Organización espacial dentro del núcleo

Chr 12, 14 y 15 Todos los Chr territorio aislado no

Hepatocito raton fibroblasto humano es sólido.-canales

nucleoplásmicos

Chromosome territories- Meaburn & Misteli- Nature 445:379, 2007

Visualizacion de sitios de transcripcion

RNA naciente se marca por 15 min con biotina-CTP que luego se revela con 1er Ab y proteina A-oro de 9 nm. RNA pol II se marca en el recuadro con Ab con particulas de oro de 15 nm

CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCION

Iborra et al. J.Cell Science 109: 1427, 1996

2100-2200 sitios de transcripción/núcleo

Sitios de transcripción vistos por microscopia de fluorescencia

celulas incubadas 15 min con BrUTP-fluoresceina

tinción general de DNA

CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCION

2100-2500 sitios por célula

Los principales factores de transcripción están localizados en numerosos dominios pequeños a lo largo del nucleoplasma

BRG1 Oct1

TFIIH GR

E2F-1 TFIIF

Localización de factores de transcripción

Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997

Células HeLa

sitios transcrip: rojo

factor: verde

BRG1

TFIIH

Oct1

E2F1

A

B

C

D

Colocalizacion restringida de los TF con los sitios de transcripcion

Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997

RNA polimerasa II y sitios transcripción

Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997

Br-UTP rojo

RNA pol 0 (fosforilada) verde (A)

RNA pol II verde (B)

RNA pol 0 (phospho) rojo

verde TF

C: BRG1

D: Oct1

E: TFIIH

F: GR (glucocorticoid recep)

Correlacion:

++RNApol con Br-UTP

-- factores transcripcion

A

B

C

D

E

F

Comparación de focos de RNA pol II en tejidos y em MEF

100-300 focos RNA pol

4000 genes siendo transcriptos en células eritroides

E10, embryonic blood; E14, fetal liver erythroid; AS, adult anemic spleen erythroid; Sp, normal adult spleen; Th, adult thymus; Br, fetal brain; MEF: mouse embryonic fibroblasts

Transcription factories are nuclear subcompartments that remain in the absence of transcription- Mitchell & Fraser Genes Dev. 2008 22: 20-25

Figure 2. Punctate localization of RNAPII is maintained in theabsence of transcription. (A) Immunofluorescence of RNAPII in untreatedand DRB- and heat-shock-treated fetal liver nuclei (4H8 orH14 antibody; bar, 4 μm). (B) Average number of foci per opticalsection (4H8) in untreated and DRB- and heat-shock-treated nuclei(n > 45; P = 0.5828; error bars depict SEM). (C) RNAPII was detectedby Western in the saponin supernatant (SS) and pellet (SP) using theARNA-3 antibody. Coomassie staining of histones, retained in thepellet, and globin proteins, extracted by 1% saponin, shows equalloading.

Celulas fetales hepaticas

-sin tratar

- tratadas con DRB (inhibidor elongacion RNApol II)

- tratadas con golpe de calor (inhibidor iniciación)

Conclusión. la RNApol II permanece en compartimentos discretos aun en ausencia de transcripción

Inhibición transcripción genes Hbb

Inhibición por DRB

(5,6-dichlorobenzimidazole)

Chr 7 celulas eritroides de bazo anémico

Genes activos comparten sitios de transcripción

Hbb-b1 globina tipo beta

Eraf : proteina estabilizadora de alfa hemoglobina

Uros: uroporfirinogeno II sintetasa

Igf2: insulin like growth factor 2

Kcnqlot1: long QT intronic transcript

Hba: alpha globina (Chr 11)

Frecuencia de transcripción de genes: RNA FISH (sondas intrónicas)

Uros

Conclusión: Los genes activos pasan por períodos on-off y muchos genes tienen mayores periodos de quiescencia que de actividad. En este caso Hbb-b1 estaria constantemente “activo”

Genes activos comparten sitios de transcripción

Colocalización de genes transcriptos en el Chr 7

Doble RNA FISH -

Hbb-1 Hbb-1Hbb-1Hbb-1 Hbb-1Eraf HbaKcnqlot1Igf2Uros

Conclusión: varios genes activos en una región de alrededor de 40 Mb colocalizan con Hbb-1 a alta frecuencia

células eritroideas de bazo anemico

células eritroideas de bazo anemico

Genes activos comparten sitios de transcripción

Parte 1-Los genes activos se asocian con focos de RNA pol II

RNA inmunoFISH

RNA Hbb-1

RNApol II Ab

células eritroideas de bazo anemico

porcentaje de alelos con señal de transcripción por RNA FISH

´porcentaje de loci que se solapan con RNAP II por DNA FISH

DNA inmunoFISH

DNA Eraf

RNApol II Ab

Conclusión: alelos en activa transcripción están asociados con focos de RNApol II mientras que alelos temporariamente inactivos no lo están

La colocalización entre genes está relacionada con su transcripción?

Genes activos comparten sitios de transcripción

La colocalización entre genes está relacionada con su transcripción?

Parte 2- Los genes en activa transcripcion colocalizan en fábricas transcripcionales

Triple marca DNA-inmunoFISH

Hbb DNA FISH

Eraf DNA FISH

RNA pol II Ab

Triple marca RNA-inmunoFISH

Hbb RNA FISH

Eraf RNA FISH

RNA pol II Ab

Alejamiento de un gen activo de su territorio

DNA FISH

-verde territorio chr 7

- rojo: Hbb

En el caso de Eraf que solo es activo el 29% del tiempo, se encuentra fuera de su territorio el 79% de los casos.

Conclusión: Genes con potencial para ser transcriptos están ubicados preferencialmente fuera de sus territorios, pero esto solo no es sufienciente para ser transcriptos

Tecnología 3C (Capturing Chromosome Conformation)

Análisis de proximidad entre los genes determinada por 3C

Comparación de una célula eritoidea E con cerebro B

Modelo de ocupancia de genes en fabricas de transcripción en presencia y en ausencia de transcripción

Figure 1 4C technology. (a) Outline of 4C procedure. Briefly, 3C analysis is performed as usual, but thePCR step is omitted. The 3C template contains bait (for example, a restriction fragment encompassinga gene) ligated to many different fragments (representing this gene’s genomic environment). The ligatedfragments are cleaved by a frequently cutting secondary restriction enzyme and are subsequentlyreligated to form small DNA circles that are amplified by inverse PCR (30 cycles) using bait-specificprimers facing outward. (b) PCR results separated by gel electrophoresis from two independent fetalliver (L1, L2) and brain (B1, B2) samples. (c) Schematic representation of the location of themicroarray probes. Probes were designed within 100 bp of HindIII sites. Thus, each probe analyzesone possible ligation partner

Tecnologia 4C

Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by 4C- Simonis et al. Nature Genetics 38: 1348, 2006

Los patrones de bandas amplificadas por PCR son similares en distintas muestras del mismo tejido y diferentes a los de otro tejido

Interacciones de largo alcance intracromosomales del gen de beta-globina activa (celulas eritroides E14.5 ) e inactiva (cerebro E 14.5)

El patrón del conjunto de genes con los cuales interactua Hbb en células donde se expresa es completamente distintos del de células en que está inactivo

Gen beta-globina activo interactúa con zonas de genes activos y beta-globina inactiva con zonas de genes inactivo

Ejemplo de interacciones intracromosomales del gen Rad23a de expresión constitutiva en todos los tejidos

Conclusión: semejante patron de interacciones en los dos tejidos.

La interacción se da con zonas de genes activos

Interacción intercromosomal de Rad23a

Conclusión

a- las interacciones intercromosomales en distintos tejidos se conservan mayormente

b- La gran mayoria de las interacciones intercromosomales con Rad23a corresponde a genes activos en higado y en cerebro embrionarios

c-d: los valores de interacción más significativos se dan en zonas de alta densidad de genes

Similar active gene cluster in specialized transcription factories- Xu & Cook- J.Cell. Biol. 181: 615-623, 2008

Abordaje

Objetivo: estudiar si la transcripción ocurre en sitios discretos (fábricas) conteniendo la maquinaria especializada y si esos sitios se especializan en transcribir diferentes tipos de genes

Los minicromosomas replicados se concentran en unos pocos focos

A las 24 h hay unos 8000 minicrosomas, y unos 20 focos

Minicromosomas con promotores idénticos son dirigidos a las mismas fábricas mientras que distintos promotores van mayormente a diferentes fábricas

Los minicromosomas organizarán sus propias fábricas o comparten las fábricas que transcriben idénticos genes del huésped?

Cells were transfected, grown for 8 h (rows 1 – 6), and treated with or without cross-linker. Active and inactive chromatin was separated by ChIP (using an antibody against trimethyl K4 in H3) and the proximity between selected genes was assessed by 3C.

II U2 , U2G ,3 box (II U2 ) II CMV , EGFP ,pA (II CMV )

Genes similares del minicromosoma y del huésped comparten fábricas

Modelos