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ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

PERÍODO: Marzo - Julio 2013

ASIGNATURA: Bioquímica.

INTEGRANTES: Fabricio Guncay

Renato Andrade

Nelson Vinueza

NIVEL: Tercero

DOCENTE : Ing. Freddy Enríquez

FECHA: 27 de Junio del 2013

SANTO DOMINGO-ECUADOR

2013

ÍNDICE

1. TEMA: ........................................................................................................................... 3

2. INTRODUCCIÓN: ........................................................................................................ 3

3. OBJETIVO GENERAL: ................................................................................................ 3

4. OBJETIVOS ESPECIFICOS: ........................................................................................ 4

5. EQUIPOS: ...................................................................................................................... 4

6. MATERIALES: ............................................................................................................. 4

7. REACTIVOS E INSUMOS ........................................................................................... 4

8. REVISIÓN DE LITERATURA: .................................................................................... 4

Caseína: .............................................................................................................................. 4

Ovoalbúmina: ..................................................................................................................... 5

Reacción de Biuret: ............................................................................................................ 5

Reacción xantoproteica ...................................................................................................... 6

Reacción para compuestos azufrados: ............................................................................... 6

9. PROCEDIMIENTO: ...................................................................................................... 7

Aislamiento de la caseína: ................................................................................................. 7

Preparación de la solución de ovoalbúmina ...................................................................... 7

Reconocimiento de proteínas ............................................................................................. 7

Reacción de Biuret ............................................................................................................. 7

Reacción Xantoproteica ..................................................................................................... 7

Reacción para compuestos azufrados ................................................................................ 7

10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: ............................................................................... 8

Determinación de contenido de caseína en la leche........................................................... 8

Reacción de Biuret ............................................................................................................. 8

Reacción Xantoproteica ..................................................................................................... 9

11. CONCLUSIONES .................................................................................................... 10

12. RECOMENDACIONES: ......................................................................................... 10

13. BIBLIOGRAFIA: ..................................................................................................... 11

14. ANEXOS: ................................................................................................................. 12

1. TEMA:

Obtención e identificación de proteínas encontradas en la leche y en la clara de huevo.

2. INTRODUCCIÓN:

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas constituyen

más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico

determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminoácidos

diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipéptidos de cientos

de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de

variantes en su conformación.

Las proteínas están formadas por aminoácidos. Los aminoácidos, gráficamente, son

representados como ladrillos que forman una pared, los aminoácidos forman diferentes

proteínas específicas, las proteínas son el fundamento mismo de la vida. En efecto, debido

a la gran variedad de proteínas existentes y como consecuencia de su estructura, las

proteínas cumplen funciones sumamente diversas, participando en todos los procesos

biológicos y constituyendo estructuras fundamentales en los seres vivos. Este grupo de

nutrientes se encarga básicamente de formar y renovar las células de nuestro cuerpo.

Además, distribuye el agua contenida, forma enzimas, hormonas y anticuerpos y, en última

instancia, nos proporciona energía.

Los alimentos que ingerimos nos proveen proteínas. Pero tales proteínas no se absorben

directamente ni como tales, sino que, luego de su desdoblamiento (“hidrólisis” o rotura),

causado por el proceso de digestión, atraviesan la pared intestinal en forma de

aminoácidos.

La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los

métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la

destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o

químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta

etapa son maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la degradación

térmica o las alteraciones secudarias por oxidación, proteólisis

La funcionalidad de la proteína es algunas veces considerada solo importante para procesos

de alta demanda, como extrusiones o emulsiones. Sin embargo, la funcionalidad de la

proteína debe ser considerada para todos los productos y sistemas de consumo humano.

La leche es un alimento rico en proteínas aunque en su mayoría, se encuentran en

reducidas cantidades entre el 3 y el 3,5% de la leche de vaca, está formado por proteínas.

Estas proteínas se distribuyen en seroproteínas o proteínas solubles, caseínas y otras

sustancias nitrogenadas de naturaleza no protéica., así mismo las proteínas del huevo la

principal proteína de la clara de huevo es la ovoalbúmina, un tipo de albúmina, además de

tener el mejor perfil proteico que se puede encontrar en un alimento, la clara contiene

vitaminas y minerales y aporta aproximadamente 17 calorías, además de la ovoalbúmina,

la clara de huevo tiene otras proteínas como la ovomucina responsable de cuajar el huevo

pochado o frito, la conalbúmina y el ovomucoide.

3. OBJETIVO GENERAL:

Aplicar técnicas para la separación y obtención de proteínas y su identificación mediante

reacciones químicas.

4. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Determinar la solubilidad de las proteínas

Determinar la cantidad de caseína presente en la leche.

Verificar si la ovoalbúmina es una proteína

Comprobar si la ovoalbúmina tiene proteínas con azufre en su composición.

5. EQUIPOS:

Balanza electrónica

6. MATERIALES:

tubos de ensayo

Matraz Erlenmeyer

Pinzas

Mechero

Vaso de precipitación

Embudo

Papel filtro

Pipeta aforada 20 ml

Pipetas

Placa calefactora

Varilla de vidrio

Vaso de precipitación 100 ml

Vasos de precipitación 250 ml

7. REACTIVOS E INSUMOS

Ácido acético 1 M

Etanol

Éter etílico

Agua

Hidróxido de sodio 1N

Sulfato de cobre 10%

Cloruro mercúrico 10%

Bicarbonato de sodio 10%

Nitrato de plata 1%

Nitrato de potasio 10%

Alcohol de 90º

Solución de ovoalbúmina

Acido clorhídrico 1N

Acetato de plomo

Ácido nítrico concentrado

8. REVISIÓN DE LITERATURA:

Caseína:

(Alais, 2003) La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se

separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un

grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido

fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos

hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en

forma de sal cálcica (caseína cálcica). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las

proteínas presentes en la leche y el 2.7% en composición de la leche.

La caseína está formada por alpha (s1), alpha (s2)-caseína,β caseína , y kappa – caseína

formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la

leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de

ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de

micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son

fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

(Ortuño, 2006) La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a Ph 4.6. El

pH de la leche es 6.6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente

y solubilizada como sal cálcica. Si se añade acido a la leche, la carga negativa de la

superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra

precipita.

La función biológica de las micelas de la caseína es transportar grandes cantidades de Ca y

P altamente insolubles en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago

para favorecer una nutrición eficiente. Además la caseína, Ca y P la micela formada

también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticas y suero. Estas micelas ocupan

del 6-12 % del volumen total de la leche.

Ovoalbúmina:

(Gil, 2010) Es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de

huevo). Además de tener el mejor perfil proteico que se puede encontrar en un alimento, la

clara contiene vitaminas y minerales y aporta aproximadamente 17 calorías. Es una

proteína de referencia en bioquímica y es conocida en la industria alimentaria por sus

propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones.

Se desnaturaliza fácilmente con el calor. Es la proteína de mayor valor biológico ya que

tiene muchos de los ocho aminoácidos esenciales. Es rica en cisteína y metionina y

presenta grupos sulfhídrilos. La presencia de estos grupos sulfhidrilos hacen una gran

contribución aparte del sabor, textura y aroma característicos del huevo.

Sus propiedades es que son insoluble en agua, soluble en soluciones alcalinas, resistente a

tratamientos térmicos suaves (coagula a 80ºC) y rica en cisteína y metionina.

Se pueden aplicar en la medicina en los casos especiales de intoxicación por metales

pesados (tales como el hierro) se puede administrar unas dosis de ovoalbúmina. La

ovoalbúmina está relacionada con los metales pesados y su misión es la de atrapar los

iones de los metales pesados debido a la presencia de las uniones sulfhídricas de la

proteína. Su coagulación tras el proceso de absorción previene la absorción de metales en

el tracto gastrointestinal previniendo el envenenamiento.

En algunos casos, es utilizada para aliviar quemaduras o como regenerador de la piel.

Reacción de Biuret:

(Mora, 2007) Es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros

compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de

sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en

presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.

El hidróxido de potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino

necesario para que tenga lugar.

Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite

determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia

ultravioleta visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ion Cu2+

).

Reacción xantoproteica

(Guarnizo, 2003) Es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de

proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da

resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos,

especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un

álcali, se torna color amarillo oscuro.

La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática

de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto

coloreado amarillo a pH ácido.

Según las guías químicas es una reacción cualitativa, mas no cuantitativa. Por ende

determina la presencia o no de proteínas. Para cuantificar se usa otra reacción, como la de

Biuret, y se hace un análisis espectro fotométrico.

Reacción para compuestos azufrados:

(Flanzy, 2003) Son compuestos que presentan azufre como es el caso de la metionina y de

la cisteína los dos aminoácidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente,

mientras que la cisteína puede formarse a partir de la metioniona (no al revés). Las dietas

basadas en leguminosas pueden ser deficientes en estos aminoácidos. Además, ambos son

bastante inestables frente a condiciones de oxidación. La cisteína es muy importante en el

mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayoría de las proteínas

mediante la formación de puentes disulfuro, en dímeros de la cisteína formados por

oxidación.

Junto a la cisteína, la metionina es uno de los dos aminoácidos proteinogénicos que

contienen azufre. Este deriva de la s-Adenosil metionina (SAM) sirviendo como donante

de metiles. La metionina es un intermediario en la biosíntesis de la cisteína, la carnitina, la

taurina, la lecitina, la fosfatidilcolina y otros fosfolípidos. Fallos en la conversión de

metionina pueden desembocar en ateroesclerosis.

Este aminoácido es usado también por las plantas en la síntesis del etileno. Este proceso es

conocido como el ciclo de Yang o el ciclo de la metionina.

9. PROCEDIMIENTO:

Aislamiento de la caseína:

Se calentó en un vaso de precipitación 150ml de agua destilada a 38ºC, se puso 50ml de

leche y luego gota a gota y con agitación, se adicionó ácido acético 1M hasta que se

observe que se forma un precipitado (la leche se corta).

Se dejó sedimentar y se filtró sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.

Se lavó el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro, se seca el precipitado

colocando varios pliegues de papel de filtro, luego se colocó el precipitado en un vaso de

precipitación pequeño previamente pesado, se volvió a pesar el vaso con el precipitado y

luego se adicionó 5ml/g de éter etílico.

Se filtró nuevamente.

Se desechó el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la

caseína.

Preparación de la solución de ovoalbúmina

En un vaso se puso la clara de huevo, se batió durante algunos instantes, luego se mezcló

con 5 veces su volumen de agua. Se filtró la mezcla.

Reconocimiento de proteínas

Reacción de Biuret

En dos tubos de ensayo se colocó 2 ml de solución de clara de huevo. Al tubo 1 se agregó

2cc de agua destilada. Se añadió igual volumen de solución de hidróxido de sodio. Se

agitó. Se agregó tres gotas de solución de sulfato de cobre y se agita.

Se dejó reposar la mezcla, y se observó la reacción

En el tubo 2 se añadió 2cc de solución de hidróxido de sodio. Se agitó. Se agregó tres gotas

de solución de sulfato de cobre y nuevamente se agitó. Se dejó reposar la mezcla, y se

observó la reacción.

Reacción Xantoproteica

En un tubo de ensayo se puso 3 ml de solución problema. Se añadió lentamente 1 ml de

ácido nítrico concentrado. Se calentó a baño maría. Se dejó enfriar y se agregó unas gotas

de hidróxido de sodio y se observó el cambio de color.

Reacción para compuestos azufrados

Se colocó en el tubo de ensayo de 2 a 3cc. de albúmina de huevo (clara de huevo). Se

añadió 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20%. Y se añadió 10 gotas de solución de

acetato de plomo al 5%.

Se calentó el tubo hasta su ebullición, si se formó un precipitado de color negruzco nos

indicó que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo

que sirvió para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.

10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

Determinación de contenido de caseína en la leche

Tabla 1. Pesos de materiales empleados para determinación de contenido de caseína

Material Pesos

Probeta vacía 72,37

Probeta con leche 126,06

Leche 53,69

Vaso de precipitación vacío 115,91

Vaso con precipitado 129,45

Peso precipitado 13,54

Peso caseína seca 2,38

El porcentaje de caseína obtenido en el laboratorio 3,65% no concuerda con el porcentaje

de Alais (2003) que es de 2,7% una de las causas de la variación del porcentaje podría ser

que la leche del laboratorio en comparación con la leche de (Alais 2003), tubo diferente

grado de procesamiento.

Reacción de Biuret

-Con ovoalbúmina

En la foto 1 se observa que la primera reacción fue positiva en los tubos con la solución de

ovoalbúmina, por este motivo tomó una coloración violeta indicando la presencia de

enlaces peptídicos, al contrario en la solución solamente con el agua destilada tomó una

coloración celeste debido a que adoptó el color del sulfato de cobre, por lo tanto fue una

reacción negativa.

En la foto 2 se observa que esta reacción es positiva mientras haya dos o mas enlaces

peptídicos.

La coloración de la primera reacción fue de un color violeta, lo que me indica que existe

presencia de proteínas, por ende estoy de acuerdo con lo que cita Mora (2007).

El color de la segunda reacción fue de celeste, no de violeta; lo que me indica que en esta

reacción no hay presencia de proteínas, péptidos cortos u otros compuestos con dos o más

enlaces peptídicos, por tal estoy de acuerdo con lo que menciona Mora (2007).

Reacción Xantoproteica

El ácido nítrico (HNO3) reacciona con el radical fenilo de los aminoácidos de la

ovoalbúmina, radical que se transforma en hidroxi-benceno, que da el color amarillo

característico de esta reacción, debido a la formación de un compuesto aromático nitrado,

por medio de sustitución nucleofílica, lo que indica la presencia de proteínas con

aminoácidos portadores de anillos aromáticos.

Con la reacción xantoproteica tuvimos un color amarillento como lo cita Guarnizo

(2003), esto nos quiere decir que en la reacción se produjo un resultado positivo en las

proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente con presencia

de tirosina

Compuestos azufrados

Los enlaces peptídicos se hidrolizan con facilidad al calentarse, es por eso que se sometió

el tubo de ensayo con ovoalbúmina e hidróxido de sodio a baño María.

La mezcla de la proteína con hidróxido de sodio formó una precipitación lechosa tal como

se observa en la figura 7, la reacción sucedida se describe a continuación:

R-SH + 2 NaOH R-OH + SNa2 + H2O

La ecuación nos muestra que el hidróxido de sodio reacciona con el aminoácido

correspondiente (metionina o cisteína) separando el azufre que éste contiene, cuando

agregamos las gotas de acetato de plomo, observamos el cambio de color en la muestra de

proteína, mientras que en el agua permaneció incoloro. Este cambio de color se debe a la

formación de un precipitado de aspecto negruzco llamado sulfuro de plomo, el cual fue el

producto final de la reacción de ovoalbúmina con hidróxido de sodio y acetato de plomo.

De esta manera se pudo comprobar que la ovoalbúmina contiene aminoácidos azufrados

(cisteína o metionina).

Por medio de la reacción para compuestos azufrados tuvimos un color negruzco, esto nos

indica que la reacción tiene en su composición aminoácidos con azufre tal como lo cita

Flanzy (2003), estos aminoácidos son la metionina y la cisteína.

11. CONCLUSIONES

La caseína luego de que la leche se cortó no fue soluble en agua, debido a este motivo se la

pudo filtrar.

La ovoalbúmina fue soluble en agua, gracias a esto se pudo formar una solución para su

posterior análisis.

El contenido de proteínas presente en la leche es muy bajo, a pesar de que la leche

empleada para la práctica era una leche pura, sin procesar tuvo un contenido de 4,43% de

caseína la cual contiene el 82,5% de las proteínas de la leche, por lo tanto el 3,65% de la

proteína de la leche está contenida en la caseína.

Se pudo observar mediante varias reacciones que la clara del huevo tiene proteínas que la

conforman, esta proteína es la ovoalbúmina.

La ovoalbúmina tiene proteínas con azufre en su composición, esto se pudo identificar

mediante la reacción de la solución de la clara del huevo con el hidróxido de sodio y el

acetato de plomo, el cual forma sulfuro de plomo con el azufre presente en algunos

aminoácidos (cisteína y metionina) de la ovoalbúmina.

12. RECOMENDACIONES:

Colocar la leche en una probeta o recipiente que tenga un diámetro pequeño para facilitar

la posterior separación del suero de leche y el precipitado, ser pacientes y esperar que se

precipite lo suficiente antes de separarlos.

Tener mucha cautela al momento de pesar las muestras, para evitar errores que

posteriormente perjudiquen el cálculo de contenido de caseína en la leche.

Al momento de extraer la clara de huevo tener cuidado que no se vaya a mezclar con la

yema, debido a que dificultaría la preparación de la solución para su respectivo análisis.

13. BIBLIOGRAFIA:

Alais, C. (2003). Ciencias de la leche. España: REVERTE.

Flanzy, C. (2003). Enología: Funadamentos Científicos y Tecnológicos. Madrid -

España: Ediciones Mundi Prensa.

Gil, A. (2010). Composicion y Calidad Nutritiva de los Alimentos. Madrid -

España: Medica Panamericana.

Guarnizo, A. (2003). Experimentos de química orgánica. Colombia: Elizcom.

Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para Bioquimica.

Costa Rica: EUNED.

Ortuño, Á. V. (2006). Introducción a la Química Industrial. España: REVERTE.

http://www.csi-

csif.es/andalucia/modules/mod_ense/revista/pdf/Numero_21/ALMUDENA_MOR

ENO_2.pdf

14. ANEXOS:

Foto 1. Reacción de Biuret

Foto 2. Reacción en enlaces peptídicos

Foto 3. Probeta con leche

Foto 4. Reacción xantoproteica

Foto 5. Solución de

ovoalbúmina con NaOH

Foto 6. Tubo con solución de

ovoalbúmina en baño maría,

reacción compuestos azufrados

Foto 7. Se forma

precipitado negruzco

Foto 8. Precipitado de caseína