cultivos están transformados con el cDNA de

proinsulina por lo que se esperaría una reacción negativa a ello, sin embargo, el extracto

proteico del cultivo p14 fue positivo a esta prueba detectando 0.25 µg/ml (Tabla 7), no así

los extractos correspondientes a las otras líneas (Wt, 9402 y 1105), lo que nos hace suponer

que en los cultivos que se establecieron transformados con el cDNA de proinsulina no solo

se está expresando este precursor, sino que se está llevando a cabo un procesamiento como

sucede de manera in vivo en las células β del páncreas de tal manera que el productor

resultante es positivo al confrontarlo con esta prueba.



CINVESTAV – IPN

65

8.5 Purificación de la proteína heteróloga

8.5.1 Perfil proteico mediante electroforesis en gel de poliacrilamida

Con el objetivo de investigar la presencia de las proteínas heterólogas en los

extractos de raíces transformadas y establecer condiciones experimentales para evaluar la

expresión de proteínas heterólogas en los extractos, se buscaron condiciones para observar

por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) el perfil proteico de los extractos

obtenidos en regiones de peso molecular (kDa) correspondientes a la preproinsulina (12

kDa) y a la proinsulina (9 kDa) que son los precursores que se expresan de manera directa

por el cDNA insertado y descrito con anterioridad, así como de la proteína procesada y

producto final de interés, la insulina (5.8 kDa). Para poder observar de manera completa el

perfil proteico y la zona menor a 50 kDa con buena resolución se utilizaron dos

concentraciones diferentes de poliacrilamida; 10% T y 3% C para el gel espaceador y 16.5

% T y 6 % C para el gel separador, en minigeles con dimensiones de 9cm x 1cm x 1mm y

9cm x 4cm x 1mm respectivamente (Figura 28).

Bajo las condiciones mencionadas podemos ver el perfil completo de los extractos

proteicos desde los 200 kDa o menos (usando un máximo de 4 µg de extracto) y las

diferentes especies de INS std; 5.8 kDa o 3.4 kDa y 2.4 kDa (cadenas unidas y separadas

respectivamente) con un límite de detección de 500 ng por banda usando tinción con

Coomasie.

Sabiendo las condiciones de esta técnica para dar seguimiento a la fracción proteica

de nuestro interés se procedió al primer paso de purificación planteado que es

concentración-fraccionamiento-desalado de los extractos usando tubos Amicon Ultra. Un

primer paso fue utilizar tamaño de corte de 30 kDa- 10 kDa y 3 kDa para extractos de la

líneas p14 (+ INS) 1105 (-INS) y 1105 spik (alimentada con INS) Figura 29.



CINVESTAV – IPN

66

Figura 28. Condiciones de SDS-PAGE para observar el perfil proteico y el estándar de INS. Arriba: se

determinó trabajar con la concentración de 1.5 µg/pozo de INS std y los extractos proteicos de las líneas no

muestran deferencias en el perfil de pt esto observando concentración de 0.5-4 µg/pozo. Abajo: se corroboró

el perfil de corrimiento de diferentes MPMs junto con muestras de INS std para verificar el corrimiento y

resolución, también se observó por spiking (adición de Insulina estándar) el comportamiento del mismo en un

extracto crudo.



CINVESTAV – IPN

67

8.5.2 Fraccionamiento, concentración y desalado de extractos proteicos

Para concentrar los extractos proteicos, previo al proceso de purificación, las

muestras fueron fraccionadas de acuerdo al peso molecular y desaladas pasando los

extractos proteicos a través de tubos Amicon Ultra. Las presencia y cantidad de proteínas se

monitoreó por PAGE (Figura 29).

Figura 29. Fraccionamiento con tubos Amicon de 30 y 3 kDa. Se observa teñido con Coomasie (Izquierda)

y con Plata (Derecha) el patrón de fraccionamiento usando tubos Amicon de 30 kDa de corte para separar el

grueso del extracto de la fracción más pequeña y tubos de 3kDa para concentrar la fracción de 30-3. Si bien se

puede separar gran cantidad de proteína para simplificar la purificación trabajando con proteínas menores a 50

kDa, la prueba de spiking por adición de Insulina estándar nos revelo que incluso usando un corte de 30kDa

se encuentra retenida en la fracción gruesa un remanente de la Insulina adicionada.

Se obtuvieron fracciones de 250 a 500 µl concentradas de 2 a 3 veces la

concentración inicial y separadas con base al tamaño de corte utilizando, recordemos que

esto es para proteínas en estado globular, es decir en una asociación tridimensional

determinada, misma que se forma con la insulina, la cual se asocia para formar dímeros,

tetrámeros, y preferentemente hexámeros como hemos descrito anteriormente y aun así se



CINVESTAV – IPN

68

presume la asociación de estructuras más complejas, superiores a los 36 kDa. Estas

asociaciones se dan debido a condiciones de concentración de INS, pH y iones divalentes

(Zn +2

). Es decir en condiciones normales a pH fisiológico y concentraciones de 1 ng/ml se

favorece el estado monomérico, en soluciones farmacéuticas a pH de 7.0-7.8 por cada 100

UI (3.5 mg/ml) se añaden 0.017 mg de óxido de zinc para asegurar el estado más estable

(hexamérico), sin embargo es solución cercana al punto isoeléctrico (pI 5.4) se favorece un

estado monomérico y añadiendo un agente quelante (EDTA) se puede obtener una solución

de insulina en dicho estado, recordando que la asociación hexamérica y estos fenómenos se

describen desde el precursor proinsulina.

Figura 30. Fraccionamiento con tubos Amicon de 10 y 3 kDa. Se observa teñido con Coomasie (Izquierda)

y con Plata (Derecha) una retención completa de INS std en la fracción de10 kDa. Asi mismo en esta fracción

se detectan diferencias de expresión por debajo de los 20 kDa en la línea de raíces transformadas con el

cDNA de proinsulina (9 kDa), lo cual lógicamente no se observó en la línea 1105. La prueba de spiking

revelo que usando un corte de 10kDa se encuentra retenida en la fracción gruesa la Insulina (INS) adicionada.



CINVESTAV – IPN

69

Trabajando con tamaños de corte de 10 y 3 kDa (Figura 30), se observó que hay

retención completa de la Insulina estándar (INS) en la fracción gruesa de 10 kDa (por lo

menos en los límites de concentración detectables por PAGE) y la fracción concentrada de

10-3 y con poca variedad detectable de proteínas de bajo peso molecular, asi mismo para la

fracción diluida 3 kDa.

Con lo anterior se propuso trabajar bajo condiciones que promuevan el estado

monomerico (5.8 kDa) como ya se mencionó anteriormente (pH 5.0 y 2 mM de EDTA)

para posteriormente aplicar el fraccionamiento de 30 y 3 kDa y separar del grueso de

proteínas de los extractos, las proteínas que nos interesan.

Se partió de un total de 60 g de biomasa acumulada en diferentes estadios de

crecimiento de la línea p14, para obtener un extracto crudo de 150 ml con una

concentración de proteína total soluble de 0.34 mg/ml y que contiene 0.31 µg INS/ml. Se

aplicó el tratamiento con tubos Amicon de 30 y 3 kDa (Figura 30), donde se obtuvieron las

fracciones siguientes mostradas en la Tabla 8. Se obtuvo un volumen de 2 ml

correspondientes a la fracción de 30 y 3 kDa, que mostró por análisis en PAGE concentrar

tamaños moleculares de proteína similares a los deseados.

Tabla 8. Fracciones obtenidas de la línea p14

FRACCION PTS

(mg/ml)

VOL. TOTAL

(ml)

PT

(mg)

˃ 30 p14 2.28 2.0 4.56

30-3 p14 0.49 2.0 0.98

˂ 3 p14 0.013 18 0.234

La proteína total soluble de la línea p14 (Br-pCpINS) fue fraccionada, concentrada

y desalada con los tamaños de corte de ˃ 30 p14, 30-3 p14 y ˂3 p14. Se generó un

cantidad aproximada de 1 mg para la fracción 30-3 p14 con tamaño de corte de 30-

3 p14, que monitoreada por PAGE,como se mencionó en la Figura 29, nos llevó al

siguiente proceso de purificación.



CINVESTAV – IPN

70

8.5.3 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR POR FPLC

Con el objetivo de purificar las proteínas heterólogas de la fracción 30-3 p14 kDa

anteriormente mencionada se estableció un proceso de recuperación y purificación de las

proteínas heterólogas por FPLC equipado con una columna de exclusión molecular para

resolver las proteínas heterólogas de interés a partir de la mezcla de proteínas en el extracto.

Tabla 9. Marcadores de peso molecular utilizados para FPLC

MARCADOR PTs

A a) Transferrina 80 kDa 1 mg/ml

b) Apomioglobina (17 kDa) 1 mg/ml

c) Ribonucleasa A (13.7 kDa) 1 mg/ml

d) Citocromo C (12.4 kDa) 1 mg/ml

B 1) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml

2) Lisozima (14.3 kDa) 0.5 mg/ml

3) Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml

C I) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml

II) Insulina (5.8 kDa) 1 mg/ml

III) Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml.

Los marcadores de peso molecular A, B, y C, brindan un amplio panorama del comportamiento de las proteínas en columna de exclusión molecular, Dilucidando el comportamiento en tamaños

de 80 a 1.3 kDa tal como se puede observar en la Figura 31

La fracción se llevó a la columna de exclusión molecular para su separación con

base a tamaños. Para ello se llevó a cabo la calibración del equipo por tamaños utilizando

tres marcadores de peso molecular que se muestran en la Tabla 9 y los cuales abarcan el

rango de resolución óptimo de la columna (70-3 kDa).

Utilizando la información proporcionada por los tres marcadores de peso (A, B y C)

se generó una curva de calibración. Esta no es necesariamente lineal, como lo reporta la

literatura para columnas de exclusión molecular. Se grafica el pm (kDa) contra tiempo de



CINVESTAV – IPN

71

elución (Figura 31), esta curva es polinomial de tercer orden con una R2

de 0.97, y nos

define el comportamiento de las proteínas del marcador por debajo de los 17 kDa. Al

utilizar los cromatogramas en conjunto de todos los marcadores en comparación con la

muestra 30-3 kDa p14 (Figura 32), la ecuación generada por la curva de tercer orden y los

volúmenes de elución de las señales x, y z se determina pesos de 14.7, 13.09 y N.D.

respectivamente. Con esta información y soportando con los determinado por SDS-PAGE

donde la proteína más pequeña que se observó en la fracción concentra 30-3 kDa p14 se

encuentra ligeramente arriba de los 6 kDa.

Figura 31. Calibración de pesos moleculares para la columna de filtración en gel con los tres marcadores.

Cuando se utilizó una mezcla los tres marcadores como patrón de peso, se trabajó con los límites de

resolución óptimo de columna y el comportamiento de las proteínas entre menores a 17 kDa, se obtuvo una

curva polinomial de tercer orden con un coeficiente de correlación aceptable (0.97).



CINVESTAV – IPN

72

Figura 32. Perfil de elución de la muestra 30-3 kDa p14 y propuesta final de colección de las fracciones.

Se llevó a cabo entonces la colección de fracciones como se muestra en Figura 33.

Figura 33. Fracciones de proteínas obtenidas por exclusión molecular mediante FPLC. Se observó que las

últimas fracciones (x, y z) contienen las proteína con los tamaños moleculares esperados para preinsulina e

insulina. La fracción y presentó las proteínas de pesos moleculares corresponden al la proinsulina (9kDa) e

insulina (5.8 kDa).



CINVESTAV – IPN

73

El volumen total a purificar de la fracción 30-3 kDa p14 es de 2 ml y por cada

corrida se pudieron trabajar 300 µl, completando la purificación de todo el volumen

realizando 7 corridas. Una vez que se colectaron los volúmenes totales de cada fracción de

interés se determinó proteína total soluble por Bradford y cada muestra se desalo y liofilizó

para tener condiciones para realizar las siguientes pruebas y análisis como SDS-PAGE y

Western Blot.

Figura 34. SDS-PAGE no reductor de las fracciones purificadas, desaladas y concentradas.

Con lo observado por análisis en PAGE es claro que se obtuvo una separación exitosa de

las proteínas por cromatografía de exclusión molecular (Figura 34). La reacción con

anticuerpos por el método de ELISA es específica para insulina y los tamaños de peso

molecular detectados por PAGE indican evidencia de las 2 bandas correspondientes a

insulina y proinsulina.

En resumen, en este sección se muestra que se logró la expresión de la preinsulina en

cultivos de raíces transformadas de brócoli y al parecer esta se transforma en insulina en el

tejido radicular.



CINVESTAV – IPN

74

9 DISCUSIÓN GENERAL

Los de este trabajo muestran que se logró positivamente la expresión del cDNA que

codifica para la proinsulina humana en cultivos de raíces transformadas de brócoli. Para

ello se estableciendo las condiciones de cultivo en cuanto al tipo de medio y balance

hormonal. Algo interesante, pero que requiere de mayor experimentación, es que al parecer

la proinsulina transgénica se transforma intracelularmente en insulina.

Por lo que respecta a las condiciones nutricionales básicas, se utilizó el medio

mineral Schenck y Hildebrandt y los resultados del experimento de cuadrados latinos para

evaluar la triple interacción de las fitohormonas reguladoras de crecimiento y

diferenciación. Se establecieron las condiciones de mantenimiento, acumulación de

biomasa y proteína total tanto en esta biomasa como en el sobrenadante del medio de

cultivo. Donde, tal como se esperaba, no necesariamente la adición de los tres reguladores

(GA, BAP y NAA) de manera simultánea tendía un efecto positivo en los objetivos. Se

encontró entonces que la concentración de NAA fuera de 0.05 mg/l para lograr dichos

objetivos anteriormente descritos. Esto dado a que se estimuló el crecimiento y desarrollo

de tejido radicular sin comprometer la estabilidad del mismo y si bien no cambio directa y

significativamente la acumulación de proteína total soluble en la biomasa, si se logró elevar

directamente la cantidad de biomasa acumulada en un periodo de 15 a 20 días y propiciar la

acción metabólica de exudados proteicos al medio de cultivo en comparación de cuando no

se usa NAA.

Por otro parte, se pudo observar la expresión de insulina a partir de su precurso

proinsulina, ya que se seleccionó trabajar con una línea de raíces transformadas con el

cDNA del gen INS a partir de la fragmento que codifica para la proinsulina, y la evidencia

de inmuno ensayo específico para insulina logra detectar niveles considerables de la

proteina. A su vez durante todo el seguimiento via SDS-PAGE se logró detectar proteínas

de pesos moleculares bajos y correspondientes a los 9 y 5.8 kDa para proinsulina e insulina

respectivamente, verificando al final por Western Blot las señales positivas para ambas

bandas de peso molecular descritas ya que los anticuerpos seleccionados para ellos



CINVESTAV – IPN

75

aseguran la hibridación con segmentos de ambos péptidos. Cabe destacar que se tomo

ventaja de esos bajos pesos moleculares de proinsulina e insulina, para establecer un

proceso de purificación basado en bajos pesos moleculares que nos permitió trabajar en una

región de poca diversidad proteica para los extractos de proteína total soluble del tejido

radicular.

Unificando ambas vertientes desarrolladas en este proyecto se reafirma el papel de

los cultivos de raíces transformadas de Brócoli como modelo no solo de expresión sino

también de producción de proteínas heterólogas, como lo fue para este caso, la proinsulina

y la insulina humana. Coadyuvando a los modelos biotecnológicos ya establecidos y

comercializados a nivel mundial para ambas proteínas de interés terapéutico y

farmacéutico.



CINVESTAV – IPN

76

10 CONCLUSIONES

Usando medio SH se determinaron las condiciones de NAA, BAP y GA3 para

promover la formación de tejido radicular a partir de explantes de raíz, hipocotilo y

hoja.

o Bajo condiciones de 0 mg/l de BAP y 0.05-5.0 mg/l de NAA, se favorece al

100% la formación de raíz a partir de explante de raíz. Específicamente en

los tratamientos 2 (0.05 mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 3 (0.5

mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.5 mg/l GA3 ) se promueve la ramificación y en

los tratamientos 6 (0 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 7

(0.05 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0 mg/l GA3 ) se promueve la

elongación.

o Los explantes de hipocotilo bajo condiciones de 0-0.5 mg/l de NAA y de 0-

5mg/l de BAP se desdiferencian y se promueve la formación de raíz.

o En concentraciones de 0.05-00.5 de NAA y BAP se promueve la formación

de raíz a partir de explantes de hoja.

La combinación de NAA como auxina y BAP como citocinina en concentraciones

bajas, promueven preferentemente la formación de raíz, a partir de cualquiera de los

tres tipos de explante raíz, hoja, hipocotilo) y no así de brotes. Se determió que la

concentración a trabajar de auxina NAA fuera de 0.05 mg/l para los cultivos

transformados y no transformados promoviendo así la acumulación de tejido

radicular en los cultivos no transformados y transformados

Se estableció y selecionó el cultivo transformado p14. Esta línea de raíces

transformadas integró en su DNA genómico el fragmento de 365 pb correspondiente

a la proinsulina humana. Dicha línea muestra un crecimiento acelerado con una

acumulación de biomasa de el triple en comparación con los cultivos no

transformados.



CINVESTAV – IPN

77

La presencia de insulina y proinsulina en los tejidos radiculares fue evidenciada en

extractos de proteina total soluble por inmunoensayo para insulina (ELISA)

obteniendo concentraciones de 0.25 µg/ml. Así mismo se identificaron por pesos

moleculares en SDS-PAGE teniendo pesos correspondientes de 9 y 5.8 kDa para

proinsulina y para insulina respectivamente después de una purificación de

cromatografía de exclusión molecular.

Integrando los resultados se propone utilizar la línea p14 transformada con el cDNA

de proinsulina humana para estableces y refinar un proceso de producción a nivel

matraz con el uso de NAA a concentración de 0.05 mg/l.

De los resultados descritos y la conclusión de los mismos la hipótesis; ―Las raíces

transformadas de Brassica oleracea var itálica expresan los polipéptidos de

proinsulina e insulina bajo condiciones de cultivo apropiadas para su crecimiento y

desarrollo‖, es aceptada



CINVESTAV – IPN

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11 RECOMENDACIONES PARA INVESTIGACIONES FUTURAS

Establecer más líneas de raíces transformadas para realizar estudios comparativos

de productividad de proinsulina e insulina.

Evaluar la expresión a nivel de transcritos

Secuenciar a nivel DNA el material genético de las líneas de raíces transformadas y

a nivel proteína.

Comprobar la actividad biológica de las proinsulina e insulina



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12 PRESENTACIONES EN CONGRESOS

XV International Scientific Congress (CNIC 2010)

- Presentación Oral

28 Junio- 01 Julio de 2010

XLIV Congreso Nacional de Ciencias Farmacéuticas

-Presentación de Cartel

23 al 26 de Octubre de 2011

VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, XVIII Congreso Nacional de

Ingeniería Bioquímica y X Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología

Molecular


- Mejor trabajo del área de Biología Molecular

28 al 30 de Marzo de 2012

VIII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, XIX Congreso Nacional de

Ingeniería Bioquímica y XI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología

Molecular


9al 11 de Abril de 2014

XV International Scientific Congress (CNIC 2015)

- Presentación de Cartel

22 Junio- 26 Junio de 2015



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13 ARTÍCULOS

TITULO

REVISTA AÑO

“Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica (broccoli)”

CENIC Ciencias Biológicas

Vol. 41, 2010

Issn: 0253-5688

2010

“Cultivos de Raíces de Brassica oleracea var italica (Brócoli) transformadas con el cDNA del Gen de la Preproinsulina Humana”

XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero (México). 28, 29 y 30 de marzo 2012. Abstract BML510GRA20120131

.

2012

“Purificación de proinsulina a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica oleracea var italica (Brócoli)”

VIII Congreso Internacional de Ingeniería

Bioquímica, XIX Congreso Nacional de Ingeniería

Bioquímica, 80 Aniversario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, XII Jornadas Científicas de

Biomedicina y Biotecnología Molecular (Mazatlán,

Sinaloa, México; Abril 9-11, 2014). Adán Núñez Arévalo (Ed.). Memorias 2014. CD, Colegio Mexicano

de Ingenieros Bioquímicos. Azcapotzalco, México D. F.

Artículo BML439BGR20140204.

2014

“Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica Oleracea Var (brócoli)”

CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, pp. 434-439, 2015

Issn: 2221-2450

2015



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Obtención de insulina humana mediante un cultivo de raíces

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