INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias BiolgicasIngeniera en Sistemas Ambientales

Prctica No. 9 Procesos microbianos del ciclo de nitrgeno

Grupo: 5AV1Equipo No. 7 y 8

Integrantes del equipo:Czares Ramos Jocelyn MildredGutirrez Ruz Karen Lucero Tinajero Domnguez Carmen Nayeli

Profesora: M. en C. Dotor Vzquez Claudia Paulina

Fecha de realizacin de la prctica: 12 de mayo del 2015Fecha de la entrega de la prctica: 4 de junio del 2015

La tcnica al servicio de la patria

Objetivos.1. Determinar experimentalmente los principales procesos metablicos involucrados en el ciclo de nitrgeno.2. Enumerar formas fisiolgicas de bacterias involucradas en estos procesos, en diferentes muestras de suelo.Resultados.ProtelisisLos resultados obtenidos en la protelisis fueron colocados en la Tabla 1, donde se muestra la cantidad de colonias con un halo trasparente que fueron contadas en el agar leche despus del tiempo de incubacin (48hrs a 28C).Para ello fue necesario aplicar las siguientes formulas:FORMULA 1

Mientras que para el clculo de UFC por gramo de suelo base seca se emple la siguiente frmula:FORMULA 2

Tomando en cuenta los resultados obtenidos por el equipo 8, donde se contabilizaron 5 colonias en la dilucin 10-3 empleando una alcuota de 0.1ml, sustituimos en la frmula 1 para obtener UFC Base hmeda:

Posteriormente para obtener UFC Base seca, sustituimos en la frmula 2, tomando en cuenta que el %H=7.5:

Tabla 1. Nmero de microorganismos representantes del proceso de protelisis del Ciclo de Nitrgeno (Cuenta en placa).EquipoMedio de cultivoDilucinNmero de coloniasUFC/g (B.H.)UFC/g (B.S.)

7Agar lecheObtuvimos muchos organismos proteolticosNo se pudieron contar-

-

8Agar leche10-355x1045.4x104

Fijacin de Nitrgeno.Los microorganismos fijadores de nitrgeno no constituyen un grupo taxonmico homogneo, la nica caracterstica que comparten es la presencia de la enzima nitrogenasa (Zehr J.P. y col., 1998). Dichas bacterias comprenden organismos fototrofos, como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias de los gneros Thiobacillus, Xanthobacter y Desulfovibrio y organismos heterotrofos como las bacterias pertenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los gneros Azotobacter, Enterobacter, Klebsiella y Clostridium (Sprent J. y Sprent P., 1990). Estos organismos pueden realizar la fijacin biolgica de nitrgeno ya sea independientemente (a excepcin de las rizobiceas) o estableciendo relaciones simbiticas (Imagen 1 y 2) con otros organismos. Son estas formas simbiticas, concretamente las establecidas entre las rizobiceas y las leguminosas.Imagen 1. Ndulos de Rhizobium en Vigna unguiculata. Fotografa: Stdout

Imagen 2. Bacterias Rhizobium en ndulos de frijol. Fotografa: Philip Poole

Amonificacin, Nitrificacin y Desnitrificacin.Para determinar si un tubo en amonificacin era positivo, el cambio de coloracin deba ser a un tono rosa mexicano, es decir, un color rosado ms intenso al comparar con el testigo. Por otra parte para determinar si un tubo en nitritacin resultaba positivo, era cuando al adicionar las tres gotas de cada reactivo de Griess A y B, se obtena un cambio de color a un tono rosado ms intenso que el testigo mientras que al resto de los tubos negativos se les adicion granalla de Zinc y si se obtena una coloracin mayor a la del testigo eran positivos para nitratacin. Por ltimo, en el caso de los tubos de desnitrificacin un tubo positivo era aquel en el que haba produccin de gas y turbidez.Para determinar el NMP/g base seca, fue necesario obtener el nmero caracterstico correspondiente a cada prueba de acuerdo al nmero de tubos positivos identificados, posteriormente se busc en las tablas de NMP el nmero correspondiente y con ello encontrbamos el NMP base hmeda y se emple la frmula 2 nuevamente para obtener el NMP base seca. Sin embargo si la tabla no manejaba las diluciones empleadas fue necesario aplicar la siguiente frmula para corregir el nmero encontrado en tablas y obtener el NMP base hmeda indicado:FORMULA 3

Donde:

Y al obtener el NMP (B.H) correcto, se emplea nuevamente la frmula 2 para obtener el NMP base seca correspondiente.Tomado en cuenta los datos obtenidos por el equipo 8 en amonificacin donde se obtuvo el nmero caracterstico de 2-2-3 y al cual le corresponde un NMP= 42, sin embargo las diluciones no coinciden con las de la tabla por ello se emple la frmula 3 para corregir el nmero obtenido tomado en cuenta que el FD=103.Sustituyendo en la frmula 3:

Posteriormente se emple la frmula 2 modificada para obtener el NMP base seca correspondiente, como se muestra a continuacin:

Sustituyendo en la formula anterior tomando en cuenta %H=7.5 tenemos que:

Los resultados obtenidos en la amonificacin, nitrificacin y desnitrificacin fueron colocados en las Tablas 2 y 3.

Tabla 2. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de Nitrgeno (Numero Ms Probable) Equipo 7.ProcesoMedio de cultivoTubos positivos por dilucinNMP en la tablaNMP/g (B.H.)NMP/g (B.S.)

10-110-210-310-4

AmonificacinStuart--3104304304.48x 102

NitrificacinNitritacin333-->1100>11001.1458x103

Nitratacin--------------

DesnitrificacinCon asparagina--333>1100>110001.1458x104

Tabla 3. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de Nitrgeno (Numero Ms Probable) Equipo 8.ProcesoMedio de cultivoTubos positivos por dilucinNMP en la tablaNMP/g (B.H.)NMP/g (B.S.)

10-110-210-310-4

AmonificacinStuart--223424204.54x102

NitrificacinNitritacin011--6.16.16.59

Nitratacin000--< 3< 3< 3

DesnitrificacinCon asparagina--32221021002.27x103

Por ltimo, se recab la informacin de todos los sitios de muestreo y se coloc en la Tabla 4.Tabla 4. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de nitrgeno en la zona de muestreo (NMP o UFC por gramo de base seca)PROCESOEQUIPO;ESTACIN

1;12;33;44;55;16;37;48;5

Amonificacin1.7 X102383.3340122.032.89X1032.89X10^31.57 X1032.89X10^34.48x 1024.54 X102

NitrificacinTN53.3320.3311.211.231.51.1458x1036.59

TN--3.335.087.431.5--< 3

Desnitrificacin8 X1021.8 X104401.86 X1045.54 X1032.42 X1022.89X10^31.1458x1042.27 X103

Proteolsis5.37 X104NDNDNDNDNDND5.40 X104

ND: No disponible para ser contado debido a un exceso de crecimiento.TN: Tubos negativos

Tabla 5. Logaritmos de NMP o UFC por gramo de base seca.PROCESOEQUIPO;ESTACIN

1;12;33;44;55;16;37;48;5

Amonificacin2.232.581.602.083.463.192.652.65

Nitrificacin--0.690.521.301.041.493.050.81

----0.520.70.861.49--< 0.47

Desnitrificacin2.904.251.604.263.742.384.053.35

Proteolsis4.72------------4.73

Discusin. a) Proteolsis.Solo dos equipos pudieron cuantificar la protelisis, que fueron el equipo uno y ocho, los otros equipos necesitaban realizar un dilucin mayor a 10-3. Las muestras que tuvieron mayor actividad se debe a la gran presencia de hongos y bacterias en estas zonas, que producen proteasas extracelulares. Los microorganismos participantes en la descomposicin son bacterias, hongos y actinomicetos. Entre las bacterias tenemos: Bacillus, Bacterium, Pseudomonas, Proteus. Los hongos ms frecuentes son: Trichoderma, Penicillium, Mucor, Aspergillus, Alternaria y Cladosporium.

b) Produccin de amoniaco (Amonificacin).

Como se observa en la grfica 1, los equipos cinco y seis (estaciones uno y tres, respectivamente) fueron la que presentaron mayor produccin de amoniaco, esto quiere decir que el suelo en estas estaciones es rico en materia orgnica y por lo tanto hay microorganismos, como hongos y bacterias (Bacillus cereus, Proteus vulagaris y Pseudomonas sp.), que participan en la descomposicin de protenas, llevando a cabo el proceso de amonificacin. En las estaciones cuatro y cinco tambin se llev a cabo este proceso, pero en menor medida a comparacin de las otras estaciones, esto debido a que las muestras entre equipos fueron tomadas de diferentes lugares o que la cantidad de materia orgnica o de microorganismos es menor en el sitio de muestreo.

c) Fijacin de Nitrgeno.La fijacin biolgica del nitrgeno atmosfrico, consistente en la reduccin de N2 a NH4+ por la enzima nitrogenasa, es, despus de la fotosntesis, la ruta metablica ms importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Curiosamente, este proceso crucial slo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent J. y Sprent P., 1990). La mayora de estos procariotas fijadores de nitrgeno viven libremente en el suelo, sin embargo unos pocos forman asociaciones simbiticas con plantas superiores, en la que el procariota aporta a la planta hospedadora nitrgeno fijado y lo intercambia por otros nutrientes y carbohidratos. Dichas simbiosis tienen lugar en ndulos que se forman en las races de la planta y que contienen las bacterias fijadoras de nitrgeno, los cuales se pudieron observar en las imgenes 1 y 2. Como el oxgeno inactiva irreversiblemente a la nitrogenasa implicada en la fijacin del nitrgeno, el proceso de fijacin del nitrgeno tiene lugar en condiciones anaerbicas. Cada uno de los microorganismos fijadores de nitrgeno funciona bien bajo condiciones anaerbicas o bien crean un entorno interno anaerbico en presencia de oxgeno.Cabe destacar que sta actividad no la realizamos en el laboratorio, debido a la falta de material biolgico.

d) Nitrificacin.a. Nitritacin.En este caso, las estaciones tres y cuatro obtuvieron los valores ms altos, lo que indica la presencia de bacterias como Nitrosomas, Nitrosolobus, Nitrosococcus y Nitrospira llevaron a cabo el proceso de oxidacin del in amonio a nitritos, sin embargo en las dems estaciones tambin se llev a cabo este proceso pero en menor cantidad, excepto en la muestra obtenida por el equipo uno (estacin uno), donde los tubos salieron negativos para este proceso.

b. Nitratacin.Esta se forma a partir de la oxidacin de los nitritos. Los nitratos son una parte esencial de los abonos de las plantas, ya que la gran mayora obtiene el Nitrgeno que necesitan para su desarrollo de los nitratos. Este proceso se realiza por bacterias Nitrobacter, en los equipos uno, dos y siete no presentaron este proceso, esto debido a que haya faltado ms tiempo para que se llevara a cabo la nitratacin, los equipos tres, cuatro, cinco, seis y ocho obtuvieron resultados en la nitratacin, aqu fue ms rpido este proceso.e) Desnitrificacin.

Conclusin.Se simularon los diferentes procesos del ciclo del nitrgeno, para saber cmo se lleva a cabo el ciclo del nitrgeno en el suelo muestreado de las cascadas de Tlaxcala, y los microorganismos que estn presentes para poder llevar acabo cada proceso del ciclo. Como en la proteolsis se puede a precisar que hubo una gran cantidad de bacterias y hongos que producan proteasas extracelulares. En algunos suelos muestreados se obtuvo gran cantidad de materia orgnica y los microorganismos descomponen a las protenas, por lo cual hubo una buena amonificacin. El ciclo del nitrgeno es de suma importancia para tener un equilibrio ecolgico, ya que los microorganismos juegan un papel muy importante en la transformacin de diferentes compuestos que pueden ser benficos o perjudiciales dependiendo la cantidad del compuesto, como lo es el amoniaco.

Cuestionario.1.- Qu factores pueden alterar el nmero de microorganismos involucrados en el ciclo de nitrgeno? Hay muchos factores limitantes de la simbiosis para la fijacin del nitrgeno, pero presumiblemente las ms importantes son las clases de terreno, la luz, la temperatura, el agua, los elementos minerales, etc. Elementos minerales. Deficiencias o excesos en determinados elementos minerales afectan directamente o indirectamente en la nodulacin. Por ejemplo el molibdeno es un constituyente de la nitrogenasa, as que un defecto de Mo en el medio causa un efecto directo y negativo en la fijacin del nitrgeno. Sin embargo el Fe (que tambin es un elemento constituyente de la nitrogenasa) no tiene un efecto directo sobre la fijacin del nitrgeno cuando este escasea en el medio. Tambin son importantes otros elementos como calcio, fsforo, azufre, cobre o zinc ya que originan cambios en el pH que si que va a afectar directamente a la fijacin. Los fertilizantes qumicos utilizados tratan de influenciar un mayor crecimiento de la planta y una mayor con fijacin del nitrgeno. Temperatura. Que la temperatura afecta a la simbiosis esta claro, pero esta interaccin es de modo indirecto aparece de un modo no especifico a travs de los procesos metablicos de la planta como respiracin, fotosntesis, transporte y transpiracin. En las leguminosas estudiadas, que tienen un ciclo de Calvin normal, su temperatura ptima es de 15 a 20 C. No se han encontrado leguminosas tropicales con metabolismo C4. La respiracin se incrementa con las altas temperaturas, esto hace que haya una menor disponibilidad de carbono para la simbiosis. Con menos de 7 C la nodulacin se hace muy poco probable. En el caso extremo de altas temperaturas, se reduce el nmero de races laterales y pelos radicales, haciendo que la probabilidad de nodulacin sea menor. A temperatura extremas tiene lugar una degradacin de los ndulos. Luz. La luz afecta a la simbiosis a travs de la fotosntesis, controlando la cantidad de carbohidratos para el desarrollo y funcionamiento del modulo. Existen evidencias de algunos efectos directos de la luz sobre la nodulacin, as es por ejemplo que la nodulacin es pobre bajo luz azul y mxima bajo efecto de la luz roja - esto implica una evidencia de la implicacin del fitocromo reversible en el proceso de nodulacin). Se han hecho experimento con la defoliacin gradual de las plantas y se ve claramente como hay una reduccin en la fijacin del nitrgeno. Agua Las deficiencias en la disponibilidad de agua causan un bajada en la fijacin del nitrgeno en leguminosas de todo el mundo, de todos modos hay diferentes adaptaciones de estas plantas a las diversas condiciones de sequa, como ejemplo podemos citar a M. sativa que llega a proyectar sus races hasta siete metros de profundidad. Otros factores Otros factores posibles pueden ser los gases que hay en el terreno, las enfermedades como hongos, virus o micoplasmas (se ha estimado que estas enfermedades causan una perdida de al menos el 24 % de las leguminosas del forraje). Por ultimo debemos decir que las actividades del hombre tambin han modificado las cantidades de fijacin de nitrgeno, la mayor parte de las veces es en beneficio (como puede ser la contribucin a la nodulacin con diferentes fertilizantes que ofrecen minerales al suelo que ayuda a la nodulacin).2.- Cmo afecta la presencia de o ausencia de oxgeno en los diferentes procesos del ciclo del nitrgeno? (Haga una tabla).PROCESOPRESENCIA DE OXGENOAUSENCIA DE OXGENO

ProteolsisSe lleva a cabo el procesoNo se lleva a cabo, debido a que las bacterias que participan son aerobias estrictas.

Produccin de amoniacoSe lleva a cabo el proceso por aerobiosis.Se lleva a cabo el proceso por anaerobiosis o mediante la ureasa.

Fijacin de nitrgenoSe lleva a cabo por fototrficos oxignicos.Se lleva a cabo por fototrficos anoxignicos, metanognesis

NitrificacinSe lleva a cabo mediante oxidacin de amonio y nitritos, por Nitrosomonas sp. y Nitrobacter sp.No se lleva a cabo.

DesnitrificacinNo se lleva a cabo, debido a que las bacterias que participan son anaerobias estrictas.Este proceso se lleva a cabo bajo condiciones anoxignicas.

3.- La adicin de fertilizantes nitrogenados puede tener consecuencias en los procesos globales de contaminacin. Indique usted cuales podran ser esas consecuencias.A principios del siglo 20, un cientfico alemn llamado Fritz Haber descubri como acortar el ciclo del nitrgeno fijando qumicamente el nitrgeno a altas temperaturas y presiones, creando as fertilizantes que podan ser aadidos directamente al suelo. Esta tecnologa se extendi rpidamente durante el ltimo siglo.No todos los fertilizantes de nitrgeno aplicados a los campos de la agricultura se mantienen para alimentar los cultivos. Algunos son barridos de los campos de agricultura por la lluvia o el agua de irrigacin, y son lixiviados en la superficie o en el agua del suelo y pueden acumularse. En el agua del suelo que se usa como fuente de agua potable, el nitrgeno excesivo puede provocar cncer en los humanos y dificultades respiratorias en los nios. La U.S. Environmental Protection Agency (Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos) ha establecido un estndar de nitrgeno para el agua potable que es de 10 mg por litro de nitrato-N. Desafortunadamente, muchos sistemas (particularmente en las reas de agricultura) ya exceden estos niveles. En comparacin, los niveles de nitrato en las aguas que no han sido alteradas por la actividad humana y rara vez son mayores de 1 mg/L. Una de las consecuencias seria la acumulacin de nitratos en el subsuelo, puede originar una eutrofizacin del medio. En un medio eutrofizado, se produce la proliferacin de especies como algas y otras plantas verdes que cubren la superficie. Esto trae como consecuencia un elevado consumo de oxgeno y su reduccin en el medio acutico, as mismo dificulta la incidencia de la radiacin solar por debajo de la superficie. Estos dos fenmenos producen una disminucin de la capacidad auto depuradora del medio y una merma en la capacidad fotosinttica de los organismos acuticos. El nitrgeno es uno de los principales contaminantes de las aguas subterrneas. Es conocido que las plantas aprovechan nicamente un 50% del nitrgeno aportado en el abonado, esto supone que el exceso de nitrgeno se pierde, generalmente lavado del suelo por el agua que se filtra al subsuelo, siendo arrastrado hacia los acuferos, ros y embalses, contaminando, por tanto, las aguas destinadas a consumo humano.El nitrgeno reactivo (como el NO3- y NH4+) que se encuentra en el agua y suelos de la superficie, tambin puede ingresar en la atmsfera como el componente del smog xido ntrico (NO) y el gas de invernadero xido nitroso (N2O). Eventualmente, este nitrgeno atmosfrico puede ser soplado en ambientes terrestres que son sensibles al nitrgeno causando cambios de largo plazo. Por ejemplo, los xidos de nitrgeno contienen una porcin significativa de la acidez en la lluvia cida que es la causante de la deforestacin en partes de Europa y del Noreste de Estados Unidos. El aumento de depsitos de nitrgeno atmosfrico tambin causa los cambios ms sutiles en las especies dominantes y funciones del ecosistema en algunos bosques y prados. Por ejemplo, en los suelos serpentina con poco nitrgeno de los prados del Norte de California, los conjuntos de plantas se han limitado histricamente a las especies nativas que pueden sobrevivir sin mucho nitrgeno. En este momento, hay evidencia que los niveles elevados de entrada de N atmosfrico proveniente del desarrollo industrial y agrcola, han allanado el camino para una invasin de plantas no nativas. Como se ha sealado con anterioridad, el NO es un factor esencial en la formacin del smog, que tambin causa enfermedades respiratorias como el asma en nios y adultos.4.- Cuales son las ecuaciones qumicas que se llevan a cabo en cada uno de los procesos biolgicos analizados.Fijacin del nitrgeno Nitrogenasa

N2 2NH4 16 ATP

Nitrificacin NH3++ O2 NO2-+ 2 H+ + H2O Nitrosomonas sp.

NO2- + O2 NO3 - Nitrobacter sp.Desnitrificacin NO3- NO2N2O N2Mineralizacion Ureasa

NH2-CO-NH2+ H2OCO2 +2NH3

CH3-CHNH2-COOH+ H2O CH3-CHO-COOH+NH3Anaerobiosis

CH3-CHNH2-COOH+O2 CH3-COOH+CO2+NH3 Aerobiosis

ProtelisisRuptura de enlaces peptdicos de las protenas.Descomposicin de materia orgnicaBibliografa https://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/fijacionN.htm www.bosquesmediterraneos.com/wp.../bacterias-fijadoras-nitrogeno.pdf http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bradyrhizobium http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p3-nitrogeno.pdf