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Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos A.C.

Comité Técnico de Normalización Nacional de Productos Lácteos

ANTEPROY-NMX-F-808-ONNPROLAC-2013

Atributos para la validación de métodos de prueba microbiológicos equivalentes.Guía de validación y/o verificación de métodos microbiológicos alternativos

PREFACIO

La industria lechera elabora productos de alta calidad que garantizan la inocuidad y cumplen con las más altas expectativas de los consumidores, a fin de fortalecer estos objetivos se constituye el “Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos, A.C.” (ONNPROLAC), obteniendo el 27 de abril 2012 el Certificado de Registro no. 010 el cual le permite …elaborar, revisar, actualizar, expedir y cancelar normas mexicanas en el área de “leche” y “productos lácteos” y, específicamente: Tratamiento y envasado de la leche”, “Elaboración de crema, mantequilla y queso”, “Elaboración de leche condensada, evaporada y en polvo”, “elaboración de helados y postres” y “Elaboración de cajeta y otros productos lácteos”...

ONNPROLAC es una Asociación Civil sin fines de lucro, que tiene entre sus principales objetivos llevar a cabo actividades de normalización en los términos dispuestos por la Ley


Federal sobre Metrología y Normalización y su Reglamento, tales como elaboración de Normas Mexicanas y promover activamente una cultura de normalización con la finalidad de satisfacer las necesidades de los consumidores mediante el incremento de la competitividad de la industria lechera nacional.

En la elaboración de la presente Norma Mexicana participaron las siguientes instituciones, empresas y asociaciones:

3M México, S.A. de C.VAsociación Mexicana de Empresas Evaluadoras de la Conformidad A.C. (AMEEC)Asociación Nacional de Tiendas de Autoservicio y Departamentales, A.C. (ANTAD) Cámara Nacional de Industriales de la Leche (CANILEC)Cámara Nacional de la Industria de la Transformación (CANACINTRA)Centro de Investigación de Alimentación y Desarrollo (CIAD)Centro Nacional de Metrología (CENAM)Chilchota Alimentos S.A. de C.V.Cremería Covadonga, S.A. de C.V.Colegio Mexicano de NutriólogosComercializadora de Lácteos y Derivados, S.A. de C.V.Danisco Mexicana, S.A. de C.V.Danone de México, S.A. de C.V.Derivados de Leche La Esmeralda, S.A. de C.V.Dirección General de Normas (DGN), Secretaría de EconomíaDistribuidora Alcatraz, S.A. de C.V.DuPont S.A de C.V. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAMGanaderos Productores de Leche Pura, S.A. de C.V.ILAS MÉXICO, S.A. de C.V.Ingredion México S.A. de C.V.Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMSZ)Liconsa, S.A. de C.V.Mead Johnson Nutricionales de México S. de R. L. de C. V. Neogen Latinoamérica, S.A.P.I. de C.V.Nestlé México, S.A. de C.V.Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos A.C. (ONNPROLAC)Palsgaard Industri de México S. de R.L. de C.V.Procuraduría Federal del Consumidor (PROFECO)Qualtia Alimentos, Operaciones S. de R.L. de C.V.Quesos Excelsior, S.A. de C.VSecretaría de Agricultura Ganadería Desarrollo Rural Pesca Alimentación (SAGARPA) – Coordinación General de Ganadería. Secretaría de Salud – Comisión Federal para la Prevención contra Riesgos SanitariosSigma Alimentos Lácteos, S.A. de C.V.Unión Nacional de Productores Pecuarios A.C. (UNPP)Universidad Veracruzana (UV)Universidad Autónoma Metropolitana (UAM)Yakult, S.A. de C.V.

1 Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos, A.C.


ÍNDICE DE CONTENIDO

0. INTRODUCCIÓN 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN2. REFERENCIAS3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES4. PRINCIPIOS GENERALES PARA LA VALIDACIÓN Y CERTIFICACIÓN DE

MÉTODOS ALTERNATIVOS 5. MÉTODOS CUALITATIVOS- PROTOCOLO TÉCNICO PARA SU VALIDACIÓN6. MÉTODOS CUANTITATIVOS – PROTOCOLO TÉCNICO PARA VALIDACIÓN 7. ANEXO A (NORMATIVO) REGLAS ESPECÍFICAS PARA LA ACEPTACIÓN DE

RESULTADOS EXTERNOS QUE YA HAYAN SIDO OBTENIDOS EN UN ESQUEMA DE VALIDACIÓN PREVIA

8. ANEXO B (INFORMATIVO) CLASIFICACIÓN DEL TIPO DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE VALIDACIÓN

9. ANEXO C (NORMATIVO) USO DE MUESTRAS NATURALMENTE CONTAMINADAS Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS ARTIFICIALMENTE CONTAMINADAS EN ESTUDIOS DE VALIDACIÓN

10.ANEXO D (NORMATIVO) MUESTRAS POR DUPLICADO PARA LA DETERMINACIÓN DE EXACTITUD RELATIVA Y DEL NIVEL DE DETECCIÓN RELATIVA PARA MÉTODOS CUALITATIVOS

11.ANEXO E (NORMATIVO) CÁLCULO DE LOS INTERVALOS DE CONFIANZA ASOCIADOS CON EL NÚMERO DE MUESTRAS ANALIZADAS

12.ANEXO F (NORMATIVO) PRUEBAS APLICADAS PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS DISCORDANTES O NO CONCORDANTES

13.ANEXO G (NORMATIVO) PUNTOS A CONSIDERAR AL SELECCIONAR CEPAS PARA LA EVALUACIÓN DE SELECTIVIDAD

14.ANEXO H (NORMATIVO) LINEAMIENTOS PARA LA ORGANIZACIÓN Y DIRECCIÓN DE ESTUDIOS COLABORATIVOS

15.ANEXO I (NORMATIVO) DETERMINACIÓN QUE LOS CONTROLES NEGATIVOS SON LIBRES DEL ANALITO OBJETIVO

16.ANEXO J (NORMATIVO) REPLICACIÓN DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS INTERLABORATORIO DE MÉTODOS CUALITATIVOS

17.ANEXO K (NORMATIVO) ANÁLISIS DE DATOS18.ANEXO L (INFORMATIVO) ESTUDIOS INTERLABORATORIO DE MÉTODOS

CUALITATIVOS: CRITERIOS DE CONFORMIDAD, CONCORDANCIA Y EL RADIO PROBABLE DE CONCORDANCIA

19.ANEXO M (NORMATIVO) REPLICACIÓN DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIÓN DE EXACTITUD RELATIVA DE MÉTODOS CUANTITATIVOS

20.ANEXO N (NORMATIVO) EJEMPLOS DE SITUACIONES ACEPTABLES Y NO ACEPTABLES, RANGO DE MEDIDAS PARA LA ESTIMACIÓN DE LA REGRESIÓN LINEAL PARA MÉTODOS CUANTITATIVOS



21.ANEXO O (NORMATIVO) EVALUACIÓN DE LA LINEALIDAD DE MÉTODOS CUANTITATIVOS POR REPRESENTACIÓN GRÁFICA

22.ANEXO P (NORMATIVO) LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN PARA RECUENTOS

23.ANEXO Q (NORMATIVO) ESTIMACIÓN DE LA ROBUSTEZ DE LA DISPERSIÓN BASADO EN LA MEDIANA RECURSIVA SN DE ROUSSEEUW

24.ANEXO R (NORMATIVO) CÁLCULOS DEL MÉTODO DE REGRESIÓN25.ANEXO S (NORMATIVO) EJEMPLOS DE CÁLCULOS PARA MÉTODOS

CUANTITATIVOS26.ANEXO T (NORMATIVO) ESTUDIO COLABORATIVO – PRUEBA RING CON

DUPLICADOS27.ANEXO U (INFORMATIVO) LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIACIONES28.BIBLIOGRAFÍA




Atributos para la validación de métodos de prueba microbiológicos equivalentes.

1. INTRODUCCIÓN

Para la industria láctea, es importante controlar la calidad microbiológica desde las materias primas hasta el producto terminado para garantizar la inocuidad de los mismos, lo cual ha llevado, a la búsqueda y aplicación de métodos alternativos confiables, que tengan ventajas como velocidad de análisis y/o respuesta, facilidad de uso y/o automatización, propiedades analíticas (precisión, exactitud, límite de detección, etc.), que coadyuvan a la productividad y reducción de costos.

Es recomendable que al elegir los métodos alternativos, se considere la documentación que avale la sensibilidad, especificidad, precisión, exactitud, entre otros, tales como certificados, acreditaciones, aprobaciones, etc., emitidos por organismos nacionales o internacionales, para los productos en los que se desea aplicar.

En la actualidad los Sistemas de Gestión de Calidad, solicitan la evidencia objetiva del cumplimiento de requisitos para la utilización de un método alternativo, que permite emitir resultados exactos y precisos, que sean reproducibles y demuestren la confiabilidad de los resultados. Es por ello necesario contar con una guía para llevar a cabo la validación y/o verificación de estos métodos, tomando en cuenta que una validación se debe realizar cuando se eligen métodos no normalizados, mientras que la verificación se aplica cuando se emplean métodos normalizados. La validación de estos métodos permite evaluar si el método es apto de acuerdo a las características de cada producto.

En esta norma mexicana se definen los parámetros a considerar en la validación y/o verificación de métodos de prueba microbiológicos alternativos.

1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

1.1 Establecer una guía con los parámetros necesarios para la validación y/o verificación de métodos de prueba microbiológicos alternativos para la industria láctea.

1.2 Esta Norma Mexicana es de observancia voluntaria para las personas físicas o morales que se dedican a la producción y comercialización de leche, proveedores de materia prima, productos lácteos y derivados lácteos dentro del territorio nacional.

2. REFERENCIAS

Para la correcta aplicación de la presente Norma Mexicana deberán consultarse las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas o las que las sustituyan:

NMX 17025ISO 16140PROYECTO DE NORMA 210



ILAC G18

NMX-CH-3534-1-IMNC-2008, Estadística- Vocabulario y símbolo - parte1: Términos estadísticos generales y términos empleados en el cálculo de probabilidades.

3.- DEFINICIONES

Parámetros – CUERPO

3. Términos y definicionesPara efectos de esta norma, aplican los siguientes términos y definiciones:

3.1 método alternativo: método de análisis que demuestra o estima, para una determinada categoría de productos, el mismo analito (3.6) como es medido usando el método de referencia reconocido correspondiente (3.4).Los métodos alternativos pueden ser normalizados y no normalizados.

3.2 métodos normalizados: proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados. Métodos aceptados y validados por organismos nacionales (NOM, NMX) e internacionales (AOAC, AFNOR, ISO, FDA, CODEX, entre otras). (CCAYAC – P-062)

3.3. métodos no normalizados:Método analítico que ha sido adaptado o modificado por el laboratorio a partir de un método normalizado, en el que se demuestra o estima el mismo analito. (Ref. ILACG18 / CCAYAC- P- 058).

3.4 método de referencia: método ampliamente investigado, que describe clara y exactamente las condiciones y procedimientos necesarios, para la medición de uno o más valores de la propiedad, que han demostrado tener exactitud y precisión de acuerdo con su propósito de uso y que puede, por lo tanto, ser usado para evaluar la exactitud de otros métodos por la misma medición, permitiendo en particular la caracterización de un Material de Referencia.17 (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.5 validación de un método alternativo: demostración del nivel de confianza que establece que los resultados obtenidos por el método alternativo son comparables o no hay diferencia significativa a los obtenidos por el método de referencia reconocido.

3.6 analito: Especie de interés a determinar en un análisis. Puede ser el microorganismo. (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.7 método cualitativo: método de análisis cuya respuesta sea presencia o ausencia de un analito detectada directa o indirectamente en una cierta cantidad de muestra.(ISO 16140)



3.8 método cuantitativo: método de análisis cuya respuesta es la cantidad de analito medido directamente (enumeración en una masa o en un volumen) o indirectamente (absorbancia de color, impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra. (ISO 16140)

3.9 verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados para un método. (NMX-CC-9000-IMNC-2000). La verificación consiste en evaluar el desempeño del método para demostrar que cumple con los requisitos para el uso previsto, que fueron especificados como resultado de su validación. (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.10 validación: Demostración de que se proporciona la confianza adecuada de que los resultados obtenidos por el método alternativo son comparables a los obtenidos por el método de referencia. (ISO 16140) 3.11 desviación/sesgo: error sistemático de un proceso de medición. (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.12 ensayo/prueba: determinación de una o más características de acuerdo con un procedimiento. (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.13 especificidad: capacidad de determinar el analito inequívocamente en la presencia de componentes los cuales se espera que estén presentes. Comúnmente puede incluir impurezas, degradantes, matriz, etc. (Métodos Analíticos Adecuados a su propósito,CENAM, 1998)

3.15 evidencia objetiva: datos que respaldan la existencia o veracidad de algo. (Política de selección y validación de métodos de ensayo, Oficina de Acreditación Guatemala, 2005) CENAM

3.16 exactitud de medición: grado de la concordancia entre el resultado de una medición y un valor verdadero (o real) de lo medido (el mensurando). (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.17 exactitud relativa: es la aproximación entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para propósito de esta guía es la cantidad de microorganismos recuperados entre la cantidad de microorganismo inoculado o nivel de fortificación. (CCAYAC-P-062)

3.18 límite de detección: concentración mínima de un analito en la matriz de una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas específicas. (NMX-CH-152-IMNC-2005)

3.19 linealidad: capacidad (dentro de un intervalo dado) para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en las muestras deexamen, en el que la respuesta del sistema de medición es una función lineal de la concentración. La representación gráfica de este tramo (concentraciones frente a respuestas) debe exhibir una buena correlación de los puntos experimentales a la recta de regresión para que el método analítico en cuestión sea aceptable. (NMX-CH-152-IMNC-2005)



3.20 sensibilidad relativa (SE): la capacidad del método alternativo para detectar el analito cuando es detectado por el método de referencia

3.21 especificidad relativa (SP): la capacidad del método alternativo para no detectar el analito cuando no es detectado por el método de referencia

3.23 robustez:

ROBUSTEZ REPETIBILIDADREPRODUCIBILIDADINCERTIDUMBREEXCLUSIVIDADINCLUSIVIDADFALSOS POSITIVOSFALSOS NEGATIVOSPRECISIONRECUPERACIONMUESTRA BLANCOMUESTRA CONTROL Límite cuantificaciónIntervalo lineal y de trabajoCEPAS REFERENCIAESPECIFICIDAD

4 Principios generales para la validación y certificación de métodos alternativos

4.1 Protocolo de validación

El protocolo de validación incluye dos fases:

un estudio de comparación (3.7) del método alternativo (3.1) contra el método de referencia (3.2) llevado a cabo en el laboratorio organizado;

un estudio interlaboratorios (3.8) de cada uno de los dos métodos.

Si es apropiado, las dos fases podrán llevarse a cabo en paralelo.

Las normas técnicas para la realización del estudio de comparación de métodos y el estudio interlaboratorio se dan en las cláusulas 5 y 6, dependiendo si el método alternativo es de naturaleza cualitativa o cuantitativa.



Si el método alternativo ya ha sido validado y cumple con los requisitos establecidos por otra organización, las normas específicas se definen en el anexo A para aceptar los resultados de esta validación previa.

4.2 Principios de la certificación

4.2.1 Si se requiere una posterior certificación del método alternativo, los dos siguientes principios también se aplicaran (en adición 4.1): Los detalles en la organización de la certificación (gestión del estudio de comparación de métodos y el estudio interlaboratorio, todos los diferentes organismos involucrados, incluyendo al laboratorio experto - designado en esta norma como “laboratorio organizador” – los revisores, los organismos de certificación, etc) [8] son designados por el organismo de certificación.

4.2.2 El fabricante aplicará un sistema de calidad en la línea de producción del producto para el cual se solicita la certificación y basado en la Norma adecuada (NMX-CC-9001-INMC) en relación con los sistemas de calidad o de otra norma internacional equivalente (por ejemplo, ISO 9001).

Al otorgar la certificación, el organismo de certificación deberá tener en cuenta la existencia de cualquier certificado del sistema de calidad emitido por un organismo de certificación acreditado para sistemas de calidad.

4.2.3 Se debe de realizar una verificación regular de la calidad del método certificado después de que se haya obtenido la certificación. Se debe llevar a cabo regularmente una auditoría para verificar que se sigue cumpliendo con lo siguiente:

Los requisitos de aseguramiento de calidad (ver 4.2.1)

Los requisitos del control de la producción de los productos (ver 4.2.1)

Además de los requisitos generales de la norma apropiada relativos al sistema de calidad, el fabricante debe presentar regularmente a la organización de certificación la documentación actualizada que toma en cuenta cualquier modificación hecha al producto o al proceso de producción que pudiera afectar las instrucciones de uso y/o desempeño del método. El organismo de certificación entonces decide si estas modificaciones afectan la certificación.

5 Métodos cualitativos- Protocolo técnico para su validación

5.1 Estudio de comparación de métodos

5.1.1 Exactitud relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa

5.1.1.1 Terminología

Para los propósitos de esta norma, aplican los siguientes términos y definiciones.



5.1.1.1.1 exactitud relativa (AC): grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método de referencia y la obtenida por el método alternativo en muestras idénticas 1 (ver 5.1.1.3.1)

NOTA el término “exactitud relativa” utilizado en este documento es complementario al de “precisión” y “veracidad” tal como se definen en las normas NMX-CH-5725-1-IMNC (ISO 5725-1) y NMX-CH-3534-1-IMNC (ISO 3534-1).

En ellas se establece que la precisión es “la concordancia más cercana entre el resultado de una prueba y el valor de referencia aceptado”, y que veracidad es “la concordancia más cercana entre el valor promedio obtenido de una gran serie de resultados de ensayos y un valor de referencia aceptado”. Para el propósito de esta norma, el valor de referencia aceptado es seleccionado como el valor obtenido por el método de referencia. Por lo tanto, el término “relativo” implica que el método de referencia no proporciona automáticamente el valor de referencia aceptado.

5.1.1.1.2 desviación positiva (PD): el método alternativo se convierte en un falso positivo cuando se presenta una desviación positiva, es decir, si da un resultado positivo cuando el método de referencia da un resultado negativo.

Una desviación positiva se vuelve un resultado falso positivo cuando el resultado verdadero puede ser probado como negativo.

Una desviación positiva es considerada como realmente positiva cuando el resultado verdadero puede ser probado como positivo

5.1.1.1.3 desviación negativa (ND): el método alternativo presenta una desviación negativa si da un resultado negativo cuando el método de referencia da un resultado positivo.

Una desviación negativa se vuelve un resultado falso negativo cuando el resultado verdadero puede ser probado como positivo.

5.1.1.1.4 sensibilidad relativa (SE): la capacidad del método alternativo para detectar el analito cuando es detectado por el método de referencia (ver 5.1.1.3.1.).

5.1.1.1.5 especificidad relativa (SP): la capacidad del método alternativo para no detectar el analito cuando no es detectado por el método de referencia (ver 5.1.1.3.1.).

5.1.1.2 Protocolo de Medición

5.1.1.2.1 Muestras de alimentos

Es de la más alta prioridad encontrar muestras de alimento contaminadas naturalmente con el analito a detectar para la validación.

1 Difícil de conseguir si los pasos de pre-enriquecimiento son diferentes.



Si se pretende validar el método para todos los alimentos, se deben estudiar cinco categorías de alimentos. El número puede ser reducido a 1, 2, 3 o 4 categorías si la validación del método alternativo se limita a estas, a petición del fabricante. Las categorías recomendadas figuran en el Anexo B.

Muestras ambientales apropiadas pueden ser incluidas como una categoría. Muestras veterinarias pueden ser tratadas como otra categoría (ver el anexo B).

Es deseable que muestras de alimentos provengan de una amplia distribución tanto como sea posible, con el fin de reducir cualquier sesgo de alimentos locales particulares y así ampliar el rango de la validación.

Cuando se analizan muestras contaminadas naturalmente, el rango y distribución de la contaminación de la muestras deberá ser representativo de los niveles normalmente encontrados en esos productos pero con énfasis en números más pequeños.

Si no es posible, adquirir un número suficiente de alimentos naturalmente contaminados para cada una de las categorías, se permite la contaminación artificial de las muestras. El método y los niveles de contaminación deberán dar como resultado un comportamiento similar a las muestras naturalmente contaminados. Ver métodos de inoculación y restricciones en el Anexo C.

5.1.1.2.2 Número de muestras

El número total de porciones de muestra a analizar es 60 por cada categoría de alimentos seleccionados a partir de las categorías indicadas en el anexo B. Dentro de cada categoría, seleccione el tipo de alimentos representativos y analice 20 porciones de muestra para cada tipo de alimento por el método alternativo y el método de referencia para producir al menos 60 resultados totales para cada categoría por cada método. Para alimentos contaminados naturalmente preparar la muestra cómo se describe en el anexo D. Para muestras de alimentos contaminadas artificialmente ajustar los niveles de inoculación para lograr la recuperación fraccionada positiva de las porciones de ensayo analizadas en al menos uno de los métodos. La recuperación fraccionada se logra cuando algún número, pero no todos, de las porciones de ensayo están determinadas a ser positivas por uno o ambos métodos, método alternativo o método de referencia.

Es recomendable producir aproximadamente 50% de resultados positivos y 50% de negativos. Sin embargo esto es una recomendación, no un porcentaje absoluto, a condición de que un número de partes de la prueba sean positivos y algunos negativos para el mismo tipo de alimentos.

5.1.1.2.3 Preparación de la muestra

Los métodos de referencia y alternativos se realizarán en la medida de lo posible, con exactamente la misma muestra.Sin embargo, si la primera fase de ambos métodos es la misma (por ejemplo el mismo caldo de pre-enriquecimiento) realizar la replicación en el segundo paso (cuadro 1, anexo D).



Si esta no es la situación, que sean diferentes el primer medio de cultivo, metodología o diluciones preparar porciones pareadas de ensayo para el análisis. Existen dos principales metodologías para tales preparaciones.

En el primer caso, se mezcla el doble del peso de la muestra con un peso/volumen igual de agua estéril u otro diluyente apropiado y homogeneizar vigorosamente. Posteriormente divida en dos porciones teniendo especial cuidado para incrementar la concentración del primer enriquecimiento (por aproximadamente 10%) para compensar el efecto de la dilución de la muestra diluida y homogeneizada (caso 2, anexo D).

En el segundo caso, inocular directamente el alimento seleccionado con un inoculo de inicio suficiente para permitir una recuperación fraccionada de los microorganismos en las porciones de ensayo analizadas por al menos uno de los métodos después de que los microorganismos se hayan equilibraron en el alimento. A continuación, pesar porciones de muestra de 25 g y proceder como se describe en el anexo D. Esto puede ser preferible para productos líquidos pero es aceptable para cualquier tipo de alimento que sea homogeneizado adecuadamente.

5.1.1.3 Cálculo e interpretación

5.1.1.3.1 Tratamiento de los datos

Tabular los datos de los resultados pareados de los métodos de referencia y alternativo y calcular los siguientes parámetros para cada categoría de alimentos (60 muestras) De acuerdo con la Tabla 1.

TABLA 1.- Resultados pareados del método de referencia y alternativo

Respuestas Método de referencia positiva (R +)

Método de referencia negativo (R-)

Método alternativo positivo (A +)

+ / + Concordancia positivo (PA)

+ / - Desviación positiva (DP) (R-/ A +)

Método alternativo negativo (A-)

+ / - Desviación negativa (ND) (A-/ + R)

- / - Concordancia negativa (NA)

Los cálculos se efectuarán con una serie de resultados negativos obtenidos por el método de referencia, los resultados en la Tabla 1 no pueden exceder dos veces el número de resultados positivos; de ser necesario los resultados negativos seleccionados pueden seguir a un resultado positivo, en el orden en que las muestran hayan sido analizadas. Expresar los tres criterios de la siguiente manera:

exactitud relativa: AC = (PA + NA) × 100%;o N



especificidad relativa: SP = NA ×100%;o N-

sensibilidad relativa: SE = PA ×100 N+

Donde:

N es el número total de muestras (NA + PA + PD + ND);

N- es el número total de resultados negativos con el método de referencia (NA + PD);

N+ es el número total de resultados positivos con el método de referencia (PA + NA).

5.1.1.3.2 Intervalos de confianza

El cálculo de los intervalos de confianza está asociado al número de muestras analizadas, están descritos en el anexo E.

5.1.1.3.3 Los resultados discordantes/no concordantes

Examine los resultados no concordantes como se describe en el anexo F (Prueba de McNemar), usando el número de PD y ND (ver 5.1.1.3.1).

Cuando los valores de PD y ND son altos y casi iguales, la diferencia estadística entre los métodos no se puede detectar mediante la prueba de McNemar. En este caso, el laboratorio debe prestar mayor atención para explicar las razones de los valores altos de PD y ND. Además, es un indicador de que la precisión relativa de un método nunca podrá interpretarse teniendo en cuenta únicamente la prueba de McNemar.

5.1.1.3.4 Resumen del cálculo

Todos los cálculos se resumen en la Tabla 2:

TABLA 2.- Cálculos de la precisión relativa, la sensibilidad relativa y la especificidad relativa

Matrices PA NA ND PD Su Precisión N+ Sensibilid N- Especificid



ma relativaAC (%)

ad relativaSE (%)

ad relativaSP (%)

N PA + ND

NA + PD

Alimento cat. 1Alimento cat. 2Alimento cat. 3Alimento cat. 4Alimento cat. 5TOTAL

5.1.1.3.5 Interpretación

En la tabla se muestran los resultados brutos (es decir, todos los resultados positivos y negativos, Tabla 1).

Tomando en cuenta el número desviaciones positivas y el número de desviaciones negativas la capacidad del método alternativo para dar más o menos resultados positivos en comparación con el método de referencia evaluado.

El informe del estudio distinguirá los resultados obtenidos mediante muestras contaminadas natural y artificialmente.

El procedimiento de la contaminación artificial de las muestras deberá ser descrito en el informe del estudio.

Los datos publicados en otras fuentes y en cumplimiento a las condiciones definidas en el anexo A pueden ser utilizados para evaluar la exactitud relativa.

5.1.2 Nivel de detección relativo

5.1.2.1 Definición

Para el propósito de esta norma, el nivel de detección relativo es el número más pequeño de microorganismos cultivables (3.4) que se pueden detectar en la muestra en el 50% de las ocasiones por el método alternativo y de referencia.


Considerar lo siguiente:



Utilizar un producto alimenticio de cada categoría seleccionada del numeral 5.1.1.2.1, dependiendo del alcance de la validación (ver anexo B);

Utilizar cinco cepas de microorganismos diferentes al microorganismo objetivo (o menos, dependiendo del alcance de la validación) cada uno relacionado con la categoría del alimento, si es posible. (Ver anexo G.1 para la definición microorganismo objetivo);

Analizar preferentemente cinco niveles (o bien, como mínimo tres niveles) de un microorganismo objetivo por alimento, incluyendo un control negativo, etc. El primer nivel podría ser el control negativo. El segundo nivel podría ser el nivel de detección teórico. El tercer nivel debe estar por arriba del umbral de detección teórico y los niveles adicionales serán superiores al anterior. Un factor de aproximadamente tres entre cada concentración en los niveles superiores se podría aplicar; en los niveles superiores un factor de alrededor de tres entre cada concentración podría aplicarse;

Replicar cada combinación (producto alimenticio, nivel de contaminación) seis veces por ambos métodos (alternativo y referencia). Efectuar la división en el nivel donde los dos métodos se diferencian como se ilustra en el anexo D. Por lo tanto, si la primera etapa de cada método es la misma (por ejemplo, el mismo caldo de pre-enriquecimiento), lleve a cabo la división en el segundo paso (caso 1, anexo D). Si este no es el caso, es decir, el primer medio de cultivo, metodología o diluciones son diferentes, mezclar el doble del peso de la muestra con igual cantidad de agua estéril u otro diluyente adecuado (p/v) y luego dividir en dos porciones;

Aplicar el procedimiento completo del método alternativo y de referencia, incluyendo la preparación de la muestra. La inoculación de cada muestra de alimento puede ser antes de la adición del medio de cultivo o después.

Si es necesario, para asegurar una mejor precisión del nivel más bajo de inoculo, aumenté la cantidad de muestra del alimento o el número de muestras por duplicado. Por ejemplo, 75 g de muestra de alimento contaminado con tres células en lugar de 25 g de muestra contaminada con una célula.

Cuanto mayor sea el número de niveles de inoculo utilizados más precisa es la determinación del umbral de detección.

5.1.2.3 Cálculo

Para cada nivel de Li (i = 0 a 3) y cada combinación de alimento / cepa (j = 1 a 5), comparar ambos métodos como se indica en la Tabla 3:

TABLA 3.- Cálculos de nivel de detección relativo

ResultadosNegativos (-) Positivos (+) Total

Método Referencia a n - a n=6Alternativo b n - b n=6Total a + b 2n – (a + b) 2n=12



Para tablas pequeñas de 2 por 2, realice la prueba exacta de Fisher [8].

Comparaciones

En lugar de solamente la comparación de ambos métodos en cada nivel y cada alimento/cepa, puede ser utilizada la misma prueba para comparar dos alimentos/cepas en el mismo nivel.Si el alimento/cepa parecen ser comparables, la misma prueba está disponible con n > 6 en la muestra agrupada (conjunto de muestras) de alimentos / cepas para cada nivel Li.

Los niveles también pueden ser agrupados para hacer verificaciones, pero usando el orden de clasificación: L0 + L1, L0 + L1 + L2, L1 + L2, L0 + L1 + L2 + L3, L1 + L2 + L3, L2 + L3 ... con o sin la agrupación de alimentos / cepas.Reporte todas las diferencias significativas entre los métodos, alimentos / cepas y / o niveles.

5.1.2.4 Interpretación

La interpretación debe ser realizada por el laboratorio organizador a cargo del estudio de comparación de métodos.El nivel de detección relativa se encuentra entre los dos niveles de contaminación dando respectivamente menos y más que el 50% del nivel de detección. Por consiguiente, el nivel de detección relativa se expresa como un rango.

5.1.3 Inclusividad y exclusividad

5.1.3.1 Definición

Inclusividad es la capacidad de un método alternativo para detectar el analito objetivo a partir de una amplia gama de cepas.

La exclusividad es la ausencia de interferencia del método alternativo con un rango relevante de cepas no objetivo.


5.1.3.2.1 Selección de cepas de prueba

5.1.3.2.1.1 Generalidades

Para los microorganismos una amplia gama de cepas son seleccionadas para evitar cualquier sesgo local.Los criterios para la selección de cepas se muestran en el anexo G.

Cada cepa debe caracterizarse bioquímicamente, serológicamente y genéticamente, si procede, con el suficiente detalle para que su identidad sea establecido y deben ser



preferentemente aisladas de los alimentos. También el material alimenticio de la que se aisló originalmente debe ser conocido y registrado.

5.1.3.2.1.2 Microorganismos objetivo

Seleccionar al menos 50 cultivos puros de microorganismos relevantes para el método alternativo y alimentos utilizados (ver G.3), excepto para Salmonella.

Para los métodos de Salmonella, seleccione al menos 30 cultivos puros de microorganismos.

5.1.3.2.1.3 Microorganismo no objetivo

Seleccionar al menos 30 cultivos puros de microorganismos seleccionados de ambas cepas conocidas que causen interferencia con el microorganismo objetivo y de cepas naturalmente presentes en cada muestra de alimento incluida en la validación (ver G.4).

5.1.3.2.2 Inoculación

5.1.3.2.2.1 Generalidades

Cada prueba se lleva a cabo una vez. La inoculación del medio de crecimiento se lleva a cabo utilizando una dilución de un cultivo puro de cada cepa de prueba. No se adiciona muestra de alimento.

5.1.3.2.2.2 Microorganismos objetivo

El nivel de inoculo será de 10 a 100 veces mayor que el nivel mínimo de detección relativo del método alternativo y debe ser utilizado el protocolo completo del método alternativo, incluyendo pre-enriquecimiento si está estipulado. Cuando se obtienen resultados falsos negativos o se duda del resultado obtenido, la cepa será analizada nuevamente, junto con el método de referencia.

5.1.3.2.2.3 Microorganismos no objetivo

El nivel de inoculo de una cepa será similar a la del mayor nivel de contaminación que se espera ocurra en todas las categorías de alimentos que serán utilizados.La exclusividad debe ser establecida. Si el medio de cultivo es selectivo puede ser remplazado por un medio de cultivo no selectivo apropiado. Cuando el método alternativo da resultados positivos o se duda del resultado con el microorganismo no objetivo, se repetirá la prueba usando el protocolo completo. El método de referencia se realiza sólo una vez.

5.1.3.3 Expresión de resultados

Tabular los resultados como en la Tabla 4:

TABLA 4.- Presentación de los resultados por selectividad



Microorganismos

ResultadosMétodo de referencia Método alternativoResultado esperado

Resultado real Resultado esperado

Resultado real

Cepas objetivo12Etc.Cepas no objetivo12Etc.


La interpretación debe ser realizada por el laboratorio encargado del estudio de comparación de métodos, tanto en aspectos cuantitativos como cualitativos deben ser tomados en cuenta(es decir patogenicidad, prevalencia, los aspectos de cultivo de las cepas analizadas, por ejemplo, la motilidad, sensibilidad a agentes nocivos, etc).

Otros datos publicados del método alternativo que cumplan los requerimientos de esta norma también pueden ser usados por el laboratorio responsable del estudio de comparación de métodos, para proveer mayor información sobre los criterios anteriores. (Ver el anexo A que proporciona criterios para la aceptación de resultados externos).

5.2 Estudio interlaboratorios

NOTA: El propósito del estudio colaborativo es determinar la variabilidad de los resultados obtenidos en diferentes laboratorios utilizando muestras idénticas y comparar estos resultados con aquellos obtenidos en el estudio de comparación de métodos.

5.2.1 Protocolo de medición

El estudio interlaboratorio deberá tener al menos 10 laboratorios colaboradores teniendo resultados sin valores atípicos.

Las directrices y requerimientos para la organización, ordenamiento y desarrollo de los estudios interlaboratorios están señalados en el anexo H.

Es necesario que el analista perteneciente a cada laboratorio colaborador demuestre su competencia en el uso del método alternativo y en el método de referencia antes de participar en el estudio correspondiente.

5.2.1.2 El protocolo es el siguiente:

una matriz relevante de alimento (anexo B) es usada para preparar las muestras del ensayo;



el protocolo para la contaminación artificial de muestras de alimentos debe ser apropiado para el sustrato alimenticio seleccionado. Cada muestra deberá ser inoculada individualmente.

cada repetición ciega deberá ser preparada para asegurar la homogeneidad para cada una de las muestras inoculadas individualmente. Debe analizarse el número adecuado de muestras para asegurar la homogeneidad (ver anexo H);

deben usarse al menos tres diferentes niveles de contaminación: un control negativo (L0), un nivel ligeramente por encima del nivel de detección del método alternativo (L1), y uno alrededor de 10 veces más alto que el nivel de detección (L2) (por ejemplo, 0; 3 y 30 células/25g);

al menos 8 repeticiones ciegas de cada nivel de contaminación son analizados por el método de referencia y el método alternativo por cada laboratorio colaborador;

se prepara una suspensión de la totalidad de cada muestra para análisis

el análisis de las muestras será realizado en cada laboratorio en la fecha estipulada;

las muestras del ensayo son cultivadas de acuerdo al anexo J. Por tanto, si el primer paso de cultivo es común tanto para el método de referencia como para el alternativo, utilice este cultivo para inocular cada una de las siguientes etapas (caso 1, anexo J). Si los cultivos primarios de cada método difieren, se lleva a cabo una réplica para cada método individualmente (caso 2, anexo J);

en cualquiera de los casos, la combinación de “número de niveles de contaminación/número de repeticiones/número de laboratorios sin valores atípicos” deberá ser seleccionada de manera que al menos 480 resultados (240 por cada método) sean generados para su uso en los cálculos

5.2.1.3 El laboratorio organizador usando todos los datos registrados (ver H.3) deberá determinar cuáles resultados son confiables y cuáles se consideran atípicos para el cálculo de precisión. Ver anexo K, que provee las directrices para definir las condiciones microbiológicas para los datos que no serán tomados en cuenta.

ADVERTENCIA Valores atípicos: No excluya los resultados de laboratorios participantes si no hay una clara justificación o un error grave para explicarlos.

5.2.2 Cálculos

5.2.2.1 Para cada nivel, colocar los resultados positivos obtenidos con cada método como en las tablas 5 y 6:



TABLA 5.- Resultados positivos por el método de referencia

Laboratorios Nivel de contaminaciónL0 L1 L2

Laboratorio 1 /8 /8 /8Laboratorio 2 /8 /8 /8Laboratorio 3 /8 /8 /8etc. /8 /8 /8Total FPa TP1

b TP2c

aFalso positivo por el método de referenciabPositivo verdadero en el nivel 1 por el método de referenciacPositivo verdadero en el nivel 2 por el método de referencia

TABLA 6.- Resultados positivos por el método alternativo

Laboratorios Nivel de contaminaciónL0 L1 L2

Laboratorio 1 /8 /8 /8Laboratorio 2 /8 /8 /8Laboratorio 3 /8 /8 /8etc. /8 /8 /8Total FPa TP1

b TP2c

aFalso positivo por el método alternativobPositivo verdadero en el nivel 1 por el método de alternativocPositivo verdadero en el nivel 2 por el método de alternativo

5.2.2.2 Para el nivel L0 y para cada método, calcular el porcentaje de especificidad SP como en la ecuación (1):

SP = 1 – FP x 100 % N-

Donde

N- es el número total de todas las pruebas L0;

FP es el número de falsos positivos.

5.2.2.3 Para cada nivel de contaminación y para cada método, calcular el porcentaje de sensibilidad SE como en la ecuación (2):



SE = TP x 100 % N+

Donde

N+ es el número total de todas las pruebas L1 o L2 respectivamente;

TP es el número de los positivos verdaderos

5.2.2.4 Para cada nivel de contaminación y para la totalidad de resultados comparar el método alternativo y el método de referencia para calcular la exactitud relativa y examinar los datos discordantes

Cada par de resultados del análisis de una muestra por el método alternativo y el método de referencia deben reportarse como en la Tabla 7:

TABLA 7.- Resultados pareados del método alternativo y de referencia por el estudio interlaboratorio

Método alternativo

Método de referencia Total+ -

+ PA PD- ND NATotal N+ N- N

Calcular la exactitud relativa expresada como porcentaje, como en la ecuación (3):

AC = (PA + NA) x 100 %N

Donde

N es el número de muestras analizadas (Para el nivel Li o todos los niveles);

PA es el número de positivos concordantes

NA es el número de negativos concordantes

5.2.2.5 Calcular los intervalos de confianza para cada porción (ver 5.1.1.3.2)

5.2.2.6 Examinar los resultados no concordantes como se describe en el anexo F, empleando las cuentas de PD y ND (ver tabla 8).

5.2.3 Interpretación



Comparar AC (Tabla 7), SE y SP (Tablas 5 y 6) con sus contrapartes relativas obtenidas en el estudio comparativo incluyendo las muestras contaminadas naturalmente y el nivel de detección relativo.

Este criterio no responde a la variabilidad del método dentro de un laboratorio o entre laboratorios (nociones de repetitividad y reproducibilidad). El anexo L proporciona mayor criterio (conformidad, concordancia y el radio probable de concordancia) que pueden ayudar a responder esta variabilidad (el criterio de repetitividad y reproducibilidad han sido definidos para métodos cuantitativos y no pueden ser empleados así para métodos cualitativos).

6. Métodos cuantitativos – Protocolo técnico para validación

6.1 General

El recuento de colonias de una determinada muestra, es más común en los métodos cuantitativos de referencia y toda la información debe ser registrada – peso de la muestra, serie de diluciones, el volumen del inoculo y recuento de colonias en cada dilución. En microbiología, estos datos discretos son truncados a menudo, por ejemplo, cuantificando placas que no tengan más de 300 colonias y aplicando el factor de expansión inverso para obtener el factor de dilución del resultado. Por esta razón y otros factores involucrados en el proceso de crecimiento de los microorganismos, así como a la distribución simétrica o aquella cercana a la distribución normal, la cuantificación de datos es transformada a logaritmos o raíz cuadrada. Esta transformación puede revisarse usando histogramas con varios datos (30 o más), todos reunidos en las mismas condiciones.

En 6.2 y 6.3 para la validación de métodos cuantitativos se describe principalmente la recolección de datos continuos (o intervalo de datos), sin embargo los comentarios respecto a los recuentos son incluidos como una categoría particular.

6.2 Estudio de comparación de métodos

6.2.1 Linealidad y exactitud relativa

6.2.1.1. Definiciones

6.2.1.1.1 Linealidad

Es la capacidad del método cuando se usa una matriz dada, para dar resultados en proporción a la cantidad del analito presente en la muestra, es decir un incremento en el analito corresponde a un incremento lineal o proporcional en los resultados.

NOTA 1. La curva de respuesta o una función de la señal se obtiene cuando la relación entre la señal o la respuesta de los métodos y la concentración del analito (dosis) en distintas muestras de materiales de referencia (RM) que tienen valores conocidos. En microbiología, donde prácticamente no hay materiales de referencia estables disponibles, estos “valores conocidos” pueden obtenerse después de varias mediciones repetidas, utilizando el método de referencia.



Después del ajuste de datos, discriminación u otro algoritmo, el proveedor del método alternativo debe establecer un modelo monotónico sobre el dominio de la aplicación del método para transformar los resultados en valores más cercanos a los de referencia. El modelo ajustado es primero (u original) una curva de calibración y a menudo la recopilación de todos los factores de calibración sobre el dominio de concentración; no es lineal. Pero esto no está incluido en el estudio de validación.

Una parte de la validación es la verificación de la calibración, que da una curva de calibración final que establece la relación entre las mediciones transformadas y los “valores de referencia”2 correspondientes, con el mismo sistema de unidades. Con las mismas escalas en los ejes, esta curva debe ser lineal, teniendo un intercepción nula (mismos valores más bajos), y una pendiente de 1 (unidades de ejes iguales) y con características de propagación bien estimadas. La extrapolación por encima y por debajo de las concentraciones probadas no debe ser realizada, excepto si es necesario examinar el comportamiento cercano a una concentración de "cero".

NOTA 2. Los recuentos siguiendo el método de regresión lineal no es correctamente obtenido para recuentos con niveles bajos o con amplios rangos. Estos recuentos tienen distribuciones de quasi-poisson con desviaciones estándar de repetibilidad proporcionales a la raíz cuadrada del promedio de los recuentos. Se trata de la misma clase de dificultad de estimación, mencionado en la nota en 6.2.3.1

6.2.1.1.2 Exactitud

Acuerdo más cercano entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado (NMX 3534-1)NOTA: El término exactitud, cuando es aplicado a un grupo de resultados de un ensayo, toma en cuenta la combinación de componentes aleatorios y errores sistemáticos comunes o de sesgo.

6.2.1.1.3 Sesgo

Diferencia entre el resultado esperado del ensayo y el valor de referencia aceptado (NMX 3534-1)

NOTA: El sesgo es el error sistemático total en comparación con el error aleatorio. Puede haber uno o más componentes de errores sistemáticos que contribuyen al sesgo. Una diferencia sistemática amplia del valor de referencia aceptado se refleja por un mayor valor de sesgo.

6.2.1.1.4 Exactitud relativa

Ver 5.1.1.1.1

6.2.1.2 Protocolo de análisis2 Se derivan por el método de referencia con muestras contaminadas naturalmente, si la RM’s y «conocidos» los valores no están disponibles.



6.2.1.2.1 Diseño

La verificación de la curva de calibración requiere muchas muestras diferentes (de ser posibles materiales de referencia, ver anexo C); y el número de niveles examinados (dosis o concentraciones) está en función del rango de concentraciones utilizadas en la práctica.

Un mínimo de 5 niveles diferentes de cada analito en cada tipo de alimento es requerido para establecer una curva de calibración. Los niveles deben de cubrir uniformemente todo rango3 de interés, teniendo un mínimo (cero u otro), un medio, un máximo y dos niveles intermedios. La selección de la escala debe realizarse antes de que los niveles de concentración sean elegidos y tomando en consideración el rango de contaminación y el límite de detección esperado (LOD); lineal para rangos pequeños (es decir <3 x LOD, o 10 LOD a 100 LOD) incluyendo cero, logarítmico para niveles más amplios (es decir > 3 x LOD). Esto puede influenciar la relación entre la desviación estándar y los valores promedios de la prueba (ver nota 6.2.1.3.1).

Debe darse prioridad a muestras naturalmente contaminadas. La palabra “nivel” es utilizada a priori como una concentración estimada del analíto. En principio, un óptimo diseño para un análisis de regresión es obtenido al seleccionar un rango apropiado y relevante de concentraciones del analito, o al no analizar muestras con recuentos similares o eliminando datos con resultados repetidos. Para líquidos, el rango también puede ser obtenido mediante dilución; sin embargo deben tomarse en cuenta precauciones relacionadas con la homogeneidad de muestras tanto sólidas como líquidas.

Las muestras del nivel 1 deben duplicarse independientemente por preparación de sub-muestras; el mismo número de sub-muestras deben analizarse en cada nivel – al menos 2 e idealmente de 5 a 10. Cuando ambos, el método de referencia y el método alternativo emplean las mismas diluciones decimales en una sub-muestra, duplicar el ensayo al nivel de caja petrí (anexo M, caso 1). Cuando solo el método de referencia necesite diluciones decimales, realizar el análisis de las muestras por duplicado (anexo M, caso 2).

Los duplicados de las cajas petri son inoculados con cada dilución decimal.

Por lo tanto, un mínimo de 10 análisis (idealmente 25 a 50 empleando muestras naturalmente contaminadas) por el método alternativo deben realizarse para la verificación de la curva de calibración.

Si no se dispone de muestras de materiales de referencia, no es posible estimar correctamente la exactitud del método alternativo, sino solamente la exactitud relativa al medir las mismas sub-muestras con el método de referencia.

6.2.1.2.2 Categorías de Alimentos

El número de categorías de alimentos que serán evaluadas son 5. Este número puede reducirse a 1, 2 ó 3 categorías, si el método alternativo está validado solamente para esas

3 Ejemplo grafico de repartición aceptable e inaceptable de medidas se dan en anexo P.



categorías indicadas (ejemplo. productos lácteos). Las categorías recomendadas se encuentran en el listado del anexo B.

Las muestras deberán ser contaminadas naturalmente con el analito bajo estudio. Si es apropiado las muestras ambientales pueden ser consideradas en una sola categoría (ver anexo B).

Es deseable que las muestras de alimentos tengan una amplia distribución a fin de reducir el sesgo en alimentos regionales y ampliar el rango de validación. El rango de contaminación deberá ser cubierto a través de un conjunto de rangos cuantitativos bajo estudio.

Si no es posible adquirir un número suficiente de muestras contaminadas naturalmente en los niveles requeridos es permitido contaminar artificialmente algunas muestras; el número deberá mantenerse como una minoría del total de muestras analizadas. El procedimiento de contaminación artificial puede resultar en muestras con características del analíto tan similares a las muestras contaminadas naturalmente (ver anexo C, segunda y tercera opción).

Por lo tanto, para cada una de las cinco categorías de alimentos, por lo menos debe haber cinco niveles de analito que se medirá por los métodos, referencia y alternativo, cada muestra será replicada el mismo número de veces (2 a 10), lo que representa globalmente 10 a 50 mediciones por método y categoría de alimento. Si los resultados obtenidos sugieren que la matriz no es homogénea, ya sea en su composición o debido a variaciones en la concentración del analito objetivo en toda la matriz, un mayor número de muestras deberán ser analizadas.

Después de separar la prueba por cada categoría de alimento, el ensayo global de la curva de calibración para todas las categorías, es un ejercicio útil para identificar las discrepancias entre el ámbito de aplicación, exactitud y repetibilidad propagada en todo el rango del analito.

6.2.1.3 Cálculos

6.2.1.3.1 Generalidades

Antes de realizar cualquier cálculo, grafique los valores con puntos bidimensionales para métodos alternativos y de referencia para cada muestra, usando el eje y (vertical) para el método alternativo y el eje x (horizontal) para el método de referencia. Los puntos de cada nivel deberán formar un conjunto discreto. Con el fin de detectar discrepancias y una no-linealidad, revisar visualmente el gráfico para detectar la presencia de resultados anormales, que se encuentren fuera de cada grupo. Si se detecta, repetir la muestra si es posible y, si no se proporciona ninguna explicación o el resultado está todavía fuera del grupo, descartar temporalmente el resultado y repetir los cálculos más abajo para estimar su efecto en contraste con los cálculos que cuentan con todos los datos. Si está implicado un efecto de dilución, examinar este punto con cautela.



Si todos aparecen correctos, usar el programa4 de regresión lineal que proporciona la probabilidad de falta de ajuste o no linealidad, y la posibilidad también de regresión de peso desigual (ver NMX-CH-11095-IMNC). Si está disponible un programa de cálculo o una computadora de menor capacidad, los cálculos requeridos están dados en 6.2.1.3.2

ADVERTENCIA - Cuando una regresión líneal simple da una línea recta (y = a + bx), su coeficiente de correlación r no es suficiente para dar la información requerida. La significancia estadística de r, o de la pendiente b, no es sinónimo de la linealidad de la prueba. Por otra parte, las dos hipótesis (a = 0 y b = 1) deberán revisarse.

NOTA si el error de repetibilidad en y (o también en x) depende del valor y (el cuál, desafortunadamente, es un caso muy frecuente), ej. Un error proporcional cada vez mayor, es mejor usar una función de ponderación suavizada (por ejemplo: peso (y) = constante/ varianza = constante/ y2) para ajustar correctamente la línea recta y = a + bx por el proceso de regresión lineal (similar al método WLS, por mínimos cuadrados ponderados). Esto hace que la línea recta cercana a los puntos observados que tienen menor dispersión y mayor distancia, donde la dispersión es mayor: el estimado de la pendiente b y la intercepción a son por lo tanto muy dependientes de este procedimiento de ponderación. Este es un tema difícil y técnico, principalmente para el uso estadístico, y no está desarrollado en esta norma NMX16140. Pueden referirse a libros estadísticos que describan los Modelos Lineales Generales GLIM/GLM, etc (ver NMX-CH-11095-IMNC). Por lo tanto si después de reunir los datos y examinar las gráficas de regresión lineal cuestionable, es recomendable que se emplee un experto en estadística para este análisis.

6.2.1.3.2 Estimaciones usando el método de regresión

6.2.1.3.2.1 Principio del método de regresión

En el caso general, el eje vertical y (variable dependiente) es usada por el método alternativo y el eje horizontal x (variable independiente) por el método de referencia. Esta variable independiente x debe de ser muy exacta, precisa y tener valores bien conocidos

Si se prevé que un error de repetibilidad sr (x) puede ocurrir en x, que es más bien comparable o mayor que sr (y) en y, las funciones de ajuste y (x) o x (y) pueden dar lugar a muy diferentes líneas rectas. En el caso en el que la desviación estándar de la repetibilidad sr (x) y sr (y) son comparables (respectivamente en x y y), calcular otras estimaciones (ver anexo R.3). Si el sr (x) son mucho más grandes que sr (y), permute los ejes X a Y, y Y a X para realizar una regresión y (x), o para utilizar la regresión x (y) sin ejes de permutación (ver anexo R.4). Para estas opciones (ver anexo R.2), utilizar un punto de corte de 2 para la relación de errores de repetibilidad en “x” y “y”, o su inversa.Para los cálculos ver el anexo R

6.2.1.3.2.2 Estimaciones adicionales

4 O una hoja de cálculo, como Excel.



Si el error de repetibilidad sr o el error residual Sy:x dependen en gran medida de x (o y), es decir, los residuos parecen aumentar o disminuir claramente con x (o y, es decir s no es constante), la regresión ajustada líneal podría ser incorrecta y no pasar por los puntos más precisos. Por otra parte, la relación de CL con x (o y) no podría ser confiable en la parte principal del rango de medición. En este caso utilizar una técnica de regresión ponderada (WLS, GLIM, etc.)Cuando se considere necesario, y con el fin de simplificar este paso, transformaciones matemáticas monótonas de los dos ejes “x” y “y” pueden ser utilizados. Por ejemplo, x '= log x y y' = log y, o x '= xm y y' = ym puede ser empleado para una buena estimación de m (negativo o positivo, semi-entero o de otra manera): la elección se hace por inspección visual de los residuos o de la repetibilidad s r para cada x; errores constantes corresponden a la transformación ideal. Cuando se utiliza este tipo de transformación, el intercepto a no será muy diferente de cero. Entonces, cuando todas las estimaciones son proporcionadas, como el estimado de <y> y CL, sus transformaciones inversas pueden finalmente hacerse.


6.2.1.4.1 La relación de la exactitud relativa entre el método alternativo y el de referencia, es a través del modelo lineal: y = a + bX.

No hay sesgo sistemático (que es la exactitud ideal) entre los métodos si esta ecuación es igual a la ecuación teórica y= x, que se aplica si los dos métodos se comportan de forma equivalente. El intercepto teóricamente es nulo dentro de este modelo ideal. La intersección estimada generada por los dos métodos es comprobado por p {a = 0}. Si el método alternativo tiene un sesgo sistemático contra el método de referencia, la probabilidad p {a = 0} es menor que = 0,05 (2 colas).

La pendiente teórica de una línea que pasa por los puntos que dan una equivalencia totalmente verdadera es igual a uno. La pendiente b estimada, generada por los dos métodos, se comprobará por p {b = 1}. Si el método alternativo no da significativamente los mismos valores que el método de referencia, la probabilidad p {b = 1} es menor que = 0,05 (2 colas). En este caso, el método alternativo tiene relativamente un sesgo al método de referencia, en función del valor de la concentración (x o y) y es máxima en los límites del dominio

6.2.1.4.2 La linealidad o la falta de ajuste se pueden visualizar mediante una representación gráfica (Anexo N). La mejor es una gráfica de residuales (ver R.1). El {yk} no se grafica contra el {xk} valores (k = 1 a N, N = qn), pero los residuales estimados {yk - Yk} frente a {xk}. Se da la forma de la no-linealidad si se detecta con p (F) en R.5.

6.2.1.4.3 La estimación de la precisión de los métodos por CL (<yU/L>) proviene principalmente de la desviación estándar residual sy:x (ver el anexo R). Proporcionando límites en los que la precisión especificada para el resultado se encuentra con una probabilidad de 95%, cuando t es igual a aproximadamente 2.

CL correspondiente (<xU/L>) (ver anexo R) es de mejor uso debido a que se incluyen en el sistema de referencia.



6.2.2 Detección y cuantificación de límites

6.2.2.1 Generalidades

Las siguientes características implican la confiabilidad de la señal (o respuesta) obtenida con el método alternativo para detectar una concentración no nula obtenido por el método de referencia. Proporcionando los límites de precisión, incluyendo sesgo, en el extremo inferior de la concentración de dominio.

El ruido de fondo o blanco (instrumental u otro) se determina generalmente con al menos seis determinaciones independientes de blancos. También corrige el sesgo general de las mediciones reales por el uso de un valor central (promedio) y proporciona una importante estimación de propagación, s0.

A menudo, cuando no es posible medir o detectar algo menor de un nivel bajo, las muestrasse eligen con una concentración de analito cercano a la primera XLC estimación tomada de la línea recta anterior para la verificación de la calibración: XLC 1.645 sa [3], [5], [1], donde se obtiene sa en el anexo R. Alrededor de esta concentración, se estima una desviación estándar la cual se espera cerca de s0, y es utilizado en su lugar. Otro procedimiento es tomar la media y la desviación estándar de todas las mediciones de las dosis más bajas detectadas después de muchas repeticiones del mismo esquema de dilución (factor de dilución 1: 2 a 1: 10).

NOTA La estimación de la desviación estándar s0 incluye muchas incertidumbres, principalmente cuando está por debajo del límite de cuantificación. Por lo tanto, una estimación inicial s (si es posible con el método robusto Sn dada en el anexo Q) es normalmente suficiente para proporcionar las nuevas estimaciones.

6.2.2.2 Definiciones

6.2.2.2.1 nivel crítico (LC): la cantidad más pequeña que puede detectarse (no nula), aunque no cuantificarse como un valor exacto. Por debajo de este valor, no puede ser seguro de que el valor verdadero no es nulo

NOTA En este nivel, la probabilidad de falsos negativos β es 50% (β es el segundo tipo de error estadístico) (Ver 6.2.2.4)

6.2.2.2.2 límite de Detección (LOD): más alto que el nivel crítico (6.2.2.2.1), porque involucra una potencia, la probabilidad 1 – β, el cual tiene que ser mayor al 50%, por ejemplo 95%. Por ejemplo: LOD = Promedio (blanco) + z s0 (blanco), donde z = 2 x 1.645 ~ 3.3 valor crítico gaussiano con α = β = 0.05 (1 cola, ver 6.2.2.4), en lugar de un alto número (n) de muestras blanco.6.2.2.2.3 límite de Cuantificación (LOQ): la cantidad más pequeña de analito, (que es el número real más bajo de organismos), el cual, puede ser medido y cuantificado con



precisión y exactitud definida bajo las condiciones experimentales del método en proceso de validación.

NOTA AOAC define el límite de cuantificación para métodos cuantitativos como: LOQ = 10 s0, es equivalente a decir que el coeficiente de variación CVr = sr /x es necesario que sea mejor que el 10%, que es lo más bajo [2].

6.2.2.3 protocolo de medición y muestras

Realizar al menos seis (preferentemente 10) determinaciones de muestras blanco (negativo, dosis cero o cercano a cero) para estimar la referencia o el umbral de difusión s0.

NOTA Para los recuentos, más de cinco muestras con un nivel mínimo distinto de cero son suficientes para determinar que el índice de contaminación es p < 50 %, cuando no se detectan positivos (nivel de confianza del 95%). Si se detecta un positivo de cinco, puede evaluarse que p > 1 %. Por lo tanto, a partir de tres dosis del analito de material de referencia elegidos entre los 3, 10, 30, 100, 300 etc UFC/unidad, cada repetición al menos seis veces, el nivel crítico (50 % de detección) puede ser estimado: por ejemplo un caso ideal podría ser: 0/6 a la 10, 2/6 a la 30, 5/6 a la 100, dando una estimación alrededor de 30 UFC/unidad. Aunque la estimación proporcionada por este procedimiento se puede utilizar (ver anexo P para una estimación coherente).

6.2.2.4 Cálculos

Generalmente, el valor crítico y el límite de detección involucran dos tipos de errores estadísticos: α (para detectar una diferencia no existente (falsos positivos)) y β (para no detectar la diferencia real (falsos negativos)). El dominio 1-β es la probabilidad de detectar un valor significativamente más grande que LC.

A partir de las determinaciones de la muestra blanco xoi, estimar su desviación estándar, s0

(a partir de Sn, anexo R) y el sesgo: x0 = mediana de xoi. Corresponde a una falta general de especificidad, que es estadísticamente significativa sí:

t = (x0 n)/s0 > t> 1.645 (ver más abajo).

El nivel crítico LC ~ 1.65 s0 (+ x0 para el método alternativo), para α = 50% (y 1- β = 50%)

(De manera más precisa, LC = ts0, con t siendo el valor Student para una 1 cola de nivel α y n - 1 grados de libertad; para α = 5% y n = 6, t= 2.015 y entonces LC 2.0 s0; si ncuando t1.645).

El límite de detección es LOD 3.3 s0 (+ x0 para el método alternativo), para α = 5% y 1 - β = 95%



(Más preciso, LD = (tα + tβ) s0; con tβ siendo el valor Student para una cola de nivel β y n - 1 grados de libertad; por ejemplo, para 1 - β = 90% y n = 6, tβ = 1.476 y LD ≈3,5 s0, para 1 - β = 80%, tβ = 0.920).

El límite de cuantificación es LOQ = 10 s0 . (+ x0 para el método alternativo).

6.2.3 Sensibilidad relativa y determinación de muestras desconocidas.

6.2.3.1 Generalidades

Una estimación de la sensibilidad se utiliza en esta norma NMX16140, con el fin de cerciorarse de que los valores dados por el método alternativo no difieren notablemente del método de referencia (menos de 30% en la diferencia).

6.2.3.2 Definición

Para los propósitos de esta norma NMX16140, la sensibilidad relativa se define como la capacidad del método alternativo para detectar dos cantidades diferentes de analito medido por el método de referencia dentro de una matriz dada, en un valor promedio específico, o en todo el rango de medición, es decir, que es la cantidad mínima variable (aumento de la concentración de analito x), la cual da, una variación significativa de la señal medida (respuesta y).

NOTA La sensibilidad difiere del límite de detección (6.2.2), porque se calcula para cada valor de la escala de medición. Implica también los 2 tipos de error estadístico α (2-colas) y b.

6.2.3.3 Cálculos

El protocolo de medición y las muestras se describen en 6.2.1.2.

Sensibilidad relativa: ΔCS= 5.1 s(<x(y)>), para 2-colas α=5% y un dominio 1- β = 95%, con s(<x(y)>) ≡ s(<y>)/b a partir de R.6.2.

(Más preciso, ΔCS = (tα + tβ) √2 s(<x(y)>). Para α= 5%, y un dominio 1 – β = 90% y n=5, tα= 2.776 y tβ= 1.533, luego ΔCS=6.1 s(<x(y)>).

Identificación y determinación de muestras desconocidas: <x(y)>=<x>±tα s<x(y)>.

Luego graficar el perfil de (im) precisión s (<x(y)>) o CV (<x(y)>) contra x (y).

6.2.4 Especificidad, inclusividad y exclusividad.

6.2.4.1 Definiciones

6.2.4.1.1 especificidad: para los propósitos de esta norma NMX16140, la especificidad se define como el grado en que un método se ve afectado (o no) por otros componentes presentes en una muestra de componentes múltiples. Esa es la capacidad de un método



para medir exactamente un analito dado, o de su cantidad, dentro de la muestra sin la interferencia de los componentes no objetivo, tales como un efecto de la matriz, o el ruido de fondo.

6.2.4.1.2 inclusividad y exclusividad: para el propósito de esta norma NMX16140, la selectividad se define como una medida del grado de no interferencia en la presencia del analito no blanco. Un método es selectivo si se puede ser usado para detectar el analito bajo examinación, y la garantía se puede hacer siempre que la señal sea detectada sólo en un producto para ese analito específico.

Este criterio no es aplicable a un recuento total viable.

Inclusividad es la capacidad de un método alternativo para detectar el analito blanco a partir de un amplio rango de cepas.

Exclusividad es la falta de interferencia por un rango de cepas no blanco del método alternativo.

6.2.4.2 Protocolo de medición

6.2.4.2.1 Muestras

En microbiología (excepto en el caso del conteo total en placa), la inclusividad y la exclusividad es establecida por el análisis de:

al menos 30 cepas puras positivas (del analito en estudio);

al menos 20 cepas puras negativas (otro analito de los que se encuentran en estudio), tomadas a partir de cepas que se sabe causan común y consistentemente interferencia con el analito blanco.

Seleccionar la cepa positiva y negativa que contamina regularmente el producto(s) alimenticio en estudio. Para las cepas que no pertenecen a una colección, llevar a cabo una identificación completa de varias cepas probadas. El origen real de una cepa de los alimentos (no de la colección) debe ser conocida.

Criterios para la elección de las cepas se dan en el anexo G.

La cepa pura para cultivo en laboratorio constituye las muestras de prueba. El nivel de inoculación para cada microorganismo es fijado en más de 100 veces el límite de detección de la especie blanco.

Cada muestra contiene una cepa que debe ser analizada dos veces.

6.2.4.2.2 Protocolo de medición



La especificidad, la inclusividad y la exclusividad del método de referencia no necesitan ser establecidas si ya se conocen.

6.2.4.3 Expresión de resultadosEstas características de selectividad son solo dadas en una manera descriptiva (ver Tabla 8) en relación al límite de detección del analito blanco; por lo tanto, no se necesitan cálculos. La falta de inclusividad y exclusividad es parte de la ausencia general de especificidad (Ver también sesgo en 6.2.1.4).

TABLA 8.- Presentación de los resultados para la inclusividad y exclusividad.

Cepa probada Método de referenciaResultado esperado o demostrado en nivel de inoculo etc.

Método alternativoResultado (dar el límite de detección, etc.)

(prueba simple) DuplicadoCepas blanco

etc.Cepas no objetivo

etc.

Datos publicados y cumpliendo los requisitos de la ISO 16140, también puede ser usada por el laboratorio organizador en el estudio de comparación de métodos, para proporcionar información adicional a los criterios anteriores (ver Anexo A, proporcionando criterios de aceptación de resultados externos).


Será posible evaluar si el método alternativo cumple con las especificaciones de fábrica y con los requisitos indispensables para su uso confiable

6.2.5 Características adicionales del método alternativo

Con respecto al método alternativo, documentar todas las características pertinentes que afecten al protocolo del método: por ejemplo estabilidad, fiabilidad, robustez o exactitud.

6.3 Estudio interlaboratorio

6.3.1. Generalidades



El estudio colaborativo pretende determinar comparativamente las características de rendimiento (exactitud y precisión) del método alternativo con respecto al método de referencia

Para las guías de los laboratorios organizadores con respecto a los estudios colaborativos ver anexo H. Ver también ISO 5725-2

6.3.2 Términos y definiciones

Para el propósito de esta ISO 16140, aplicar los siguientes términos y definiciones:

6.3.2.1 exactitud: cercanía entre el resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado[ISO 3534-1]

NOTA Esto es aproximadamente estimado a un rango, el rango debe ser la parte sistemática del error.

6.3.2.2 precisión: cercanía de acuerdo entre los resultados obtenidos de las pruebas independientes bajo las condiciones de repetibilidad y reproducibilidad (ver 6.3.6 y 6.3.7) [ISO 3435-1].

6.3.2.3 atipico: valor extremo, que normalmente aparece de manera aleatoria, en al menos 1% de las pruebas, pero más frecuentemente, si ocurren situaciones anormales. Para cuantificar esta probabilidad, pueden utilizarse los procedimientos de prueba.

Nota: El enfoque “robusto” de esta ISO 16140, no excluye a los atipicos, a menos que haya una indicación clara o una razón microbiológica para hacerlo. Este enfoque puede utilizarse ya sea como un procedimiento de prueba para la detección de los atípicos o estimaciones estadísticas robustas.

6.3.3 Protocolo de mediciones y muestras

6.3.3.1 El estudio interlaboratorio produce por lo menos ocho laboratorios colaborativos sin tener resultados atípicos. Las estimaciones de exactitud y precisión, deberán calcularse de un gran número de resultados duplicados de pruebas.

Esta figura deberá ser un mínimo de 96 resultados para cada una de las matrices de alimentos elegidas.

Los lineamientos y requerimietnostos para organizar, enviar y realizar los estudios interlaboratorio, son de acuerdo al anexo H.

El laboratorio organizador es también responsable de la preparación del protocolo de la prueba y la hoja de datos (ver abajo) recordando todos los datos experimentales y las condiciones experimentales críticas que fueron usadas en cada laboratorio (Ver H.3)



Es necesario para el analista de cada laboratorio colaborador, demostrar sus competencias en el uso del método alternativo y el método de referencia, participando en el estudio apropiado.

6.3.3.2 El protocolo es el siguiente:

usar una matriz relevante de alimento (ver anexo B);

las concentraciones de analitos, deben ser elegidas para cubrir al menos el nivel inferior, medio y superior de todo el rango del método alternativo. Las muestras deberán ser homogéneas por el laboratorio organizador. Un control negativo también podría ser incluido;

contaminación artificial de una muestra de alimento con el analito blanco puede ser usado;

para comparar el método alternativo con el método de referencia, las mismas muestras serán usadas para cada método. Cuatro sub-muestras de cada nivel (o dos alícuotas, para cada medición por ambos métodos) son preparadas en cada laboratorio. Estas son debidamente codificadas y etiquetadas para dos mediciones por el método de referencia y dos mediciones por el método alternativo;

muestras líquidas (comparadas con muestras sólidas), da una mayor seguridad de homogeneidad si es preparada y enviada sin cambios en el contenido de la carga microbiológica usada correctamente. En casos específicos, esto puede ser necesario para subdividir las muestras justo antes de medir con ambos métodos;

el análisis de muestras debe realizarse en cada laboratorio colaborativo y el laboratorio organizador, en una fecha estipulada usando los mismos lotes de kits y medios;

el redondeo de los resultados será fijado por el laboratorio organizador. Después de la recopilación de resultados de cada laboratorio, la tabulación final de datos para cada nivel de analito j, será presentada como se muestra en la Tabla 9.

TABLA 9.- Presentación de los resultados del estudio interlaboratorio por cada nivel de analito (j)

Laboratorios (i)

Métodos (k) y duplicados (r) Método de referencia (código) Método alternativo (código)Duplicado 1 Duplicado 2 Duplicado 1 Duplicado 2

12etc.(n)

6.3.4 Cálculos

6.3.4.1 En microbiología, los datos de {y} no siempre muestran una distribución estadística normal, es decir, una distribución Gaussiana. Esta distribución se puede comprobar si hay



suficientes valores disponibles (más de 30 resultados) todos al mismo nivel. A menudo, con el fin de obtener una distribución más simétrica, pocos conteos se transforman en logaritmos. Otros procedimientos más complicados también pueden ser utilizados.

A menudo es difícil hacer estimaciones confiables (media, desviación estándar, etc) con un pequeño sesgo y en presencia de valores atípicos. ISO 5725 incluye las pruebas de valores atípicos (Cochran, Dixon, Grubbs) con el fin de descartar la influencia de valores negativos y obtener una mejor estimación, sin embargo reduce el número de valores útiles para el análisis estadístico.

Por lo tanto, con el fin de protegerse contra estas dificultades, se utilizan estimadores robustos en esta ISO 16140, ya que son insensibles a cualquier valor extremo, y por otra parte no dependen demasiado en la distribución de los datos, no se excluyen los valores extremos reportados por los laboratorios, a no ser que la exclusión este basada en razones microbiológicas. Estimar tres valores de consenso para todos los laboratorios participantes:

estimación del centro global (para las estimaciones de sesgo): la mediana MED (en lugar de la media M);

estimación de la propagación entre las medias por duplicado, incluyendo la reproducibilidad: sb basada en la mediana recursiva Sn (6), (ver el anexo Q), en lugar de una desviación estándar clásica (s); y

estimación dentro de la propagación típica, la repetibilidad de la desviación estándar de deriva de la mediana de las desviaciones estándar de duplicados: k2 MED {si}, en lugar de la desviación estándar clásica combinada, procedentes de las variaciones significas

6.3.4.2 Por cada método k (por ejemplo 1: referencia, 2: alternativo) y nivel j, calcular:

Nivel j Replicas M i siMétodo k

1 2Laboratorio (i): 1 y i1 y i2 ( y i1+ y i2 )

2|y i1− y i2|

√2



2 … … … …… … … … …N … … … …

MEDIANA: MED{M i} Sr=k2MED {s i}Robusto sR=Sb=s {M i }=k 1×Sn

SR=√ Sb2+ Sr22

Donde las constantes k1=1.1926 y k2= 1.4826; esta última constante es dependiente en el hecho de que solamente los duplicados (valores de dos laboratorios) son usados y no hay más réplicas5

Sn corresponde al siguiente procedimiento el cual no usa un centro estimado:

Sn = MEDi {MEDj |Mi - Mj|}. Éste consiste en 2 fases de medianas sucesivas:

para cada uno de los valores n, la mediana de sus (n-1) diferencias absolutas a los otros valores es estimada; y

la estimación de propagación es la mediana de las n medianas desviadas, anteriormente calculado (por ejemplo, ver anexo P).

NOTA Sólo existen alternativas pobres. La desviación absoluta de la MEDiana o MAD (Hampel, 1974): MAD = MEDi {| Mi - MED |}. Esta estimación de la propagación robusta es simétrica alrededor de un centro de estimación (MED). Caso de Gauss: 1.4826 MAD. Otra alternativa comparable se basa en el rango intercuantil IQR = Q3-Q1 = 3er – 1er cuartil, para el caso gaussiano 1.4826 IQR / 2. Esto último es fácil de conseguir con Excel6.

6.3.5 Precisión Relativa

6.3.5.1 Definición

Para los propósitos de esta ISO 16140, los valores de referencia aceptados dentro de una definición de verdadero, están dados solamente por las respuestas obtenidas por el método de referencia en muestras idénticas

Por lo tanto, la desviación de las mediciones obtenidas por el método alternativo corresponde mejor a una precisión relativa.

5 Esto es √ VX2 , con X2 = chi-cuadrada para p=0.5 (X2 = 0.455) y V grados de libertad con replicas (V= 2-1 por duplicado).

6 La función estadística Excel usadas aquí son: MEDIANA(rango) igual al 2º cuartil, y CUARTIL(rango:k) con k=1,2 para el 1er ,2º y 3er

cuartil.



6.3.5.2 Cálculos

Para cada nivel de analito j, calcular d i = Mi,alt - Mi,ref para i = 1 hasta n laboratorios,donde

Mi,alt es la media duplicada del laboratorio i obtenida por el método alternativo;

Mi,ref es la media duplicada del laboratorio i obtenida por el método de referencia.

Por lo tanto, la mediana MED {d i} = sesgo D y la desviación estándar robusta SD {d i} = K1Sn proporcionan un t-like estadístico:

t (d) = MED {di} √n/s {di}, con n - 1 grados de libertad (df).

En la tabla t Student se encuentra la probabilidad de que D = 0. (Por ejemplo, para n = 12 (11 df), el valor crítico de 2 colas α= 0.05 es t 0.05;11 = 2.201). Si t (d)> tα, df del D sesgo entre los dos métodos en comparación esto significa, que el método alternativo carece de precisión, en relación con el método de referencia, por el nivel j.La relación entre la exactitud relativa y los niveles puede ser modelada (sesgo constante o proporcional, etc), en relación con la linealidad de la curva de calibración.


Se espera que un sesgo nulo (D = 0) para cada nivel de analito. Sin embargo, si bien la magnitud estimada D es demasiado grande para el propósito de los métodos, o la significancia estadística es alcanzada, el método alternativo es diferente al de referencia.

6.3.6 Repetibilidad

6.3.6.1 Términos y definiciones

Para los efectos de esta norma ISO 16140, aplican los siguientes términos y definiciones:

6.3.6.1.1 repetibilidad: grado de concordancia cercana entre resultados sucesivos e independientes obtenidos por el mismo método sobre material de pruebas idénticas, bajo las mismas condiciones (aparato, operador, laboratorio y cortos intervalos de tiempo, es decir condiciones de repetibilidad)

6.3.6.1.2 límite de repetibilidad (r): valor menor o igual que la diferencia absoluta entre dos resultados de prueba obtenidos bajo condiciones de repetibilidad, esperando una probabilidad del 95%

Uso: si la diferencia entre dos resultados excede r, los resultados se deben considerar como sospechosos.

6.3.6.2 Cálculos

Para cada método k y el nivel de analito j, calcular:



límite de repetibilidad r= 2.8 sr´ con7 la desviación estándar de la repetibilidad sr;

desviación estándar relativa de la repetibilidad RSD r=100% SR-MED {Mi}

La repetibilidad de los métodos de referencia y alternativo, son comparados con una distribución – F:

F=(sr;alt/sr;ref)2 con n y n grados de libertad. Una tabla F proporciona la probabilidad p(F) que sr;alt=sr;ref; por ejemplo para n=12, el valor crítico para dos colas α=0.05 es F0.05;12;12=2.69.

Si F(o 1/F)>Fα;n;n cuando la comparación de métodos tienen diferente repetibilidad, para el nivel j. La relación entre la repetibilidad y los niveles puede ser modelada, así como la desviación relativa estándar de la repetibilidad. Para este propósito, ver ISO 5725.


Una repetibilidad comparable para cada nivel de analito esperado. Mientras, si la significancia estadística p(F) < α (dos colas) es alcanzada, el método alternativo es diferente al de referencia.

El criterio no disponible es válido para el rechazo del método alternativo.

6.3.7 Reproducibilidad

6.3.7.1. Términos y definiciones

Para el propósito de esta ISO 16140, aplican los siguientes términos y definiciones;

6.3.7.1.1 reproducibilidad: grado de concordancia entre resultados de pruebas simples, usando el mismo método y material de prueba idéntico y obtenido por operarios en distintos laboratorios, con equipos diferentes (es decir, condiciones de reproducibilidad)

6.3.7.1.2 límite de reproducibilidad (R): valor menor o igual que la diferencia absoluta entre dos resultados de prueba obtenidos bajo condiciones de reproducibilidad, esperando una probabilidad del 95%Uso: si la diferencia entre dos resultados excede R, los resultados se deben considerar como sospechoso

6.3.7.2 Cálculos

7 La constante 2.8 @ za = 1.960 y 2-colas a = 0.05 o un nivel de confiabilidad del 95%.



El valor de R es calculado de la desviación estándar de la repetibilidad sr y entre la desviación estándar de los laboratorios sb, para cada método k y cada nivel de analito j.

Límite de reproducibilidad R=2.8 sR

Con la desviación estándar de la reproducibiliad sR = sR=√ sL2+sr2=√sb2+

sr2

2 y sL

2=sb2−sr

2

2=

varianza de laboratorio, con sb=k1Sn

Desviación estándar relativa de la reproducibilidad RSDR=100 % sR/MED{M i}La reproducibilidad del método alternativo y de referencia es comparada con una distribución – F.

ECUACIÓN (ILSE) La relación entre la reproducibilidad y los niveles pueden ser modelados, asi como para la reproducibilidad relativa RSDr. Para este propósito, ver ISO 5725.

En este punto, estimar la probabilidad p(F) teniendo homogeneidad para la distribución entre laboratorio, esto es, las diferencias de laboratorio son menos que sus típicas determinaciones de propagación: F=2(sb(sr)2 con df(NUM)=n-1 y df(DENOM)= n grados de libertad. Una tabla F, proporciona la probabilidad p(F), indicando la importancia de la variación entre laboratorios sL.


Una reproducibilidad comparable para cada nivel de analito es esperada. Mientras, si la significancia estadística p(F) < α (2 colas) es alcanzada, el método alternativo es diferente del método de referencia (peor o mejor, según R). El criterio no disponible es válido para el rechazo del método alternativo.

R≤ 2r es generalmente correcto (ver criterio de Horwitz). Sin embargo, depende de la respuesta del método y el contexto de uso. La probabilidad de tener no homogeneidad con una gran dispersión entre laboratorios, generalmente indica que la estandarización del método tiene que ser mejorada, o las instrucciones para cada operación no fueron bien entendidas (redacción, explicación, etc), o los análisis no fueron bien hechos (falta de habilidades), o hay cambios anormales de tiempo para las reacciones, cultivos, etc. Así como para todas las condiciones externas al laboratorio.



Anexo A(Normativo)

Normas específicas para la aceptación de resultados externos ya obtenidos en un esquema de validación previa.

(Ver referencias: 4.1; 5.1.1.3.5; 5.1.3.4; 6.2.4.3)

A.1 General

Este considera que los datos generados por las Normas Internacionales o Europeas y otros métodos de referencia.

A.2 Métodos alternativos que han cambiado o se han validado con anterioridad a una Norma Internacional o Europea.

Al evaluar si los datos externos existentes pueden ser aceptados de conformidad ISO 16140, establecer si el método alternativo se ha cambiado de alguna manera después de que se producen los datos.

Si este es el caso, y los cambios que se consideran importantes, los resultados no pueden ser aceptados.

Si no hay cambios o si los cambios son menores, a continuación, se dirigirán al sistema de calidad del laboratorio que lleva a cabo la validación.

Si la organización de laboratorio no fue acreditado según ISO / IEC 17025, una auditoría se llevará a cabo para comprobar la calibración, los medios de comunicación, la temperatura, el equipo y los registros de capacitación de la época en que se llevó a cabo la validación. Si los resultados de la auditoría no son satisfactorios, los resultados no pueden ser aceptados. La auditoría deberá ser documentada por escrito.

Sin embargo, si la organización del laboratorio está aceptada sobre la base de la auditoría, o el laboratorio tenía ISO / IEC 17025, los criterios de validación se consideran de fiabilidad satisfactoria.

También se evaluará la información sobre los laboratorios colaborativos (su capacidad y las prácticas de control de calidad).

A.3 Métodos alternativos que no han sido validados contra un método de referencia de una norma Internacional o Europea.



Los estudios anteriores serán aceptables bajo esta norma, siempre que:

Que se han llevado a cabo de acuerdo con protocolos de validación aprobados por un panel de revisores técnicos reconocidos y los resultados de tales estudios habían sido aceptados plenamente por ellos;

Que los revisores técnicos estaban operando bajo el patrocinio de organizaciones internacionalmente reconocidas que realizan validaciones de métodos (por ejemplo, AFNOR, NORVAL, AOAC International, Instituto de Investigación de la AOAC);

Que las validaciones incluyan estudios que cumplan con al menos el número total de la muestra y los requisitos de la matriz del alimento de esta norma.

Cuando el método alternativo se ha comparado con un método de referencia reconocido internacionalmente (como la AOAC Internacional) que se diferencia en aspectos menores del método de referencia en la norma internacional o europea y si el protocolo es similar a esta norma, a continuación, los resultados pueden ser aceptados.

Si el método es sustancialmente diferente del método de referencia en la norma internacional o europea, se realiza una evaluación para determinar si estas diferencias podrían tener un impacto mayor o menor en el funcionamiento del método. Se realiza una evaluación con respecto a los datos complementarios, en su caso, necesario para resolver diferencias de criterios de procedimiento y / o referencia (por ejemplo, diferentes caldos de enriquecimiento de primaria). Las decisiones que los métodos de referencia contienen mayor diferencia se sustanciarán por la organización de laboratorio, con datos documentados. Los datos necesarios para resolver las diferencias percibidas se estipularán.

Anexo B(Informativo)

Clasificación de los tipos de muestras para estudios de validación.(Ver referencias: 5.1.1.2.1; 5.1.2.2; 5.2.1.2; 6.2.1.2.2 y anexo H)

B.1 Food and animal feeding stuffs samples

TABLA B.1 - Categorías de alimentos pertinentes a los principales patógenos de transmisión alimentaria.

Tipo de producto

Yersinia

spp.

Clostridium

perfringens

Listeria

monocytogenes

E. coli

O157

Staphylococcus

aureus

S.aureus enterotoxins

Campylobacter

spp.

Salmonella

spp.

Bacillus

cereus



&

VTEC

Productos cárnicos

Crudo x x x x x x

Procesado por calor

x x x

Congelado x X

Fermentado

x X

Curado x x x x

Otro Platos/salsa

Paté

Aves

Crudo x x x

Procesado por calor

Congelado

Otros Platos/salsa

Pescado y productos del mar

Crudo x x x x

Procesado por calor

Congelado

Ahumado x x

Otros

Productos basados en frutas y vegetales

Crudo x x x x x

Procesado por calor



Congelado

Secado x

Fermentado

Crudo/Salado

Jugos/Concentrado

x x

Baja humedad/IMF

Otros Champiñones procesados

Productos lácteos

Crudo x x x x x x x x

Procesado por calor

x

Congelado x x x x x x

Fermentado

x x x x x

Secado x x x x

Otros

Chocolate/Productos de panadería

Baja humedad/IMF

x

Secado x

Otros Pasteles Natillas

Otros productos



Cerveza

Aderezos

Especias x x x

Mayonesa x x

Pasta x

Huevo y derivados

x

Cereales/arroz

x

Alimentos para animales

Diversos x

TABLA.2 - Categorías de alimentos pertinentes a los principales microorganismos no patógenos.

Tipo de producto

Levaduras/Mohos

Bacterias de ácido láctico

Recuentos totales viables

Coliformes

Escherichia coli

Productos cárnicos

Crudo x x x x

Procesado por calor

x x x

Congelado x x

Fermentado x x

Curado x

Otros x

Aves

Crudo x x x x

Procesado por calor

x x x

Congelado x x



Otros

Pescado y productos del mar

Crudo x x x x

Procesado por calor

x x x

Congelado x x

Ahumado x x x

Otros

Productos a base de frutas y vegetales

Crudo x x x x

Procesado por calor

x x

Congelado x x

Secado x x x

Fermentado x

Curado/Salado x

Jugos/Concentrado

x x

Baja humedad/IMF

x

Otros

Productos lácteos

Crudo x x x

Procesado por calor

x x

Congelado x x x

Fermentado x x

Secado x x

Otros

Chocolate/Productos de panadería



Baja humedad/IMF

x x x

Secado x x

Otros

Otros productos

Cerveza x

Aderezos x x

Especias

Mayonesa x x

Pasta

Derivados de huevo

Cereales/Arroz

Alimentos para animales

Diversos x x

B.2 Muestras veterinarias

Para la proyección de los siguientes animales de granja las muestras citadas se examinan para Salmonella:

TABLA B.3 – Muestras veterinarias para Salmonella

Animal, producto o su entorno Muestra para el análisis

Huevos degradados Muestras fecales compuestas

Puesta de huevos Muestras fecales compuestas

Pollos de un día Paja de cama

Gallinas de cría Muestras fecales agrupadas

Cadáveres de poblaciones de cría Muestras combinadas de meconio

Carne fresca de ave Pedazos de la piel del cuello o de trozos de tejido

Aves Muestras combinadas de heces

Carne fresca de vacuno y de cerdo Frotis de superficie de cadáveres,



piezas de tejido y goteos de agua.



Anexo C(Normativo)

Uso de muestras naturalmente contaminadas y preparación de muestras artificialmente contaminadas en estudios de validación.

(Ver referencias: 5.1.1.2.1; 5.1.1.2.3; 6.2.1.2.1; 6.2.1.2.2; 6.3.3.2; anexo H)

La selección de un tipo de alimento dentro de una categoría con el fin de aumentar la proporción de muestras contaminadas naturalmente, debe ser considerada. Si sólo un número limitado de muestras contaminadas naturalmente están disponibles a continuación, la segunda opción a continuación se puede tomar para aumentar el número de muestras. La tercera opción sólo se utilizará en casos muy justificados. Los materiales de referencia que contienen microorganismos estresados, preferiblemente con niveles bien definidos de analito blanco (microorganismos) y la vida útil cuantificado se pueden utilizar cuando se indique.

1ra opción: Naturalmente muestras contaminadas

Utilice muestras recogidas de productos analizados sobre una base rutinaria por cualquiera de la organización de laboratorio u otros laboratorios.

Almacenamiento debe minimizar tanto el cambio microbiológico y minimizar el estrés microbiano. Contaminación



(cualitativa o cuantitativa como sea el caso) debe ser confirmada inmediatamente antes de la estudio de validación.

2da opción: Contaminación por mezcla

Inocular los productos líquidos y semi-sólidos a ser probados por dilución con una muestra contaminada de manera natural de tipo similar.

La microflora de fondo en el "producto diluido" deberá ser de un tipo similar y en un estado similar de estrés a los que ocurren en los productos contaminados de forma natural.

3ra opción: Muestras contaminadas

Si está disponible, el material de referencia 8 se debe utilizar para la realización de la contaminación.

Si no está disponible, las cepas utilizadas deberían haber sido aislados del mismo tipo de producto.

Un protocolo para subrayar el microorganismo blanco debe ser definido y el estrés demostrado en el momento de la inoculación.

El nivel de la microflora debe ser representativo de la contaminación que se produce en ese producto natural.

4ta opción Materiales de referencia

Los materiales de referencia, tales como material de referencia certificado, que contienen niveles adecuados, pero bien definido de analito blanco (microorganismos) en un estado estable, pero estresado, se pueden utilizar las muestras para el análisis de pico con métodos cualitativos y

8 10 réplicas en cada uno de los 3 o 4 niveles de contaminación son examinados.



cuantitativos. Para los estudios cualitativos su uso debe ser limitado cuando sólo unas pocas cepas o serotipos de origen de los alimentos del analito blanco están disponibles como materiales de referencia.



Anexo D(Normativo)

D.1 Caso 1- Cuando todas las condiciones del primer estado de cultura de ambos métodos son idénticos.


25 g de muetsra de alimento.

Homogeneizar

Primer estado de cultivo (Por ejemplo

preenriquecimiento).

División

Método de referencia. 2° estado

etc.

Continuar cada análisis de acuerdo a

su protocolo.

Métodoalternativo. 2° estado etc.

Continuar cada análisis de acuerdo a

su protocolo.

Leticia Segura, 29/08/13,

Leticia Segura, 29/08/13,


D.2 Caso 2- Cuando el estado del primer cultivo de ambos métodos es diferente.



NOTA Cabe señalar que en el caso 2, debido a la dilución de los medios por la muestra + diluyente, el medio no puede ser utilizado y la concentración de los ingredientes en el caldo preparado en el laboratorio se deben aumentar en aproximadamente un 10%.


Para productos no líquidos.

50 g de muestra de alimento+ 50 mL de agua u otro diluyente

adecuado.

Homogeneizar completamente la mezcla.

División.

Método de referencia.

50 g de alimento homogeneizado (o 25 g de producto líquido) + medio de

cultivo para obtener la proporción correcta w/v.

Continuar cada análisis de acuerdo a su protocolo.

Método alternativo.

50 g de alimento homogeneizado (o 25 g de producto líquido) + medio de

cultivo para obtener la proporción correcta w/v.

Continuar cada análisis de acuerdo a su protocolo.

Para productos líquidos agregar 50 mLde muestra de

alimento


Anexo E(Normativo)

Calculo de los intervalos de confianza asociados con el número de muestras analizadas.

(Ver referencia: 5.1.1.3.2)

Para cada AC9, SE y SP porcentaje (p) (ver 5.1.1.3.1) calcular los intervalos de confianza (CI):

si 10 % <p< 90%, calcular los dos intervalos de confianza de ambos lados aproximados al 95%:

CI (al 95%) ≈ p ±2√ p(1− p)n

con n= N, N+, N-, respectivamente para p (en%) = AC, SE,

SP, Para p≥90%, calculando el menor límite de confianza al 95% (1 lado), con n≈ N, N +, N-,

respectiva para p (en%) = AC, SE, SP.

En este caso, es preferible usar la tabla binomial para n = 10, 20, 30, 40, 50, 60. Ver tabla E.1:Tabla E.1 - Límite de confianza inferior al 95% para p = 90% y más.n= 10 20 30 40 50 60

P= 0.90 0.75 0.83 0.82 0.84 0.83 0.84

0.92 0.85 0.83 0.85 0.86 0.87 0.88

0.94 0.85 0.88 0.88 0.89 0.89 0.89

0.96 0.85 0.93 0.92 0.91 0.93 0.93

0.98 0.95 0.93 0.95 0.96 0.95 0.96

0.99 0.95 0.98 0.98 0.96 0.97 0.98

EJEMPLO n=20, p=94% entonces (p; al 95%)= 88%

9 Ver anexo W para las explicaciones de las abreviaturas.



Anexo F(Normativo)

Prueba aplicada al examen de resultados discordantes.

(Ver referencia: 5.1.1.3.3; 5.2.2.6)

Cuente el número total de resultados discordantes donde Y se expresa de la siguiente manera:

Y=PD + ND (Por ejemplo PD=2, NM=10, entonces Y=12.)

Comprueba si los dos métodos podrían ser diferentes por el balance de sensibilidad frente a la especificidad.

Para Y < 6, (Menos de seis desacuerdos): ninguna prueba está disponible;

Para 6 ≤ Y ≤ 22, (es decir entre 6 y 22 desacuerdos), determine m como el valor más pequeño de los dos valores de PD y ND(Por ejemplo m = PD = 2, porque PD < ND) y usando la ley binomial de acuerdo con la siguiente tabla F.1:

Sí m ≤ M para un determinado Y, los dos métodos son diferentes a α<0,05 (2-colas).

TABLA F.1 – M valores para Y desacuerdos (6 ≤ Y ≤ 2)



Desacuerdos Y = PD + ND

6 a 8 0 a 11 12 a 14 15 a 16 17 a 19 20 a 22

M = Max (m) para α < 0,05

0 1 2 3 4 5

Por ejemplo, para Y = 12 desacuerdos y m = 2, M = 2 y m ≤ M: por lo tanto, los dos métodos son diferentes con p < 0,05.

Para Y > 22, (más de 22 desacuerdos), usar la prueba McNemar con distribución de chi-cuadrada con 1 grado de libertad:

X2=d2

Y, con d = |PD- ND| e Y = PD + ND.

Los dos métodos son diferentes con una α < 0,05 (2-colas) sí X2 > 3,841.

Esta prueba de chi-cuadrada corresponde al mínimo d para cada Y de la siguiente Tabla F.2 para α < 0,05.

(Para una determinada Y, d será igual o superior al valor indicado en la tabla F.2 para concluir que los dos métodos son diferentes.)

TABLA F.2 – d valores para Y desacuerdos (Y > 22)

Desacuerdos Y = PD + ND

22 a 26 27 a 31 32 a 37 38 a 44 44 a 51 52 a 58

d = | PD – ND | ≥ 10 11 12 13 14 15

Anexo G(Normativo)

Puntos a ser considerados al seleccionar cepas para pruebas de selectividad



(Ver referencias: 5.1.2.2; 5.1.3.2.1; 5.1.3.2.1.2; 6.2.4.2.1; anexo H)

G.1 General

En este anexo se describen los requisitos de prueba mínimos para el uso general. En la selección de cepas de la prueba la mayoría debe proceder de la gama de materiales alimenticios utilizados en el estudio y para abarcar la gama reconocida del analito blanco con respecto a la distribución siguiente-geográfica, la incidencia, la diversidad de características de identificación, por ejemplo, bioquímica, serotipo, fagotipo, etc. y todas las reclamaciones formuladas por los productores del método alternativo.

G.2 Categorías de grupos de objetivo.

a) Grupo indefinido, por ejemplo recuento total, coliformes, levadura, bacterias de ácido láctico;

b) Familia por ejemplo Enterobacteriaceae;

c) Género por ejemplo Salmonella, Pseudomonas, Listeria;

d) Especies por ejemplo Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli;

e) Tipo por ejemplo Salmonella enteritidis phage type 4.

G.3 De acuerdo con el grupo destinatario especificado en G.1 una gama de microorganismos positivos puede ser elegido.

f) Para los grupos definidos para los que el grupo objetivo se define por el método de referencia, las cepas utilizadas serán seleccionados de los que son capaces de crecimiento típico en el método de referencia;

g) Para las familias: utilizar cepas de una variedad de géneros en la familia y si es posible incluir un miembro representativo de todos los géneros en la familia;

h) Por géneros: utilizar una amplia gama de especies de este género y, si es posible, compruebe todas las especies en el género;

i) Para las especies: una amplia gama de cepas de esta especie. La definición de la cepa debe tenerse en cuenta al hacer este juicio. En los patógenos presentes tales como Salmonella y Listeria se serotipables, sin embargo Listeria spp también están fago escrito, en el futuro otros métodos de tipificación genética como RAPD escribir, escribir y PFGE ribotipificación se utilizará. En la definición de las cepas positivas para usar en las pruebas, la organización de los laboratorios dében utilizar disponible información



actualizada para asegurar que las cepas son relevantes en ese momento para las categorías de alimentos de destino;

j) de tipo: una gama de fuentes de esa cepa.

G.4 Grupos no objetivo utilizados en el estudio de selectividad

a) Los grupos no objetivo (es decir, los que se espera que sea negativo y que se utiliza para las pruebas de reactividad cruzada) debe ser especificado de acuerdo con el grupo objetivo;

b) Cuando el grupo objetivo es una familia: las cepas no diana se incluyen las familias;

c) Cuando el grupo objetivo es un género: cepas no objetivo se incluyen otros géneros considerados para ser similar al género de destino;

d) Cuando el grupo objetivo es una especie: las cepas no diana se incluyen otras especies dentro del género de destino;

e) Cuando el grupo objetivo es una cepa: las cepas no diana se incluyen otras cepas de la misma especie.



Anexo H(Normativo)

Directrices para la organización y realización de estudios colaborativos(Ver referencias: 5.2.1.1; 5.2.1.3; 6.3.1; 6.3.3.1: Anexo J)

H.1 Preparación de muestras de alimentos

Muestras negativas (control).

En los casos generales solo la contaminación artificial es usada y el analito diana no se demostrara en alimentos sin inocular. Tomar un número adecuado de muestras de



conformidad con el anexo J y analizar para confirmar. Los controles negativos también se estipulan durante el juicio.

Muestras positivas contaminadas con analito diana.

Para algunos estudios cuantitativos, por ejemplo cuenta bacteriana total, levaduras y mohos, coliformes, etc, muestras contaminadas naturalmente que contienen el analito diana y/o microflora representante deben ser usados para estudios colaborativos. A falta de un número adecuado de muestras contaminadas naturalmente, o donde el nivel de contaminación es demasiado estrecho o inadecuad, pueden ser usadas muestras contaminadas artificialmente. Las muestras deben ser contaminadas con la segunda o tercera opción señalada en el anexo C.

Cuando se utilice material de referencia (anexo C) es responsabilidad de la organización del laboratorio para enviar tanto los materiales de referencia cómo los detalles del procedimiento de la inoculación a cada laboratorio colaborador.

En ambos casos de métodos cualitativo y cuantitativo, el alimento y la muestra analito/microorganismos debe ser capaz de ser homogeneizada y mantenerse estable tanto en el transporte y duración del análisis. Homogeneidad y estudio de estabilidad deben ser realizados antes de despachar el material de estudio del laboratorio organizador.

Como se indica en el anexo C, la muestra de alimento debe contener un fondo representativo de microflora o componentes interferentes que también deben mantenerse estables durante el transporte y duración del análisis.

Un método alternativo debe ser probado utilizando como mínimo un tipo de alimento, elegido entre las categorías de alimentos previamente definidos en el anexo B. La calidad e idóneamente

Con base en los estudios comparativos, las características de la cepa microbiológica elegida (Ver anexo G) que se utiliza para validar un método debe ser representativa del género/especie que se busca, por ejemplo, la tasa de crecimiento, características antígeno y sensibilidad de agentes hostiles etc.

H.2 Transporte de la muestra

La organización del laboratorio debe definir el tipo de alimento que se usara y comprobara que el transporte de los envases será adecuado para el viaje.

Las muestras individuales deben ser selladas por duplicado para asegurar que cualquier fuga de muestra no afecte la integridad del resto de las muestras.

Cada laboratorio colaborador es responsable de suministrar al laboratorio organizador los datos pertinentes que aseguren que la distribución de las muestras para el estudio cumple con los reglamentos postales internacionales y nacionales.

El laboratorio organizador debe publicar una prueba y distribuir los métodos mediante el envío de un conjunto de muestras a un laboratorio colaborador solicitando su regreso



inmediato, con el fin de determinar los efectos de las condiciones de tránsito (la seguridad y estabilidad microbiológica) antes del estudio. Los efectos negativos deben ser evaluados y medidos para minimizar/evitar que se repitan.

Con el fin de mantener el analito diana o microflora de origen natural sin cambios durante la distribución puede ser necesario el uso de condiciones refrigerantes o congelantes durante el transporte a los laboratorios colaboradores. Las condiciones de envasado y el mejor método de transporte deben ser determinados por el laboratorio organizador. Lo ideal sería un medio adecuado para el monitoreo de la temperatura de las muestras durante el tránsito.

Para cada laboratorio, un paquete adicional, identificación de las muestras de ensayo, para la medición de la temperatura en el recibo deberá ser proporcionada.

H.3 Organización del estudio colaborativo (Ver ENV ISO/TR 11133-1)

Protocolos de operación.

Procedimiento estándar de operación de trabajo debe ser distribuido a los colaboradores para que formulen comentarios y se familiaricen antes de iniciar el ensayo. Un protocolo final deberá ser emitido antes de la evaluación.

Confirmación de calidad de la muestra.

Cada laboratorio colaborador deberá ser instruido para realizar la enumeración del conteo total de bacterias de una muestra designada. Un método estándar para la enumeración deberá ser presentado a cada colaborador por el laboratorio organizador.

Métodos alternativos y métodos de referencia.

Los operarios que realizan el análisis en cada laboratorio colaborador deberán ser calificados a un nivel apropiado (y capacitarlo, si es necesario) y conozca el método alternativo y el método de referencia antes de comenzar el ensayo.

Reactivos y condiciones de operación.

Los factores adicionales, por ejemplo la calidad y composición de los medio de cultivo y reactivos, el control de la temperatura de incubación etc. Puede tener un profundo efecto sobre el resultado de las pruebas. Por esta razón, la variabilidad se reduce al mínimo (por ejemplo, envió de medios/reactivos a todos los colaboradores), o bien tener en cuenta la interpretación de los datos.

El grado de tolerancia permitido, en todos los aspectos del análisis, por ejemplo tiempos, temperaturas, masas, recuento total en placa y días de análisis, deberán ser declarados en el protocolo. Una clara advertencia se emite si no se permiten tolerancias.

Orientación.

El laboratorio organizador deberá ser avalado para proporcionar asesoramiento y orientación a los colaboradores durante el periodo de la validación.



Colección de datos.

El laboratorio organizador deberá desarrollar un cuestionario para que genere información con respecto a los puntos críticos del proceso. Todo colaborador deberá registrar detalles como medios, pH, tiempos de incubación, inicio y fin de incubación, datos de control de calidad, estado de llegada de muestras, tiempo de llegada, temperatura de llegada, condiciones de almacenamiento /tiempo, etc. El contenido de cuestionario deberá ser convenido, tanto por el laboratorio organizador como por el fabricante del método alternativo, con el fin de cumplir los pasos críticos del ensayo o procedimiento de la prueba de los métodos alternativos.

Confirmación de calidad de muestras de prueba.

Las alícuotas representativas de la muestra deberán ser analizadas por el laboratorio organizador el día del análisis programado para comenzar a confirmar la presencia y homogeneidad del analito diana. Las muestras, tenidas previamente bajo condiciones ideales, deberán también ser analizadas por el laboratorio organizador el día del comienzo del análisis por el laboratorio colaborador. Estos análisis solo se utilizarán para confirmar el procedimiento de inoculación y estabilidad del analito. El resultado no deberá ser usado en la estadística de evaluación del método bajo prueba.

Anexo I(Normativo)

La determinación de que los controles negativos son libres de analito blanco.

(Véase la referencia: 5.1.2.2)

Con el fin de comprobar la ausencia del microorganismo blanco en el producto para su uso, ya sea como controles negativos o antes de la inoculación artificial, el análisis de los materiales de prueba es esencial. Cuanto mayor sea el número de sub-muestras



examinadas mayor es la seguridad para una determinación fiable. Muestras de control negativo también se confirman durante el estudio.

Hay una probabilidad de que niveles muy bajos de analito (número de microorganismos) no son detectados por la cantidad de muestra analizada, o si está presente no pueden ser distribuidos homogéneamente a través de la muestra.

Por motivos estadísticos, si se prueban ocho muestras, la probabilidad de detectar la presencia de 1, 2, 3, 4 o 5 células por 600 g de producto son 0,33; 0,57; 0,72; 0,83 y 0,90, respectivamente.

Se divide el número de muestras analizadas en dos categorías:

Por lo menos se analizaron seis muestras antes de iniciar el experimento, con el fin de comprobar la ausencia de los microorganismos, el número está determinado por el protocolo de ensayo;

Más muestras negativas se examinan durante el experimento, el número está determinado por el protocolo de ensayo.


Muestras 1 a 8 replicas a nivel 1.

1 parte de la muestra + "y" partes del medio (por

ejemplo 1:9 m/v).

Homogeneización.

1er estado de cultivo (por ejemplo pre-enriquecimiento).

Incubación.

División.

Método de referencia 2°

estado.

Continue con analisis de acuerdo a su protocolo.

Método alternativo 2° estado.


Muestras 2 a 8, en nivel 1, cada ensayo individual para

muestras 1.

1 parte de la muestra + "y" partes del medio (por

ejemplo 1:9 m/v).

Homogeneización.

1er estado de cultivo (por ejemplo pre-enriquecimiento).

Incubación.

División.

Método de referencia 2°

estado.


Método alternativo 2° estado.



Anexo J(Normativo)

Replicación de muestras por estudios inter-laboratorios de métodos cualitativos.

(Ver referencia: 5.2.1.2)

J.1 Caso 1 – Cuando el primer paso de cultivo del método de referencia como del método alternativo son idénticos.

Ocho muestras replicadas en cada uno de los tres o cuatro niveles de contaminación son examinadas por cada método.



J.2 caso.2 – La replicación es por duplicado cuando el primer paso de cultivo de cada método difiere.

Ocho muestras replicadas en cada uno de los tres o cuatro niveles de contaminación son examinadas en cada método.




Duplicado.


Muestra 1 + 1er medio de cultivo de referencia.




Método dereferencia.

Muestra 1 + 1er medio de cultivo alternativo.

Muestra 2 + 1er medio de cultivo alterativo.




Anexo K(Normativo)

Consideración de datos


Cuando el estudio inter-laboratorio es completo, toda la información en las hojas de datos y los resultados se presentaran al laboratorio organizador y examinado de la siguiente manera:

Comprobar que las muestras/kits de pruebas, etc., no fueron dañados durante el transporte;

Entregar la marca y número de lote de los medios utilizados. El laboratorio experto debe comprobar si la formula está en conformidad con el método de referencia.

Cuando se produce daño a la muestra deberán ser ignorados. La contaminación cruzada de otras muestras en el mismo embalaje también deberán ser consideradas;

Ignorar los datos si las condiciones de transporte quedan fuera de la tolerancia aceptable especificada;

Ignorar los datos si los valores de numeración quedan fuera de la tolerancia aceptable especificada;

Ignorar los datos si el cuestionario sugiere que el laboratorio se ha desviado de cualquier protocolo estándar o condiciones de operación críticas.



Anexo L(Informativo)

Estudio inter-laboratorios de métodos cualitativos: criterios de conformidad, concordancia y concordancia odds ratio (razón de probabilidades)

(Ver referencia: 5.2.3)

L:1 General

Los criterios de exactitud, sensibilidad y especificidad (ver 5.2.2) realmente no abordan la variabilidad del método dentro y entre los laboratorios (precisión del método).

Este anexo establece criterios adicionales (según, la concordancia y concordancia odds ratio) que pueden ayudar a abordar esta variabilidad. Criterios de repetibilidad y reproducibilidad miden la diferencia probable entre dos muestras enviadas a cualquiera de los mismos o diferentes laboratorios. Dado que la diferencia para los datos que no es cuantitativa no se puede utilizar, las estadísticas de los métodos cualitativos en cambio se basan en la probabilidad (expresada como un porcentaje) que dos muestras producen el mismo resultado.Estos criterios han sido desarrollados por el proyecto europeo SMT CT 96 2098 financiado por la Comisión / DG XII Europea para validar los seis principales métodos normalizados utilizados en microbiología de los alimentos (coordinador: Dr. C. Lahellec, AFSSA, Francia) [9].

Los cálculos se ilustran por medio de la siguiente tabla (ver Tabla L.1).

TABLA L1. – Ejemplo de valores numérico



Número de réplicaLaboratori

o1 2 3 4 5 Números positivos (fuera de 5)

1 + + + + + 52 + + + + + 53 + + + + + 54 + + + + + 55 - - + + + 36 + + + + + 57 - - + + + 38 + + + + + 59 + + + + + 510 + + + + + 5

Los datos que aparecen en esta tabla son sólo para un nivel de un tipo de alimento. En la práctica, un ensayo colectivo sería más grande, un conjunto de datos más pequeño hace que sean más fácil de explicar los cálculos.

L.2

L.2.1definición

La conformidad es el porcentaje de posibilidades de encontrar el mismo resultado (es decir, tanto negativos o positivos) a partir de dos porciones de ensayo idénticas, analizadas en el mismo laboratorio, en condiciones de repetibilidad (es decir un operador usando el mismo aparato y los mismos reactivos en el intervalo de tiempo más breve posible).

Por consiguiente, la conformidad es el equivalente de la repetibilidad de los métodos cuantitativos.

L.2.2 Cálculos

Para derivar la conformidad de los resultados de un estudio entre laboratorios, la probabilidad de que dos muestras den el mismo resultado se calcula para cada laboratorio participante, y esta probabilidad se promedia para todos los laboratorios.

Por ejemplo. Ver tabla L.1 y L.2.

Para los laboratorios (como el laboratorio 1), donde se encuentran todas las muestras positivas, la mejor estimación de la probabilidad de obtener el mismo resultado es claramente 1,00 o 100%.

Para los otros (en el ejemplo de los laboratorios 5 y 7) la probabilidad de que una réplica será positivo es 3/5 = 0,60 y la probabilidad para obtener de un par de repeticiones positiva es (0,62 = 0,36). Hacer lo mismo para la probabilidad de que un par de réplicas sean negativas (0,42 = 0,16). A continuación, añadir estas dos figuras juntas para obtener la probabilidad general de que dos réplicas darán el mismo resultado (0,36 + 0,16 = 0,52).



Hacer esto para todos los laboratorios (ver tabla L.2).

TABLA L.2.- cálculos de concordancia

Laboratorio

Número de

positivos

Probabilidad de

positivos

Probabilidad de

dos muestras positivos

Probabilidad de

negativos

Probabilidad de

dos muestras negativo

s

Probabilidad de

dos muestras diferentes con el mismo

resultado1 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,002 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,003 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,004 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,005 3 0,60 0,36 0,40 0,16 0,526 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,007 3 0,60 0,36 0,40 0,16 0,528 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,009 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,00

10 5 1,00 1,00 0,00 0,00 1,00Media: 0,904=90,

4%

El acuerdo es el promedio (media) de las probabilidades de que dos repeticiones dan el mismo resultado para cada laboratorio: en este caso es de 90,4%.

L.3 Concordancia

L.3.1 Definición

La concordancia es el porcentaje de posibilidades de encontrar el mismo resultado para dos muestras idénticas analizados en dos laboratorios diferentes.

Por consiguiente, la concordancia es el equivalente de la reproducibilidad de los métodos cuantitativos.

L.3.2 Cálculos

Para calcular la concordancia de los resultados de un estudio inter-laboratorios, tome cada una de las réplicas en cada laboratorio participante, sincronizarlo con resultados idénticos de todos los laboratorios.

La concordancia es el porcentaje de todos los vínculos que dan los mismos resultados en todos los posibles emparejamientos de datos.

Por ejemplo, ver tablas L.1 y L.3.



Tomar cada réplica de cada laboratorio en turno, comience con la primera réplica de laboratorio 1, que es positiva. Esta puede ser emparejada con cualquiera de las 45 réplicas de los otros laboratorios, y todas menos 4 de estas parejas (aquellos con dos repeticiones de los laboratorios 5 y 7) dividirlo (es decir, dar un par de positivos), 41 pares por lo tanto dan el mismo resultado.

Lo mismo ocurre con las otras cuatro repeticiones del laboratorio 1, por lo que hay un total de 225 (5 x 45) entre laboratorios de emparejamientos de réplicas que implican al laboratorio 1, de los cuales 205 (5 x 41) dan el mismo resultado.

Lo mismo se aplica a los otros laboratorios con todas las repeticiones con resultado positivo.

Para el laboratorio 5, con 3 réplicas de 5 positivas, con 2 repeticiones negativas de cada partido con sólo 2 otros replicas negativas del laboratorio 7, mientras que el 3 positivos repeticiones de cada partido con 43 repeticiones positivas. Así, el número total de pares con el mismo resultado es 133 (2x2 + 3x43).

TABLA L.3.- Cálculo de concordancia

Laboratorio Número de positivos

Inter-laboratorio con los mismos

resultados

Tota lnter-Laboratorio emparejado

1 5 205 2252 5 205 2253 5 205 2254 5 205 2255 3 133 2256 5 205 2257 3 103 2258 5 205 2259 5 205 225

10 5 205 225Total 1906 2250

La concordancia es el porcentaje de todos los emparejamientos de los duplicados que dan el mismo resultado, en este ejemplo es de 84,7% (1 906/2 250 x 100).

L.4 Concordancia odds ratio

L.4.1 General y definición.

Si la concordancia es menor que el acuerdo, indica que dos muestras idénticas son más propensas a dar el mismo resultado si se analizan por el mismo laboratorio, que si se analizan por otro diferentes, lo que sugiere que puede haber variabilidad en el rendimiento entre los laboratorios.



Esta es la misma situación que cuando la reproducibilidad es mayor que la repetibilidad de un método cuantitativo.

Por desgracia, la magnitud de la concordancia y conformidad es fuertemente dependiente del nivel de precisión, por lo que es difícil de evaluar fácilmente el grado de variación entre laboratorios.

Por tanto, es útil para calcular la concordancia odds ratio (COR), que se define de la siguiente manera:

COR=conformidad X (100−concordancia)

concordancia X ¿¿

L.4.2 Pruebas de significancia

Un valor de odds ratio de 1,00 sería el caso si conformidad y concordancia fueran iguales, y cuanto mayor sea el odds ratio, la variación es más predominante entre laboratorios.

Sin embargo, los valores por encima de 1,00 se pueden producir por la existencia de variación, por lo que una prueba de significancia estadística se debe utilizar para confirmar si las pruebas para la variación adicional entre laboratorios son convincente.

La "prueba exacta" es la mejor prueba recomendada10. La filosofía detrás de este tipo de pruebas es que las probabilidades de ocurrencia se calcula para todos los conjuntos de resultados replicados que podría haber producido el número total de positivos y negativos.

Por ejemplo, ver Tabla L.1.

Con un total de 46 positivos y 4 negativos, los arreglos posibles son dados como columnas en la tabla L.4.

TABLA L.4. - Posibles arreglos de repeticiones positivas (columnas) para dar un total de 46 positivos

4 3 3 2 14 4 3 4 54 4 5 5 54 5 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 5

10 Esta prueba puede ser realizada usando paquetes estadísticos como SAS®.



La disposición actual se muestra en negrita (tercera columna) en la Tabla L.4. En la prueba se suma la probabilidad P de todos los posibles arreglos que muestran evidencia de variación entre laboratorios donde la disposición es real – como todas las permutaciones de las tres columnas de la derecha.

Si esta probabilidad es menor que el valor convencional de 0,05 o 5%, es poco probable que este grado de variación entre laboratorios podría haber ocurrido por casualidad y por lo tanto, se concluye que existe una variación significativa en el rendimiento entre los laboratorios.

En el ejemplo de la tabla L.4, P=0,039 lo que indica que la variación entre laboratorios es significativa al nivel del 5%.

Cuando los programas informáticos para la "prueba exacta" no están disponible, un análisis de chi-cuadrado ordinario por tablas de contingencia, se puede utilizar como una alternativa. Los resultados de esta prueba son menos fiable que la "prueba exacta" con el número de repeticiones, así que por lo general se utiliza en estudios de colaboración, pero las simulaciones sugieren que los resultados proporcionan una guía razonable a la significancia de las diferencias entre laboratorios.

Con cualquiera de las pruebas, se deberá tener en cuenta que la capacidad de detectar diferencias entre laboratorios es dependiente del número de laboratorios y del número de muestras replicadas analizadas en cada laboratorio. Un resultado de una prueba no significativa no debe tomarse en el sentido de que el rendimiento no varía entre laboratorios, sino más bien que no se han probado tales diferencias, lo que es particularmente cierto cuando el valor P es sólo justo por encima de 0,05. La solución ideal sería citar la odds ratio con un error estándar o límites de confianza, pero la distribución de la odds ratio es muy desigual por lo que es muy difícil producir límites fiables.



Anexo M(Normativo)

Replicación de muestras para la determinación de exactitud relativa de métodos cuantitativos

(Ver referencia6.2.1.2.1)

M.1Caso 1- Cuando la referencia y los métodos alternativos usan las mismas diluciones decimales de cada sub-muestra.

El mismo número de sub-muestras (al menos 2 y preferiblemente de 5 a 10) se cultivan por ambos métodos.


10 g de muestra + 90 mL de

diluyente y homogeneizar.

Primera dilución decimalde

submuestras.

División.


Plato1

Plato 2


Plato 1

Plato 2

Segunda dilución decimal.

División.


Plato 1

Plato 2


Plato 1

Plato 2

1mL + 9 mL


M.2 Caso 2- cuando solo el método de referencia requiere dilución decimal.

Mismo número de sub-muestras (al menos 2 y preferentemente de 5 a 10) se cultivan por ambos métodos.


10 g de muestras + 90

mL de diluyente

Método de referencia

Primer sub-muestra

Plato 1

Plato 2

Segunda dilución decimal

Plato 1

Plato 2

Segunda sub-muestra

Segunda sub-muestra

Plato 1

Plato 2

Segunda dilución decimal

Plato 1

Plato 2Etc.


Anexo N(Normativo)

Ejemplos de situaciones aceptables e inaceptables y alcance de mediciones de estimación de la regresión lineal por métodos cuantitativos.


N.1 situación inaceptable


Figura N.1 – Falta de puntos centrales. Figura N.2 – Mal reparto.


N.2 Situación aceptable

N.2 Situación aceptable


Figura N.4 – Para uso en una escala larga, solo si SD aumenta con y.

Figura N.3 – Rango demasiado estrecho para cubrir 0 a 1.



Figura N.5 – Situación aceptable.


Anexo O(Normativo)

Evaluación de la linealidad de los métodos cuantitativos de representación gráfica.


O.1 Casos de no linealidad

O.2 Casos de linealidad


Figura O.1 Figura O.2 Figura O.3

Figura O.4 Figura O.5


Anexo P(Normativo)

Detección y cuantificación de límites para los recuentos


P.1 Límites de detección

Normalmente, en la presencia de incertidumbre del método, relacionadas por ejemplo con la muestra usada, la observación de solo una unidad formadora de colonias (UFC) en el medio no es eficiente para suponer la presencia del analito. En este bajo nivel, es necesario una división del fenómeno en la presencia (1 o más UFC) y ausencia (sin UFC), como para los métodos cualitativos. Por lo tanto, el proceso sigue ya sea la ley de poisson (bajo o altos índices) o una binomial (tasas intermedias) a lo largo de la frecuencia de presencia (np).

Considerando que un control negativo teórico no da ningún resultado de presencia del analito, un límite de detección de una contaminación bajo (Poisson) se alcanza por lo menos presencias np correspondientes a los niveles de decisión LC = 3 (a 1 - α = 95%) o 5 (al 99%). Los límites de detección se obtienen incluyendo un error tipo 2 error estadístico β por ejemplo LOD = 7 en 1-lados α=5% y 1-β>90%.

La ley de Poisson da el número mínimo de np de resultados positivos entre n (proporción p) para obtener, con el fin de llegar a una declaración positiva significativa en el nivel de confianza 1-α (Ver Tabla P.1):

TABLA P.1. – números mínimos para np de resultados positivos entre n≥

n np para 1 – α = 0,95

np para 1 – α = 0,99

1 1 12 2 23 2 34 3 3



5 a 15 3 416 y por final 3 5

P.2 Límite de determinación



La aplicación de la regla de la AOAC’s que cuanta podría dar LOQ ≥ 100… una distribución de priori Poisson se utiliza en esta ISO 16140 con s(n) = √n, y CV(n) = s(n)/n = 1/√n ≤ 10%, lo que da n ≥ 100.

P.3 volumen de muestra

Hasta ahora, el volumen de la muestra no ha sido tomado en consideración, la división de una muestra en muchas sub muestras y el uso de todas ellas para detectar la presencia de contaminación, requiere la demostración de al menos 3(o 5) UFC en la totalidad de la muestra. Por lo tanto el límite anterior deberá ser proporcionado como un número de UFC por unidad de muestra. Se repetirá el muestreo hasta que se obtenga al menos tres colonias con el fin de determinar una estimación final del volumen.

En general, se necesita un volumen mínimo dado para la determinación microbiológica; pero también podría ser alcanzado por dilución. Por lo tanto, un límite teórico L de UFC en el medio, es finalmente corregido en la dilución multiplicándolo por el factor de dilución K, por ejemplo k L. L=7 UFC/mg de 1 en 10 de una muestra sólida tendría un límite L=70 UFC/mg en la muestra sólida.




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.4.1

)

S R 4, 1, 1, 1, 1, 2, 0, 0, 2, 0, 1, 1, 3, 1, 1, 0, 1,

R Q 4,8

0,3

0,9

0,2

0,8

1,7

0,8

1,5

1,2

1,0

0,9

0,4

3,0

1,0

0,1

0,8

0,9

Q P 5, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 1, 1, 1, 0, 0, 2. 0, 0, 1, 0,

P O 5, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 2, 0, 0, 1, 0, 1, 1, 0,

2)

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2,1

2,7

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3,9

4,6

1,8

4,1

2,1

2,5

1,9

2,8

3,0

3,8

2,6

N M 5, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 2, 0, 1, 0, 2, 0, 0, 0, 1, 0,

M L 5, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 2, 0, 2, 0, 2, 0, 0, 0, 1, 0, Et

L K 3,7

1,4

2,0

1,3

1,9

2,8

0,2

0,4

2,3

2,0

1,5

4,1

2,1

1,2

1,0

0,2

1,5

…=

ME

DIA

K J 6, 0, 0, 0, 0, 0, 2, 2, 2, 0, 0, 1, 0, 1, 1, 2, 0,

J I 3,3

1,9

2,5

1,8

2,4

3,3

0,7

2.7

0,4

2,5

2,0

4,6

2,6

1,7

1,5

0,7

2,0

I H 4,00

1,24

1,80

1,15

1,73

2,66

0,70

2,08

0,22

1,81

1,35

3,92

1,93

1,05

0,87

0,03

1,35 …

3)

Cop

iar e

n la

tabl

a.

4)

Elim

inar

de

la d

iago

nal p

rinci

pal.

H G 6, 1, 0, 1, 0, 2, 3, 0, 2, 0, 1, 1, 0, 1, 1, 2, 1,

G F 5,7 Et

0,4

0,0

0,5

0,9

1,7

2,4

0,3

1,9

0,0

0,3

2,1

0,2

0,6

0,8

1,7

0,6

= M

ED

IA (D

7:D

22)

= M

ED

IA (D

23:S

23)

= 1,

1926

*D25F E 5,15

=|E

5-0,

090,

65

0,58

1,51

1,15

1,85

0,93

1,37

0,65

0,20

2,77

0,78

0,11

0,29

1,12

0,78

1)

Tran

spos

ició

n de

dat

os d

e la

E B

5,80

=|E

5-0,

56

0,65

0,07

0,86

1,80

2,50

0,28

2,02

0,00

0,45

2,12

0,13

0,76

0,94

1,77

0,76

D A

5,24

=|D

5-

0,56

0,09

0,49

1,42

1,24

1,94

0,84

1,46

0,57

0,11

2,68

0,69

0,20

0,38

1,21

0,69 ↓

0,91

1,08

Ope

raci

ones

(Exc

el

C Tra

→ | | |E

tc.

ME

B DA

T ↓5,

245,

805,

155,

736,

664,

003,

306,

083,

785,

815,

357,

925,

935,

054,

874,

03 16

A a b e f g h i j k l m n o p q r n

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34


Anexo R(Normativo)

Cálculos con método de regresión

(Ver referencias: 6.2.1.3.2.1; 6.2.1.4.2; 6.2.1.4.3; 6.2.2.1; 6.2.3.3)

R.1 Notaciones y cálculos preliminares

i es el nivel (concentración de analito), incluyendo el cero si no transformado en los registros (i = 1 a q);

q es el número de niveles

j es una repetición hecho con el método alternativo, así como con el método de referencia (j = 1 a n).

n es el número de repeticiones, un mismo número para cada nivel i.

N es el número de muestras (N = qn).

Un priori es utilizar el eje x para el método de referencia y el eje y para la alternativa uno. Es una opción más adecuada en S.2 si es necesario.

R.1.1 Estimar el nivel de significa en cada nivel de la muestra probada, para el método de referencia (x i) y la alternativa uno (y i).

Para cada muestra nivel i = 1 to q: x i = 1n∑j=1

n

xij y y 1=1n∑j=1

n

yij

R.1.2 Calcular las desviaciones estándar de repetibilidad en cada nivel, por el método de referencia (Sxi) y el alternativo (Syi).



Desviaciones estándar de repetibilidad en cada nivel de la muestra i = 1 hasta q:

Sxi= √Vxi con Vxi= 1n−1∑j=1

n

(xij−x i)2 para n=2 sxi= |xi 1−xi2|/√2

Syi= √Vyi con Vyi= 1n−1∑j=1

n

( yij− y i)2[ídem]

R.1.3 Calcular la repetibilidad global de desviaciones estándar s r a todos los niveles, por el método de referencia (sr(x)) y el alternativo (sr(y)). Repetibilidad Global de desviaciones estándar sr de todos los niveles es la siguiente:

Sr(x) = √Vwx con Vwx= 1q∑i=1

q

Vxi = dentro de varianza.

Sr(y) = √Vwy con Vwy= 1q∑i=1

q

Vyi = dentro de varianza.

R.1.4 Estimar el medio global de x y y de ambos métodos (i = 1 a q niveles) de la siguiente manera:

x=1q∑i=1

q

Xi y y=¿ 1q∑i=1

q

Yi

R.2 Elección

Elija la regresión lineal ortogonal (R.3, GMFR) [4] o el de mínimos cuadrados ordinarios de regresión lineal (R.4, OLS11):

Elija radio R= sr(alt)/sr(ref).

Si R> 2: Continúe usando el eje x (variable independiente) para el método de referencia y luego utilizar estimaciones OLS (S.4: x = ref).

Si R<½: Use el eje x para el método alternativo y el eje y para el de referencia y, a continuación, utilizar estimaciones OLS (S. 4: x = alt). Intercambiar lo tanto todas las estimaciones x en estimaciones y, y viceversa, es decir {Xi }❑

⇔{Yi },{Sxi }❑

⇔{Syi }, sr(x) ❑

⇔sr(y),

X❑⇔Y .

Si ½ <R <2 (caso de quasi-igualdad de repetición en x y y), uso (ortogonales) estimaciones GMFR (S.3), manteniendo el eje x para el método de referencia.

R.3 Regresión lineal ortogonal (GMFR)

R.3.1Desviación estándar global

11 OLS: Mínimos cuadrados ordinarios.



Cálculo de la desviación estándar global para el método de referencia (Sx) y el método alternativo (Sy) de la siguiente manera:

Sx=√V x con V x=1

N−1∑i=1

q

∑j=1

n

(x ij− x)2

Sy=√V y con V y=1

N−1∑i=1

q

∑j=1

n

( y ij− y)2

R.3.2 Estimación del coeficiente de correlación r de la siguiente manera:

r=V xy

√V x ∙V y con la covarianza V xy=

1q−1∑i=1

q

( xi−x¿)( y i− y)¿

R.3.3 Estimar la intercepción a y la pendiente b de la regresión lineal y= a + bx de la siguiente manera:

Pendiente b = Sy / Sx, intercepción a = y−b x

R.3.4 Estimar la desviación estándar residual Sy : x para el punto estimado por regresión.

sy : x ≈SMy : x √n con SMy: x=√∑i=1

q

( y i− y i)2

q−2 para el punto estimado por la regresión:

y i=a+b x i; (i=1 a q)

R.3.5 Estimar la desviación estándar sa de la intercepción a y la prueba de hipótesis a=0

sa≈SMy : x=√ 1q+ x2

(q−1)∙V x

Prueba de a = 0: t=|a|/sa con (q-2) grados de libertad;

Una tabla t-student da p(t)=o{a=0}: valor critico ≈ 2 por 2 caras ∝=0,05.

R.3.6 estimar la desviación estándar Sb de la pendiente b y la prueba de hipótesis b=1.

sb≈SMy : x

Sx √q−1

Prueba de b=1: t=|b-1|/Sb con (q-2) de la siguiente manera;

Una tabla t-student da p(t)=p{b=1}: valor critico ≈ 2 por dos caras ∝=0,05.

R.4 Ordinaria de mínimos cuadrados de regresión lineal (OLS)12

12 Función estadística de Excel para ser usada: CORREL ({x});{y}) para el coeficiente de correlación, COVAR ({x});{y}) para la covarianza, pero esta última función es parcial y ({y};{x}) y se debe multiplicar por n/(n-1), con n=COUNT({y}), a continuación pendiente ({y};{x}) e intercepción ({y};{x}) siendo las estimaciones para b y a, error TÍPICO ({y};{x}) para el residual SD y, TDIST(t;df;colas9 para la probabilidad pro la distribución t Student y FDIST(F;df1;df2;colas) para la probabilidad de la distribución F-Fisher.



R.4.1 Desviaciones estándar globales:

Sx= √V x conV x=n

N−1∑i=1

q

(Xi−x)2

Sy= √V y conV y=1

N−1∑i=1

q

(Yij− y )2

R.4.2 Coeficiente de correlación:

R=V xy

√V x ∙V y con la covarianza Vxy= 1

N−1∑i=1

q

∑j=1

n

(Xi−X ¿)(Yij−Y )¿

R.4.3 Pendiente b = V xy

V x =r

S ySx

, intercepta a = y−b x para la regresión lineal y= a+bx

R.4.4 Desviación estándar residual sy : x=√∑k=1

N

¿¿¿¿ desde los puntos estimados por la

regresión:

Yk= a+b xK (k=1 para N, N=qn)

R.4.5 La desviación estándar del intercepto a: sa= sy:x √ 1N

+ X2

(N−1) ∙V x

Prueba de a = 0: t = | a |/ sa con (N - 2) grados de libertad;

Tabla de Student-t da p (t) = p {a = 0}, valor crítico ≈2 de 2 lados α= 0,05.

R.4.6 Desviación estándar de la pendiente b: Sb= Syx/√((N-1)Vx)

Prueba de b = 1: t = | b - 1 | / sb con (N-2) grados de libertad;

Tabla de Student da p(t)= p{b=1}; valor critico ≈ 2 para 2 lados α=0.05.

R.5 Prueba de linealidad (no falta de ajuste)13

F= ((N-2)((S^2 yx)/Vwy)-q(n-1))/(q-2)

Con vnum= q-2 grados de libertad para el numerador F y vden= q(n-1) para este denominador.

De la tabla F Snedecor, p(F,vnum, vden) y valores críticos F(p) para p=α=0.05 puede ser obtenido como se muestra en la Tabla R.1:

TABLA R.1 — p(F, vnum, vden) y valores críticos F(p) para p=α=0.05.

Fcrit n=2 n=5q=5 5.4

13.10

13 Este valor no es proporcionado por Excel (ver ISO 11095).



q=6 4.53

2.78

La relación no es lineal si F>Fcrit (αnum, αden) o p(F, αnum, vden)<α

R.6 Limites de confianza (CL)

R.6.1 Limites de confianza (CL) (<yU/L>) de un punto previsto <y> en cualquier punto x:

CL(<yU/L>)= a+bx± t s(<y>), con s(<y>) = Syx √(1+1/N 〖 (x-x ̅) 〗 ^2/((N-1)∙V_x ))>S_(y:x)

Donde la t es el valor de Student para dos lados de nivel de confianza α y (N-2) grados de libertad.

R.6.2 Limites de confianza inversos CL(<XU/L>) y <x> para una muestra y desconocida:

CL(<XU/L>) ≈ [y - a ± t s(<y>)]/b con s(<y>) en <x> = (y - a)/b,

Donde la t es el valor de Student para dos lados de nivel de confianza α y (N-2) grados de libertad.

Anexo S(Normativo)

Ejemplo de cálculos para métodos cuantitativos.

(Ver referencia: 6.2.1.3.2.1)

S.1 Caso 1 – ejemplo de regresión OLS (comparación del método alternativo con el método de referencia).

Método de referencia Método alternativoIdent Rep. 1 Rep. 2 M x 1 Sx1 Rep. 1 Rep. 2 M y 1 Sd y1

1 4,073 4,214 4,143 0,100 4,342 4,652 4,497 0,2192 5,758 5.778 5,768 0,014 5,720 6,289 6,005 0,4023 6,828 6,816 6,822 0,008 6,227 6,252 6,239 0,0184 6,992 7,000 6,996 0,006 6,737 7,719 7,228 0,6945 7,856 7,737 7,796 0,084 6,976 7,932 7,454 0,676

MED= 6,822 0,014 MED= 6,239 0,402Robusto. Swx= 0,021 Robusto. Swy = 0,596

Q(niveles) = 5

N(replicas) = 2



V(df) = 3 Sdwy/Swy = 28,14

Elección: método de referencia en eje x, regresión clásica y(x).

Regresión: comparación del método alternativo con una referencia.

(Por Excel: herramientas/análisis de datos/regresión)

Métodos Referencia Alternativo Y

=STDEV (Y1:Y2)

Indet Rep. 1 Rep. 2 SdwyPrimera réplicaRep. 1

1 4,143 4,342 4,652 O,2192 5,768 5,720 6,289 0,4023 6,822 6,227 6,252 0,0184 6,996 6,737 7,719 0,6945 7,796 6,976 7,932 0,676

Segunda réplicaRep.2

1 4,143 4,652 Robusto Sw=

0,5962 5,768 6,2893 6,822 6,252 = 1,4826*MEDIA ({Sw }¿4 6,996 7,7195 7,796 7,932

Para el uso de la herramienta de regresión lineal:

A: copiar toso {x}.

B: copiar {y} Rep. 2.

C: usar solo las 2 primeras columnas, para {x} y {y}.

Resumen de salida

Regresión estadísticaMúltiple R 0,9177

R cuadrado 0,8422R cuadrado ajustado 0,8225

Error estándar 0,491 = Srobservaciones 10 = N = qn

N = 2 réplicas


Res

idua

l


Q= 5 niveles

ANOVA

df SS MS F Significancia F

Regresión 1 10,287 10,287 42,701 1,8x10−4

Residual 8 1,927 0,241Total 9 12,214

Coeficiente Error estándar

T stat Valor-P Bajo 95%

Arriba de 95%

Interceptar (a)

1,207 0,792 1,523 0,166 -0,620 3,034

Variable 1 X (b)

0,805 0,123 6,535 1,8x10−4 0,521 1,089

El 95% de intervalos de confianza incluye a = 0 y b = 1.

Falta de ajuste no lineal (no linealidad):

V1 (df num) = 3 = q-2

V2 (df den) = 5 = q(n-1)

Rob. F = 0,142 = [v (Sr/Sw) ^2-v2}/v1

P(rob. F) = 0,931 = FDIST (F:v1:v2)

Concusiones: no falta precisión, ya que 0,52 <b <1,09 y -0,6 <a <3,0 y lineal (p = 0,931)


Línea de ajuste gráfica x Y Previsto Y

Figura S.1

Gráfico residual

Figura S.2


S.2 caso 2 – ejemplo de GMFR/regresión ortogonal

Regresión: comparación del método alternativo con el método de referencia

Método de referencia Método alternativo Residual estimado

Indent

Rep. 1

Rep. 2 M xi Sxi Rep. 1

Rep. 2 M yi SDyi Y En Y

1 3,126 5,161 4,143 1,439 4,342 4,652 4,497 0,219 4,479 -0,0182 5,623 5,914 5,768 0,206 5,720 6,289 6,005 0,402 5,836 -0,1693 6,908 6,736 6,822 0,121 6,227 6,252 6,239 0,018 6,716 0,4774 6,939 7,053 6,996 0,081 6,737 7,719 7,228 0,694 6,862 -0,3665 8,657 6,936 7,796 1,217 6,976 7,932 7,454 0,676 7,530 0,076

s(M x) = 1,408

s(M y) = 1,176

M = 6,305

0,206 M = 6,285

M = 0,000

MED = 6,882

0,305 MED = 6,239

O,402

robust.Swx = 5 Robus. Sdwy

= 0,596

q (niveles)

= 5 Sdwy/Swx

n (réplicas)

= 2 1,95


Probabilidad normal gráfica

Figura S.3


v (df) = 3

Alternativa: método de referencia en eje X, referencia ortogonal.

Con promedio:

r(M) = 0,9642 Sr(M) = 0,363

Sr(y) = 0,514

s t:H p (t:H) Hb = 0,835 0,129 1,27

70,291 1

a = 1,019 0,830 1,228

0,307 0

Falta de ajuste no lineal (no linealidad)

V1 (df num) = 3 = q-2

V2 (df den) = 5 = q(n-1)

Rob. F = 0,315 = [(qn-2){Sr(y)/Sy) ^2-v2}/v1

P(rob. F) = 0,8144 = FDIST (F:v1:v2)


Línea de ajuste gráfica x Y Previsto Y

Gráfico residual

Figura S.4 Figura S.5


Anexo T(Normativo)

Estudio colaborativo – resultados de la prueba anillo con duplicados

R = 2 replicas

Numero de laboratorios, n = 16



MEDIANA {…} MED = 5,30 0,83

Para Sn robust. Sb = 1,08

K2 = 1,4826

K2*MEDIANA {Sw} robust.s (r) = 1,24

SQRT (Sb^2+((Sr^2)/2)) robust.SR =1,39

FDIST (2*(Sb/Sr)^2;n-1;n) p(F) = 0,207


Laboratorios Rep. 1 Rep. 2 M Sw1 4,30 6,18 5,24 1,332 5,60 6,00 5,80 0,283 5,60 4,70 5,15 0,644 6,72 4,74 5,73 1,405 7,06 6,25 6,66 0,576 4,70 3,30 4,00 0,997 3,30 3,30 3,30 0,008 7,55 4,60 6,08 2,099 4,26 3,30 3,78 0,6810 5,60 6,01 5,81 0,2911 5,00 5,70 5,35 0,4912 8,76 7,08 7,92 1,1913 6,26 5,60 5,93 0,4714 6,79 3,30 5,05 2,4715 3,30 6,43 4,87 2,2116 3,30 4,76 4,03 1,03

MIN = 3,30 3,30 0,00

MAX = 8,76 7,92 2,47


Anexo U(Informativo)

Lista de símbolos y abreviaturas

AC = precisión relativa

Cl = intervalo de confianza

CL = límite de confianza

FP = falso positivo

LC = nivel crítico

LOD = límite de detección

LOQ = límite de cuantificación

NA = acuerdo negativo

ND = desviación negativa

PA = acuerdo positivo

PD = desviación positiva

r = límite de repetibilidad

R = límite de reproducibilidad

RSDr = desviación estándar de la repetibilidad relativa

RSDR = desviación estándar de la reproducibilidad relativa

Sr = desviación estándar de la repetibilidad

SR = desviación estándar de la reproducibilidad

SE = sensibilidad relativa

SP = especificidad relativa

TP = positivo verdadero



Bibliografía

1. EN ISO 9001, Quality management systems – Requirements (ISO 9001:2000).

2. EN ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories (ISO/IEC 17025:1999).

3. ISO 11095, Linear calibration using reference materials.

4. C.Clayton, J.Hines, P.Elkins, Detection limits with specified assurance probabilities, Anal. Chem. (1987), 59, 2506-2514.

5. D.Coleman, J.Auses, N.Grams, Regulation - From an industry perspective or Relationships between detection limits, quantitation limits, and significant digits, Chemometrics & Intell.Lab.Syst. (1997), 37, 71-80.

6. L.A. Currie, Limits for qualitative detection and quantitative determination: Application to radiochemistry, Anal. Chem. (1968), 40, 586-593.

7. DRAPER Norman R., YANG Younghong (Fred); Generalization of the geometric mean functional relationship, Comput.Statist. & Data Anal. (1997), 23, 355-372.

8. A.Hubaux, G.Vos, Decision and detection limits for linear calibration curves, Anal.Chem. (1970), 42,8, 849-855.

9. Rousseeuw Peter J., Croux Christophe, Alternatives to the median absolute deviation, JASA 88, (1993), 424, 1273-1283.

10.Gopal K. Kanji, Statistical tests, Sage publications, (1993).

11.MicroVal Rules and Certification Scheme (1998), published by the MicroVal



secretariat NEN. Nederlands Normalisatie-Instituut (NEN) Vlinderweg 6 P.O. Box 5059, 2600 GB Delft, Netherlands.

12.Langton, SD, Chevennement, R., Nagelkerke, N., and Lombard, B: Analyzing collaborative trials for qualitative microbiological methods: accordance and concordance, International Journal of Food Microbiology (in press).

EN EL APARTADO DE BIBLIOGRAFIA SE DEBE METER LAS NORMAS ISO QUE EN ESTA NORMA SE CITEN, CON EL NOMBRE COMPLETO POR EJEMPLO ISO 16140 E ISO 5735


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