ORGANOS, CELULAS y ATOMOS

TAMAÑO DE CÉLULAS, SUS COMPONENTES Y PODER DE RESOLUCIÓN DE LOS MICROSCOPIOS

Principios del MICROSCOPIO OPTICO

SISTEMA OPTICO DE UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

COLORANTES FLUORESCENTES UTILIZADOS COMUNMENTE

MICROSCOPIA FLUORESCENTE CON MULTIPLES SONDAS

Célula en mitosis vista con 3 sondas fluorescentes: microtúbulos con anticuerpo

(verde), centrómeros con rojo y ADN de cromosomas condensados con azul DAPI.

INMUNOCITOQUÍMICA INDIRECTA

MICROSCOPÍA CONFOCAL DE FLUORESCENCIA

Comparación entre microscopía convencional y confocal. Embrión de Drosophila

en el estadío de gástrula.

COMPARACIÓN DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO CON UNO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

(TEM, transmission electron microscopy)

Fijadores químicos que se utilizan en microscopíaelectrónica. El osmio se unea lípidos y proteínas y los estabiliza.

En el microscopio óptico las lentes son de vidrio y en el electrónico son bobinas magnéticas. En el electrónicola muestra es colocada en un fuerte vacío (células muertas). Los tejidos se cortan en secciones muy delgadas(1/200 del espesor de una célula). Previamente, se deshidrata y polimeriza la célula con una resina. La imagendepende del contraste que se origina por los electrones que se dispersan en la muestra. Esto depende del númeroatómico (bajo) de los átomos de la célula (C, N, O, H). Se constrasta con plomo, uranio, oro.

CÉLULA DEL MERISTEMA APICAL DE RAIZ DE GRAMÍNEA CONTRASTADA CON OSMIO

Con tetraóxido de osmio puedenidentificarse lípidos. Una parte de los lípidos ennegreceinmediatamente por la acción de la soluciónde ácido ósmico. Elennegrecimiento se forma por el dobleenlace -C=C- de los ácidos grasosinsaturados. Los ácidos grasos, que al principio se vuelvenpardos, puedenennegrecerse portratamiento con alcohol 60-70%.Para la microscopíaelectrónica, lasmuestras fijadas con glutaraldehído se fijanposteriormente con solución de óxido deOsmio (VIII).

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM, scanning electron microscopy)

El SEM es un instrumento que permite la observación y caracterización superficial de materialesinorgánicos y orgánicos, entregando información morfológica del material analizado. Con el SEM se pueden realizar estudios de los aspectos morfológicos de zonas microscópicas de los distintosmateriales. Las principales utilidades del SEM son la alta resolución (~100 Å), la gran profundidad de

campo que le da apariencia tridimensional a las imágenes y la sencilla preparación de las muestras.

La muestra es barridapor un haz de electrones focalizado. Los cambios en la superficie de la muestrahacen que los electrones se dispersen. Un detector mide la dispersión e intensidad de los electrones dispersados. Puede escanear célulaspero no arganelas.

TEM SEM(Caso particular)

Espiga (flor) de trigo en desarrollo. Se congeló, se recubrió con una capa de metal y se examinó con SEM.El sombreado

metálicopermite el examen de detallessuperficialescon el TEM. El metal se refuerza con una capa de Carbono.

AUTORADIOGRAFÍA + MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Células pancreáticas marcadas con un pulso de (3H)-leu (5 min) y luego se agregó exceso de leu no marcada (‘caza’) (10 min). Se observan los granos negros de plata de la emulsion fotográfica quecorresponde a la localización de la insulina (proteína de secreción) en el RE (A, foto tomada luego de la ‘caza’) y luego en el Golgi (B, foto tomada 5 min después de la ‘caza’).

A B

Citometría de Flujo

• Es una tecnología biofísica/bioquímica empleadapara: el conteo de células, su separación pordiferentes propiedades, funcionar como detector de biomarcadores, etc.

• Permite el análisis simultáneo multiparamétrico de lasdistintas propiedades de las células

• Permite aislar poblaciones de células con propiedades/características idénticas

# Herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño, color y propiedades. El análisis se realiza mediante la medida simultánea de múltiples características (fluorescencias asociadas y tamaño) de partículas individualizadas sobre las que se hace incidir un haz de luz láser.

TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO

# Separación física de partículas (células) sobre la base de la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica.

# Muy utilizada para la detección de cáncer de sangre, carga viral, etc. P. ej. El recuento de linfocitos CD4/CD8 en sangre y su relación, da una idea del estado inmunológico de la persona infectada.

Citómetro de flujo: Fluorescence activated cell sorting (FACS)

1. Suspensión concentrada de células marcadas con fluorescenciase hace pasar a través de un haz de rayos laser.

2. Con detectores se mide la luzemitida y la dispersada. Se determina asi tamaño y forma de células.

3. Se fuerza a la formación de gotitas que contienen una sólacélula y se le da una carga eléctricaproporcional a la fluorescencia quefue detectada previamente.

4. Las gotas sin carga y las quetienen cargas eléctricas diferentesson separadas por medio de un campo magnético y recogidas. Se pueden separar 10 millones de células por hora.

5. Se preparan cultivos de célulascon propiedades diferentes perohomogéneas.

CARACTERÍSTICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

-El análisis es multiparamétrico y simultáneo. Los parámetros analizables son:

Los relacionados con las características físicas de la partícula (tamaño y complejidad: dispersión de luz frontal y lateral de la luz incidente)

Las fluorescencias asociadas a la partícula. Se utilizan sondas fluorescentes asociadas de manera específica a la partícula (anticuerpos acoplados a fluorocromos, proteínas/molélulasfluorescentes)

- El análisis se realiza sobre partículas individuales dentro de una población compleja.

- El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000 partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad estadística (permite analizar poblaciones representadas en baja frecuencia).

- Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm (bacterias, levaduras, células eucarióticas).

LAS APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

CITOMETRÍA DE FLUJO ANALÍTICA

1. Inmunofenotipo2. Ensayos Funcionales3. Ensayos con genes reporteros

Separación celular en base a la detección diferencial de una o varias fluorescencias asociadas a un parámetro fenotípico, una característica funcional o a la expresión deun gen reportero.

APLICACIONES

1. InmunofenotipoIdentificación y cuantificación de distintas poblaciones celularesen base a la expresión diferencial de marcadores de membrana.

- Identificación de poblaciones celulares desconocidas.- Análisis de las posibles alteraciones en poblacionescelulares conocidas (aplicaciones clínicas, análisis del efecto causado por la modificación de la expresión de un gen)

Caracterización fenotípicade precursores

Hematopoyéticos (desarrollo de células

de la sangre)

CD34 y CD44, antígenos (glicoproteínas de la superficie celular); FS, Folistatina, glicoproteína con funciones autócrinas; IL-7R, citokina; GM-CSFR, receptor del factor de estimulación de formación de colonias en granulocitos (macrófago).

1. Inmunofenotipo

2. Ensayos Funcionales (ejemplos):Análisis de ciclo celular (PI, 7-AAD, Hoechst, BrdU)Apoptosis (AnexinaV, Caspasa-3)Flujo de Ca++ (Indo-1, Fura-3)Cuantificación de la producción de citoquinasSeñalización intracelular (fosforilación de proteínas)

APLICACIONES

Ciclo celular

0 200 400 600 800 1000FL2-A

Células T

Sub-G13%

G0/G170%

S18%

G2/M9%

(DNA dye)

Apoptosis:

Muertas

apoptosis

Anexina V-FITC

Yod

uro

de p

ropi

dio

viables

I. Proporción de células anexina V positivas. La anexina V es una proteina que se une al lípidofosfatidilserina de la MP con ayuda de Ca2+. Es anticoagulante, desplaza factores de coagulación.

conjugadosAnexina V

citoplasma

Apoptosis

citoplasmafosfatidilserina