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Gisela Maria Henrique Maia

Papel das Vias Serotoninérgicas Ascendentes na

Epileptogénese e nas Patologias Associadas à

Epilepsia

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Instituto de Anatomia J. A. Pires de Lima

Centro de Morfologia Experimental

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Papel das Vias Serotoninérgicas Ascendentes na

Epileptogénese e nas Patologias Associadas à Epilepsia

Plano de Tese de Doutoramento

Sob a Orientação de:

Professor Doutor Nikolay Lukoyanov

e Co-Orientação de:

Professor Doutor José Paulo Andrade

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Índice

Lista de Abreviaturas…………………………………………………………………….6

ESTADO DA ARTE

Introdução……………………………………………………….………………….……8

Capítulo 1. Epilepsia do Lobo Temporal…………………………………………...…10

1.1. Alterações morfológicas da ELT………………………………..…..….11

1.2. Défices emocionais e cognitivos associados à ELT……………...…….13

Capítulo 2. Modelos Experimentais de Epilepsia do Lobo Temporal……………...….16

2.1. Modelos Agudos de ELT…………………………………………………..16

2.2. Modelos Crónicos de ELT……………………………………………...….17

2.2.1. Modelos Baseados no Status Epilepticus………………….……..17

2.2.1.1 SE induzido por Ácido Caínico……………………...…17

2.2.1.2 SE induzido por Pilocarpina………………………….....19

2.2.2. Modelos de Kindling……………………………………………..20

2.2.2.1. Kindling Rápido………………………………….…….21

2.2.2.2. Kindling Rápido da Amígdala……………………….…22

2.2.2.3. Kindling Químico………………………………………23

Capítulo 3. Envolvimento da Serotonina na Génese da Actividade Convulsiva….......24

3.1. Receptores 5-HT1………………………………………………………….25

3.2. Receptores 5-HT2………………………………………………………….27

3.3. Receptores 5-HT3………………………….………………………………27

3.4. Receptores 5-HT4……………………………………………...…………..28

3.5. Receptores 5-HT7………………………………...………..………………28

3.6. Antidepressivos como agentes proconvulsivantes…….……………..……31

3.7. Antidepressivos como agentes anticonvulsivantes……………………….31

Capítulo 4. Envolvimento da Serotonina nas Alterações Comportamentais e

Neuroanatómicas Associados à Actividade Convulsiva………………………………34

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Capítulo 5. Alterações Serotoninérgicas Periféricas Associadas à Epilepsia…..……..36

5.1. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com epilepsia…....36

5.2. Alterações serotoninérgicas n as plaquetas de pacientes com alterações

emocionais…………………………………………………………………...…37

CONTRIBUIÇÃO PESSOAL

Objectivos gerais…………………………………………………......…………..…….40

Planeamento das tarefas…………………………….…………………………………..42

Tarefa 1. Efeito das crises convulsivas sobre neurónios serotoninérgicos no

núcleo dorsal do rafe, na formação do hipocampo, no córtex entorrinal e na

amígdala…………………………………………………………………………...…....43

Tarefa 2. Alterações comportamentais e morfológicas resultantes das crises

convulsivas após inibição da síntese de serotonina no núcleo dorsal do

rafe………………………………………………………………….……………....…..45

Tarefa 3. Efeitos antiepilépticos e neuroprotectores da fluoxetina e da

eslicarbazepina: estudos comportamentais e morfológicos no modelo de ácido

caínico……………………………………………………………..……………..…….47

Tarefa 4. Efeitos antiepilépticos e comportamentais resultantes da estimulação

do nervo vago na epilepsia refractária: alterações morfológicas em modelos de ácido

caínico………………………………………………………………………………….49

Cronograma de Actividades………..……………………………...….……………..51

Referências Bibliográficas……………………………………….…………...………52

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Lista de Abreviaturas

5-HT – Serotonina

Ach - Acetilcolina

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DR – Núcleo dorsal do rafe

ECS – Electrochoques

ERC – Córtex entorrinal

EEG – Electroencefalograma

ELC - Eslicarbazepina

ELT – Epilepsia do lobo temporal

ELTm – Epilepsia do lobo temporal mesial

FLX - Fluoxetina

GABA – Ácido gama-aminobutírico

GERP – Genetically epilepsy prone rats

HS – Esclerose Hipocampal

I.p. - Intraperitoneal

KA – Ácido Caínico

MAO – Monoamina oxidase

MES – Maximal Electroshocks

MPPF – 4-18-fluoro-N-2-(1-2-methoxiphenil)-1-piperazinil)ethil-N-2-piridinilbenzamida

RMN – Ressonância magnética nuclear

PCA – para-cloranfetamina

PET – Tomografia por emissão de positrões

REAK – Rapid electrical amigdala kindling

SE – Status epilepticus

SERT – Transportador da Serotonina

SNC – Sistema nervoso central

SNP – Sistema nervoso periférico

SPECT – Tomografia por emissão monofotónica

SSRI – Inibidor selectivo da recaptação de serotonina

TAC – Tomografia axial computorizada

Trp - Triptofano

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Estado da ArteEstado da ArteEstado da ArteEstado da Arte

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INTRODUÇÃO

O projecto aqui apresentado, intitulado “Papel das Vias Serotoninérgicas

Ascendentes na Epileptogénese e nas Patologias Associadas à Epilepsia” foi realizado

no âmbito do projecto de doutoramento do Programa Doutoral em Neurociências da

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, a ser desenvolvido no Instituto de

Anatomia J. A. Pires de Lima desta Instituição.

Os primeiros relatos do síndrome que é hoje conhecido como epilepsia datam de

há 3000 anos A.C. Nos primordiais tempos de Platão, a doença era associada a factores

divinos. Face à falta de conhecimento da época, a manifestação física da crise epiléptica

era explicada com base em conceitos pagãos. O conceito de epilepsia adaptou-se ao

longo dos tempos, sendo o séc. XIX o ponto de viragem no conhecimento e na aceitação

de que a epilepsia é uma patologia com origem no sistema nervoso central, tendo os

trabalhos de Georget, Charcot, Babinski, Gowers e Lennox contribuído para este facto.

Desde essa altura os fenómenos sobrenaturais, os ovários e as crises de histeria perdem

vigor; actualmente a epilepsia é uma das patologias mais estudadas no campo das

neurociências.

Hoje em dia sabemos que as crises convulsivas resultam de uma alteração da

actividade bioeléctrica cerebral, temporária e reversível, que induz manifestações

motoras, sensitivas, sensoriais, psíquicas e neurodegenerativas. Apesar da ciência já

muito ter contribuído para o conhecimento nesta área, acredita-se que ainda estamos

longe de saber detalhadamente os fenómenos inerentes aos processos de epileptogénese.

A complexidade é tal, que alguns tipos de epilepsia respondem favoravelmente à

terapêutica medicamentosa, enquanto outros tipos adquirem gradualmente resistência à

intervenção farmacológica. Um dos exemplos é a epilepsia do lobo temporal associada a

esclerose mesial hipocampal, cuja patofisiologia lhe confere refractabilidade

medicamentosa. Assim, este projecto de doutoramento foi desenvolvido com o intuito

de dar continuidade à investigação da epileptogénese, estabelecendo o paralelismo entre

as alterações morfológicas do sistema nervoso central e a função dos diversos receptores

de serotonina no controlo das crises.

Este trabalho divide-se em duas grandes partes. A primeira debruça-se sobre o

Estado da Arte e os seus 4 capítulos sintetizam os estudos feitos até à data no âmbito da

epilepsia do lobo temporal, abordando não apenas a experimentação animal, mas

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também a humana; são abordados os modelos animais utilizados neste tipo de epilepsia,

bem como o envolvimento da serotonina na génese da actividade convulsiva, nas

alterações comportamentais e neuroanatómicas associadas à epilepsia. Na segunda

parte, Contribuição Pessoal, é feito o planeamento das tarefas a serem desenvolvidas ao

longo do tempo.

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Capítulo 1.

Epilepsia do Lobo Temporal

A epilepsia representa o segundo grupo de doenças neurológicas mais comum,

caracterizado por crises convulsivas recorrentes. Afecta cerca de 2% da população

mundial e estima-se que mais de um terço dos pacientes epilépticos desenvolvam um

quadro de resistência farmacológica. Destes, metade possui epilepsia do lobo temporal

(ELT), o tipo de epilepsia sintomática mais comum, associada a alterações do complexo

amigdalóide, formação do hipocampo e córtices entorrinal e perirrinal (Squire e Zola-

Morgan, 1991). A alteração da estabilidade das membranas neuronais destas regiões

induz crises parciais simples ou parciais complexas, cuja semiologia é caracterizada por

sensações epigástricas ascendentes, alterações emocionais, alucinações auditivas ou

gustativas e perda de consciência (Engel, 1996). Uma característica frequente da ELT é

a alteração dos estados de memória (Helmstaedter, 2002), devido ao envolvimento

frequente da formação do hipocampo.

Dado o elevado número de pacientes que desenvolvem resistência farmacológica,

torna-se essencial elucidar os mecanismos de epileptogénese, de forma a identificar

estratégias de tratamento para prevenir o desenvolvimento das crises. A crise é o ponto

comum a todas as epilepsias. Por sua vez, a característica comum a todos os tipos de crise é

a alteração transitória do comportamento, induzida pelo firing alterado, síncrono e rítmico

de uma população de neurónios, cujas descargas se propagam para regiões com conexões ao

foco principal.

Os estudos clínicos indicam que cerca de 70 a 80% dos doentes com epilepsia

podem ser tratados com sucesso, chegando mesmo a abandonar a terapêutica

farmacológica com um baixo risco de recidivas. Apesar disso, um número significativo

desenvolve resistência farmacológica. Nestes pacientes verifica-se um fracasso no

controlo das crises após dois ou mais esquemas de fármacos antiepilépticos. Perante

este quadro, a decisão de quando efectuar cirurgia nestes doentes com epilepsia

refractária é uma questão bastante relevante. É necessário um estudo multidisciplinar

minucioso, implicando a compilação de informações com origem clínica, sinal

biológico (EEG), imagem morfológica (TAC, RMN) ou imagem funcional (PET,

SPECT), permitindo a classificação das crises e a selecção de pacientes para

determinada estratégia cirúrgica. Alguns dos síndromes epilépticos que poderão

apresentar resolução cirúrgica incluem a ELT (com comprometimento do complexo

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amígdalo-hipocampal), as epilepsias neocorticais (epilepsias frontais e também

occipitais) e epilepsias relacionadas com tumores ou malformações vasculares

(Kilpatrick et al., 2003). Os tipos de crises tratáveis com a cirurgia são as crises parciais

simples, as crises parciais complexas e alguns tipos de crises generalizadas. A cirurgia

mais comum e com maior sucesso utilizada na ELT é a cirurgia de ressecção do córtex

temporal anterior com amigdalohipocampectomia.

1.1. Alterações morfológicas da ELT

A HS (esclerose hipocampal) é a patologia mais frequente nos doentes com ELT

e a sua identificação, quando presente na RMN, dá um suporte imagiológico ao

diagnóstico clínico e electroencefalográfico. As amostras cirúrgicas obtidas em casos de

displasia cortical focal e displasia parahipocampal em que há evidência imagiológica de

alterações de sinal na substância branca parahipocampal, correspondentes a gliose

reactiva e células hipertróficas (Pillay et al., 2009) vêm dar um apoio morfológico aos

registos electrofisiológicos, nos quais se identifica uma diferença de padrão de

propagação das crises parahipocampais e hipocampais. Todavia, parece não existir

dúvidas de que a atrofia do córtex entorrinal, presente em 63% dos pacientes com ELT e

HS, poderá estar na génese da epilepsia (Pillay, 2009).

Durante a epileptogénese desencadeiam-se na formação do hipocampo inúmeras

alterações neurobiológicas, consideradas potenciais alvos para a intervenção terapêutica.

Essas alterações incluem a perda neuronal nas regiões CA1 e CA3 (Blumcke et al.,

2002; Wieser et al., 2005), mas tipicamente mais marcada em CA1 (Carne et al., 2004),

verificando-se também uma perda neuronal no hilo da circunvolução denteada e

também em regiões extrahipocampais, nomeadamente na amígdala e córtex entorrinal

(Blumcke et al., 2002; Wieser et al., 2005, Cardoso et al., 2008a). Outras alterações

descritas incluem gliose, fenómenos de plasticidade neuronal e dendrítica. (Jutila et al.,

2002). Acredita-se que a epileptogénese pode ser provocada por perda neuronal e que,

por sua vez, uma variedade de insultos que incluem status epilepticus (SE) (Gorter et

al., 2003), isquemia (Sadowski et al., 1999) e acidose (Ding et al, 2000) induzem a

morte dos neurónios da formação do hipocampo. Todavia, as alterações estruturais e

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funcionais não têm obrigatoriamente que ser acompanhadas de morte neuronal, embora

esta morte seja evidente em grande parte dos casos.

Apesar da morte neuronal ser um fenómeno bem caracterizado na ELT, é ainda

controverso se esta mesma perda neuronal é causa ou consequência das crises. Alguns

estudos indicam que o SE induz morte neuronal aguda no Homem (Pitkanen e Sutula,

2002), sendo esta evidência apoiada por estudos experimentais em diversos modelos

animais, nos quais as crises prolongadas induzidas por ácido caínico (KA), pilocarpina e

kindling, produzem um padrão de neurodegenerescência hipocampal semelhante ao

padrão encontrado no Homem (Nissinen, 2006). Tendo em conta que a epilepsia se

caracteriza pela repetição de crises convulsivas, também a administração repetida de

electrochoques (ECS) causa lesões cerebrais, sendo o córtex entorrinal e o hilo da fáscia

denteada, estruturas particularmente vulneráveis (Sloviter et al., 1996; McNamara,

1999; Salmenpera et al., 2000). Do ponto de vista morfológico, observa-se uma perda

aproximada de 17% de neurónios no hilo da circunvolução denteada (Lukoyanov et al.,

2004), bem como uma diminuição do número de sinapses entre a camada II do córtex

entorrinal e as células granulares da fáscia denteada, com redução do volume das

camadas II, III, V-VI do córtex entorrinal (Cardoso et al., 2008). Também o córtex

retrosplénico b (Rgb) está envolvido na actividade convulsiva, verificando-se perda

significativa de neurónios nas camadas IV e V do Rgb, acompanhadas de redução do

volume nas camadas I, IV, V e VI (Cardoso et al b., 2008). Esta perda neuronal e

volumétrica é acompanhada de ligeiro aumento da neurogénese na circunvolução

denteada (Scott et al., 2000) e do sprouting das fibras musgosas na camada molecular

(Gombos et al., 1999; Vaidya et al., 1999) em modelos de administração repetitiva de

ECS. Estes estudos mostram existir um envolvimento do córtex entorrinal nas crises

epilépticas, embora pareça contribuir menos para as crises quando comparado com a

formação do hipocampo (Heinemann et al., 1993).

Na formação do hipocampo as células granulares e as células do hilo da

circunvolução denteada actuam como filtro para a dispersão dos estímulos excitatórios

do córtex entorrinal; quando há lesão da circunvolução denteada estes mecanismos

falham, o que contribui para a génese das crises no circuito córtex entorrino-hipocampal

(Pillay et al., 2009). Porém, para que este processo se verifique, torna-se necessária a

repetição das crises, e os modelos de ECS oferecem-nos essa clara evidência, com perda

neuronal no hilo da circunvolução denteada, mas não no hipocampo próprio, visto que a

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exposição aos ECS é breve (Gombos et al., 1999; Vaidya et al., 1999). No entanto,

quando se induzem descargas prolongadas das células granulares na circunvolução

denteada através da estimulação da via perfurante em ratos, verifica-se perda

significativa de neurónios piramidais nas camadas CA3 e CA1 do hipocampo próprio,

bem como alterações nas conexões sinápticas dos neurónios nas restantes regiões da

formação do hipocampo. (Sloviter e Damiano, 1981; McIntyre et al., 1982; Sloviter et

al., 1983).

1.2. Défices Emocionais e Cognitivos Associados à ELT

A relação entre epilepsia e alterações cognitivas tem vindo a ser cada vez mais

descrita (Kondziella et al., 2007), dado que a epilepsia refractária tem numerosos

impactos na vida social, psicossocial e diária dos pacientes. A frequência das crises, os

sintomas depressivos e uma precária qualidade de vida dos pacientes com este tipo de

patologia parecem ser as razões que levam ao suicídio, tornando-se este a principal

causa de morte (Gilliam et al., 2004). Parece haver uma relação entre epilepsia,

comportamentos suicidas e depressão, partilhando estas patologias alguns mecanismos

comuns, nomeadamente a disfunção serotoninérgica no sistema límbico (Oquendo et

al., 2003).

A amígdala é uma das estruturas-chave do sistema límbico com papéis muito

bem definidos tanto a nível emocional como na epilepsia. Estudos com PET e SPECT

nos pacientes com ELT (Theodore, 2006; Didelot et al.; 2008; Ito et al.; 2007) e em

ratos epilépticos (Keele et al., 2005) mostram alterações nos receptores 5-HT na

amígdala, formação do hipocampo e noutras áreas do sistema límbico (Kim et al., 2007;

Smolders et al., 2008). A diminuição crónica dos níveis serotoninérgicos nos indivíduos

com ELT conduz a uma hiperexcitabilidade da amígdala basolateral (Rainnie et al.;

1992), resultando na incapacidade de inibir os comportamentos emotivos e controlar os

impulsos associados a desordens afectivas que incluem o medo, a ansiedade, a insónia,

a agressão, a dificuldade de aprendizagem e o défice no reconhecimento (de faces, por

exemplo). Desenvolve-se assim uma combinação de causa-efeito entre crise convulsiva

devido a alterações químicas e estruturais no sistema límbico e alterações psiquiátricas.

Consultando o Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, podemos

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verificar a existência de uma relação bidireccional entre doenças psiquiátricas e

epilepsia; os doentes com epilepsia, incluindo crianças, mostram taxas elevadas de

doenças depressivas (22,6%), ansiedade (35,8%) e défices de atenção e hiperactividade

(ADHD, 26,4%).

A prevalência da depressão situa-se entre os 20 a 55% em pacientes com um

pobre controlo das crises (Gillian et al., 2004; Pellock et al., 2004), em comparação

com a população geral, cujos casos rondam os 13 a 21% (Blazer et al., 1994). A

combinação sintomatológica de depressão, anergia, irritabilidade e euforia, a dor atípica,

a insónia, o medo e a ansiedade é conhecida como desordem disfórica interictal e

coexiste frequentemente com um quadro de excessiva actividade neuronal paroxística

nos doentes com epilepsia. Além disso, verifica-se também uma relação entre as taxas

de suicídio em casos de epilepsia, dado que a depressão ocorre numa grande

percentagem de pacientes epilépticos que se suicidam (Salzberg e Vajda, 2001). Uma

hipofunção serotoninérgica parece constituir o maior mecanismo patogénico que está na

base do desenvolvimento da depressão (Hasler et al., 2004). Os pacientes com

depressão evidenciaram resposta atenuada aos agonistas dos 5-HT1A in vivo e

diminuição da ligação dos receptores 5-HT1A post mortem (Lesch et al., 1990).

Verifica-se uma correlação significativa entre sintomas depressivos em doentes com

ELT e diminuição das ligações dos receptores 5-HT1A (Hasler et al., 2007) nas regiões

límbicas incluindo a formação do hipocampo ipsilateral (Giovacchini et al., 2005) e o

córtex do cíngulo anterior (Savic et al., 2004).

Os pacientes com ELT apresentam frequentemente défices na memória espacial

e outras formas de memória declarativa. Em comparação com indivíduos controlos, os

casos de ELT evidenciam uma performance cognitiva baixa em várias tarefas,

nomeadamente na memória, no discurso e na resolução de problemas diários (Silva et

al., 2007). Esta relação não está totalmente esclarecida, pelo que se tornam necessários

mais estudos comportamentais e de memória em modelos animais de ELT.

Os modelos animais de epilepsia refractária (induzida por pilocarpina e que

desenvolvem SE com posteriores crises espontâneas) exibem aumento significativo da

ansiedade em testes comportamentais e em testes de memória como o open field, o

elevated plus maze, o hole board e o teste de exploração de novos objectos;

simultaneamente, desenvolvem também diminuição da imobilidade no forced swim and

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tail suspension test, enquanto que o Morris water maze indica uma severa deficiência da

aprendizagem e da memória (Müller et al., 2009). Todavia, nos modelos que utilizam

ácido caínico, após injecção intrahipocampal deste composto, os animais exibem apenas

pequenas alterações nos testes comportamentais utilizados para avaliar a actividade e a

função motora, os comportamentos depressivos, a aprendizagem e a memória (Gröticke

et al.; 2009).

Estudos realizados com o precursor da serotonina, o triptofano, e com os sub-

receptores desta amina, evidenciam o seu papel na modulação das funções cognitivas

em modelos animais de ELT. A modulação da memória é da dependência dos

receptores 5-HT4, que também regulam a síntese de vários neurotransmissores a nível

pré- e pós-sináptico (Lucas, 2009). Pelo contrário, os antagonistas dos receptores 5-HT6

promovem o processo de memória e revertem a amnésia; o SB-39985 e as drogas

amnésicas como o dizocilpina e a escopolamina, modulam a expressão do RNAm do

receptor 5-HT6 no córtex pré-frontal, na formação do hipocampo e no corpo estriado,

em animais submetidos ao Pavlovian/mental autoshaping task (Huerta-Rivas et al.,

2009).

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Capítulo 2.

Modelos Experimentais de ELT

As limitações éticas e experimentais dos estudos em humanos fazem com que os

estudos em animais se tornem imprescindíveis. Dada a necessidade de melhorar a

compreensão dos mecanismos envolvidos no início ictal, na epileptogénese e nas crises

espontâneas recorrentes, bem como o estudo de novas estratégias terapêuticas, conduz

ao gradual desenvolvimento de modelos animais que mimetizam os diferentes tipos de

epilepsia/crises do Homem. Estes modelos dividem-se em dois grandes grupos,

nomeadamente agudos ou crónicos, consoante as capacidades de indução de

convulsões/epilepsia.

No que diz respeito à ELT, os diversos modelos experimentais dão-nos a

oportunidade de (1) estudar diferentes factores (trauma, contusão) que podem

influenciar o subsequente desenvolvimento de epilepsia; (2) observar diferentes eventos

que podem contribuir para o processo de doença (durante a epileptogénese)

subsequentes a esses factores mas antecedente ao início e ao desenvolvimento de crises

espontâneas; e (3) estudar o SNC (sistema nervoso central) na epilepsia crónica em

detalhe, utilizando técnicas fisiológicas, farmacológicas, moleculares e anatómicas

(Nissinen, 2006)

2.1. Modelos Agudos de ELT

Os modelos agudos permitem essencialmente estudar as alterações promovidas

pelas crises convulsivas e, no que diz respeito à ELT, o modelo de MES (maximal

electroshocks) é um dos modelos eléctricos não invasivos mais usados, a par do modelo

químico de pentilenotetrazol (PTZ)

No modelo de MES usa-se um estímulo eléctrico intenso e de curta duração para

induzir uma crise tónico-clónica generalizada. Esta crise acontece imediatamente após a

estimulação induzida, mediante eléctrodos estimuladores bipolares implantados na

córnea, ou um eléctrodo monopolar em cada lobo da orelha.

O PTZ, cujo mecanismo de acção é conferido pela inibição dos canais de cloro

associados a receptores do GABA, implica a injecção de uma dose relativamente

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elevada (geralmente 70 mg/Kg) subcutaneamente, o que resulta em convulsões tónico-

clónicas recorrentes de curta duração.

2.2. Modelos Crónicos de ELT

2.2.1 Modelos Baseados no Status Epilepticus

Contrastando com o modelo de kindling, o SE é mais fácil de produzir, embora

as sequelas induzidas sejam mais variáveis. O SE é frequentemente produzido pela

administração sistémica (subcutânea ou intraperitoneal) de ácido caínico ou pilocarpina.

Estes agentes convulsivos podem também ser aplicados em locais específicos como a

amígdala e a formação do hipocampo. Após a indução do SE, as crises espontâneas

ocorrem num período de 1 mês e as alterações morfológicas que ocorrem no hipocampo

após o SE induzido tanto por substâncias químicas, como por estimulação eléctrica, são

frequentemente semelhantes às alterações encontradas na ELT humana. A desvantagem

do SE reside na dificuldade do seu controlo, bem como o substancial número de animais

que morrem durante a fase de SE.

2.2.1.1. Status Epilepticus induzido por Ácido Caínico

O KA é um análogo estrutural do glutamato, com propriedades excitotóxicas

(Coyle, 1983) que induz um comportamento epileptiforme em ratos após administração

intraventricular, e crises convulsivas após administração sistémica (Tanaka et al., 1992).

O seu mecanismo de acção desenvolve-se pela sua interacção com o receptor

glutamatérgico (sub-tipo KA), onde promove despolarização de todos os neurónios que

expressam este receptor, por um longo período de tempo. O stratum lucidum de CA3 e

as camadas piramidais de CA1 e CA3 da formação do hipocampo expressam grande

afinidade para as ligações do KA, sendo as áreas mais sensíveis para a acção deste

ácido. (Sperk, 1994).

São várias as formas de administração do KA, desde a administração

intraperitoneal, endovenosa, subcutânea, até à administração via cirurgia estereotáxica

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nos ventrículos cerebrais, na formação do hipocampo e na amígdala. O fármaco pode

ser administrado numa única dose eleveda (8 a 15 mg/Kg), em várias pequenas doses

(2,5 a 5,0 mg/Kg) (Hellier et al., 1998), ou localmente em doses de 0,1 a 0,3 µg por

hemisfério (Leite et al., 2002)

Após a administração sistémica de KA, as crises límbicas que se originam na

formação do hipocampo, rapidamente se propagam para o septo lateral, complexo

amigdalóide, complexo subicular, córtex entorrinal e várias regiões extralímbicas (Ben-

Ari et al., 1981). Cinco minutos após administração sistémica de KA os ratos adaptam

uma postura catatónica, e 9 minutos após a administração são registadas os primeiros

grafoelementos de actividade paroxística no EEG, caracterizados por pontas ou surtos

de pontas (Tuunanen et al., 1999). Aproximadamente 1 hora após a administração de

KA o EEG regista pontas contínuas, o que é considerado o início do SE. As primeiras

crises espontâneas motoras (Tanaka et al., 1992; Hellier et al., 1998) ocorrem entre 4 a

7 dias após a injecção de KA e a frequência das crises é bastante variável de animal para

animal, indo desde um pequeno número de crises, até crises diárias (Hellier et al.,

1998), sendo na maioria do casos, crises generalizadas no estádio 3 a 5, de acordo com a

escala de Racine (1972).

O modelo de KA mostra muitas alterações neuropatológicas semelhantes às

encontradas na ELT em humanos. Em ambos os casos as lesões neuronais confinam-se

à formação do hipocampo, região parahipocampal, complexo amigdalóide e córtex

piriforme (Schwob et al., 1980; Ben-Ari et al., 1985; Hudson et al., 1993; Pitkänen et

al., 1998; Tuunanen et al., 1999). O hilo da circunvolução denteada, as regiões CA1 e

CA3 (Schowb et al., 1980; Groticke et al., 2008) do hipocampo, a camada III do córtex

entorrinal (Du et al., 1993, 1995) e especialmente o núcleo basal da amígdala

(Tuunanen et al., 1999; Yilmazes-Hanke et al., 2000) encontram-se alterados de uma

forma semelhante à que é encontrada no Homem. No que diz respeito à circunvolução

denteada, as lesões são caracterizadas por uma desorganização estrutural na camada das

células granulares, provavelmente devido às alterações da migração neuronal (Engel,

1996, 2001). Porém, tanto no modelo animal com KA como na ELT, a camada granular

parece ser bastante resistente às crises epilépticas, sendo a perda neuronal nesta região

menos evidente (Houser, 1992).

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2.2.1.2. Status Epilepticus Induzido por Pilocarpina

A pilocarpina é um agonista dos receptores muscarínicos da acetilcolina (Ach),

que induz crises epilépticas em roedores após ser administrada sistémica ou

intracerebralmente (aplicação focal ou intraventricular) (Turski et al., 1989). Pode ser

administrada numa única dose elevada (320-400 mg/kg) ou combinada com lítio (3

mEq/Kg, correspondentes a 127 mg/Kg) (Tariq et al., 2008). O tratamento prévio com

lítio, seguido de várias doses de pilocarpina, produz um SE eficiente, com a vantagem

de se registar uma menor mortalidade, comparado com doses mais elevadas (Glien et

al., 2001). A par da pilocarpina procede-se à administração subcutânea de

metilescopolamina (1mg/Kg) de forma a reduzir os efeitos periféricos associados à

activação do sistema nervoso autónomo provocada pela pilocapina (Cavaleiro et al.,

2006). Esta substância produz várias alterações comportamentais, a seguir às quais se

desencadeiam crises límbicas motoras cerca de 30 minutos após a injecção do fármaco;

o estado 4 ou 5 desenvolve-se passados 10 minutos e a actividade crítica progride para

crises epilépticas límbico, que dura várias horas; todavia, o SE é mantido por cerca de

90 minutos, após os quais é feita administração de diazepam para parar a crise e

diminuir a taxa de mortalidade (Cavalheiro et al., 2006).

A primeira crise epiléptica espontânea ocorre após 2 a 75 dias após injecção de

pilocarpina e a frequência, no período crónico, varia consideravelmente entre os animais

(Cavalheiro et al., 2006), sendo que estes podem experimentar desde apenas poucas

crises até ao desenvolvimento de crises diárias. A maioria das crises no modelo de

pilocarpina preenchem os critérios dos estádios 3 a 5 da escala de Racine (crises

generalizadas).

A amígdala, o tálamo, o córtex olfactivo, a formação do hipocampo, o neocórtex

e a substância negra são as regiões mais sensíveis às lesões provocadas pela pilocarpina

(Turski et al., 1989; Fujikawa, 1996). O SE induzido provoca alteração nas funções

cognitivas, como está comprovado utilizando o Morris water-maze (Hort et al., 1999;

Grotick et al., 2008).

20

2.2.2 Modelo de Kindling

Denomina-se kindling o fenómeno pelo qual a aplicação repetitiva de um

estímulo eléctrico com limiar inicialmente subconvulsivo (via implantação crónica de

eléctrodos), produz alterações progressivas nas respostas diárias à estimulação (Goddard

et al., 1969). A sua grande vantagem reside na facilidade de indução das crises.

O modelo de kindling eléctrico aproxima-se mais às condições humanas de TLE,

em comparação com os modelos de crises induzidas quimicamente. Os primeiros

estádios do kindling representam um modelo de crises parciais; todavia, com a repetição

diária, observam-se crises parciais complexas secundariamente generalizadas. As áreas

cerebrais mais sensíveis ao kindling afectam toda a região límbica, bem como algumas

áreas prosencefálicas; o efeito mais dramático encontra-se após estimulação de

estruturas do lobo temporal como a amígdala e região cortical adjacente, incluindo os

córtex piriforme, perirrinal, insular e entorrinal (Mohapel et al., 1996).

Uma vez produzido, o estado kindled persiste indefinidamente, sendo induzido

através da estimulação diária, durante várias semanas a meses. Estima-se que um padrão

de 90 a 100 crises sejam necessárias para que o animal desenvolva um estádio de crises

espontâneas (Sutula e Ockuly, 2006). Aproximadamente 20 a 25% das aplicações de

kindling na via perfurante irão desencadear crises convulsivas de índice 4 ou mais

(Racine, 1972; Michalaskis et al., 1998). Tal é confirmado pelo estudo

electrofisiológico após estimulação bilateral desta via, em que se registaram descargas

das células granulares por um período de 4 horas, resultando em morte das células

musgosas do hilo, e que expressam a sub-unidade 2 do receptor de glutamato (GluR2),

em ratos geneticamente modificados para resistência ao KA. Estimulações mais

prolongadas da via perfurante, por um período de 24 horas, promovem uma perda

neuronal extensa na formação do hipocampo, no septo e no córtex entorrinal (Kienzler

et al., 2009).

21

2.2.2.1. Kindling Rápido

O kindling rápido é um método pelo qual se observam fenómenos de

epileptogénese que conduzem a uma hiperexcitabilidade límbica, assim como à

progressão de alterações cognitivas e resposta às drogas anti-epilepticas (Schmutz et al.,

1988; Loscher, 2002; Pitkanen e Sutula, 2002). Mazarati et al. (2007) demonstraram o

valor do kindling rápido no estudo das modificações da doença em termos de atraso do

desenvolvimento das crises motoras em resposta a estímulos repetitivos. Todavia, a

utilidade do kindling rápido como modelo de supressão da epileptogénese necessita de

uma validação mais completa.

A vantagem do kindling rápido reside na possibilidade de estudar as alterações

precoces ao rearranjo de redes neuronais identificadas nos casos crónicos de ELT,

podendo-se identificar formas de minimizar as consequências a longo prazo, pelo que as

epilepsias pediátricas poderão vir a beneficiar bastante deste tipo de estudos (Mazarati

et al., 2007). De acordo com Michalakis et al. (1998), as crises espontâneas não

provocam lesões nos tecidos, não se verificando diferenças histológicas entre crises

espontâneas e crises não espontâneas no hilo da cincunvolução denteada. Todavia, uma

única crise com duração pós-descarga de 82 segundos pode induzir fragmentação de

DNA das células granulares da fáscia denteada, bilateralmente (Bengzon et al., 1997).

Estes dados são confirmados com estudos de diferenciação de kindling rápido e lento,

com concomitante análise dos níveis de neurotransmissores e monoaminas. A

estimulação em massa (a cada 6 segundos, durante 40 estímulos) em ratos

geneticamente sensíveis ao kindling da amígdala, provocou crises cada vez mais

intensas associadas a um aumento progressivo do glutamato extracelular e diminuição

do GABA, promovendo também um aumento dos níveis de noradrenalina e dopamina,

mas não de serotonina. Estes resultados estão em linha com resultados prévios,

permitindo aferir que o sistema serotoninérgico desempenha um papel menos relevante

do que o noradrenérgico no kindling (Araki et al., 1983; During et al., 1992; e Shin et

al., 2004). Mais ainda, a estimulação repetitiva massiva da amígdala pode

diferencialmente afectar e/ou inibir os níveis de neurotransmissores nas crises, sendo a

sensibilidade a esta manipulação, geneticamente determinada (Shin et al., 2004).

Outra vantagem acrescida do kindling rápido é o estudo de drogas anti-

epilépticas e a grande diferença está na frequência diária dos estímulos. Os protocolos

22

de kindling tradicional implicam uma ou duas estimulações diárias, podendo levar

semanas a realizar-se, desenvolvendo-se o kindling da amígdala mais rapidamente que o

kindling da formação do hipocampo (McIntyre et al., 2002). Porém, os protocolos de

kindling rápido têm em conta a aplicação de vários estímulos por dia, permitindo que os

animais atinjam um estado de pleno kindling mais rapidamente, em comparação com o

kindling tradicional. A diferença é bastante significativa, já que os estudos de kindling

tradicional indicam que após 150 crises do estado 5 observa-se progressiva redução de

neurónios nas regiões CA1 e CA3 da formação do hipocampo, da circunvolução

denteada e do córtex entorrinal (Cavazos et al., 1991). Já no kindling rápido que induz

crises hipocampais recorrentes (Lothman e Williamson, 1993, 1994), os animais

atingem um estado de kindling total em 3 dias, obtendo-se uma resposta positiva do

levtiracetam ao quarto dia (Smedt et al., 2005). O kindling rápido da formação do

hipocampo promove morte neuronal generalizada nos ratos (Bengzon et al., 2007),

induzindo um aumento da apoptose nas células granulares da circunvolução denteada

após estimulação da via perfurante (Sloviter et al., 1996).

2.2.2.2. Kindling Rápido da Amígdala

As crises produzidas pelo kindling rápido da amígdala (REAK) estimulam a

neurogénese na circunvolução denteada, sem aparente morte neuronal. O modelo REAK

em ratinho promove uma oportunidade para testar, de uma forma bastante controlada, o

efeito das crises numa grande variedade de condições experimentais.

Em contraste com os modelos de SE em que se verifica extensiva morte

neuronal na formação do hipocampo (Borges et al., 2003; Smith et al., 2005), o REAK

provoca um aumento mitótico na região subgranular da circunvolução denteada, sem

que se verifique aumento da morte neuronal nesta região (Smith et al., 2005). Trata-se

de um modelo rápido de indução de crises focais fenotipicamente semelhantes às que

ocorrem na ELTm em humanos, e que regula a neurogénese em resposta às crises, não

somente devido à brevidade dos insultos, mas também à ausência de morte neuronal

(Smith et al., 2005).

23

2.2.2.3 Kindling Químico

O kindling químico é uma forma rápida de indução de crises generalizadas, de

índole mais grave e prolongada (Cavalheiro et al., 1991), estando associado a alterações

metabólicas incluindo hipóxia e hipertermia, e a lesão dos neurónios da formação do

hipocampo e alterações na neurogénese (Smith et al., 2005). Estes modelos baseiam-se

na administração repetitiva de substâncias químicas, e o PTZ parece ser bastante

relevante, dado o seu papel antagonista do sistema GABAérgico.

24

Capítulo 3.

Envolvimento da Serotonina na Génese da Actividade Convulsiva

A serotonina é um importante neurotransmissor encontrado nos SNC e sistema

nervoso periférico (SNP) dos mamíferos e o estudo do seu envolvimento na epilepsia é

necessário para a resolução do problema da resistência farmacológica (Loscher e

Leppik, 2002). Associada a fenómenos de regulação das crises (Bagdy et al., 2007),

participa em mecanismos inibitórios e excitatórios, consoante os neurotransmissores

activados, nomeadamente o GABA e o glutamato. Na verdade, altas concentrações

extracelulares de serotonina promovem um efeito protector e anticonvulsivante,

enquanto as reduzidas concentrações extracelulares agravam as crises (Clinckers et al.,

2004). No SNC, o principal centro de síntese e regulação de serotonina são os núcleos

do rafe, principalmente o núcleo dorsal do rafe (DR) (Moore e Halaris, 1975; Azmitia e

Segal, 1978) que projecta para várias estruturas do sistema límbico, especialmente a

formação do hipocampo e a amígdala.

Não é apenas a redução de serotonina mas também do seu precursor, o triptofano

(Trp), que estão envolvidos nos fenómenos de epileptogénese. Estudos realizados em

pacientes com epilepsia indicam diminuição dos níveis de Trp no plasma e no líquido

cefalorraquidiano (Ko et al., 1993; Marion et al., 1985), verificando-se uma redução de

cerca de 30% na taxa de captação cerebral de Trp nestes pacientes, quando comparados

com os controlos (Mainardi et al., 2008). Baixas concentrações de Trp na dieta durante

o desenvolvimento produz diminuição da taxa de síntese de 5-HT, afectando o

desenvolvimento e maturação dos interneurónios corticais GABAérgicos (Orozco-

Suárez, 1997, Thompson, 1998), e serotoninérgicos (Orozco-Suarez et al., 2003) no

córtex cerebral e nos núcleos do rafe, respectivamente. Estes factos promovem

alterações da excitabilidade cortical, contribuindo, em parte, para o aumento da

actividade convulsiva (Feria Velasco et al., 2008). Vários estudos revelam que a 5-HT é

essencial para a activação dos neurónios GABAérgicos e, desta forma, inibir a

actividade epileptiforme.

Nos últimos anos os estudos das vias serotoninérgicas têm vindo a reforçar o

papel desta monoamina na modulação da excitabilidade neuronal em várias áreas

cerebrais, via activação dos cerca de 14 receptores descritos, cuja distinção tem por base

as diferentes características estruturais, funcionais e farmacológicas (Brandley et al.,

25

1986; Hoyer et al., 1994). Existem diferentes tipos de neurónios que expressam

receptores serotoninérgicos no SNC e, pelo menos, os 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2C e 5-HT7

(Hoyer et al., 1994; Barnes e Sharp, 1999) e 5-HT4 (Tokarski et al., 2002) estão

presentes nos neurónios GABAérgicos e glutamatérgicos da formação do hipocampo

e/ou córtex cerebral. Os receptores serotoninérgicos acoplados à proteína G e o receptor

5-HT3 ligado a canais iónicos podem directa ou indirectamente modificar a condutância

iónica das membranas celulares, resultando em despolarização ou hiperpolarização

neuronal (Barnes e Sharp, 1999).

O córtex entorrinal (ERC), que recebe fortes projecções 5-HT do núcleo do rafe

e as envia para a formação do hipocampo e outras regiões corticais, expressa grandes

quantidades de receptores 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT3, parecendo ser o local de modulação

da actividade bioeléctrica. A aplicação de serotonina no ERC inibe a transmissão

excitatória (Schmitz et al., 1995) e reduz a excitabilidade neuronal via activação dos

canais de K+ (Grunschlag et al., 1997; Ma et al., 2007). Mais recentemente estes dados

foram apoiados pelos trabalhos de Deng e Lei (2007), que demonstraram pela primeira

vez que a 5-HT aumenta a síntese do GABA, por facilitação do TASK-3 – um tipo de

canal K2p, e inibe a actividade paroxística em modelos animais com concentrações

reduzidas de Mg2+, na camada III do ERC, via activação dos receptores 5-TH2A. Outros

autores referem que a 5-HT excita as células piramidais de CA1 (Schmitz et al., 1995) e

as células granulares da circunvolução denteada (Levkovitz e Segal, 1997) via inibição

dos interneurónios GABAérgicos.

3.1. Receptores 5-HT1

Os receptores 5-HT1A estão localizados tanto a nível pós-sináptico nos neurónios

do sistema límbico, como a nível dos dendritos e do soma dos neurónios dos núcleos do

rafe do mesencéfalo e protuberância. No prosencéfalo, estes receptores estão presentes

nos neurónios piramidais do neocórtex, bem como nas células granulares e piramidais

da formação do hipocampo (Francis et al., 1992). Em ratos tratados com KA, verifica-se

uma correlação significativa entre a perda dos receptores 5-HT1A e a perda neuronal na

região CA1 durante a fase crónica após injecção de KA (Van Bogaert et al., 2001).

26

Os receptores 5-HT1A expressam-se em neurónios serotoninérgicos do núcleo do

rafe, em neurónios colinérgicos no septo e, provavelmente, em neurónios

glutamatérgicos do córtex e formação do hipocampo (Francis et al., 1992).

Alguns investigadores referiram que a serotonina inibe a actividade

epileptiforme por activar o receptor 5-HT1A (Salgado-Commissariat e Alkadhi, 1997) e

hiperpolarizar directamente as células piramidais no córtex cerebral (Colino e Halliwell,

1987). Estes receptores estão predominantemente localizados em regiões límbicas e os

estudos em animais sugerem que a 5-HT, por via destes receptores, medeia um efeito

anti-epiléptico e anticonvulsivo.

Apesar de se reconhecerem vários tipos de receptores, os 5-HT1A são a classe

mais envolvida na epileptogénese e vários estudos apontam para a importância da sua

redução em casos de epilepsia temporal. Os estudos no Homem utilizando o PET

indicam que os receptores serotoninérgicos 5-HT1A pós-sinápticos estão em défice na

formação do hipocampo ipsilateral ao foco epiléptico em pacientes com (Ito et al.,

2007) e sem atrofia hipocampal na RMN (Theodore, 2004; Toczek et al., 2003). Outros

estudos evidenciam um défice de 5-HT1A na amígdala, no córtex do cíngulo anterior,

córtex temporal lateral, na formação do hipocampo contralateral e nos núcleos do rafe

(Savic et al., 2004), estando de acordo com as evidências em animais, demonstrando o

papel da amígdala e da formação do hipocampo (Andrade et al., 1986 e Colino et al.,

1987) no controle da hiperexcitabilidade neuronal. Além disso, o neocórtex que envolve

o foco epiléptico de pacientes com ELTm apresenta défice de ligações de 5-HTT em

todas as camadas corticais, especialmente nas camadas I e II, enquanto as camadas V e

VI apresentam aumento nas ligações dos receptores 5-HT4 (Rocha et al., 2007).

Fica a dúvida se esse défice é causa ou consequência das crises. Note-se que a

perda selectiva de receptores 5-HT1A nos interneurónios da região CA1 de musaranhos

adultos sensíveis às crises pode ser uma modificação compensatória adquirida, induzida

pela repetição de crises (Kim et al., 2007).

A activação dos receptores 5-HT1A pré-sinápticos e pós-sinápticos têm efeitos

opostos: a activação dos 5-HT1A pré-sinápticos nos neurónios glutamatérgicos pode

induzir convulsões por aumento da síntese de glutamato, enquanto a activação dos 5-

HT1A pós-sinápticos nos mesmos neurónios glutamatérgicos tem um efeito

anticonvulsivo (Kim et al., 2007)

27

3.2. Receptores 5-HT2

Os receptores mais estudados e com maior impacto na epilepsia são os 5-HT2C,

apresentando-se em elevada concentração no plexo coroideu, apesar dos locais de

ligação destes receptores estarem difusamente distribuídos e presentes em áreas do

córtex cerebral (piriforme, cíngulo e retrosplénico), sistema límbico (nucleus

accumbens, formação do hipocampo e amígdala) e no núcleo caudado e substância

negra. A sua função ainda não está claramente definida, dividindo-se os vários estudos

pelas acções proconvulsivantes, como anticonvulsivantes.

A activação dos receptores 5-HT2 na formação do hipocampo e no corpo

estriado pode facilitar as crises induzidas pela estimulação muscarínica de várias áreas

do sistema límbico (Freitas et al., 2004) em modelos de SE induzido por pilocarpina.

Neste mesmo modelo de pilocarpina, o SE induzido não é capaz de alterar a densidade

dos receptores 5-HT2C na formação do hipocampo, mas pode levar a uma diminuição da

afinidade dos 5-HT2C para a 5-HT (Freitas et al., 2005)

A presença dos 5-TH2C no córtex piriforme e substância negra foi demonstrada

pela resposta electrofisiológica mediada (Sheldon e Aghajanian, 1991) e, quando

activados, verifica-se aumento da actividade da fosfolípase C no plexo coroideu,

iniciando-se uma excitação neuronal em várias regiões cerebrais (Sheldon e Aghajanian,

1991). Todavia, esta ideia não é apoiada por outros estudos, nos quais se verificou um

efeito anti-convulsivante mediante a supressão da hiperexcitabilidade neuronal

(Applegate e Tecott, 1998); além disso ratinhos geneticamente modificados com

bloqueio dos receptores 5-HT2C são muito mais susceptíveis a crises audiogénicas

(Tecott et al., 1995; Brennan et al., 1997; Applegate et al., 1998).

3.3. Receptores 5-HT3

Os receptores 5-HT3 encontram-se no SNC e SNP, sendo os núcleos do tronco

cerebral (núcleo dorsal do vago e núcleos do nervo trigémeo), a área postrema e o

núcleo solitário, e a substância gelatinosa em todos os níveis da medula espinal, as

regiões que apresentam maior densidade destes receptores (Hoyer et al., 1994). Embora

em menor densidade, estes receptores também se encontram no córtex cerebral e em

28

regiões límbicas como a formação do hipocampo, a amígdala e núcleo medial da

habénula. O seu envolvimento na epilepsia é pouco claro e os estudos com estes

receptores são escassos, mas parece que a sua activação desencadeia uma rápida

despolarização por abertura de canais selectivos de catiões (Peters et al., 1992).

3.4. Receptores 5-HT4

Os receptores 5-HT4 expressam-se em estruturas límbicas (hipotálamo, nucleus

accumbens e amígdala), nos tubérculos olfactivos, no hipocampo, nos núcleos da base e

na substância negra, estando bem documentado o seu envolvimento nos processos de

aprendizagem e memória (Engel et al., 1996; Bockaert et al., 1998), assim como no

aumento da susceptibilidade para as crises (Compan et al., 2004). A activação dos 5-

HT4 aumenta a actividade epileptiforme na formação do hipocampo de ratos (Tokarsky

et al., 2002), diminuindo ao mesmo tempo a síntese de GABA e aumentando a síntese

de serotonina (Bockaert et al., 1998).

3.5. Receptores 5-HT7

A concentração de receptores 5-HT7 é relativamente elevada no tálamo,

hipotálamo e formação do hipocampo, apresentando-se em menor concentração no

córtex cerebral e na amígdala (Stowe e Barnes, 1998). A actividade biológica dos

ligandos sugere que os 5-HT7 podem estar envolvidos na dor, enxaqueca, epilepsia,

depressão, ansiedade, memória e regulação dos ciclos circadianos (Lovenberg et al.,

1993; Thomas et al., 2003). Os primeiros estudos destes receptores são a favor de um

efeito proconvulsivante; todavia, estudos mais recentes apontam estes receptores como

anticonvulsantes.

Assim, a aplicação de SB 269970, um antagonista dos receptores 5-HT7, mostra

actividade antidepressiva (Wesolowska et al., 2006) e aumenta a acção das drogas

antidepressivas (Wesolowska et al., 2007), como imipramina (um antidepressivo

tricíclico) ou de citalopram (um bloqueador selectivo da recaptação de 5-HT). Estes

diminuem a resposta da região CA3 do hipocampo à activação dos receptores 5-HT7

29

(Tokarski et al., 2005) e parecem actuar no núcleo supra-quiasmático, onde sub-regulam

os 5-HT7, após tratamento crónico (Mullins et al., 1999). Estes resultados vão ao

encontro dos resultados obtidos por Pericic (2007), onde se demonstra que o 5-CT (um

potente agonista dos 5-HT7) exerce acções anticonvulsivantes em ratos submetidos ao

stress; este efeito anticonvulsivo foi abolido pelo SB 269970 (Peričić e Strac, 2007).

Nem todas as classes de antidepressivos estão estudadas e alguns revelam mesmo não

possuir qualquer efeito. É o caso da tiapentina, um antidepressivo atípico facilitador da

recaptação da serotonina, e do hidroaspartato de lítio, cujo uso não resulta na

modificação da resposta hipocampal à activação dos receptores 5-HT7 (Pitra et al.,

2007).

Por outro lado, vários autores apoiam a hipótese de que o aumento da

excitabilidade neuronal está associada ao aumento da soma de potenciais de acção pós-

sinápticos excitatórios e inibitórios, contribuindo para a formação da actividade

bioeléctrica do cérebro, apoiando o efeito pro-convulsivo destes receptores. Estudos

electrofisiológicos têm mostrado que a activação dos receptores 5-HT7 aumenta a

excitabilidade da membrana neuronal nos gânglios dorsais espinhais (Cardenas et al.,

1999), na formação do hipocampo (Bacon e Beck, 2000; Gill et al.; 2002; Tokarski et

al., 2003), especialmente na região CA3 (Stowe e Barnes, 1999; Gill et al., 2002), no

tálamo (Chapin e Andrade, 2001a,b) e no córtex pré-frontal (Beique et al., 2004),

resultando em surtos intermitentes de actividade paroxística (Chapin e Andrade,

2001a,b, Gill et al., 2002; Tokarski et al., 2003). Assim a depleção do receptor 5-HT7

diminui a susceptibilidade para a actividade paroxística e para o fenótipo resistente às

crises, parecendo existir uma modificação adaptativa ao longo do desenvolvimento.

Neste âmbito, Beique et al., (2004) concluem que no córtex pré-frontal se verifica uma

regulação de receptores de 5-HT que controlam a excitabilidade de neurónios

piramidais. A serotonina promove uma despolarização na camada V durante os 6 a 12

dias do período pós-natal, surgindo gradualmente uma hiperpolarização durante a

terceira semana pós-natal. Estas ou outras modificações que ocorrem em áreas do

cérebro mais directamente relacionadas com a epilepsia, como a formação do

hipocampo, apesar de serem ainda pouco conhecidas, sugerem que as modificações

adaptativas à perda da despolarização induzida pelos 5-HT7 pode ter contribuído para o

actual fenótipo observado na predisposição para as crises (Witkin et al., 2007). Outros

30

estudos são necessários para determinar o mecanismo exacto do efeito proconvulsivante

da depleção de receptores 5-HT7.

A depressão é um ponto comum aos animais pós-SE, embora coexista com várias

alterações comportamentais e bioquímicas congruentes com um estado depressivo,

levando a um desenvolvimento sintomatológico de anedonia (a perda da capacidade de

sentir prazer, Mazarati et al., 2008), um dos sintomas-chave em indivíduos deprimidos,

(Overstreet et al., 2005), a par das alterações da memória, das funções locomotoras e

emocionais (Groticke et al., 2008) que acompanham os casos de ELTm. Estudos

realizados em animais geneticamente modificados demonstram défices de aprendizagem

dependentes das alterações da formação do hipocampo e aumento dos níveis de

ansiedade (Sarnyai et al., 2000).

Apesar de já nas décadas de 70 e 80 do século passado a investigação básica

demonstrar que as concentrações reduzidas de 5-HT estavam intimamente relacionadas

com a susceptibilidade das crises em modelos animais (Lazarova et al., 1983) e no

homem a ideia de que os antidepressivos podem ser utilizados no tratamento da

epilepsia é recente. Somente após a década de 90 foi estabelecido o papel da serotonina

na patogénese da epilepsia; antes desta data, os inibidores selectivos da recaptação de

serotonina (SSRIs), utilizados até então apenas como agentes antidepressivos, não

existindo indicação para tratamento de depressão em pacientes com epilepsia, apesar

das já existentes evidências contrárias: Boggan e Seiden em 1973 mostraram que o 5-

hidroxitriptofano, um precursor da serotonina, tinha efeito antiepiléptico. Também

Truscott (1975) descrevera o efeito da fenilalanina e do 5-hidroxitriptofano nas crises de

ratinhos

É certo que a administração repetida de antidepressivos exerce uma influência

pronunciada nos sistemas serotoninérgicos cerebrais. Todavia, estes sistemas não estão

totalmente compreendidos e apenas recentemente se chegou a um consenso sobre o uso

de antidepressivos na epilepsia. Como é evidente, o efeito antidepressivo é útil porque

os pacientes com epilepsia refractária apresentam fortes sinais e sintomas de depressão.

Por outro lado parecem aumentar a latência das crises epilépticas, diminuindo a sua

intensidade e duração. No entanto nem todos os antidepressivos podem ser usados,

existindo alguns que estão mesmo contra-indicados.

31

3.6. Antidepressivos como agentes proconvulsivantes

Como referido, os antidepressivos estavam contra-indicados em indivíduos

epilépticos, dado ocorrerem crises em pacientes com história intencional ou acidental de

overdose de antidepressivos tricíclicos (Liper, 1994; Baselt, 2000). Além disso os

tratamentos da depressão ou outras doenças psiquiátricas com antidepressivos tricíclicos

registam alguns casos de crises convulsivas (Rosenstein et al., 1993). O uso de doses

terapêuticas e overdose de SSRIs e inibidores da MAO conduziram a observações

similares (Marangel et al., 1999; Barry et al., 2001). A apoiar a ideia proconvulsiva dos

antidepressivos surgem os estudos epidemiológicos, que mostram que os indivíduos que

tomam antidepressivos têm um maior risco de convulsões, quando comparados com a

população geral (Hauser, 1997).

3.7. Antidepressivos como agentes anticonvulsivantes

Nos últimos anos a teoria anticonvulsivante tem vindo a ganhar espaço e vários

são os estudos que a apoiam, contornando as evidências prévias de aumento das crises

em indivíduos sujeitos a terapêutica antidepressiva. Os estudos animais indicam que a

depleção de serotonina no SNC não altera a acção anticonvulsivante da fluoxetina

(FLX), deixando as camadas profundas do colículo superior como o local de acção

anticonvulsivante da FLX na atenuação de crises tónico-clónicas generalizadas em

GERPs (geneticaly epilepsy-prone rat). Se o local de acção parece ser o colículo

superior, o mecanismo poderá estar relacionado com a sub-regulação dos receptores de

galanina tipo 2 (GalR2). Na verdade, a administração crónica de fluoxetina sub-regula

os GalR2, mas não os GalR1 no DR (Lu et al., 2005). Dado que os GalR2 promovem a

transmissão serotoninérgica, esta acção da fluoxetina pode ser um dos mecanismos do

efeito antidepressivo. Alguns autores defendem que o aumento da transmissão

serotoninérgica pode reduzir selectivamente a sensibilidade dos circuitos cerebrais para

a iniciação das crises. Este fenómeno pode explicar, pelo menos parcialmente, a

actividade anticonvulsiva da FLX. Ainda assim, existem vários estudos clínicos que

apoiam esta acção, visto que a FLX aumenta o efeito anticonvulsivante de várias drogas

antiepilépticas como a fenitoína e a carbamazepina (Mamiya et al., 2001). Em pacientes

32

com ELT mesial a administração de FLX reduz a frequência das crises parciais

complexas (Albano et al., 2006); já nos animais submetidos a FLX verifica-se no

estádio pós-SE a inibição de crises espontâneas recorrentes após a administração deste

fármaco (Hernandez et al., 2002). O efeito antiepiléptico nas crises induzidas por

estimulação hipocampal apenas se observa após tratamento crónico e persiste por uma

semana após o fim do tratamento com FLX (Wada et al., 1995, Mazarati et al., 2008). É

de notar que o tratamento crónico com fluoxetina exibiu alguns efeitos favoráveis nas

propriedades anticonvulsivantes de antiepilepticos (como a carbamazepina, fenitoína e o

valproato de sódio), resultando, contudo, de interacções farmacocinéticas (Borowicz,

2007).

O efeito antidepressivo induzido pelos fármacos aumenta a actividade

serotoninérgica, facto que resulta numa acção anticonvulsivante (Jobe e Brawning,

2005). Esta ideia é apoiada pelos estudos realizados em GERPs, que apontam uma

diminuição de noradrenalina e serotonina no encéfalo, neste modelo de epilepsia (Jobe

et al., 1995; Jobe, 2004). Os GERPs são um bom modelo para a avaliação

anticonvulsivante da fluoxetina, dado que a predisposição destes animais para as crises

é parcialmente dependente dos défices serotoninérgicos no cérebro (Dailey et al., 1992)

Estes défices ocorrem tanto a nível pré-sináptico como pós-sináptico e tanto os GERP3

(animais com 3 tipos de crises) como os GERP9 (animais com 9 tipos de crises)

apresentam uma magnitude semelhante de défices de serotonina. As alterações pré-

sinápticas surgem, pelo menos parcialmente, devido a uma perda de terminais

serotoninérgicos e noradrenérgicos, enquanto os défices pós-sinápticos surgem da falha

de regulação de receptores para compensar quantitativamente as reduções nas

concentrações (Nicoletti et al., 1986). Estes ensaios foram todos realizados com doses

terapêuticas. Os estudos animais indicam que elevadas doses podem activar outros

processos biológicos podem aumentar a susceptibilidade para convulsões (Jobe e

Browning, 2005).

Apesar da FLX inibir o metabolismo da 5-HT e interromper o SE induzido pela

excitabilidade cerebral em ratos pós-SE, falha na melhoria dos comportamentos

associados ao SE. Ainda assim, estão associados efeitos anticonvulsivantes da FLX em

modelos de electrochoques (Borowicz et al., 2007), verificando-se um aumento no

limiar da crise, bem como uma potenciação da actividade anti-electrochoque da

carbamazepina, difenilhidantoina e fenobarbital (Borowick et al., 2006).

33

A imipramina e o citalopram (antidepressivo tricíclico e inibidor selectivo da

recaptação de serotonina, respectivamente) exibem efeitos antidepressivos, a par das

suas propriedades anticonvulsivantes nos modelos animais de pilocarpina, facilitando

directamente a síntese de serotonina (Albano et al., 2006; Smolders et al., 2008). Este

efeito anticonvulsivo que os antidepressivos exibem e a simultânea facilitação

serotoninérgica (e também dopaminérgica) da formação do hipocampo leva a colocar a

hipótese de esta estrutura é um importante local de acção anticonvulsiva-antidepressiva

combinada, e que a ausência desta acção está associada ao bloqueio directo do aumento

destas monoaminas nesta região.

Os estudos mais recentes vêm confirmar que o sistema serotoninérgico não

contribui para as propriedades proconvulsivantes dos antidepressivos mas que, mesmo

assim, é preferível o uso de SSRIs em detrimento dos tricíclicos (cuja sobredosagem

causa convulsões) e dos inibidores da MAO (Jobe e Browning, 2005). Assim se reforça

a ideia de que o uso de antidepressivos em doses terapêuticas promove aumento da

transmissão noradrenérgica e serotoninérgica, actuando como agentes

anticonvulsivantes, enquanto overdoses de antidepressivos activam outros processos

biológicos que podem ser proconvulsivantes. Talvez a resposta positiva dos SSRI esteja

na sua capacidade de prevenir a atrofia do hipocampo por estimulação da neurogénese

das células (McEwen et al., 2005) e por mecanismos de neuroprotecção. Cada vez se

verifica um maior incentivo clínico para o uso de SSRIs, dado que estes têm um efeito

positivo do âmbito de quadros clínicos depressivos e de epilepsia. Assim, são seguros

quando administrados com precaução em doentes com epilepsia e depressão e a sua

utilização não deve ser menosprezada (Kondziella et al., 2009).

34

Capítulo 4.

Envolvimento da Serotonina nos Défices Comportamentais e nas Alterações

Morfológicas Associadas à Epilepsia

O principal desafio em qualquer estudo experimental na área da epilepsia é

determinação se as modificações estruturais e/ou funcionais que ocorrem como resposta

a lesões cerebrais são causa ou consequência do desenvolvimento da epilepsia. No que

diz respeito ao envolvimento da serotonina nestes processos, os estudos são ainda muito

escassos, sendo necessário avaliar todo o eixo serotoninérgico, desde o núcleo dorsal do

rafe até ao córtex cerebral. De facto, já existem alguns dados a nível dos locais de

síntese da 5-HT, que relacionam este sistema serotoninérgico com a epileptogénese. Por

exemplo, o neuropéptideo galanina modula as crises límbicas dado que interage com a

produção de serotonina nas populações neuronais que projectam para a formação do

hipocampo e ERC. O núcleo dorsal do rafe apresenta dois tipos de receptores de

galanina, GalR1 e GalR2, que desempenham efeitos opostos no que concerne á

epileptogénese: a activação dos GalR1 reduz a síntese de seronotina no núcleo dorsal da

rafe e, consequentemente, na formação do hipocampo (efeito pró-convulsivante),

enquanto que a activação dos galR2 aumenta a síntese de 5-HT nestas mesmas regiões,

tendo, por conseguinte, um efeito anti-convulsivante (Mazaratti et al., 2005).

A estimulação da via perfurante promove descargas prolongadas das células

granulares, o que causa extensas alterações na formação do hipocampo, acompanhada

de lesões extrahipocampais restritas ao septo e ERC, sprouting das fibras musgosas e

crises convulsivas (Kienzler et al., 2009). A estimulação prolongada da via perfurante

produz esclerose hipocampal, reorganização sináptica e um SE permanente. A injecção

intra-hipocampal de KA produz hipertrofia maciça da camada granular (Suzuki et al.,

1995; Bouilleret et al., 1999; Riban et al., 2002), que aparentemente resulta da perda de

expressão de reelina que normalmente mantém a estrutura laminar da camada granular

(Heinrich et al., 2006). Seria de total interesse o estudo das alterações serotoninérgicas

decorrentes da estimulação desta via, dado que os dados anatomo-funcionais são

escassos e pouco claros, no que diz respeito ao envolvimento da serotonina nas crises

epilépticas.

Das diversas classes de receptores 5-HT estudados, os 5-HT1A são talvez os mais

investigados e os estudos indicam degenerescência destes receptores nos processos de

35

epilepsia. Será a degenerescência destes receptores um dos fenómenos responsáveis

pela epileptogénese, ou este achado é consequência das crises? Kim e colaboradores,

utilizando ratos geneticamente modificados, estudaram musaranhos resistentes e

musaranhos sensíveis á epilepsia, verificando que a sub-regulação dos receptores pós-

sinápticos 5-HT1A nos neurónios GABAérgicos da formação do hipocampo de

musaranhos sensíveis pode ser uma resposta compensatória para aumentar a inibição

GABAérgica, regulando assim as crises; verificaram também uma redução selectiva dos

5-HT1A nos interneurónios da região CA1 em musaranhos sensíveis adultos, o que

reflecte uma modificação compensatória, induzida pelas crises repetidas (Kim et al.,

2007).

Mais recentemente, estudos em ratos geneticamente modificados, em que se

verifica um grande aumento de fibras serotoninérgicas, revelam que esta lhes confere

resistência às crises generalizadas induzidas por KA; por outro lado, o tratamento

prolongado com para-cloranfetamina (PCA), um dos inibidores da síntese de serotonina

restabeleceu a susceptibilidade às crises, confirmando que os défices de serotonina estão

envolvidos nos processos degenerativos e na propagação da actividade convulsiva.

36

Capítulo 5.

Alterações Serotoninérgicas Periféricas Associadas à Epilepsia

Quando o tema Epilepsia é abordado, o conceito imediato que nos surge limita

esta doença à ideia geral de que a epilepsia resulta de uma hiperexcitabilidade cerebral

que induz alterações cerebrais, menosprezando-se os estudos periféricos. Este erro

frequente traduz a escassez de estudos a nível sanguíneo, quando, de facto, parece haver

uma forte correlação entre as alterações serotoninérgicas centrais e as alterações no

transportador da serotonina (SERT) acoplado à membrana das plaquetas sanguíneas;

assume-se que este transportador reflecte, embora através de mecanismos ainda

desconhecidos, a correlação funcional entre as plaquetas humanas e o SERT cerebral

(Rausch et al., 2005; Uebelhack et al., 2006).

Importa referir que a 5-HT presente nas plaquetas sanguíneas deriva da 5-HT

sintetizada pelas células enterocromafina do gut, a principal fonte de serotonina

periférica (Gershon, 2004) e funciona como neurotransmissor no sistema nervoso

entérico (Gershon, 2003). Parte desta 5-HT entra na circulação sanguínea, e apesar da

maior parte ser eliminada pelo fígado, pulmões e outros órgãos (Anderson et al., 1987),

parte dela é captada pelas plaquetas através da acção do SERT. Comparada com a 5-HT

das plaquetas, a concentração de 5-HT livre no sangue humano é negligível (Anderson

et al., 1987; Beck et al., 1993). Assim, a 5-HT plasmática deriva principalmente das

plaquetas, que há já alguns anos têm sido consideradas como um modelo periférico de

neurónios serotoninérgicos pré-sinápticos. (Pletscher et al., 1980)

5.1. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com epilepsia

Os estudos que estabelecem uma relação entre o SERT plaquetário e a

ocorrência de crises convulsivas em pacientes com epilepsia são escassos e englobam

apenas os casos nos quais se verifica um controlo farmacológico das crises. Neste

contexto, as convulsões são escassas, ocorrendo em intervalos de vários dias a meses.

Nas amostras sanguíneas destes doentes, após tratamento com paroxetina, verifica-se

uma diminuição da densidade dos SERT nas plaquetas sanguíneas, após episódios

recentes (há menos de 4 dias) de crises convulsivas, revertendo-se este efeito alguns

37

dias depois (Cupello et al., 2005). Assumindo que estes resultados representam eventos

bioquímicos que têm lugar no tecido cerebral, os dados sugerem que este fenómeno

representa parte de uma reacção homeostática do cérebro, em resposta à

hiperexcitabilidade (Albano et al., 2006). Todavia, estes achados não se verificam nos

pacientes com crises psicogénicas pseudocrises (Cuppelo et al., 2008), pelo que a

determinação da densidade dos SERT nas plaquetas poderá ser um método viável para o

diagnóstico diferencial entre as verdadeiras crises convulsivas e as pseudocrises.

O estudo dos SERT plaquetários extende-se aos estudos farmacológicos. O

topiramato, um antiepilépticoi de elevado espectro de acção utilizado tanto em crianças

como em adultos, pode mesmo influenciar o metabolismo da 5-HT em crianças

afectadas pela epilepsia; são contudo necessários mais estudos para estabelecer até que

ponto estas modificações plasmáticas indicam efeitos directos do topiramato no sistema

serotoninérgico (Grosso et al., 2008).

Nenhum dos estudos encontrados na literatura contempla casos de epilepsia do

lobo temporal associada a esclerose hipocampal, que confira um carácter de

refractabilidade farmacológica. Neste âmbito, são ainda desconhecidas as alterações nos

SERT plaquetários em pacientes que experimentam convulsões frequentes, cuja

periodicidade de ocorrência das crises não permite, supostamente, a reversão dos efeitos

nos SERT, descritos por Cupello, em 2005.

5.2. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com alterações

emocionais

A epilepsia está associada a diversas patologias do foro psiquiátrico, como

previamente descrito. A patofisiologia de várias destas doenças, como as desordens de

humor, estão associadas a alterações nos receptores serotoninérgicos e no SERT das

plaquetas (Alda e Hrdina, 2000; Mendelson, 2000). Além disso, o efeito terapêutico dos

SSRI associados a modificações adaptativas que afectam a via fosforilativa intracelular.

Também nos pacientes com desordens de pânico e ansiedade estão descritas alterações

serotoninérgicas associadas às plaquetas, nomeadamente modificações nos níveis de

SERT, assim como alterações nos receptores 5-HT1A (Lesch et al., 1992).

38

Em doentes deprimidos verificam-se alterações específicas da densidade dos

SERT das plaquetas (Paul et al., 1981; Langer et al., 1982; Langer etal., 1987; Mellerup

et al., 1993; Uebelhack et al., 2006). Estes estudos periféricos, quando analizados em

paralelo com os estudos do sistema nervoso central, reforçam a ideia geral de que a

depressão e a epilepsia partilham de uma reacção comum aos sistema serotoninérgico

cerebral, sendo a alteração da densidade dos SERT uma dessas reacções, e que esta se

traduz a nível cerebral e a nível sanguíneo.

39

Contribuição PessoalContribuição PessoalContribuição PessoalContribuição Pessoal

40

Objectivos Gerais

Embora existam claras evidências de que a serotonina participa activamente na

regulação das crises convulsivas associadas à ELT por esclerose mesial hipocampal,

existe ainda um número significativo de questões que necessitam de resposta. Em

particular, permanece pouco claro como este neuromediador está envolvido no processo

de epileptogénese, assim como no desenvolvimento de alterações cerebrais estruturais e

funcionais, associados com doenças neurológicas. Neste âmbito, as principais técnicas

utilizadas para o estudo do papel das vias serotoninérgicas ascendentes na ELT

fundamentam-se apenas nas análises electrofisiológica e bioquímica, em diversos

modelos animais. Embora exista um consenso em relação ao papel pró ou

anticonvulsivante de alguns sub-tipos de receptores serotoninérgicos, há ainda classes

destes receptores cuja acção é ainda desconhecida ou ambígua. Por outro lado,

praticamente não existem estudos sobre as alterações nas vias serotoninérgicas

ascendentes associadas com os diversos tipos de crises epilépticas. O estudo de

interacções de serotonina e mecanismos de plasticidade associados à epileptogénese é

bastante recente e ainda limitado à investigação farmacológica.

Realizada a revisão bibliográfica sobre o papel da 5-HT na ELT, deparamo-nos

com escassez de estudos comportamentais e morfológicos que incluam esta amina, pelo

que ainda estão por estudar vários aspectos relacionados com os seguintes pontos:

1. Paralelismo entre crises convulsivas e a integridade funcional e estrutural do

sistema serotoninérgico do SNC;

2. Papel da serotonina na epileptogénese e no desenvolvimento das alterações

comportamentais e morfológicas, resultantes da actividade convulsiva;

3. Potencial antiepiléptico e neuroprotector dos agonistas da serotonina;

4. Relação entre a estimulação do nervo vago e a actividade do sistema

serotoninérgico no cérebro, e desenvolvimento das alterações

comportamentais e estruturais associadas com a actividade convulsiva.

41

A epilepsia provoca lesão neuronal, ou a lesão neuronal provoca epilepsia? Esta

é uma das questões que todos os epileptologistas gostariam de ver definitivamente

resolvida; todavia, os estudos continuam a revelar resultados díspares e a extrapolação

dos ensaios em modelos animais para a realidade humana revela-se difícil e controversa.

Acredita-se que o estudo morfo-funcional a ser desenvolvido com os recursos existentes

no Centro de Morfologia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade do

Porto pode vir a contribuir, na qualidade de principal objectivo deste projecto, para a

resolução dos paradigmas acima mencionados. Pode ser um passo para melhorar o

controlo das crises epilépticas, combater a refractabilidade farmacológica e diminuir o

número de casos cirúrgicos. Os objectivos específicos de cada uma das tarefas acima

referidas são desenvolvidos de seguida.

42

Planeamento das Tarefas

43

Tarefa 1.

Efeito das crises convulsivas sobre a via serotoninérgica ascendente

O objectivo principal deste trabalho é definir o tipo de alterações morfológicas e

funcionais na via serotoninérgica ascendente, consequentes a crises convulsivas, em

modelos animais de ELT. Para tal, pretende-se fazer um estudo do núcleo dorsal do

rafe, cujos neurónios sintetizam a serotonina, bem como de estruturas ricas em

receptores de 5-HT, como é o caso da formação do hipocampo e do córtex entorrinal.

Proceder-se-à à estimativa do número total de neurónios destas regiões encefálicas

expressam receptores de 5-HT, bem como à densidade das fibras serotoninérgicas,

usando para o efeito, métodos estereológicos unbiased. O passo seguinte versa a análise

destes mesmos parâmetros, mas em animais submetidos a status epilepticus (SE)

prolongado induzido químicamente pelo KA.

Para este estudo serão usados 18 ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10

semanas de idade, distribuídos por 2 grupos (9 animais por grupo). O primeiro grupo

sera compost por ratos que serão submetidos a SE previamente induzido por KA,

enquanto os ratos do segundo grupo (não tratados) serão utilizados como controlos.

Os cérebros dos animais serão seccionados com o vibratome e tratados

imunohistoquimicamente com anticorpos policlonais (Chemicon International). Em

cada grupo (KA e controlo), serão usados cortes seriados para cada anticorpo, a saber:

anticorpos para 5-HT, 5-HTT, receptores 5-HT1A e 5-HT4.

Será efectuada análise morfométrica (número de célulasusando métodos

estereológicos unbiased. A densidade das fibras serotoninérgicas sera estimada usando

sistemas de grelhas apropriados, como previamente descrito.

Com este trabalho pretende-se fazer um estudo morfológico de várias regiões

responsáveis pelo papel pró- ou anti-convulsivo da serotonina, abordando para tal os

seguintes parâmetros:

44

(1) Número total de neurónios e volume neuronal que sintetizam serotonina no

núcleo dorsal do rafe, em condições normais (controlo) e após indução de SE por AC;

(2) Número total de neurónios que expressam receptores de 5-HT1A na formação

do hipocampo e no córtex entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de

SE por AC;

(3) Número total de neurónios que expressam receptores de 5-HT4 na formação

do hipocampo e no córtex entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de

SE por AC;

(4) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e no córtex

entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de SE por AC.

45

Tarefa 2.

Alterações comportamentais e morfológicas resultantes das crises

convulsivas após inibição da síntese de serotonina no núcleo dorsal do rafe

Os avanços na compreensão da transmissão serotoninérgica cerebral têm vindo a

evidenciar o papel regulador desta amina no início e propagação da actividade

epiléptica. Dado que os estudos morfológicos envolvendo a serotonina são escassos,

este trabalho tem como principal objectivo definir o tipo de alterações estruturais em

consequência das crises, após inibição da síntese de 5-HT no núcleo dorsal do rafe. Para

este efeito, pretende-se correlacionar os volumes e os números totais de neurónios na

formação do hipocampo e no córtex entorrinal. Simultaneamente, pretende-se

determinar o número de neurónios produtores do neuropeptídeo Y (NPY) na formação

do hipocampo, após inibição da síntese de serotonina, usando-se para este efeito,

métodos estereológicos unbiased.

Neste estudo serão usados 18 ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10

semanas de idade, distribuídos por 3 grupos (grupo controlo com n=9 e grupo

experimental de ácido caínico com n=9). Todos os animais utilizados nesta tarefa foram

previamente tratados intraperitonealmente com uma neurotoxina selectiva da 5-HT, a

paracloranfetamina (PCA) numa dose de 20 mg/Kg.

Serão realizados testes comportamentais em todos os animais, aplicando o

Morris Water Maze para avaliar a memória espacial e a memória de trabalho, o

Elevated Plus Maze para estudar a ansiedade, o Forced Swim Test para avaliar a

depressão e o Open Field para avaliar a resposta emocional dos animais.

Os cérebros dos animais serão utilizados para os estudos histológicos. Alguns

deles serão mantidos em glicolmetacrilato, obtendo-se então séries de cortes de cada

animal, para tratamento com método de Giemsa, a fim de avaliar as estruturas acima

descritas. Será obtida ainda uma série adicional para tratamento com anticorpo de

coelho anti-NPY (Chemicon International) e outra para tratamento com anticorpo anti-

transportador de 5-HT (Chemicon International).

46

Com este trabalho pretende-se estudar, em termos comportamentais e

morfológicos, as alterações cognitivas, emotivas e neuroanatómicas induzidas pelas

crises convulsivas, após a depleção de serotonina no cérebro. Estes objectivos serão

conseguidos através da avaliação dos seguintes parâmetros:

(1) Estudo das funções cognitivas (aprendizagem e memória espacial, memória

de trabalho, passive e active avoidance) em animais epilépticos, com e sem lesões das

vias serotoninérgicas;

(2) Estudo das funções emotivas (ansiedade, reactividade a novas situações e

condicionamento de medo) em animais epilépticos, com e sem lesões das vias

serotoninérgicas;

(3) Determinação do número total de neurónios na formação do hipocampo e

córtex entorrinal após a inibição da síntese de 5-HT, em animais controlo e em animais

submetidos a SE;

(4) Determinação do número total de neurónios produtores de NPY na formação

do hipocampo, após a inibição da síntese de 5-HT, em animais controlo e em animais

submetidos a SE;

(5) Quantificação da densidade das fibras serotoninérgicas da formação do

hipocampo e do córtex entorrinal, após a inibição da síntese de 5-HT, em

animais controlo e em animais submetidos a SE.

47

Tarefa 3.

Efeitos antiepilépticos e neuroprotectores da fluoxetina e da

eslicarbazepina: estudos comportamentais e morfológicos no modelo de

ácido caínico

A relação entre epilepsia, depressão e ansiedade são actualmente alvo de um

forte interesse clínico e experimental, tendo sido estabelecido o papel relevante da 5-HT

nestas patologias. Elevadas concentrações extracelulares desta amina no sistema límbico

estão associadas a efeitos antidepressivos existindo um aumento da plasticidade

neuronal. Os mecanismos de acção de alguns dos fármacos inibidores da recaptação da

serotonina (SSRIs) parecem ser dependentes dessa plasticidade. O uso da fluoxetina na

epilepsia tem sido crescente, sendo evidentes os benefícios da conjugação deste fármaco

com os antiepilépticos, no sentido de diminuir as doses terapêuticas e minimizar a

intensidade das crises.

O progresso científico na compreensão dos processos patofisiológicos

associados à iniciação, amplificação e propagação da actividade paroxística no cérebro

tem permitido o desenvolvimento de novas linhas de anti-epilépticos, muitos dos quais

quimicamente semelhantes aos fármacos já utilizados clinicamente. O acetato de

eslicarbazepina (ELS) é um dos anti-epilépticos de terceira geração cuja eficácia no

controlo das crises e a redução dos efeitos colaterais comparativamente aos

antiepilépticos clássicos têm acrescidas vantagens nas crises associadas à ELT, pelo que

se supõe a existência de um maior efeito neuroprotector em relação aos fármacos

convencionais. A ELS possui uma potência anticonvulsivante semelhante à

carbamazepina e partilha com esta e com a oxcarbazepina a capacidade de inibir os

canais de sódio dependentes da voltagem; é ainda eficaz contra crises induzidas por

electrochoques e previne o desenvolvimento de kindling em ratos.

Com este trabalho pretende-se definir o potencial antiepileptogénico e

neuroprotector da fluoxetina e da ELS após a indução de crises pelo KA. Para o efeito

estabeler-se-à a relação entre crises convulsivas, défices comportamentais e alteração no

número de neurónios mais vulneráveis a estas crises e o efeito neuroprotector dos

antiepiléptico e do antidepressivo.

48

Para este estudo serão usados ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10

semanas de idade, previamente tratados KA. Alguns dos animais serão submetidos a um

tratamento adicional com FLX ou ELS. Todos os dados serão comparados com os

dados do grupo controlo (ratos não tratados).

A actividade crítica será avaliada comportamentalmente de acordo com a escala

de Racine (classificação I-V) (Racine, 1972) durante um período de 2 meses após a

indução do SE e durante o período dos estudos comportamentais. Todos os animais

serão submetidos a estudos comportamentais, procedendo-se para o efeito à aplicação

do Morris Water Maze para estudar as funções cognitivas, do Elevated Plus Maze para

estudar a ansiedade, do Forced Swim Test para avaliar a depressão e o Open Field para

avaliar a resposta emocional dos animais.

Os cérebros dos animais serão utilizados para os estudos histológicos. Alguns

deles serão mantidos em glicolmetacrilato, obtendo-se então séries de cortes de cada

animal, para tratamento com método de Giemsa, a fim de avaliar as estruturas acima

descritas. Os restantes cerebros serão utilizados para procedimentos imunocitoquímicos

de forma a obter amostras marcadas para o 5-HTT.

Com este trabalho pretende-se fazer um estudo comportamental e morfológico,

resultante da acção antiepiléptica e neuroprotectora da fluoxetina e da eslicarbazepina,

após a indução de SE com KA, abordando para o efeito os seguintes parâmetros:

(1) Alterações comportamentais e avaliação das crises em animais sujeitos a SE

e em animais tratados com fluoxetina e eslicarbazepina após o SE;

(2) Número total de neurónios na formação do hipocampo e córtex entorrinal em

animais controlo, em animais sujeitos a SE por KA e em animais posteriormente

tratados com fluoxetina e eliscarbazepina;

(3) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e córtex

entorrinal em animais controlo, em animais sujeitos a SE por KA e em animais

posteriormente tratados com fluoxetina e eliscarbazepina.

49

Tarefa 4.

Efeitos antiepilépticos e comportamentais resultantes da estimulação do

nervo vago no modelo de ácido caínico

A estimulação do nervo vago (VNS) é um método terapêutico aprovado pela

FDA (Food and Drug Administration) e pela EMEA (Agência Europeia do

Medicamento) e já foi utilizado em mais de 10000 pacientes com epilepsia refractária à

medicação e que não têm indicação cirúrgica. A sua aplicação clínica estende-se a

várias alterações do foro neurológico e psiquiátrico, pelo que também foi recentemente

aprovado como tratamento co-adjuvante na depressão farmaco-resistente.

Os estudos electrofisiológicos em ratos evidenciaram um aumento da taxa de

disparo dos neurónios serotoninérgicos nos núcleos dorsais e medial do rafe, 14 dias

após a estimulação do nervo vago. Por outro lado, a estimulação repetitiva do nervo

vago parece contribui para os processos de LTP (long-term potentiation), activando

desta forma sinapses serotoninérgicas latentes, especialmente na formação do

hipocampo. Nesta estrutura, os receptores 5-HT1A parecem contribuir para a acção

antidepressiva e antiepileptogénea, através da regulação da taxa de disparo dos

neurónios (Manta et al., 2009). Esta tarefa tem como objectivo principal estudar o efeito

da estimulação do nervo vago nas alterações comportamentais e morfológicas em

animais epilépticos, após a indução de SE pelo KA.

Parte deste trabalho, nomeadamente no que diz respeito á estimulação do nervo

vago, será realizado em colaboração com o Institute of Mental Health Research,

Ottawa, Canada. Sumariamente, nos animais do grupo 1 será implementado

cirurgicamente um dispositivo estimulador do nervo vago; este grupo receberá também

tratamento com KA, 5 dias depois da colocação do estimulador. No grupo 2 será

implementado um dispositivo semelhante em tamanho e forma ao estimulador do nervo

vago, mas que não emitirá nenhum pulso eléctrico; à semelhança do grupo 1, os animais

do grupo 2 serão submetidos a tratamento com KA. No grupo 3 será implementado um

verdadeiro neuroestimulador do vago, sendo que após este procedimento os animais

receberão uma solução i.p. de soro fisiológico. O grupo 4 será formado pelos animais

que receberão um dispositivo semelhante ao neuroestimulador, mas que não emite

50

impulsos eléctricos, recebendo posteriormente um tratamento com solução de soro

fisiológico intraperitonealmente. O estimulador será colocado subcutaneamente e os

eléctrodos serão ligados ao nervo vago esquerdo. Doze horas após a indução do SE, o

estimulador vagal será accionado, e os animais dos grupos experimentais receberão

neuroestimulação do nervo (30 segundos de estimulação, 5 minutos off de ondas

contínuas com uma frequências de 20 Hz e pulso de 500 µs e intensidade de 0,25 mA).

A actividade crítica será avaliada comportamentalmente de acordo com a escala

de Racine (classificação I-V) (Racine, 1972) durante um período de 2 meses. Após este

período os animais serão submetidos a estudos comportamentais (Morris Water-Maze

para avaliação da memória espacial, do Elevated Plus Maze para estudar a ansiedade e o

Open Field para avaliar a reactividade emocional dos animais).

Os cérebros dos animais serão utilizados para os estudos histológicos. Alguns

deles serão mantidos em glicolmetacrilato, obtendo-se então séries de cortes de cada

animal, para tratamento com método de Giemsa, a fim de avaliar as estruturas acima

descritas. Os restantes cerebros serão utilizados para procedimentos imunocitoquímicos

de forma a obter amostras marcadas para o 5-HTT.

Com este trabalho pretende-se fazer um estudo comportamental e morfológico,

resultante da acção antiepiléptica promovida pela estimulação do nervo vago, após a

indução de SE com KA, abordando para o efeito os seguintes parâmetros:

(1) Alterações comportamentais e avaliação das crises em animais submetidos a

estimulação do nervo vago, após tratamento com KA;

(2) Número total de neurónios na formação do hipocampo e córtex entorrinal em

animais controlo e em animais submetidos a estimulação do nervo vago, após

tratamento com KA;

(3) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e no córtex

entorrinal em animais submetidos a estimulação do nervo vago, após tratamento com

KA.

51

Cronograma de Actividades

Preve-se a realização das 4 tarefas num período de aproximadamente 4 anos,

conforme esquematizado no seguinte cronograma:

52

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