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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES – UNSM – T. PRESENTADO POR: Est: JUAN CARLOS GUERRERO ABAD TARAPOTO – PERÚ 2006
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL
INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES
OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia
volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES –
UNSM – T.
PRESENTADO POR:
Est: JUAN CARLOS GUERRERO ABAD
TARAPOTO – PERÚ
2006
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL
AREA DE BIOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES
OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia
volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES –
UNSM – T.
Ing. M.Sc. Armando D. Cueva Benavides Blgo.Msc. Winston Franz Ríos Ruiz
REVISOR ASESOR
Ing. Henri Delgado Haya Est. Juan Carlos Guerrero Abad
CO – ASESOR PRÁCTICANTE
TARAPOTO – PERÚ
2006
DEDICATORIA
A Dios por la maravillosa vida
A mis queridos padres Crecencio Guerrero y
María Luisa Abad, por que han sido
el bastón de mis pasos como estudiante.
A mis queridos y
traviesos hermanos: Maria,
Gladis, Roger, Alexander
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Nacional de San Martín por permitirme realizar mis
practicas pre – profesionales.
Al Blgo. M. Sc. Winston F. Ríos Ruiz, por brindarme su apoyo como
asesor en el presente trabajo.
De una manera muy especial al Ing. Henri Delgado Haya, por brindarme su
gran apoyo incondicional y el empuje a ser investigador.
Al Blgo. Marco León Martínez, por ser el iniciador de la idea del presente
trabajo.
A mis queridos compañeros de laboratorio, para Melissa Castro Sánchez,
Engels Padilla Gómez, Mike Anderson Corazón Güivin, Flor Gonzáles
Dávila, Salvith Ortiz Ramírez, quienes de alguna manera me brindaron su
apoyo y valiosas recomendaciones.
RESUMEN DEL INFORME
La presente práctica pre – profesional se llevo acabo en el Laboratorio de Tejidos
Vegetales de la Universidad Nacional de San Martín – Facultad de Ciencias
Agrarias. Busco el adiestramiento en el manejo de técnicas del cultivo In Vitro,
que consistía en el uso y manejo adecuado de materiales, equipos y reactivos
aplicados en diferentes áreas, paralelo a ello se desarrollo a manera de
investigación una metodología de regeneración artificial para la especie
Plukenetia volubilis L.
Es por ello que se realizaron ensayos en Embriogénesis somática, para determinar
una posible ruta de regeneración en tejidos cultivados a nivel In Vitro. Iniciándose
de esa manera con la introducción de embriones de semillas de Sacha Inchi a
condiciones In Vitro, con la finalidad de obtener brotes terminales sanos. Obtenidos
los brotes terminales en las plantas cultivadas, estos fueron cultivados e inducidos
a un medio de cultivo (M&S a concentración total – con vitaminas B5,
suplementado con 20 g/l de sucrosa, 2,5 g/l de phytagel, 5 mg/l de ANA, 2 mg/l de
BAP, 1 mg/l de KIN, 100 mg/l de myo-inositol y 10 mg/l de ácido cítrico), dando
origen a la formación de callos no diferenciados en forma desordenada.
Para el proceso del desarrollo, maduración y germinación de la formación callosa,
se subcultivo los callos formados alrededor del explante, a un medio de cultivo
(M&S a media concentración, suplementado con 3,5 g/l de agar + 4 g/l de carbón
activado + 20 g/l de sucrosa + 0,4 mg/l de Tiamina – HCl. + 0,5 mg/l de ácido
nicotínico), que genero la emergencia de primordios foliares.
ÍNDICE
Contenido Pág.
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………... 01
II. OBJETIVOS………………………………………………………... 02
III. ANTECEDENTES………………………………………………….. 03
3.1 Características del Cultivo………………………………… 03
3.1.1. Origen y Distribución………………………………. 03
3.1.2. Clasificación botánica……………………………… 03
3.1.3. Morfología General………………………………….. 04
3.1.4. Condiciones Edafoclimaticas para su cultivo…. 06
3.1.5. Plagas y enfermedades……………………………. 07
3.2. Cultivo de Tejidos Vegetales………………………………. 08
3.2.1 Generalidades………………………………………... 08
3.2.2 Medios de Cultivo…………………………………… 09
3.2.3 Técnicas de cultivo In Vitro……………………….. 11
3.2.3.1. Regeneración de Plantas
(Organogénesis y Embriogénesis)…... 11
3.2.3.2. Factores que influyen la
embriogénesis somática……………….. 14
IV. ACTIVIDADES DESARROLLADAS……………………………... 17
4.1. Reconocimiento de áreas, equipos, reactivos
y materiales del laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales de la UNSM – T………………………………... 17
4.1.1. Áreas del laboratorio……………………………... 17
4.1.2. Equipos del laboratorio………………………….. 22
4.1.3. Materiales y reactivos…………………………… 25
4.2. Callogénesis en Sacha Inchi……………………………. 27
4.2.1. Formulación y preparación
de medios de cultivo……………………………… 28
4.2.2. Protocolos para la preparación
de medios de cultivo……………………………. 29
4.2.3. Selección y recolección del material vegetal... 31
4.2.4. Preparación del material vegetal………………. 32
4.2.5. Procesos para la introducción de embriones.. 32
4.2.6. Inicio al proceso de la generación de
callos embriogénicos…………………………….. 39
V. CONCLUSIONES………………………………………………….. 42
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………. 43
VII. LITERATURA CONSULTADA…………………………………… 44
ANEXOS…………………………………………………………… 47
1. Composición del medio de cultivo de la
primera formulación (Germinación de embriones)………. 48
2. Composición del medio de cultivo de la
segunda formulación (Estimulación a la callogénesis)….. 49
3. Composición del medio de cultivo de la
tercera formulación (Maduración y
Germinación de embrioides)………………………………….. 50
4. Terminologías…………………………………………………. 51
5. Abreviaturas…………………………………………………… 52
6. Diagrama de flujo……………………………………………... 53
ÍNDICE DE FOTOS
Nº de Fotos Descripción Pág.
Foto Nº 01 Muestra prensada – acc. acchilla 03
Foto Nº 02 Planta – acc. Pacchilla 04
Foto Nº 03 Disposición de hojas 04
Foto Nº 04 Hoja 04
Foto Nº 05 Disposición de flores 05
Foto Nº 06 Inflorescencia 05
Foto Nº 07 Frutos inmaduros 05
Foto Nº 08 Fruto maduro 05
Foto Nº 09 Semillas 06
Foto Nº 10 Almendras 06
Foto Nº 11 Hormigas 07
Foto Nº 12 Atrofiamiento 07
Foto Nº 13 Diabrotica en sacha inchi 07
Foto Nº 14 Phytium sp.. 08
Foto Nº 15 Meloydogine spp. 08
Foto Nº 16 Colletrotrichum sp. 08
Foto Nº 17 Área de lavado de materiales 18
Foto Nº 18 Área de preparación de medios 19
Foto Nº 19 Área de siembra y transferencia 19
Foto Nº 20 Área de incubación 20
Foto Nº 21 Aclimatación – Fase I 21
Foto Nº 22 Aclimatación – Fase II 21
Foto Nº 23 Biblioteca 21
Foto Nº 24 Computadora 21
Foto Nº 25 Olla autoclave 22
Foto Nº 26 Balanza analítica 22
Foto Nº 27 Destilador 23
Foto Nº 28 Peachimetro 23
Foto Nº 29 Refrigerador 24
Foto Nº 30 Materiales de vidrio 25
Foto Nº 31 Materiales de de metal 26
Foto Nº 32 Reactivos 27
Foto Nº 33 Preparación de medios de cultivo 28
Foto Nº 34 Selección del material vegetal 31
Foto Nº 35 Escarificación 32
Foto Nº 36 Cámara húmeda 32
Foto Nº 37 Preparación de soluciones desinfectantes 33
Foto Nº 38 Retiro de testa 35
Foto Nº 39 Almendras 35
Foto Nº 40 Preparación del área de siembra 36
Foto Nº 41 Desinfección con 1,5% de NaOCl 37
Foto Nº 42 Enjuague 37
Foto Nº 43 Excisión de almendras 38
Foto Nº 44 Desarrollo In Vitro de plantas 39
Foto Nº 45 Inicio de callogenésis 40
Foto Nº 46 Callo no diferenciado 40
Foto Nº 47 Germinación de embrioides 41
I. INTRODUCCIÓN
La Región San Martín esta ubicada dentro del llano Amazónico del Perú,
albergando una gran biodiversidad de especies vegetales promisorias intactas a la
investigación, capaces de poder generar alternativas a la problemática de la
alimentación, la medicina, la artesanía, etc. Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.),
es una oleaginosa oriunda del Perú, por ser utilizada desde nuestro incanato como
un sustituto alimenticio y encontrarse en forma silvestre conviviendo con las
comunidades nativas y zonas rurales de la Región San Martín.
En la actualidad Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L.), tiene una gran perspectiva
para la producción y exportación de aceites a los mercados europeos por contener
ácidos grasos esenciales como los Omega 9, Omega 6 y Omega 3 esenciales en la
nutrición alimenticia.
El Cultivo de Tejidos Vegetales es una herramienta de la biotecnología de gran
utilidad, aplicada en aquellas especies vegetales que puedan ejercer la
“totipotencialidad celular”, que no es más que la capacidad que tiene una célula
vegetal en dar origen a un nuevo individuo bajo ciertas condiciones físicas y
químicas que se les brinda a nivel In Vitro. La embriogénesis somática es una
eficiente forma de multiplicación clonal, que consiste en cultivar células o tejidos
somáticos bajo la inducción de ciertas concentraciones hormonales (auxinas,
citoquininas y/o giberelinas), generando un proceso de multiplicación celular, que al
ser acondicionados a medios de cultivo enriquecidos dan origen a la formación de
embriones sin tener que pasar obligatoriamente por la unión de células gameticas
(sexuales).
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Desarrollar un protocolo para la obtención de callos embriogénicos en
Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L), a partir de Ápices meristematicos,
en el Laboratorio Cultivos de Tejidos Vegetales de la UNSM – Morales
2006.
2.2. Objetivos específicos:
Adiestramiento en los procesos y técnicas del cultivo In Vitro.
Establecer embriones de sacha inchi a condiciones In Vitro.
Acondicionar brotes terminales que permitan la obtención de callos a
partir de plántulas cultivas In Vitro.
Analizar y publicar los resultados obtenidos.
III. ANTECEDENTES
3.1. CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO
3.1.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN.
Según Valles (1991), menciona que el Sacha Inchi (P. volubilis
L.) es una planta voluble, trepadora y semileñosa. Fue descrita en
1753. Botánicamente pertenece a la Familia Euforbiacea. Esta
distribuida en el trópico latinoamericano desde el sur de México,
Indias Occidentales, la Amazonia y el Acre de Bolivia. En nuestro
país se ha recolectado en Madre de Dios, Huanuco, Oxapampa, San
Martín, Rodríguez de Mendoza, Ucayali (Pucallpa, Contamana y
Requena), Putumayo, Iquitos, Junín, Cuzco y Caballococha.
3.1.2. CLASIFICACIÓN BOTÁNICA
Arévalo (1996), menciona la clasificación botánica del sacha inchi
como se muestra en la (Foto Nº 01)
Foto Nº 01: Muestra prensada – acc. pacchilla
ORDEN : Euphorbiales
FAMILIA : Euphorbiaceae
GENERO : Plukenetia
ESPECIE : volubilis L.
3.1.3. MORFOLOGÍA GENERAL
La Planta se caracteriza
por ser:
Las Hojas son:
Alternas, acorazonadas, aseruladas, trinervadas con una nervadura
central dirigida al ápice acuminado (fotos Nº 03 y 04), así mismo en
la base del limbo presenta 2 glándulas laterales (albergando en las
mañanas gotitas de azucares orgánicos) y una pequeña proyección
intermedia denominada estipela (muy variable en los diversos
ecotipos).
Voluble, perenne,
semileñosa con
crecimiento indeterminado,
como se muestra en la
(Foto Nº 02)
Foto Nº 02: Planta – acc. pacchilla
Foto Nº 03: Disposición de Hojas Foto Nº 04: Hoja
Con respecto a las Flores, estas son:
Hermafroditas monoicas, las flores masculinas son pequeñas,
blanquecinas y dispuestas en racimos, en la base del racimo y
lateralmente se encuentra una, dos y hasta tres flores femeninas, en
las flores femeninas se aprecia que el número de estigmas es igual al
número de ovarios como se muestran en las (fotos Nº 05 y 06).
Los frutos son cápsulas dehiscentes, distribuidos en lóculos, el
número de lóculos esta en función a la variabilidad genética de sacha
inchi, presentando cuatro, cinco y hasta siete lóculos (fotos Nº 07 y
08).
Foto Nº 05: Dispos. de flores Foto Nº 06: Infloresc.
Foto Nº 07: Fruto Foto Nº 08: Fruto maduro
La Semilla.
Tiene forma ovalada de color marrón-oscura, abultada hacia el centro
y aplastada hacia los costados (foto Nº 09), al abrir la testa de la
semilla observamos la almendra de color blanco que esta protegido
por una película blanquecina (foto Nº 10).
3.1.4. CONDICIONES EDAFOCLIMATICAS PARA SU CULTIVO
Altitud.
Sacha Inchi se adapta desde los 100 a 2000 msnm (Manco, 2005).
Registrándose así mismo las mejores semillas (> 12mm) a
plantaciones establecidas desde los 600 m.s.n.m.
Clima.
Manco (2005), menciona que los parámetros de temperaturas
adaptables a esta planta esta entre 10 y 36ºC, temperaturas altas
son desfavorables por que ocasiona aborto en flores y la
conformación de semillas pequeñas.
Foto Nº 09: Semillas Foto Nº 10: Almendras
Luz.
Uno de los factores ecológicos importantes en esta especie es la luz,
mientras mas luz reciba la cubierta vegetal mayor es la población de
brotes, flores y frutos.
Suelo.
Valles (1991), menciona que se adapta a suelos ácidos con
contenidos muy significativos en aluminio, así mismo prospera en
áreas pobladas por shapumba (Pteridium aquilinun) y Cashucsha
(Imperata brasiliensis).
Para tener un buen suelo en la producción de Sacha Inchi, este
debe tener un nivel de fertilidad que va de medio a alto, que tenga un
buen drenaje y una buena profundidad.
Agua.
La disponibilidad del agua al inicio es importante en el marco de la
siembra directa y dentro del transplante si se hace mediante
viverización, es indispensable también en su etapa de giamiento y
dentro de la floración y fructificación, al efectuar los riegos tratar de
hacer a su capacidad de campo y no encharcarlos para evitar el
riesgo de favorecer condiciones que permiten elevar altas
poblaciones del Nematodo del nudo (Meloidogyne spp.).
3.1.5. PLAGAS Y ENFERMEDADES
Plagas.
Las plagas más visibles son indaneros, diabróticas, grillos
cortadores, hormigas azucareras, etc. Como se observa en las
fotos (Nº 11, 12 y 13).
Enfermedades.
La enfermedad más saltante es el nemátodo del nudo asociado a
Fusarium spp. Que aniquila a la planta durante su periodo de
producción, también existen otras enfermedades como se muestra
en las imagines (fotos Nº 14, 15 y 16).
Foto Nº 13: Diabrotica Foto Nº 12: Atrofiam. Foto Nº 11: Hormig.
Foto Nº 16: Colletrotrichum sp.Foto Nº 15: Meloydogine spp.Foto Nº 14: Phytium sp.
3.2. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
3.2.1. GENERALIDADES.
Ruiz (2003), define al cultivo de tejidos In Vitro, en su acepción
amplia como un grupo heterogéneo de técnicas mediante los cuales
un explante (parte separada de un vegetal, células, tejidos,
embriones, etc) con potencialidad de diferenciación, se cultiva bajo
condiciones asépticas, en presencia de un medio de cultivo
constituido por macro y micronutrientes, vitaminas y hormonas que
se incuban a condiciones ambientales controladas.
El cultivo de tejidos vegetales, es una técnica de propagación de las
plantas que se halla a disposición del cultivador, pero no es
ampliamente usado debido a su poca difusión (Mejia, 1994).
Roca Y Mroginski (1991), mencionan que la investigación en
cultivos de tejidos vegetales incluye un rango amplio, desde la
investigación básica sobre los procesos fisiológicos ocurridos in
vitro, hasta llegar a las investigaciones aplicadas y al desarrollo de
tecnologías en la propagación clonal o en el mejoramiento genético
de plantas.
Las técnicas de cultivos In Vitro han contribuido no solo a un mejor
entendimiento de los eventos de diferenciación celular, si no a un
mejor aprovechamiento de tales eventos en la explotación más
eficiente de las plantas
Al igual que otros métodos de multiplicación vegetativa o asexual,
los individuos descendientes de una planta madre cultivada in vitro
son clones, es decir copias genéticamente iguales entre ellas e
idénticas a la madre. En plantas propagadas por semilla la
descendencia no es clonal, pues cada semilla tiene su propia base
genética que resulta de la recombinación de genes de ambos
progenitores (Roca y Miroginski, 1991).
3.2.2. MEDIOS DE CULTIVO
Krikorian (1991), Menciona que el crecimiento de las células y
tejidos cultivadas a nivel In Vitro, requieren de compuestos
orgánicos e inorgánicos dispuestos en diversas concentraciones de
macro y microsales, compuestos carbonados, vitaminas, hormonas,
aminoácidos, etc. participando en una forma responsable y activa en
el crecimiento de los explantes introducidos a nivel In Vitro.
Barrera (2004), Mediante una prueba de ensayos, concluyó que el
mejor medio de cultivo que manifestó mejores resultados en el
crecimiento de embriones de Plukenetia volubilis estaba
formulado a base de sales a concentración total de M&S
(Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0,4 mg/l de tiamina,
0,5 mg/l de ácido nicotínico, 20 g/l de sucrosa, 2 g/l de carbón activo
y 2,5 g/l de gel rite todo esto ajustado a un pH = 5,8. Manifestando
como recomendación la suplementación de compuestos
antioxidantes debido a la presencia de fenolización en un 40%.
Para el caso de embriogénesis somática se ha utiliza el medio
desarrollado por (Murashige et al, 1962). Debido a la concentración
alta de sales es muy benéfica en el proceso de la embriogenesis
somática (Litz, R. & Jarret, R. 1991).
Wertherell (1984), ha demostrado que es posible aumentar el
potencial embriogénico en zanahoria utilizando concentraciones
altas de sacarosa (2% a 3% hasta 12%), el nitrógeno suministrado
como nitrato o como ión amonio es esencial en el desarrollo y
maduración de los callos, mencionado en (Litz, R. & R. Jarret.
1991)
Roca et al (1991), comprobaron que el medio de cultivo que
regeneró plantas de Stylosanthes sp. contenía sales M&S
(Murashige y Skoog, 1962) y Vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968),
suplementado con 1mg/L de ANA y 1 mg/L BAP.
Roca y Mroginski (1991), mencionan que el empleo de sustancias
antioxidantes como el ácido ascórbico, L – Cisteína,
Polvinilpirrolidona), puede ser efectivo para el cultivo de explantes
que muestran altos contenidos de polifenoles.
3.2.3. TECNICAS DE CULTIVO IN VITRO.
Dentro de las técnicas de cultivo in vitro tenemos:
Micropropagación vegetal
Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis)
Cultivo de meristemas
Cultivo de suspensiones de células vegetales
Cultivo de protoplastos
Cultivo de anteras
Cultivo de óvulos y embriones
3.2.3.1. REGENERACIÓN DE PLANTAS (embriogénesis y
Organogénesis).
Haberlandt (1902), propuso que todas las células de los
vegetales tienen la capacidad de poder formar plantas
completas, quiere decir que estas plantas tienen un grado
de totipotencialidad (Krikorian et. al., 1969)
Litz (1991), menciona que la regeneración directa de
plantas (organogénesis) y la regeneración indirecta a partir
de callos (embriogénesis somática), se ha utilizado como
una alternativa a la propagación de plantas y debido a la
diferente fisiología de los vegetales no se ha podido
generalizar por que existe muy poca estabilidad genética
en el cultivo de los callos (en su forma, estructura y
viabilidad.)
Embriogénesis Somática.
La Embriogénesis somática comprende la formación de
un embrión a partir de una célula diferente a un gameto o
al producto de la unión de gametos, siendo conocida en la
naturaleza como una forma de apomixis, la cual recibe el
nombre de embrionia adventicia (Merkle et al, 1995).
Los embriones somáticos formados son: estructuras
bipolares con un eje radial apical que no poseen conexión
vascular con el tejido materno. Estas estructuras bipolares
son capaces de crecer y formar plantas completas y
normales (Gómez, 1998).
Según Boner (1965), dos condiciones tienen que ser
satisfechas para que ocurra la embriogénesis:
a) Las células especializadas tienen que estar separadas
del tejido adyacente, tal que sea una célula simple.
b) Las células especializadas tienen que estar rodeadas de
un medio de cultivo que contenga los nutrientes
necesarios para el crecimiento del embrión (Halperin,
1995)
El desarrollo de un sistema experimental para la
regeneración de plantas vía embriogénesis somática
incluye los siguientes pasos:
• Inducción de los embriones somáticos.
• Proliferación
• Desarrollo de los embriones somáticos
• Maduración
• Germinación y conversión en plantas
Inducción
Según Parrot 1993, la inducción del estado embriogénico
incluye la inducción de los mismos mecanismos genéticos
que conllevan a la embriogénesis cigótica. Contrariamente
a los embriones cigóticos los embriones somáticos no
contienen un nuevo grupo de genes sino que poseen la
misma combinación genética de la planta fuente de
explante. El empleo de la auxina es la mejor manera de
inducir la formación de células embriogénicas desde
células somáticas. La inducción de la división celular como
una respuesta a esta auxina puede resultar en un callo con
crecimiento desorganizado o bien en un crecimiento
polarizado coordinado para la formación de un embrión"
(Gómez 1998).
Desarrollo
El estadio temprano o pre globular de los embriones
somáticos son fácilmente reconocidos generalmente por el
contenido de citoplasma denso y la ausencia general de
vacuolización (Krikorian, 1995). Durante esta fase las
auxinas son inhibitorias para el desarrollo de los
agregados celulares embriogénicos a embriones
(Halperin, 1995).
Proliferación
Uno de los más poderosos aspectos de la embriogénesis
somática que permite su aplicación en la propagación
masiva y la transferencia de genes es la habilidad de los
cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a
proliferar o multiplicarse indefinidamente (Merkle et al.,
1995). El factor más fuerte asociado con la proliferación
continua de las células embriogénicas es la auxina. Sin
embargo parece ser que el efecto de esta fitohormona no
puede ser considerado independiente a la reducción de la
concentración de nitrógeno, existiendo una fuerte
evidencia de la interacción entre ambos (Ram et al.,
1982/cit. por Gómez R., 1998). Además el nivel de auxina
necesario para mantener la embriogénesis repetitiva varía
de acuerdo a la especie (Merkle et al., 1995).
Maduración
La maduración es el período en el que el embrión somático
sufre expansión de sus células, y la acumulación de
sustancias de reserva (Bewley y Black, 1985/cit. por
Gómez R., 1998). En esta etapa juega un papel
fundamental la presencia de nitrógeno en el medio de
cultivo, siendo necesario el suplemento con nitratos,
amonio, aminoácidos y caseína hidrolizada. Los
carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones
de 3-6% son esenciales, junto a bajas concentraciones de
oxigeno en el medio, lo cual permite una maduración total
y evita la germinación precoz (Merkle et al., 1995).
3.2.3.2. Factores Que Influyen En La Embriogénesis Somática
Explante
Litz & Jarret (1991), mencionan que virtualmente todos los
tejidos tienen la capacidad para formar callos, pero sin
embargo pocos son los explantes que manifiestan la
formación de callos embriogénicos, comúnmente se han
utilizado explantes como cotiledones, hipocotilos,
embriones, ápices caulinares, segmentos de tallos, hojas,
raíces, inflorescencias inmaduras que han dado origen a la
formación de callos embriogénicos.
Muchos factores influyen en la conducta del explante en el
medio de cultivo (Murashigue, 1962). Estos incluyen (1) el
órgano que esta sirviendo como la fuente de tejido, (2) la
edad fisiológica y ontogénica del órgano, (3) la estación en
que el explante es obtenido, (4) el tamaño del explante y (5)
las cualidades globales de la planta de la cual se ha
obtenido el explante (Thorpe & Patel, 1984/cit por Thorpe
et al., 1991).
Reguladores de Crecimiento
La presencia de 2,4-D, para la inducción y proliferación de
embriones somáticos puede afectar la estabilidad genética
de las células embriogénicas (Merkle et al, 1995).
El picloran es otro reactivo que se utiliza reemplazando al
2,4-D para inducir embriogénesis, pudiéndose adicionar en
concentraciones de alrededor de 0.1 mg/l (Pliego Alfaro,
1988).
Según Merkle et al, 1995, la incidencia de variación
somaclonal podría aumentar al incrementarse la
concentración de 2,4-D empleada en el medio y la duración
a la exposición a esta hormona.
Medio de cultivo
La inducción de embriogénesis somática requiere
usualmente no mas de 5 – 12.5 uM de amonio en el medio.
Niveles muy altos de amonio pueden inhibir la
embriogénesis (Merkle et al., 1995).
Según Ammirato (1983), la presencia de nitrógeno
reducido en el medio promueve la embriogénesis, pero
existen algunos casos en que la adición de aminoácidos
disminuye la producción de embriones (Von Arnold,
1987/cit por Fernández Guijarro B. et al., 1995).
La importancia del abastecimiento de nitrógeno durante la
embriogénesis puede ser un reflejo de los requerimientos
de nitrógeno por la continua síntesis de proteínas, ácidos
nucleicos y substancias de reserva (Merkle et al., 1995).
IV. ACTIVIDADES DESARROLLADAS
4.1. Reconocimiento de áreas, equipos, reactivos y materiales del
laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la UNSM – T.
Es de vital importancia reconocer y conocer satisfactoriamente el uso y
manejo de los materiales, equipos, reactivos y como saber aplicarlos en el
trabajo In Vitro, teniendo como única finalidad que el cultivador realice el
mejor trabajo a medida que lo ejecute, el conocimiento de la organización y
el manejo adecuado de los materiales y equipos resulta ser una eficaz causa
para obtener resultados satisfactorios a nivel de investigación, pues el
conocimiento del correcto funcionamiento y aplicación de los ítems
mencionados anteriormente influye bastante en la duración y permanencia
de los entes que integran el Laboratorio.
Para tal caso a continuación se menciona algunas de las pautas que se
debe tener en cuenta en el reconocimiento y manejo de áreas, equipos,
reactivos y materiales más usuales el Laboratorio de Tejidos Vegetales.
4.1.1. Áreas del Laboratorio
El laboratorio de tejidos vegetales se organiza en una forma integral
mediante áreas que permita facilitar el desarrollo dinámico y
sincronizado de la actividad que se este realizando.
Área de lavado y preparación de materiales
En esta área se efectúa el lavado y la preparación de materiales de
vidrio, plástico y metal provenientes de las áreas de: siembra y
transferencia, preparación de medios de cultivo, aclimatación, y
aquellos frascos contaminados ya estériles (foto Nº 17).
Área de esterilización y preparación de medios de cultivo.
Esta área cumple funciones de preparación y esterilización de medios
de cultivo, agua destilada, materiales de vidrio, etc. Así mismo se
realiza la preparación de soluciones stock, la calibración del pH, el
dispensado y empaquetado de los frascos que contienen el medio de
cultivo, etc. Como se aprecia en la (foto Nº 18).
Conjuntamente a esta área existen espacios para la estufa, el
refrigerador, y el destilador que son indispensables para el desarrollo
del trabajo antes mencionado.
Foto Nº 17: Área del Lavado de Materiales
Área de siembra y transferencia
En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de excisión,
inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo.
Dado de que en este ambiente se necesita altos niveles de limpieza
ambiental es indispensable la instalación de gabinetes de flujo
horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión (cámara de flujo
laminar). (foto Nº 19)
Foto Nº 18: Área de preparación de medios de cultivo
Foto Nº 19: Área de siembra y transferencia
Área de incubación
Los cultivos se incuban en gabinetes o cámaras de crecimiento. Esta
área debe proporcionar condiciones físicas controladas en Tº (20-
28ºC), iluminación (1000 a 5000 lux) y una humedad relativa de (70%
a 80%). En ella se instalan estanterías metálicas distribuidas en forma
ordenada y en dimensiones variables y dentro de las funciones que
tiene el área de incubación es optimizar el desarrollo de los explantes
cultivados en los medios de cultivo dentro de sus condiciones
atribuidas (foto N° 20).
Área de preaclimatación
En este recinto las plántulas desarrolladas a nivel In Vitro y próximas
a aclimatarse, están expuestas al medio ambiente, buscándose iniciar
los primeros pasos a la aclimatación.
Área de Aclimatación
Foto Nº 20: Área de incubación
Consta de dos etapas, una de ellas se trabaja a nivel de laboratorio y
la otra a nivel de vivero, dentro de la primera etapa se efectiviza los
procesos del lavado, desinfección y sembrado de las plántulas en
sustratos estériles, pasados algunos días en cámara húmeda se
procede con la segunda etapa que consiste en llevar aquellas
plántulas que están en cámara húmeda a condiciones de vivero, con
la finalidad de criarlas (fotos Nº 21 y 22).
Área de oficina
Constituida por materiales y mobiliarios como libros, escritorios,
catálogos, documentos, reportes y un sistema de cómputo que
permite la facilitación del procesamiento de datos, redacción y
publicación de trabajos realizados en el laboratorio de tejidos
vegetales (fotos Nº 23 y 24).
Foto Nº 21: Fase I Foto Nº 22: Fase II
Foto Nº 23: Biblioteca Foto Nº 24: Área de redacción
4.1.2. Equipos del laboratorio
Los equipos del laboratorio son los componentes que ayudan en el
suceso de una actividad, tal es así que es importante su uso y manejo
adecuado. La Facultad de Ciencias Agrarias cuenta con los equipos
necesarios para realizar trabajos relacionados al área de
biotecnología.
Autoclave
Equipo que facilita la esterilización de
Medios de cultivo, Materiales de metal,
Materiales de Vidrio, Agua destilada, etc.
La esterilización se llevaba acabo
mediante vapor a una presión de 1
atmósfera o 15 psi con 121ºC de
temperatura por un lapso de 15 minutos,
propiciándose la destrucción de bacterias,
hongos y esporas. (Foto N° 25)
Balanza Analítica
La balanza analítica permite pesar
reactivos con precisión (mg y µg),
destinados a la preparación de la
preparación de soluciones stock,
medios de cultivo, etc. (foto N° 26)
Foto Nº 25: Olla autoclave
Foto Nº 26: Balanza analítica
Destilador
El destilador (foto Nº 27), proporciona agua
destilada químicamente pura ajustandose
aproximadamente a un pH 7,0; el agua esta
destinada a la preparación de medios de
cultivo, lavado de materiales de vidrio y metal,
esterilización de la misma en pequeños
volúmenes para ser usada en la preparación de
soluciones stocks, etc.
pH-metro
La foto Nº 28, muestra el pH-metro que
permite medir el grado de concentración de
iones (H+ y/o OH-) en la preparación de
medios de cultivo, consta de un tablero
digital y un electrodo sensible que sumergido
en la solución de preparación da como
resultado la lectura del pH
Refrigeradora
Es un equipo que proporciona una cámara de
frió, destinada a la preservación bajo
temperaturas bajas de soluciones estoks,
vitaminas, hormonas, compuestos orgánicos
(agua de coco), agua destilada estéril, etc.
(foto Nº 29)
Foto Nº 28: peaachimetro
Foto Nº 27: Destilador
Foto Nº 29: Refrigerador
Cámara de Flujo laminar
Es un equipo que facilita las actividades de desinfección, excisión y
transferencia de explantes a los medios de cultivo, proporcionando un
ambiente aséptico durante el proceso del trabajo. Para el uso es muy
importante llevar en una forma ordenada la integración de los
materiales que se utilizan dentro de ella, facilitando así un espacio
máximo en la mesa de trabajo, es muy importante el uso de mandiles
y mascarillas y evitar en lo posible la salida continua de la cámara,
esto evitara tener bajos riesgos en contaminación.
Microscopio compuesto
Este equipo es muy elemental en un laboratorio de Tejidos por que
permite la observación de células vegetales, tales como semillas,
callos, tejidos, etc.
Estereoscopio
Es un equipo de fácil uso, práctico en la observación de semillas,
yemas laterales, ápices meristemáticos. Facilita realizar cortes y
visualizar la morfología y la estructura de órganos no sensibilizados a
simple vista. .
4.1.3 Materiales y Reactivos
El laboratorio de Tejidos Vegetales de la UNSM – FCA, cuenta con
materiales y reactivos; dentro de los materiales están aquellos
compuestos por metal, vidrio y plástico. Los reactivos son aquellos
compuestos que contienen sales macro(N, P, K, Mg, Ca) y micro (Cu,
Zn, Cl, I, Co, Mo, Mn, Fe, B, Na,), hormonas, vitaminas, etc.
Materiales de vidrio
Los materiales de vidrio estan compuestos por frascos de 15 onzas,
tubos de ensayo, placas petri, pipetas, probetas, vasos de precipitado,
frascos erlenmeyer, mechero, todos ellos graduados y dispuestos en
diferentes tamaños. (foto Nº 30)
Materiales de metal
El Laboratorio cuenta con materiales quirúrgicos tales como pinzas,
mangos para bisturís, bisturís en diferentes números, espátulas de
bronce y de acero inoxidable, tijeras, etc. (foto Nº 31)
Foto Nº 30: Materiales de Vidrio
Foto Nº 31: Materiales de metal
Reactivos
El Laboratorio también cuenta con reactivos e insumos químicos que
se utilizan en base a la formulación de los medios de cultivo, los
insumos están contenidos en compuestos de: Sales minerales
formuladas por Murashige & Skoog (1962), Ácido cítrico, Myo-inositol,
Tiamina-Hcl, Piridoxina, Botina, Ácido nicotínico, Ácido Naftalen
acético, Ácido 2,4-Dicloro-fenoxi-acético, Ácido indol Acético, Ácido
indol Butírico, Bencil amino purina, Kinetin, Acido Giberelico,
Sucrosa, Fructuosa, Carbón activo, Agar, Phytagel, vitaminas, Agua
de coco (foto Nº 32).
Foto Nº 32: Reactivos
Otros materiales.
Mascarillas, Rejillas, Alcohol a 96º, Lejía, Fósforo, Algodón, Bandejas,
Baldes, Papel toalla, Papel aluminio, clear plastic wrap, Carrito de
transporte, Detergentes, Mandiles, Toallas, Fibra de coco,
Hexagonales de plástico, magentas, tapas de tubos, Papel de
reciclaje, Hilo pabilo, Pizetas, propipeta, cámara digital, trípode, etc.
4.2. Callogénesis en Sacha Inchi
4.2.1 Formulación y preparación de medios de cultivo
La preparación de los medios de cultivo se hizo a base de tres
formulaciones , siguiendo un mismo protocolo de preparación para
cada caso (foto Nº 33), variando las concentraciones de aplicaciones
M&S y adiciones de hormonas y vitaminas como se hace mención a
continuación.
Primera formulación (Germinación de embriones)
Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:
M&S (Macro y microsales a concentración total)* + 3,5 g de agar +
2 g Carbón activo + 0,5 mg Ácido nicotínico + 0,4 mg Tiamina-HCl +
20 g De Sucrosa, todo esto ajustado a un rango de pH: 5.7 – 5.8
Segunda formulación (Estimulación a la callogenesis)
Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:
M&S (Macro y microsales a concentración total)* + 2,5 g de phytagel
+ 100 mg de myo-inositol + 10 mg de ácido cítrico + B5( Vitaminas a
concentración total)* + 30 gr. De sucrosa + 5 mg de ANA + 2 mg de
BAP + 1 mg de KIN, todo esto ajustado a un rango de pH: 5,7 – 5,8.
Tercera formulación (Maduración y germinación de embriodes)
Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:
M&S (media concentración en macro y microsales)* + 3,5 g de agar +
2 g de carbón activado + 20 g De sucrosa + 0,8 mg de Tiamina – HCl.
+ 1,0 mg de ácido nicotínico
Foto Nº 33: Preparación de medios de cultivo
4.2.2. Protocolos para la preparación de medios de cultivo.
Protocolo del medio de cultivo para la germinación de
embriones y embroides.
Lavar y enjuagar con agua destilada frascos de 15 onz.
Colocar en un vaso precipitado de 1L. 500 ml de agua destilada.
Agregar los Stocks A, B, G, C, D, E, F*, de acuerdo a los
requerimientos de cada la formulación.
Agregar vitaminas.*
Agregar la sucrosa
Agregar el carbón activo.
Enrazar a 1L. de solución.
Medir el pH
Agregar el gelificante *
Dispensar 50 ml de medio de cultivo a cada frasco de 15 onz.
Tapar y amarrar con papel aluminio y papel reciclado los frascos
de 15 onz.
Autoclavar los frascos a 1 atm por 15 minutos, a una temperatura
de 121 ºC.
Agitar suavemente y dejar enfriar al medio ambiente.
Rotular y almacenar en el área de incubación o refrigerador.
* Las descripciones se muestran en los anexos.(anexo 1 y anexo 3)
Protocolo del medio de cultivo para la formación de callos
Lavar y enjuagar con agua destilada tubos de ensayo de
25x150mm.
Colocar en un vaso precipitado de 1L. 500 ml de agua destilada.
Agregar los Stocks A, B, G, C, D, E, F*, de acuerdo a los
requerimientos de la formulación.
Agregar (vitaminas, hormonas, antioxidantes).*
Agregar la sucrosa
Enrazar a 1L. de solución.
Medir el pH
Agregar el gelificante *
Dispensar 15 ml de medio de cultivo a cada tubo de ensayo.
Tapar con papel aluminio y con una tapa de plástico a los tubos de
ensayo.
Autoclavar los tubos de ensayo, a 1 atm por 15 minutos, dentro
de una temperatura de 121 ºC.
Agitar suavemente y dejar enfriar al medio ambiente.
Rotular y almacenar en el área de incubación o refrigerador.
*Las descripciones se muestran en los anexos.(Anexo 2)
4.2.3. Selección y recolección del material vegetal
La selección y colección del material vegetal se hizo de la
accesión “pacchilla”, ubicada en el distrito de Cacatachi a unos 5
Km carretera “Fernando Belaunde Terry”, partiendo desde la
ciudad de Tarapoto.
Se procedió a colectar en forma manual los frutos maduros y
secos (foto Nº 34), para luego ser llenados en una bolsa de
polipropileno y trasladados al laboratorio.
Foto Nº 34: Selección del material vegetal
4.2.4. Preparación del material vegetal.
Obtenidos los frutos se procedió a:
Separar las cápsulas del fruto.
Escarificar las cápsulas hasta obtener las semillas de color
marrón.( foto Nº 35)
Desinfectar las semillas con una concentración de 1,5% de NaOCl
por un lapso de 10 minutos.
Lavar, enjuagar con agua corriente y acondicionar en una placa
estéril mediante una cámara húmeda por un lapso de 24 horas,
con el fin de hidratar los endospermos y facilitar los cortes.
(foto Nº 36)
Foto Nº 35: Escarificación Foto Nº 36: Cámara húmeda
4.2.5. Procedimiento para la Introducción de embriones - primera
formulación (Germinación de embriones)
Preparación de frascos.
Para la preparación de los frascos se procedió a:
Colocar 4 frascos de 15 Onz. en la mesa de trabajo.
Acondicionar un mechero en actividad.
Asperjar alcohol etílico de 96º en la parte interna del frasco.
Acercar la boca del frasco a la flama del mechero, con la finalidad
de que se ejecute la combustión interna del alcohol lográndose la
incinerización de microorganismos contenidos dentro del frasco.
inmediatamente tapar con papel aluminio.
Hacer esto con cada uno de los frascos y ponerlos a disposición a
la recepción de las soluciones desinfectantes y almendras.
Preparación de la solución desinfectante y tensoactiva
Para la preparación de las soluciones desinfectantes se utilizo la
aplicación de la ley de concentraciones.
Foto Nº 37: Preparación de soluciones desinfectantes
C1 x V1 = V2 x C2
Donde:
C1 = Concentración inicial del NaOCl y/o Alcohol etílico.
V2 = Volumen inicial del NaOCl y/o Alcohol etílico.
C2 = Concentración final de la solución
V1 = Volumen final de la solución.
Preparación de 100 ml de NaOCl a una concentración de 1,5%. (foto
Nº 37)
5,25% x X = 100 ml x 1,5%
X = 100 ml x 1,5%5,25%
X = 28,57 ml de NaOCl aplicados a 71,43 ml de Agua destilada.
Nota.
El mismo procedimiento es para la preparación de la solución
tensoactiva y desinfectante del alcohol etílico al 70% y/o 70º. Las
soluciones desinfectantes fueron albergadas en dos frascos de los
cuatro preparados anteriormente, debidamente tapados y rotulados.
Preparación de las almendras
Después del acondicionamiento de las semillas en cámara húmeda
por 24 horas se procedió a:
Lavar las semillas con agua corriente y agua destilada y
disponerlas sobre una placa petri estéril.
Rociar la pinza y las manos con alcohol de 96º, y dejarse secar al
medio ambiente.
Con la pinza retirar la testa de las semillas con la finalidad de
obtener las almendras de color blanquecino y ponerlas sobre una
placa estéril (fotos Nº 38 y 39).
Terminada la obtención de las almendras, disponerlas en uno
frasco de los cuatro preparados anteriormente.
Tapar y rotular con el papel aluminio.
Acondicionamiento de la cámara de transferencia
Para ejecutar la desinfección de las almendras se procedió a:
Desinfectar la mesa de trabajo.
Transportar e introducir dentro de la cámara a los tres frascos que
contienen las almendras, las soluciones desinfectantes. Y el
cuarto frasco como colector de los enjuagues realizados en el
proceso de desinfección.
Foto Nº 38: Retiro de testa Foto Nº 39: Almendras
Así mismo trasportar, introducir y organizar en la cámara de
transferencia, 2 erlenmeyer de 150 ml conteniendo agua destilada
estéril, 1 erlenmeyer vació estéril, medios de cultivo para
germinación de embriones, pinzas (1 grande, 1 pequeña), 2
mangos para bisturí, 2 hojas de bisturí Nº 10, placas petri (2
grandes, 1 pequeña), reloj, plumón marcador, segmentos de clear
plastic wrap para envolver los frascos, mechero, frasco con
alcohol, aspersor. (foto Nº40)
Esterilizar las pinzas y los bisturís y colocarlos sobre los bordes de
las placas petri.
Dejar enfriar.
Foto Nº 40: Preparación del área de siembra
Desinfección de las almendras.
Para la desinfección de las almendras se procedió a:
Sumergir las almendras a la solución con 70% de alcohol, por un
lapso de 10 segundos.
Desechar el alcohol al frasco colector y vaciar las almendras
dentro de una placa petri.
Con la ayuda de la pinza grande introducir las almendras una por
una al erlenmeyer estéril.
Agregar al erlenmeyer la solución desinfectante con 1,5% de
NaOCl y agitar por un lapso de 10 minutos (fotos Nº 41 y 42)
Desechar la solución desinfectante al frasco colector.
Realizar tres enjuagues con agua destilada estéril por un lapso
de 1 minuto, con la finalidad de liberar moléculas de la solución
desinfectante de la superficie de las almendras.
Disponer a las almendras desinfectadas sobre una palca estéril.
Foto Nº 41: Desinfección con 1,5% de NaOCl/10 min. Foto Nº 42: Enjuague
Disección y separación de embriones
Para este procedimiento se debe tener bastante cuidado de no
dañar estructuras del embrión, situados en el interior de las
almendras, teniendo esto como recomendación se procedió a:
Acondicionar una pequeña lamina de agua destilada estéril al
interior de una placa petri, para la recepción de embriones con la
finalidad de evitar la deshidratación de los mismos.
Con los dos bisturís realizar tres cortes, dos laterales y uno
superior teniendo como referencia al punto de crecimiento de la
raíz, ubicado en la parte inferior de la almendra.
Con la ayuda de la pinza grande y un bisturí destapar una tapa de
la almendra.
Con el bisturí y con cuidado levantar el embrión y disponerlo
sobre la lámina de agua estéril contenida en la placa petri. (foto
Nº 43).
Foto Nº 43: Excisión de almendras
Siembra de embriones
Este procedimiento es bastante sencillo, pero se debe tener cuidado
en evitar la contaminación en ellos.
Para efectuar una buena siembra se procedió a:
Destapar el frasco que contiene el medio de cultivo.
Con la ayuda de la pinza grande recoger y sembrar el embrión
acondicionándolo suavemente en la superficie del medio de
cultivo.
Posteriormente tapar, rotular tomando como datos la fecha de
siembra y transferirlo al área de incubación.
4.2.6. Inicio al proceso de la Generación de callos embriogénicos.
Para este proceso se indujo a la formación de una masa callosa a los
brotes terminales obtenidos de plántulas In Vitro que fueron
desarrolladas por un lapso de 30 días. (foto Nº 44)
De igual manera a través de subcultivos se indujo a la maduración de
los callos provistos en la masa callosa, con la finalidad de obtener
callos maduros capaces de generar nuevas plántulas.
Transferencia de brotes terminales a la segunda formulación –
(Estimulación a la callogenesis)
Una vez seleccionados los frascos que contienen a las plántulas
de sacha inchi, estas fueron puestas con mucho cuidado sobre
una placa petri.
Luego se genero los cortes con la finalidad de separar los ápices
terminales de la planta madre.
Brote Terminal
Foto Nº 44: Desarrollo In Vitro de plántulas de sacha inchi
Una vez separados los ápices terminales y con la ayuda de una
espátula de bronce, se inoculo al interior del tubo de ensayo que
contenía el medio de la segunda formulación (foto Nº 45)
Luego se tapo y se rotulo los tubos de ensayo.
Transferencia de Callos (Madurac. y Germinación de embrioides)
Obtenida la formación callosa a partir de los diez días alrededor
del explante, esta se transfirió a una placa petri y a partir de ella
se realizo las disecciones y se separo los callos albergados en los
explantes ( fotos Nº 45 y 46)
Después de realizar la separación y disección de los callos, con la
ayuda de una pinza se transfirió a la tercera formulación del
medio de cultivo, acondicionándolos en una forma superficial.
Callo
Masa callosa
Foto Nº 45: Callogénesis Foto Nº 46: Callo no diferenciado
Los subcultivos de los mismos callos se hizo cada seis días con la
finalidad de poder obtenerse un mejor desarrollo. (foto Nº 47)
Foto Nº 47: Germin. de embrioides
V. CONCLUSIONES
Se concluye que:
5.1. Se ha logrado el adiestramiento en el uso de las técnicas In Vitro.
5.2. Para la primera formulación (Germinación de embriones), se
obtuvo plántulas con un excelente desarrollo, mostrando la mejor
conformación de brotes terminales.
5.3. Los explantes inducidos con la segunda formulación (Inducción a
la callogénesis), obtuvo una buena formación callosa.
5.4. Los callos introducidos para su diferenciación celular al medio
(Maduración y germinación de embrioides), dio un resultado
muy esperado, mediante los subcultivos se obtuvieron primordios
foliares (Foto N° 47).
5.5. Sacha Inchi tiene una totipotencialidad celular, que demuestra la
formación de tejidos a partir de células somáticas.
5.6. La aplicación del protocolo mediante un trabajo de investigación
en embriogénesis somática permitirá obtener un procedimiento de
de multiplicación clonal en Plukenetia volubilis L..
VI. RECOMENDACIONES
6.1. Se recomienda realizar un trabajo de investigación en
embriogénesis somática en Plukenetia volubilis L., a prueba de
diferentes fuentes y a diferentes concentraciones hormonales.
6.2. Realizar pruebas en la utilización de concentraciones variadas en
ANA y BAP, teniendo como parámetro de referencia a las
concentraciones utilizadas.
6.3. Para la introducción de explantes vegetales (segmentos nodales,
ápices meristemáticos, fracciones de hojas) en sacha inchi se
recomienda utilizar 10 mg/L de Acido cítrico y 100 mg/L de mio-
inositol por que mostraron un buena respuesta ante el 40% de
fenolización que tiene sacha inchi.
VII. LITERATURA CONSULTADA
1. AREVALO, G. 2005. Informes de Resultados de investigación. Programa
Nacional de Investigación en Recursos Genéticos y Biotecnologia.
E.E –“El porvenir”. Años 1989 – 1995.
2. BARRERA, O. 2004. Practicas Pre – Profesionales. “Actividades Para la
Introducción a Condición In Vitro de Sacha Inchi (PLukenentia
volubilis L.), Realizado en el Laboratorio de Tejidos Vegetales”.
Tarapoto – Perú. 59 – 60 p.
3. FERNANDÉZ-GUIJARRO, B; CELESTINO, C. & TORIBIO, M. 1995.
Influence of External Factors on Secundary Embriogenesis and
Germination in Somatic Embrios from Leaves of Quercus suber
Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Kliwer Academic Publisher.
41: 99-106. pp
4. GÓMEZ, R. 1998. Generalidades sobre la embriogénesis somática.
Resúmenes del curso Internacional de Propagación Masiva in
Vitro de Especies vegetales Instituto Biotecnología de las Plantas.
Santa Clara – Cuba. 134 p.
5. HALPERIN, W. 1995. In vitro embriogénesis: some historical tissues
and unresolved problems. In: In vitro Embriogénesis in plants.
(Ed.) Thorpe TA. Kluwer Academic, Dordrecht, Netherlands. 1-16.
pp
6. KRIKORIAN, A. 1991. Medios de Cultivo. “Generalidades Composición y
Formulación”. Departament of Biochimestry of New York – EEUU.
42 p.
7. LITZ, R. & R. JARRET. 1991. Regeneración de Plantas en el Cultivo de
Tejidos. “Embriogénesis Somática”. Tropical Research and
Educación Center. University of Florida – EEUU. 144 p.
8. MANCO, E.2005. Informes de Resultados de Investigación. Programa
Nacional De Investigación en Recursos Geneticos y Biotecnología.
E.E. “El Porvenir”. Años 1996-2005.
9. MEJIA, R. 1994. Propagación comercial 312 especies de plantas por
cultivo in vitro. Agrobiotegnologia: Fundamentos y aplicaciones.
Lima-Perú.
10. MERKLE, S.A; PARROTT, W.A. & FLINN, B.S. 1995. Morphogenic
Aspects of Somatic Embriogenesis, In: in Vitro Embriogenesis in
Plants.155-203 pp.
11. MURASHIGE, T. y F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-
497 pp.
12. PLIEGO ALFARO, F. & MURASHIGE, T. 1988. Somatic Embriogenesis in
Avocado (Persea americana Mill.). In Vitro. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture. 12, 61-66. pp
13. ROCA, W., L. SZABADOS. 1991. Agentes Gelatinizadotes en el Cultivo de
Tejidos. Unidad de Investigación en Biotecnología. Centro
Internacional de Agricultura Tropical – Colombia. 81 p.
14. ROCA, W y L. MROGINSKI 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura.
Fundamentos y aplicaciones. CIAT. 499 - 553 –554 p.
15. RUÍZ A. 2003. “Micropropagación y determinación cromosómica del género
Crotón productoras de látex”.
16. VALLES, R. 1991. Potencial agroalimentario Industrial del “Sacha
Inchi” para la selva alta. P.O. Box. 239. 1-8 p.
ANEXOS
Anexo Nº 01. Composición del medio de cultivo de la primera formulación
(Germinación de embriones)
ITEM Composición Concentración Vol/L Unid
Macro y micro nutrientes( compuestos inorgánicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
Vitaminas:
ac. Nicotinico 1000 ppm 0,50 ml
8 Tiamina 1000 ppm 0,40 ml
9 Sucrosa 2% 20g g
10 Agar 0,35% 3,50 g
11 Carbón Activ. 0,02% 2,00 g
pH : 5,7 - 5,8
Anexo Nº 02. Composición del medio de cultivo de la segunda formulación (Estimulación a la callogénesis)
ITEM Composición Concentración Vol/L Unid
Macro y micro nutrientes( compuestos inorgánicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
M&S
Vitaminas
8 Ac. Nicotinico 1000 ppm 1,0 ml
9 Tiamina 1000 ppm 10,0 ml
10 Piridoxina 1000 ppm 1,0 ml
11 Myo-inositol: 1000 ppm 100,0 ml
12 Sucrosa 3% 3,0% 30g g
13 Phytagel 0,25% 2,50 g
14 Ac. Cítrico 1000 ppm 10,0 ml
Hormonas:
BAP 1000 ppm 5,0 ml
ANA 1000 ppm 2,0 ml
KIN 1000 ppm 1,0 ml
pH : 5,7 - 5,8
M&S: Murashige y Skoog (1962).
B5: Gamborg etal., (1968).
Anexo Nº 03. Composición del medio de cultivo de la tercera formulación
B5
(Maduración y Germinación de embrioides)
ITEM Composición Concentración Vol/L Unid
Macro y micro nutrientes( compuestos inorgánicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
Vitaminas
Ac. Nicotinico 1000 ppm 0,50 ml
8 Tiamina 1000 ppm 0,40 ml
9 Sucrosa 2% 20g g
10 Agar 0,35% 3,50 g
11 Carbón activo 0,02% 2,0 g
pH : 5,7 - 5,8
TERMINOLOGÍAS
Antioxidante.- Compuesto químico que permite la captación de fenoles y
polifenoles.
Ápice.- Tejido meristematico que ocupa la parte Terminal del tronco, raíces
y ramas.
Apomixis.- Producción de descendientes en las estructuras sexuales
habituales, sin mezcla y segregación de cromosomas.
Callogénesis.- Proceso fisiológico que da origen a la formación de callos
en una forma desordenada.
Callo.- Estructura somática no diferenciada.
Clon.- Célula que posee carga genética idéntica a la célula madre.
Cigote.- Es el producto de la unión de dos células sexuales diferentes
(masculinas y femeninas)
Embriogénesis somática.- Técnica de multiplicación clonal, que permite
obtener embriones cigoticos sin tener que pasarse por la reproducción
sexual.
Embrioide.- Célula de óptimo desarrollo que permite la expresión de la
totipotencialidad mediante la generación de un individuo.
Embrión.- Planta esporofítica joven, que se encuentra retenida en el
gametofito o en la semilla.
Explante.- Porción de tejido vegetal adquirido de de cualquier parte de una
planta.
Medio de Cultivo.- Compuesto enriquecido en sales macro y micro,, en
adición de vitaminas, hormonas, antioxidantes proveen los requerimientos
nutricionales para su desarrollo.
Meristemo.- Tejido no diferenciado, cuyas células son capaces de efectuar
una división celular activa y la diferenciación de tejidos especializados.
Organogénesis.- Evento fisiológico que permite la generación de órganos a
partir de un tejido.
Protocolo.- Procedimiento sincronizado y ordenado de técnicas In Vitro
para lograrse un objetivo.
Regeneración.- Capacidad que expresan las células a la formación de
nuevos individuos.
Regeneración Directa.- Ruta de la Embriogénesis somática que permite
obtenerse nuevos individuos a partir de órganos.
Regeneración indirecta.- Una de las rutas de la Embriogénesis somática
que permite la obtención de nuevos individuos a partir de la formación de
callos.
Somático.- Células diploides de los organismos.
Totipotencialidad.- Capacidad de regeneración de una célula.
ABREVIATURAS
B5 : Gamborg etal., (1968).
M&S : Murashige y Skoog (1962)
BAP : 6 – Bencil Amino Purina
ANA : Acido 1-Naphthal acético
KIN : 6 – Furfurylaminopurine
Diagrama de flujo: ESTABLECIMIENTO DE UN LABORATORIO DE TEJIDOS VEGETALES
Diferentes áreas de un laboratorio de tejidos - Tomado de Roca 1991
BAÑO
ALMACÉN
OFICINA
TRANSFERENCIA
ESTERILIZACIÓN
LAVADO
INCUBACIÓN IN VITRO
PREPARACIÓN
Terapia y control Fitosanitario
Cuarentena In VitroCrecimiento In Vivo
(Casa de malla)
Crecimiento In Vivo
Observación y examen
