Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para ...

Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo embrionario de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-

Carnitina

Natalia Jaramillo Bolívar

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2018

Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo embrionario de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-

Carnitina

Natalia Jaramillo Bolívar

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias-Biotecnología

Director (a):

(Biol., MSc, Ph.D) Neil Aldrin Vásquez Araque

Línea de Investigación:

Reproducción

Grupo de Investigación:

Biotecnología Animal

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2018

A la vida, porque a pesar de todo sigue siendo bella.

Agradecimientos

A Dios, a mi familia y a mis amigos.

A todos aquellos compañeros y profesores que hicieron parte de este proceso de

formación. En especial al profesor Neil Vásquez que a pesar de las dificultades

me ha apoyado y acompañado.

A mis compañeros de laboratorio, por su valiosa colaboración sin la cual no

hubiese sido posible la realización de este trabajo.

Al grupo de Biotecnología Animal y al laboratorio de genética por proporcionar la

infraestructura necesaria para la realización de este trabajo.

A la planta de beneficio de Copacabana, por su colaboración en el aporte del

Material biológico.

Resumen y Abstract I

Resumen

La L-Carnitina (L-C) es una molécula con una reconocida función en el metabolismo

lipídico y con propiedades antioxidantes, lo que la convierte en un potencial suplemento

para estudiar en sistemas celulares con alteraciones en el metabolismo lipíco y en la

generación de especies reactivas de oxígeno (EROs). El objetivo de este trabajo fue

evaluar el efecto de la L-C durante la maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos sobre

diferentes parámetros asociados a la calidad de este. Los complejos ovocito cúmulo

(CCOs) fueron madurados por 24 horas con o sin L-C (3.8 mM). Se determinó la

cantidad de lípidos con Rojo Nilo, la actividad mitocondrial con Mitotracker green, los

niveles de EROs con diclorofluoresceina diacetato H2DCFDA y la cantidad de glutatión

reducido (GSH) con Monochlorobimane (mBCI); la intensidad de fluorescencia (IF) fue

normalizada con la media del grupo control. Se corroboró la expresión de los transcriptos

CPT1A, CPT1B y CPT2, por RT-PCR a partir del RNA extraido de los ovocitos MIV. Para

evaluar el efecto de la L-C sobre el desarrollo embrionario, los CCOs maduros fueron

fertilizados y cultivados por 8 días; se determinó %clivaje y %blastocistos. Los datos

fueron analizados por ANOVA y las medias comparadas por test de Tukey. En este

trabajo se corroboró la presencia de CPT1A, CPT1B y CPT2, y se encontró que los

ovocitos madurados con L-C disminuyeron en 8.1% la cantidad relativa de lípidos y en

41.6% la de EROs, aumentaron en un 160% la actividad mitocondrial y en 10% el

porcentaje de blastocistos al día 7, pero no se encontró efecto sobre la cantidad de GSH.

En conclusión, con base en estos hallazgos se postula la L-Carnitina como un

suplemento durante la maduración del ovocito de bovino para mejorar su calidad y

competencia para el desarrollo embrionario.

Palabras clave: Biotecnología, Metabolismo, fluorocromo, β-oxidación.

II Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo

embrionario de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina.

Abstract

L-Carnitine (L-C) is a molecule with a recognized function in lipid metabolism and

with antioxidant properties, which makes it a potential supplement to study in

cellular systems with alterations in lipid metabolism and in the generation of

reactive species of oxygen (EROs). The objective of this work was to evaluate the

effect of L-C during the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on different

parameters associated with the quality of this. The oocyte cumulus complexes

(CCOs) were matured for 24 hours with or without L-C (3.8 mM). The amount of

lipids with Nile Red, the mitochondrial activity with Mitotracker green, the levels of

EROs with dichlorofluorescein diacetate H2DCFDA and the amount of reduced

glutathione (GSH) with Monochlorobimane (mBCI); the fluorescence intensity (IF)

was normalized with the mean of the control group. The expression of the CPT1A,

CPT1B and CPT2 transcripts was corroborated by RT-PCR from the RNA

extracted from the MIV oocytes. To evaluate the effect of L-C on embryonic

development, mature CCOs were fertilized and cultured for 8 days; % cleavage

and % blastocysts were determined. The data were analyzed by ANOVA and the

means compared by Tukey test. In this work the presence of CPT1A, CPT1B and

CPT2 was corroborated, and it was found that oocytes matured with L-C

decreased in 8.1% the relative amount of lipids and in 41.6% that of EROs,

increased mitochondrial activity by 160% and 10% the percentage of blastocysts

at day 7, but no effect on the amount of GSH was found. In conclusion, based on

these findings, L-Carnitine is postulated as a supplement during the maturation of

the bovine oocyte to improve its quality and competence for embryonic

development.

Keywords: Biotechnology, Metabolism, fluorochrome, β-oxidation.

Contenido III

Contenido

Introducción .................................................................................................................... 4

Capítulo 1: Marco Teórico............................................................................................... 7 1.1 Producción in vitro de embriones ....................................................................... 7

1.1.1 Criterios de calidad para ovocitos y embriones ................................................ 8 1.2 Metabolismo embrionario ................................................................................. 10

1.2.1 Cambios del metabolismo embrionario .......................................................... 10 1.2.2 Influencia del sexo en el metabolismo embrionario ........................................ 12

1.3 Metabolismo lipídico ......................................................................................... 13 1.3.1 Biogénesis de las gotas lipídicas ................................................................... 14 1.3.2 Función de la L-Carnitina en el metabolismo lipidico ..................................... 15

1.4 Función antioxidante de la L-Carnitina ............................................................. 17 1.5 Hipótesis y Objetivos ........................................................................................ 19

1.5.1 Hipótesis ........................................................................................................ 19 1.5.2 Objetivo General ............................................................................................ 19 1.5.3 Objetivos Específicos..................................................................................... 19

Capítulo 2: Determinación del contenido lipídico y la actividad mitocondrial en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina ........................................................ 21

2.1 Sitio de estudio ................................................................................................. 21 2.2 Obtención de complejos cúmulo ovocito .......................................................... 21 2.3 Maduración in vitro de ovocitos ........................................................................ 22 2.4 Determinación del contenido relativo de lipídos en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina ............................................................................................. 22 2.5 Determinación de la actividad mitocondrial relativa en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina ............................................................................................. 23 2.6 Resultados ....................................................................................................... 23 2.7 Discusión ......................................................................................................... 26

Capítulo 3: Expresión de los genes CPT1A, CPT1B y CPT2 ...................................... 29 3.1 Sitio de estudio ................................................................................................. 29 3.2 Obtención complejos cúmulo ovocito y Maduración in vitro de ovocitos ........... 29 3.3 Detección de transcriptos de CPT1A, CPT1B y CPT2 en ovocitos bovinos madurados in vitro .................................................................................................... 29 3.4 Resultados ...................................................................................................... 30 3.5 Discusión ........................................................................................................ 31

Capítulo 4: Evaluación de los niveles relativos de especies reactivas de oxígeno y de Glutation activado en ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina ..... 34

4.1 Sitio de estudio ................................................................................................. 34 4.2 Obtención complejos cúmulo ovocito y Maduración in vitro de ovocitos ........... 34 4.3 Determinación de la cantidad de glutatión activado en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina ............................................................................................. 34 4.4 Determinación de EROs en ovocitos madurados en presencia de L-Carnitina . 35 4.5 Resultados ....................................................................................................... 35 4.6 Discusión ........................................................................................................ 37

IV Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo


Capítulo 5: Determinación la competencia para el desarrollo embrionario de

ovocitos bovinos madurados con L-Carnitina .............................................................41 5.1 Sitio de estudio ................................................................................................. 41 5.2 Obtención complejos cúmulo ovocito y Maduración in vitro de ovocitos ............ 41 5.3 Fertilización de ovocitos y cultivo de presuntos embriones ............................... 41 5.4 Resultados ........................................................................................................ 42 5.5 Discusión .......................................................................................................... 44

Conclusiones .................................................................................................................47

Anexos ............................................................................................................................51

A. Tabla: Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para Rojo Nilo y Mitotracker green ...........................................................................................................51

B. Tabla: Descripción de cebadores específicos para amplificación de los transcriptos 51

C. Análisis de Primers .................................................................................................52

D. Tabla: Análisis de varianza-ANOVA para EROs y GSH ........................................56

E. Tabla: Análisis de varianza (ANOVA) para las variables porcentaje de clivaje y de blastocistos ...............................................................................................................57

Bibliografía .....................................................................................................................59

Lista de Figuras

Figura 1. Relación entre el diámetro del ovocito y su capacidad para alcanzar la

maduración nuclear y el desarrollo embrionario después de la fertilización (Tomada de

Blondin et al., 2012). ........................................................................................................ 9

Figura 2. Clasificación morfológica de los complejos ovocito cúmulo de bovino (Tomado

de De Wit et al., 2000). ..................................................................................................... 9

Figura 3. Producción de CO2 con [U_14C Glucosa (Rombos), [1-14 C Piruvato (Cuadrado),

y [1_14C Lactato (Triángulos) en ovocitos inmaduros y en embriones producidos in vitro

en diferentes etapas del desarrollo embrionario (Tomado de Khurana & Niemann, 2000).

....................................................................................................................................... 11

Figura 4. Esquema de las etapas principales de las vías glucolítica/lipogénica y de

las pentosas fosfato en el hígado. La expresión de los enzimas presentes en el

esquema se induce a nivel transcripcional por una dieta rica en carbohidratos.

Activadores conocidos de la transcripción: verde: insulina (mediado por SREBP-1c); azul:

insulina (mediado por SREBP-1c) y glucosa (mediado por ChREBP); rosa: insulina

(mediado por SREBP-1c) y glucosa; amarillo: SREBP-1c. (Tomada de Casado, 2003). 13

Figura 5. Formación de diferentes poblaciones de gotas lipídicas. Existen dos

poblaciones de gotas lipídicas básicas, las más pequeñas son generadas por el retículo

endoplásmico (ER), a partir de los productos enzimáticos de las enzimas ER tales como

diacilglicerol o aciltransferasa 1 (DGAT1) (izquierda). Una segunda población está

conformada por aquellas gotas que pueden adquirir mayor tamaño al tener incorporada

en su membrana la DGAT2 (derecha) capaz de sintetizar triacilgliceroles a partir de

sustratos locales, tales como: diacilglicerol (DAG), ácido graso (FA), ácido lisofosfatídico

(LPA), lisofosfatidilcolina (LPC), fosfatidiletanolamina (LPE), monoacilglicerol (MAG),

ácido fosfatídico (PA), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina

(PS), fosfatidilinositol (PtdIns). Tomado de Thiam et al., 2013

....................................................................................................................................... 14

Figura 6. Producción de energía a partir de ácidos grasos intracelulares. CPTI: Carnitina

palmitoil transferasa 1; CPTII: Carnitina palmitoil transferasa 2. Modificado de Sutton-

McDowall et al., 2012 ..................................................................................................... 16

Figura 7. Esquema de la β-oxidación y las enzimas involucradas. Tomado de Montjean

et al., 2012 ..................................................................................................................... 17

2 Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo


Introducción

Figura 8. Esquema de la reacción entre DPPH y L-Carnitina. Tomado de Gülҫin, 2006. 18

Figura 9. Reacción propuesta de la quelación de iones ferrosos por L-Carnitina. Tomado

de Gülҫin, 2006. .............................................................................................................. 19

Figura 10. Contenido relativo de gotas lipídicas en ovocitos MIV. Tinción con rojo nilo; (A)

control (100%) y (B) L-Carnitina (91.12%). ...................................................................... 24

Figura 11. Actividad mitocondrial relativa en ovocitos MIV. Tinción con Mitotracker green;

(A) control (100%) y (B) L-Carnitina (260%). ................................................................... 24

Figura 12A. Tinción con Rojo Nilo (Contenido relativo de lípidos) 12B. Mitotracker green

(Actividad mitocondrial relativa). En ovocitos madurados con y sin L-Carnitina *Diferencia

estadística significativa (p<0.05). .................................................................................... 26

Figura 13. Electroforesis de los productos de amplificado por PCR punto final, todos los

valores están dados en pares de bases (pb), MP (Marcador de Peso). .......................... 31

Figura 14. Producción relativa de EROs en ovocitos MIV. Tinción con H2DCFDA; (A)

control (99.99%) y (B) L-Carnitina (41.7%). ..................................................................... 36

Figura 15. Cantidad relativa de GSH en ovocitos MIV. Intensidad de fluorescencia

relativa (A) control (100%) y (B) L-Carnitina (95.3%). ...................................................... 37

Figura 16. Producción relativa de EROs en ovocitos madurados con y sin L-Carnitina.

*Diferencia estadística significativa (p<0.05). .................................................................. 37

Figura 17. Parametros evaluados de desarrollo embrionario *Diferencia estadística

significativa (p<0.05). ...................................................................................................... 44

Figura 18. Biogénesis y expansión de las gotas lipídicas. Modificado de Thiam et al.,

2013. ............................................................................................................................... 48

Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo embrionario

de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina 3

Lista de Tablas

Tabla 1. Categorías de complejos cúmulo ovocito para procesos de fertilización In vitro

de embriones (FIV). ........................................................................................................ 22

Tabla 2. Parámetros estadísticos para la intensidad de fluorescencia con rojo nilo y Mito

tracker. ........................................................................................................................... 25

Tabla 3. Análisis de varianza (ANOVA) para las tinciones con rojo nilo y mitotracker .... 25

Tabla 4. Parámetros estadísticos intensidad de fluorescencia por tratamiento............... 36

Tabla 5. Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para EROs y GSH. .. 36

Tabla 6. Parámetros estadísticos de desarrollo embrionario .......................................... 42

Tabla 7. Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para los parámetros de

desarrollo. ...................................................................................................................... 43



Introducción

Introducción

La L-Carnitina (3-hidroxi-4-trimetilaminobutirato) es una amina cuaternaria

sintetizada en el hígado, los riñones y el cerebro a partir de los aminoácidos lisina

y metionina, por su actividad biológica ha sido estudiada más enfáticamente en el

campo de la medicina (Pekala et al., 2011). A finales de los años cincuenta se

descubrió su papel en la fisiología de las células de mamíferos y desde entonces

se ha relacionado con procesos diferentes a la β- oxidación de ácidos grasos

como el metabolismo de cuerpos cetónicos, el desarrollo de las espermátides, la

contracción y protección del miocardio, entre muchos otros (Landazuri et al.,

2000). Se han encontrado tres isoformas de sus transportadores a través de la

membrana celular, OCTN1 (SLC22A4) y OCTN2 (SLC22A5) en seres humanos y

animales, y Octn3 (Slc22a21) exclusivo de ratones; mutaciones en estos genes

han sido asociadas con una serie de síntomas, incluyendo cardiomiopatía,

debilidad del músculo esquelético, hígado graso e infertilidad masculina (Tamai,

2013).

Los sistemas de PIVE, presentan dos grandes dificultades, la primera asociada

con bajos porcentajes de blastocistos, indicador que ha conducido a la búsqueda

de estrategias para mejorar la eficiencia y calidad de embriones bovinos. La

segunda con la baja viabilidad y tasa de preñez de embriones sometidos a la

criopreservación (Block et al., 2011). Es necesario suplir estas deficiencias en la

Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo embrionario

de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina 5

PIVE y aumentar las cifras de productos finales, así que se deben plantear

modificaciones como la suplementación de moduladores metabólicos en los

medios de cultivo, tanto en la maduración in vitro como en el desarrollo

embrionario (Ideta et al., 2013). La composición de ácidos grasos en ovocitos

bovinos es relevante para su competencia y puede desempeñar un papel

importante en la prevención de los daños relacionados con la crioconservación

(Sánchez-Lazo et al., 2014), para reducir la concentración de gotas lipídicas en el

citoplasma de los embriones bovinos es necesario retirar el suplemento de suero

bovino fetal (SBF) de los medios de cultivo (George et al., 2008), y evaluar otras

alternativas, tales como activadores del metabolismo.

Entre los moduladores del metabolismo más utilizados está el Forskolin (Thomas

et al., 2004), la insulina (Vasquez-Araque et al., 2014a), y la L-Carnitina. Esta

última es requerida durante la oxidación de lípidos, para el transporte de ácidos

grasos desde el citosol al interior de las mitocondrias para la generación de

energía. La L-Carnitina ejerce un importante efecto antioxidante y anti-apoptótico,

proporcionando múltiples mecanismos de protección celular al ovocito y al

embrión en desarrollo (Abdelrazik & Agarwal, 2008).

En Latinoamérica, es Brasil el mayor productor de conocimiento científico en el

campo de la PIVE, en el 2011 Sudano y su equipo de investigadores plantearon

la relación existente entre la concentración del contenido de gotas lipídicas con la

susceptibilidad a la criopreservación y la apoptosis de embriones bovinos

producidos in vitro.

En Colombia, particularmente en Antioquia, se ha liderado la investigación

relacionada con la modulación de la maduración del ovocito buscando mejorar la

competencia para el desarrollo, para lo cual se han evaluado suplementos

antioxidantes (Vásquez-Araque et al., 2014b, c, d), energéticos (Gómez et al.,

2014) y hormonales (Vásquez-Araque et al., 2014a), en los que se ha

determinado que la suplementación en el medio de cultivo con fructosa a 5.6 mM

mejora la cinética de desarrollo y la producción de embriones in vitro, con glucosa

a 2.5 mM e ITS se favorece el porcentaje de blastocistos, la adición del

antioxidante ácido ascórbico a 100 µM mejora el potencial para el desarrollo

embrionario, disminuye la producción de especies reactivas de oxígeno y

aumenta la abundancia relativa de los transcriptos Bmp15, Gdf9 y Jy1 (genes

relacionados con calidad del ovocito).



Introducción

Por estas y otras razones los objetivos de este trabajo fueron evaluar el efecto del

suplemento L-Carnitina durante la maduración in vitro de ovocitos bovinos sobre

diferentes parámetros metabólicos (el contenido lipídico, la actividad mitocondrial

y expresión de los genes cpt1A, cpt1B y cpt2, relacionados con el transporte de la

aciL-Carnitina), antioxidantes (niveles de producción de especies reactivas de

oxígeno y de Glutation) y el porcentaje de desarrollo embrionario.

Capítulo 1: Marco Teórico

1.1 Producción in vitro de embriones

La producción in vitro de embriones (PIVE), se ha fortalecido como una de las

técnicas en nuestro medio para el mejoramiento genético en bovinos; sin

embargo, la tasa de producción es menor que la obtenida con los procesos in vivo

(Rizos et al., 2003). Se ha demostrado que varios factores pueden influir en esta

respuesta, entre las cuales se puede resaltar el metabolismo embrionario

(Khurana & Niemann, 2000). Adicional a los carbohidratos, el metabolismo lipídico

es esencial para la calidad del ovocito y el desarrollo embrionario; no obstante, la

acumulación de lípidos en su forma neutra, triacilgliceroles, tiene efectos

deletéreos para varios parámetros embrionarios, tales como la eficiencia (Jeong

et al., 2009) y criotolerancia de los embriones (Abe et al., 2002).

Lo anterior ha conducido a la disminución del suplemento suero bovino fetal en el

medio de cultivo (Crocco et al., 2013) y el uso de agentes que pueden regular el

metabolismo, como el suplemento Insulina- Transferrina – Selenio, ITS (Tsujii et

al., 2002, Vasquez-Araque et al., 2014a), o la adición de carbohidratos como la

fructosa, que indirectamente disminuyen la formación de gotas lipídicas (Barcelo-

Fimbres & Seidel, 2007).

Actualmente se ha planteado el uso de moduladores del metabolismo lipídico,

como la L-Carnitina, un transportador de ácidos grasos de cadena larga al interior

de la mitocondria, en donde se lleva a cabo la β-oxidación, y de esta manera

podría disminuir la formación de gotas lipídicas. Durante la maduración in vivo, el

ambiente folicular presenta L-Carnitina, y en los procesos de producción in vitro

se carece de esta, sugiriendo estudios en el que la L-Carnitina sea adicionada

durante la PIVE.

En la búsqueda de condiciones óptimas para la producción in vitro de embriones

(PIVE) bovinos, se han descrito diferentes herramientas con el fin de mejorar la

calidad del embrión. Entre las más utilizadas están la cinética de desarrollo, la


embrionario de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina

Título de la tesis o trabajo de investigación

morfología embrionaria, el número total de células, la viabilidad celular e índice de

apoptosis, indicadores metabólicos, la abundancia relativa de transcriptos y su

capacidad para tolerar la criopreservación. Pero, el criterio más acertado sería la

tasa de preñez y el nacimiento de individuos vivos, pero estos últimos requieren

mucho tiempo y recursos (Augustin et al., 2003). A pesar de las bondades que

representa la PIVE en la ganadería no solo de bovinos, sino también de otras

especies promisorias, se han reportado algunas dificultades tales como la baja

eficiencia y calidad de la producción de embriones, la cual se refleja en una baja

tasa de preñez (Block et al., 2011). Debido a esto, varios estudios han planteado

modificaciones de las condiciones y los medios usados para maduración,

fertilización y desarrollo embrionario, mejorando los sistemas de PIVE (Rizos et

al., 2003).

1.1.1 Criterios de calidad para ovocitos y embriones

En el ovario, el ovocito se encuentra en un bloqueo meiótico (profase I, etapa de

vesícula germinal-GV) por muchos meses o años hasta que ellos son ovulados o

se degeneran. La maduración del ovocito es iniciada durante el crecimiento

folicular y es completada por el pico preovulatorio de la hormona lueinizante (LH),

el cual induce la ovulación. Esta maduración del ovocito es un largo proceso

durante el cual adquiere la habilidad intrínseca para progresar a eventos

posteriores como son, la fertilización y el desarrollo embrionario (Ferreira et al.,

2009), que a su vez está relacionada con el diámetro del ovocito (figura 1) (Fair,

2003, Blondin et al., 2012).

En los procesos de producción in vitro de embriones (PIVE) en bovinos, se tienen

en cuenta los parámetros de morfología de los complejos ovocito cúmulo (CCOs),

tales como, número de capas de células de la granulosa que rodean al ovocito y

la calidad del citoplasma (figura 2). Estas características morfológicas están

directamente implicadas en la eficiencia de diferentes procesos reproductivos,

tales como el porcentaje de maduración nuclear del ovocito, determinado por la

expulsión del primer cuerpo polar o metafase II (Stojkovic et al., 2001), como

también el potencial para el desarrollo embrionario (Bilodeau-Goeseels & Panich,

2012). El tipo de CCOs no sólo afecta la eficiencia en la producción de

embriones, sino también la cinética de desarrollo embrionario, en donde se ha

reportado una relación entre el porcentaje de clivaje a las 48 horas de cultivo

9

(horas pos-inseminación, h.p.i) y la formación de estructuras embrionarias como

mórulas y blastocistos (Stojkovic et al., 2001).

Figura 1. Relación entre el diámetro del ovocito y su capacidad para alcanzar la maduración

nuclear y el desarrollo embrionario después de la fertilización (Tomada de Blondin et al., 2012).

Figura 2. Clasificación morfológica de los complejos ovocito cúmulo de bovino (Tomado de De

Wit et al., 2000).

Otro parámetro asociado a la calidad embrionaria es la cantidad de células

totales, y se ha encontrado una relación entre la cantidad de células totales y el

origen del embrión, in vivo, in vitro y clonado, presentando este último, la menor

cantidad de células (Ushijima et al., 2008). Principalmente, ha sido de mayor

relevancia la cantidad de células de la masa celular interna (MCI) del embrión en




la etapa de blastocisto (Coelho et al., 2014) y un bajo número de células de la

MCI se han asociado con una baja calidad del embrión y un mayor índice de

apoptosis (Leidenfrost et al., 2011). De esta manera, se han evaluado diferentes

suplementos de cultivo que pueden favorecer la proliferación celular y aumentar

el número de células totales, pero no mejora la relación MCI con las células del

trofoectodermo (TE) (Fouladi-Nashta et al., 2005). Aunque, suplementos como la

insulina (Augustin et al., 2003), el factor de crecimiento insulinoide tipo I (IGF-I)

(Ta-Chin et al., 2003) y el fluido folicular (Coelho et al., 2014) presentan un efecto

benéfico sobre la cantidad de células MCI.

1.2 Metabolismo embrionario

1.2.1 Cambios del metabolismo embrionario

Inicialmente los embriones bovinos comienzan a metabolizar en mayor proporción

el lactato y piruvato en las primeras fases de división, pero a medida que se

avanza en el desarrollo es necesario el consumo de glucosa a partir del estadio

de 2 células e incrementando su metabolismo en el estadio de 8-16 células y un

aumento significativo en el proceso de expansión del blastocisto. Este incremento

del uso de la glucosa está relacionado con la producción de ATP, que responde a

los procesos de activación del genoma embrionario, compactación y formación

del blastocele (Garcia et al., 2012) y se da gradualmente junto con el metabolismo

de otras fuentes de carbohidratos, como el piruvato y el lactato (Figura 3)

(Khurana & Niemann, 2000).

En los primeros estadios de desarrollo, el piruvato y el lactato son fuentes

principales de energía para el embrión, mientras que él metabolismo de la

glucosa es mínimo. Luego a partir del estadio de 8-16 células hasta la etapa de

blastocisto, el metabolismo embrionario aumenta y la glucosa pasa a ser parte

fundamental para su desarrollo, esta se metaboliza principalmente por la vía de la

glucolisis (Khurana & Niemann, 2000; Camargo et al., 2008). Adicionalmente la

glucosa interviene en la síntesis de ribosa y NADPH, a través de la vía de las

pentosas fosfato, mientras que la glucólisis genera piruvato, que es transformado

en Acetil-CoA e ingresa al ciclo de Krebs (Swain et al., 2002).

11

Figura 3. Producción de CO2 con [U_

14C Glucosa (Rombos), [1-

14 C Piruvato (Cuadrado), y

[1_14

C Lactato (Triángulos) en ovocitos inmaduros y en embriones producidos in vitro en diferentes etapas del desarrollo embrionario (Tomado de Khurana & Niemann, 2000).

Durante el metabolismo embrionario, uno de los suplementos más estudiados ha

sido la glucosa, la cual juega un papel diferenciador en las etapas del desarrollo

embrionario, no solo cumpliendo un papel energético en el embrión, sino también

participando en la síntesis de biomoléculas y en la activación de genes

lipogénicos (Kabashima et al., 2003). Sin embargo, el uso de la glucosa en los

medios de cultivo ha sido muy debatido debido a que su uso en altas

concentraciones genera un freno en el desarrollo embrionario, motivo por el cual

se han utilizado otras fuentes energéticas para la suplementación en los medios

de cultivo como la fructosa, otro monosacárido que es capaz de entrar a la vía

glucolítica (Kimura et al., 2005).

Barcelo-Fimbres y Seidel en el 2007, comprobaron que cuando se usa ambas

fuentes energéticas (glucosa o fructosa) en concentraciones inferiores 0,5 mM no

hay diferencia significativa en clivajes de 8 células, debido a que su desarrollo no

depende de ambas fuentes energéticas, adicionalmente la fructosa mostró

mejores resultados frente a la glucosa cuando se usa en concentraciones de (5,4

mM) en el porcentaje de blastocistos obtenidos y con una menor cantidad de

gotas lipídicas.

Las gotas lipídicas (Lipid Droplets, LD) son orgánulos intracelulares de

almacenaje de lípidos neutros (diacilglicerol, triacilgliceridos, esteres de retinol,




esteres de colesterol y colesterol libre), complejos y dinámicos (González-Muñoz;

2007); que constituyen la principal reserva energética para el ovocito y el

embrión. La generación de ATP a partir de lípidos se lleva a cabo dentro de la

mitocondria a través de la β-oxidación de los ácidos grasos; la inhibición de la β-

oxidación durante la maduración de ovocitos deteriora el desarrollo posterior a

blastocisto y por el contrario la suplementación con L-Carnitina aumenta la β-

oxidación, mejora la competencia para el desarrollo en ausencia de carbohidratos

como fuente energética y aumenta significativamente el clivaje. Por lo tanto, la L-

Carnitina es un cofactor importante para el ovocito y el desarrollo embrionario

(Dunning et al., 2010).

1.2.2 Influencia del sexo en el metabolismo embrionario

La proporción de embriones producidos in vitro, es a favor de los machos y ha

sido asociada a la presencia de la glucosa en los medios de cultivo (Camargo;

2012). Uno los principales hallazgos, postula que el gen glucosa 6 fosfato

deshidrogenasa, el cual es clave para la vía de las pentosas fosfato, se encuentra

ubicado en el cromosoma X. Además, los embriones hembras cultivados in vitro

tiene una cantidad doble de esta enzima en comparación con los machos, esto se

debe posiblemente a la no inactivación oportuna de uno de sus dos cromosomas

X, por lo cual, a nivel in vitro la actividad de la enzima se ha encontrado

cuadriplicada con respecto a la misma vía en embriones machos (Camargo et al.,

2008).

Por otro lado, el desbalance para la expresión de la enzima no se encontró en

embriones hembras y machos in vivo (Wrenzycki et al., 2002). Se ha encontrado

un menor porcentaje de blastocistos cuando utilizaron la glucosa a una

concentración de 4 mM con respecto a una concentración de 2.5 mM. También se

encontró un aumento en la cantidad de machos bovinos en el día 8 de desarrollo,

aun así, otras fuentes energéticas como la fructosa a concentraciones de 2.5 mM

y 5.6 mM no tienen efectos adversos en el desarrollo y no distorsiona la

proporción de sexos.

La diferencia entre estas dos fuentes energéticas con respecto a la proporción de

sexos puede estar relacionada con el metabolismo de cada una, la fructosa se

convierte en fructosa 6 fosfato e ingresa a glucolisis, mientras que la glucosa

ingresa a glucolisis se convierte a glucosa 6 fosfato y por la enzima glucosa 6

fosfato deshidrogenasa asociada a la vía de las pentosas fosfato (Kimura et al.,

13

2005), genera xilulosa 5 fosfato (Xu 5p), lo que resulta en la activación de

proteínas fosfatasa 2 (PP2A) que a su vez activa el factor de transcripción

ChREBP y aumenta la transcripción de genes lipogénicos para la síntesis de

ácidos grasos (Kabashima et al.,2003) (figura 4).

Figura 4. Esquema de las etapas principales de las vías glucolítica/lipogénica y de las pentosas fosfato en el hígado. La expresión de los enzimas presentes en el esquema se induce a nivel transcripcional por una dieta rica en carbohidratos. Activadores conocidos de la transcripción: verde: insulina (mediado por SREBP-1c); azul: insulina (mediado por SREBP-1c) y glucosa (mediado por ChREBP); rosa: insulina (mediado por SREBP-1c) y glucosa; amarillo: SREBP-1c. (Tomada de Casado, 2003).

1.3 Metabolismo lipídico

Entre las moléculas energéticas, los ácidos grasos son fundamentales para el

metabolismo embrionario y se encuentran almacenadas como triacilgliceroles

(TAG) (también denominados lípidos neutros). La fuente principal de estos ácidos

grasos son los TAG, provenientes de lipoproteínas como la lipoproteína de baja




densidad (Low Density Lipoprotein, LDL) o de gotas lipídicas de origen

intracelular o exógeno (Sánchez-Lazo et al., 2014). Particularmente estas gotas

lipídicas están compuestas de triacilgliceroles y la alta proporción de gotas

lipídicas (LD) se han asociado con efectos deletéreos en diferentes procesos

biotecnológicos como son el freno del desarrollo embrionario y la baja

criotolerancia, lo que ha conducido a un mayor interés en estudios sobre la

biogénesis y metabolismo de estas estructuras. Sin embargo, la β-oxidación es

esecial para el desarrollo embrionario, lo que se ha demostrado al agragar al

medio de cultivo etomoxir un inhibir de la CTP1 enzima fundamental para el

ingreso de los grupos aciL-Carnitina al interior mitocondrial (Dunning et al., 2010,

Sanchez-Lazo et al., 2014).

1.3.1 Biogénesis de las gotas lipídicas

Para la biogénesis de las gotas lipídicas se han descrito dos enzimas, la

diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT1) y 2 (DGAT2), responsables de la

transferencia de un ácido graso al diacilgliceriol, generando el TAG. Ambas

enzimas se localizan en el retículo endoplasmático (ER), pero la isoforma 2

también se encuentra en las membranas de mitocondrias y de gotas lipídicas, lo

que le confiere la capacidad de seguir incorporando ácidos grasos y así aumentar

su tamaño (figura 5) (McFie et al., 2011).

Figura 5. Formación de diferentes poblaciones de gotas lipídicas. Existen dos poblaciones de

gotas lipídicas básicas, las más pequeñas son generadas por el retículo endoplásmico (ER), a partir de los productos enzimáticos de las enzimas ER tales como diacilglicerol o aciltransferasa 1

15

(DGAT1) (izquierda). Una segunda población está conformada por aquellas gotas que pueden adquirir mayor tamaño al tener incorporada en su membrana la DGAT2 (derecha) capaz de sintetizar triacilgliceroles a partir de sustratos locales, tales como: diacilglicerol (DAG), ácido graso (FA), ácido lisofosfatídico (LPA), lisofosfatidilcolina (LPC), fosfatidiletanolamina (LPE), monoacilglicerol (MAG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PtdIns). Tomado de Thiam et al.,

2013

1.3.2 Función de la L-Carnitina en el metabolismo lipidico

El metabolismo de los ácidos grasos en las celulas del cumulus es importante

para mantener la homeostasis metabólica y puede influir en la progresión de la

meiosis y la supervivencia de los ovocitos (Sanchez-Laso et al., 2014). Además,

las células de la granulosa durante la maduración in vitro, participan en la

regulación de la orientación metabolica lipídica (síntesis de ácidos grasos y

lipólisis) para suministrar energía al ovocito, y se ha demostrado una mayor

actividad de la lipasa sensible a hormonas (HSL) en el ovocito cuando es

madurado en presencia de células del cúmulo (Auclair et al., 2013), lo cual podría

potenciar la actividad lipolítica en el ovocito, ya que la lipólisis de las LD en

adipocitos, se da inicialmente por la lipasa de triglicéridos adiposos (ATGL) que

cataliza el primer paso de la lipólisis, conduciendo a la liberación de ácidos grasos

libres (FA) y de 1,3-diacylglycerol (DAG). La lipasa sensible a las hormonas

(HSL), asociada a las gotas lipídicas, hidrólisa DAG en ácidos grasos libres y

monoacilglicerol (MAG), el cual es hidrolizado a ácidos grasos libres y glicerol por

MAG lipasa (MGL), que es soluble en el citosol (Thiam et al., 2013).

Estos ácidos grasos libres de cadena larga, son activados por la Acil-coA sintasa

al unirles un grupo CoA, generando Acil-CoA, los cuales tomara la enzima

carnitina palmitoiltransferasa isoforma 1 (CPT1) que se encuentra anclada a la

membrana mitocondrial externa y los une a moléculas de L-Carnitina formando

Acil-Carnitina+CoA, lo que permite su translocación al interior mitocondrial, donde

la CPT2 escinde la carnitina y forma grupos Acil-CoA, los cuales a través de la β-

oxidación generan acetil-CoA, sustrato para el ciclo del ácido tricarboxilico,

produciendo los equivalentes reductores NADH H+, FADH2, que a su vez, por

fosforilación oxidativa generan energía en forma de ATP (figura 6) (Indiveri et al.,

2011; Sutton-McDowall et al., 2012).

La β-oxidación (figura 7) es fundamental para el desarrollo embrionario,

demostrado mediante el uso de inhibidores de CPT1 donde se disminuye la

eficiencia de desarrollo (Sanchez-Lazo et al., 2014). Adicionalmente el




suplemento de L-Carnitina al medio de cultivo tiene diferentes efectos, como son

la disminución de gotas lipídicas (Dunning & Robker, 2012) y de especies

reactivas de oxígeno (Mishra et al., 2016a) por sus propiedades antioxidantes

(Gülҫin, 2006), aumento de la actividad mitocontrial (Mishra et al., 2016a),

aumento de la actividad de la enzima CPT1a (Shin et al., 2006), y dependiendo

de la concentración y el tiempo de cultivo, el desarrollo embrionario (Moreira et

al., 2015). Phongnimitr en el 2013 evalúo la adición de L-C a 0.0, 0.3, 0.6 y1.2

mg/ml en el medio de MIV, FIV y CIV encontrando solo efecto en la MIV a la

concentración de 0,6 mg/ml la cual presenta mayores tasas de maduración

nuclear y posterior desarrollo embrionario, por esta razón dicha concentración

(equivalente a 3,8 mM) fue elegida para trabajar en esta investigación.

Varios estudios han reportado los niveles de L-Carnitina en diferentes fluidos

corporales tales como suero sanguíneo de 10 a 70 µmol/L (Warshaw & Curry,

1980), leche 0.32 mM/L (Harmeyer, 2003) y en el líquido folicular que es

altamente variable va desde 0.6 μmol/L a 45.8 μmol/L. (Montjean et al., 2012), sin

embargo, el medio de cultivo utilizado para la maduración in vitro de ovocitos no

contiene L-Carnitina (M199-Gibco 12340), lo que hace necesario su adición en

este proceso y su evaluación en diferentes procesos reproductivos. Como lo son:

el contenido de lípidos en ovocitos, la producción embrionaria y la variación en la

abundancia relativa de los transcriptos implicados en el metabolismo lipídico,

entre muchos otros relacionados.

Figura 6. Producción de energía a partir de ácidos grasos intracelulares. CPTI: Carnitina palmitoil

transferasa 1; CPTII: Carnitina palmitoil transferasa 2. Modificado de Sutton-McDowall et al., 2012

17

Figura 7. Esquema de la β-oxidación y las enzimas involucradas. Tomado de Montjean et al.,

2012

1.4 Función antioxidante de la L-Carnitina

Las propiedades antioxidantes de la L-Carnitina han sido evaluadas in vitro

mediante el uso de diferentes ensayos, tales como el barrido de radicales libres

con 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPHI), actividad antioxidante total, reducción del

potencial, eliminación de radicales anión superóxido, barrido de peróxido de

hidrógeno y actividad de quelación de metales; arrojando resultados similares o

mejores para la L-Carnitina con respecto al antioxidante natural α-tocoferol y su

análogo soluble en agua trolox (Gülҫin, 2006). Entre los mecanismos

antioxidantes no enzimáticos está el método basado en HAT (Hydrogen Atom

Transfer) que mide la capacidad de un antioxidante para extinguir los radicales

libres, generalmente radicales peroxilo (ROO•) mediante la donación de átomos

de H+ (Figura 8) y el método basado en ET (Electron Transfer) que es pH

dependiente y es la capacidad de un antioxidante de reducir un agente oxidante

mediante la donación de electrones (Figura 9) (Apak et al., 2016).




Las especies reactivas de oxígeno (EROs), incluyen radicales libres tales como

radicales de aniones superóxido (O2-), hidroxilo (OH°) y H2O2 y diversas formas

de oxígeno activado (1O2). Estas moléculas son factores que provocan lesiones

intra y extracelures, además de acelerar el proceso de envejecimiento celular

(Halliwell & Gutteridge, 1984). Sin embargo, la célula posee sus propias

extrategias para librarse de este tipo de agentes utilizando enzimas tales como la

superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa, dt-deafarasa, y biomoléculas entre

las que se encuentran la ceruloplasmina, betacarotenos, transferinas, ubiquinol-

10, lactoferinas, albúminas, haptoglobinas, proteínas que ligan metales, sistemas

proteolíticos, ácido úrico, vitamina C, vitamina E y GSH (Venereo, 2002); este

ultimo el glutatión reducido es sintetizado virtualmente en todas las células

animales por las acciones secuenciales de dos enzimas: gamma-glutamilcisteína

sintetasa y GSH sintetasa (Meister, 1994), La importancia del GSH no es sólo por

su abundancia, si no también por su versatilidad para contrarrestar el peróxido de

hidrógeno, los hidroperóxidos de lípidos o los xenobióticos, principalmente como

un cofactor de las enzimas glutatión peroxidasa (GPX) y la glutatión-S-transferasa

(GSTs) (Marí et al., 2009).

Los compuestos de los medios de cultivo sufren procesos oxidativos que pueden

afactar directamente las membranas celulares y el proceso de desarrollo, por esta

razón es importante implementar estrategias que permitan regular los niveles de

EROs. En cuanto a la producción in vitro de embriones se han suplementado los

medios de cultivo con diversos antioxidantes como el α-tocoferol (Vásquez, 2014),

ácido ascórbico (Vásquez, 2014), quercetina (Kang et al., 2013) y resveratrol

(Huang & Chan, 2012).

Figura 8. Esquema de la reacción entre DPPH y L-Carnitina. Tomado de Gülҫin, 2006.

19

Figura 9. Reacción propuesta de la quelación de iones ferrosos por L-Carnitina. Tomado de

Gülҫin, 2006.

1.5 Hipótesis y Objetivos

1.5.1 Hipótesis

Los parámetros de calidad del ovocito bovino mejoran al ser cultivados con L-

Carnitina, debido a sus propiedades metabólicas y antioxidantes.

1.5.2 Objetivo General

Evaluar el efecto del suplemento L-Carnitina durante la maduración in vitro

de ovocitos bovinos sobre diferentes parámetros metabólicos,

antioxidantes y el porcentaje de desarrollo embrionario.

1.5.3 Objetivos Específicos

Determinar el contenido lipídico y la actividad mitocondrial en ovocitos

cultivados en presencia de L-Carnitina.

Validar la expresión de los genes CPT1A, CPT1B y CPT2, relacionados

con el transporte de la aciL-Carnitina en ovocitos bovinos madurados in

vitro.




Evaluar los niveles de producción de especies reactivas de oxígeno y de

Glutation en ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina.

Determinar el efecto del suplemento L-Carnitina sobre la eficiencia en la

producción in vitro de embriones bovinos.

21

Capítulo 2: Determinación del contenido lipídico y la actividad mitocondrial en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina

2.1 Sitio de estudio

La investigación se realizó en las instalaciones de los laboratorios de Genética de

la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín y la consecución del material

biológico para la obtención de los complejos cúmulo ovocito (CCOs), fue

suministrado por la planta de faenado del municipio de Copacabana.

2.2 Obtención de complejos cúmulo ovocito

Los ovarios bovinos recolectados a partir de hembras bovinas sacrificadas, se

depositaron en solución de tampón fosfato salino (PBS) estéril a 37ºC y fueron

transportados al Laboratorio de genética. Luego con aguja N°18 y jeringa de 10

ml, se procedió a la aspiración de los folículos con un diámetro de 3 a 6 mm y el

aspirado se recolectó en tubos cónicos de 15 ml a 37ºC. El líquido folicular se

centrifugó a 1500 rpm, por 5 minutos y el precipitado se resuspendió en 1 ml de

medio de lavado TCM-199 con sales de Hank´s (Sigma M2520), suplementado

con 275 µg/ml de ácido pirúvico (Sigma P2506), 29.2 µg/ml de glutamina (Sigma

G9003) y 1% de solución antibiótica (ICN 1670049). En caja de Petri estéril de 60

x 15 mm, bajo observación con estereomicroscopio se seleccionaron los

complejos CCOs de buena calidad según los criterios previamente establecidos

(Tabla 1) (De Wit et al., 2000). Los CCOs seleccionados fueron lavados con

medio TCM-199, y transferidos a gotas de medio de maduración.




Tabla 1. Categorías de complejos cúmulo ovocito para procesos de fertilización

In vitro de embriones (FIV).

Tomado de De Wit et al., 2000

2.3 Maduración in vitro de ovocitos

Los CCOs se incubaron por 24 horas en grupos de 10-15 por gota de 50 µl de

medio de maduración (Gibco 12340-030) suplementado con 0.33 mM de piruvato

de sodio, 1µg/ml de estradiol, 3% de suero fetal bovino SFB, 6 mg/ml de albúmina

sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA FAF, Sigma A6003), 1% de solución

antibiótica, 50 µg/ml de LH (Chorulon® es hCG), 1 µg/ml de FSH porcina (pFSH-

Sigma F2293) y con o sin L-Carnitina a 3.8 mM (Phongnimitr et al., 2013). Las

gotas fueron cubiertas con aceite mineral (Sigma M8410) e incubadas a 38.5ºC,

5% CO2 en aire con 90% de humedad por 24 horas. Al finalizar el tiempo de

maduración, los CCOs se utilizaron para determinar el contenido lipídico y la

actividad mitocondrial.

2.4 Determinación del contenido relativo de lipídos en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina

Para determinar el contenido lipídico se procedió a teñir con Rojo Nilo (Sigma

N3013, Molecular Probes), los ovocitos madurados cultivados con o sin L-

Carnitina; en grupos de 10 se incubaron a 4°C por 24 horas en gotas de 250 µl de

Tipo Células del cúmulo Citoplasma

1. Excelente Capas múltiples y compactas de

células (cuatro o más) Homogéneo y transparente

2. Bueno Capas múltiples de células (entre

una y tres)

Homogéneo con zonas

periféricas oscuras

3. Regular Sin células (Desnudos) Irregular con zonas oscuras

4. Malo Células expandidas Irregular con zonas oscuras

23

medio de fijación que contiene PBS Dulbecco´s, formaldehido (16%) y

glutaraldehído (50%), luego se lavaron en PBS Dulbecco´s y pasaron a la

solución del colorante (1µg/ml) a temperatura ambiente por 24h; pasado este

tiempo se retiró el exceso de colorante lavando con PBS Dulbecco´s y en grupos

de 3 se pusieron en gotas de 10 µl de PBS Dulbecco´s sobre portaobjetos

(Ballard; 2007), y se observaron con un aumento de 200X en un microscopio de

epifluorescencia (Nikon, eclipse 80i) con filtro C-FL G2A con una longitud de

excitación a 515-560 nm y de emisión a 590 nm. El área de ovocitos fue ajustada,

las imágenes se guardaron como archivos gráficos en formato TIFF. Las

intensidades de fluorescencia de las gotas lipídicas en ovocitos fueron analizadas

por el software ImageJ (Version 1.41; National In-stitutes of Health, Bethesda,

MD, USA) y normalizadas con la medida de fluorescencia de los ovocitos sin

tratamiento o control (Barceló-Fimbres & Seidel, 2011).

2.5 Determinación de la actividad mitocondrial relativa en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina

Para determinar la actividad mitocondrial se tiñó con Mito Tracker® green

(Invitrogen M7514, Molecular Probes), los ovocitos madurados cultivados con o

sin L-Carnitina; en grupos de 10 se incubaron a temperatura ambiente por 20

minutos en gotas de 50 µl de Mito Tracker 0.5 mM, luego se lavaron en PBS

Dulbecco´s y pasaron en grupos de 3 en gotas de 10 µl de PBS Dulbecco´s sobre

portaobjetos (Ballard, 2007), y se observaron con un aumento de 200X en un

microscopio de epifluorescencia (Nikon, eclipse 80i) con filtro FITC/FLUO-3 (B-

4A) con una longitud de emisión a 516 nm y de excitación a 490 nm. El área de

los ovocitos fue ajustada, las imágenes se guardaron como archivos gráficos en

formato TIFF. La intensidad de fluorescencia en ovocitos fue analizada por el

software ImageJ (Version 1.41; National In-stitutes of Health, Bethesda, MD,

USA) y normalizadas con la medida de fluorescencia de los ovocitos sin

tratamiento o control (Barceló-Fimbres & Seidel, 2011), la comparación de medias

de los tratamientos se reaizó por test de Tukey.

2.6 Resultados

Se utilizó un n de 120 CCOs de bovino para someterlos a maduración in vitro con

y sin L-Carnitina (control), de los cuales, 60 fueron usados para evaluar el

contenido relativo de lipídos intracelular mediante la tinción con rojo nilo (figura




10A y B). El resto de los CCOs fueron usados para determinar la actividad

mitocondrial relativa mediante la tinción con Mito tracker green (figura 11A y B).

La intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto al control (100%).

Figura 10. Contenido relativo de gotas lipídicas en ovocitos MIV. Tinción con rojo nilo; (A) control (100%) y (B) L-Carnitina (91.12%).

Figura 11. Actividad mitocondrial relativa en ovocitos MIV. Tinción con Mitotracker green; (A) control (100%) y (B) L-Carnitina (260%).

Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA), para la tinción de

lípidos y de actividad mitocondrial relativas se encontró un efecto del tratamiento,

teniendo en cuenta un valor de significacia menor de 0.05 (tabla 3). Así que, se

permite inferir que los tratamientos presentan respuesta diferencial sobre la

variable evaluada. Con base en lo anterior se realizó una prueba de comparación

de medias por el test Tukey.

A. B.

A. B.

25

Tabla 2. Parámetros estadísticos para la intensidad de fluorescencia con rojo nilo

y Mito tracker.

Tratamiento n Media (%) Desv Est. Error Est. Contenido de

gotas lipídicas

L-C 30 91.2 0.110 0.020

C 30 100 0.185 0.034

Actividad Mitocondrial

L-C 30 260 0.533 0.097

C 30 100 0.108 0.020

Con respecto a la cantidad relativa de lípidos, el grupo de ovocitos madurados

con L-Carnitina presentó un porcentaje promedio de intensidad de fluorescencia

de 91.19% (tabla 2), siendo significativamente menor (p<0.05) (Tabla Anexo A)

que el grupo madurado sin L-Carnitina (control) (100%) (tabla 2). Mientras la

actividad mitocondrial relativa de los ovocitos madurados con L-Carnitina

presentó un porcentaje promedio de intensidad (260%) (tabla 2),

significativamente mayor (p<0.05) (Tabla Anexo A) que el grupo control (100%)

(tabla 2).

Tabla 3. Análisis de varianza (ANOVA) para las tinciones con rojo nilo y mitotracker

SS Df MS F p

Contenido de gotas lipídicas

0.116 1 0.116 5.032 0.029*


38.457 1 38.457 259.97 0.000*

*Diferencia estadística significativa.




Figura 12A. Tinción con Rojo Nilo (Contenido relativo de lípidos) 12B. Mitotracker green (Actividad mitocondrial relativa). En ovocitos madurados con y sin L-Carnitina *Diferencia estadística significativa (p<0.05).

2.7 Discusión

Los lípidos intracelulares en los ovocitos se almacenan principalmente en gotas

lipídicas (LD) que proporcionan energía, a través de la β-oxidación (Paczkowski et

al., 2013), para un crecimiento y desarrollo adecuado. Estos lípidos también son

importantes moléculas de señalización implicadas en los mecanismos

reguladores de la maduración y, por lo tanto, en la adquisición de la competencia

de los ovocitos (Prates et al., 2014). Particularmente, los lípidos neutros como los

triacilgliceroles son la forma más común de almacenaje de las gotas lipídicas, las

cuales afectan las propiedades de criotolerancia (Takahashi et al., 2013,

Meneghel et al., 2017). Por lo que diferentes estrategias se han evaluado para

disminuir las gotas lipdicas en ovovcitos y embriones, como la adición de forskolin

(Fu et al., 2011), etosulfato de fenazina (PES) (Ghanem et al., 2014) y 2,4 dinitro

fenol (DNP) (De la Torre-sanchez et al., 2006), entre otros. Es muy importante la

entrega directa a la mitocondria de lípidos por la L-Carnitina, puesto que garantiza

el suministro de sustrato para la generación de energía y la disminución en la

producción de gotas lipídicas en ovocitos bovinos inmaduros y madurados in vitro

(Aon et al., 2014). En este trabajo se evalúo la L-Carnitina 3.8 mM durante la MIV,

la cual generó una reducción del contenido de lípidos del 8.1% (Figura 12A). Esta

27

disminución de gotas lipídicas asociadas a la L-Carnitina se ha observado en

ovocitos de ratón (Dunning & Robker, 2012), de porcino (Somfai et al., 2011) y

embriones de bovino (Ghanem et al., 2014); sin embargo, este efecto no se

encontró en ovocitos ovinos madurados in vitro en presencia de L-Carnitina

(Reader et al., 2015). Adiconalmente, la L-Carnitina en embriones

preimplantatorios favorece el metabolismo de lípidos, determinado por el aumento

de la β-oxidación, utilizando ácidos grasos radiomaracados, midiendo el

excedente del ácido graso (consumo del ácido graso) (Dunning et al., 2014), o el

agua tritiada (agua superpesada o radiactiva) como producto de la β-oxidación

(Dunning et al., 2010, 2011), y por la tasa de conversión de ATP-ADP (Sutton-

McDowall et al., 2012).

Además, los ovocitos de bovino madurados con L-Carnitina presentan una

disminución de la expresión de los genes DGAT1, DGAT2 y PLIN2 (Perilipin 2)

(Ghanem et al., 2014; Sanchez-Lazo et al., 2014), en donde DGAT1 y PLIN2

están relacionados con la biogénesis, mientras que el DGAT2 con la expansión o

crecimiento de la gota lipídica (Thiam et al., 2013). Tambien se ha reportado un

aumento en la expresión de CPT1 y CPT2, implicadas en el transporte de ácidos

grasos activados al interior mitocondrial (Sanchez-Lazo et al., 2014). Estos

reportes podrían explicar la reducción de la cantidad relativa de lipídos,

encontrados en este trabajo, debido a la disminución de la biogénesis y

expansión de las gotas lipídicas.

Al tener en cuenta que la L-Carnitina es un factor limitante para el transporte de

ácidos grasos a la matriz mitocondrial, demostrado por adición del inhibidor de la

CPT1 (Etomoxir), el cual afecta el transporte de la acilcarnitina a la matriz

mitocondrial, con un efecto deletéreo en la maduración del ovocito (Sanchez-Laso

et al., 2014); como también con el Mildronato, que ejerce una Inhibición

competitiva tanto del transportador CPT2, disminuyendo la disponibilidad de la L-

C, como de la enzima gama butirobetaina hidroxilasa, responsable de la

biosíntesis de L-Carnitina (Dambrova et al., 2016). En este trabajo se evaluó la

actividad mitocondrial de ovocitos MIV con L-C a 3.8 mM, la cual generó un

aumento en la actividad mitocondrial del 160% con respecto a los ovocitos

madurados sin L-C (Figura 12B), este aumento es debido a la mayor

disponiblilidad de grupos acil-carnitina por la presencia de la L-Carnitina en el

medio de maduración, aunque otros factores pueden influir en estra respuesta

tales como, la expresón de CPT1 (Sanchez-Lazo et al., 2014) y por lo tanto de la

β-oxidación (Dunning et al., 2010), inducidas por la L-C. Esta activación

mitocondrial también se ha encontrado en ovocitos porcinos madurados con L-




canitina a una concentración de 1.25 mg/ml (Somfai et al., 2011) y en embriones

bovinos cultivados con L-C (Ghanem et al., 2014).

Los resultados de este trabajo permiten concluir que la L-C a una concentración

de 3.8 mM durante la maduración in vitro de ovocoitos de bovino, mejora

diferentes parámetros de la calidad del ovocito, como la disminución de la

cantidad relativa de lipídos y el aumento de la actividad mitocondrial.

29

Capítulo 3: Expresión de los genes CPT1A, CPT1B y CPT2


La investigación se realizó en las instalaciones de los laboratorios de Genética y

Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y la

consecución del material biológico para la obtención de los complejos cúmulo

ovocito (CCOs), fue suministrado por la planta de faenado del municipio de

Copacabana.

3.2 Obtención complejos cúmulo ovocito y Maduración in vitro de ovocitos

La obtención de los complejos y la MIV se realizó como se describió en el capitulo

2.

3.3 Detección de transcriptos de CPT1A, CPT1B y CPT2 en ovocitos

bovinos madurados in vitro

La presencia de los transcriptos para los genes que codifican para la Carnitina

palmitoil transferasa 1A, 1B y 2 (CPT1A, CPT1B y CPT2, respectivamente) en los

ovocitos bovinos madurados in vitro, fue determinada por la técnica de

transcriptasa reversa–reacción en cadena de la polimerasa (reverse transcription-

polymerase chain reaction, RT-PCR). Los ovocitos de cada grupo de estudio

fueron desnudados por pipeteo en hialuronidasa al 0.1% en PBS para remover

las células del cúmulo y posteriormente fueron transferidos a 10 μl buffer de

resuspensión suplementado con 1 μl RNasa Out y 1 μl Lysis enhancer para lisar

los ovocitos. El DNA complementario (cDNA) fue sintetizado con cebadores




hexámeros (Bettegowda et al., 2007) de acuerdo con las recomendaciones del kit

SuperScript™ III CellsDirect cDNA Synthesis (Invitrogen Life Technologies). Los

ovocitos lisados fueron incubados a 75°C/10 min, y se adiciono 1 μl de DNAasa

para digerir el DNA remanente (Invitrogen) y se incubó a 70°C/10 min para

desnaturalizar la DNAasa. La transcripción reversa (RT) se realizó en un volumen

total de 30 μl, usando 1 μ de transcriptasa reversa (SuperScript® III RT), 12,5 μl

de buffer de reacción 2X, 2 μl de cebadores hexámeros aleatorios (2.5 μM), 10 μl

de lisado y 4.5 μl de agua tratatado con DEPC, se incubó a 50°C/50 min, luego se

inactivó la reacción a 85°C/5 min, se adicionó un 1 l de RNAasa H (2U/l) y se

incubo a 37°/20 min (Bettegowda et al., 2007).

Las reacciones de PCR fueron realizadas en un volumen final de 25 μl en un

termociclador S1000™ (Life Science Research, BIO-RAD). En cada reacción se

usó 2 μl (40ng) de la solución de cDNA y el kit Platinum®Blue PCR SuperMix

(Invitrogen). Este kit contiene los dNTPs, 1 U de Platinum Taq polimerase, 200

nM de cada cebador específico (tabla Anexo B) (F forward y R reverse) fueron

adicionados a la reacción. El protocolo de PCR incluye: un paso inicial a 94°C/3

min como hot start, 40 ciclos 94°C/30 seg, 60°C/30 seg y 72°C/1 min (Invitrogen).

Los cebadores específicos de los genes utilizados para la PCR están descritos en

la tabla 5 y fueron analizados mediante el software BlastN del NCBI (Anexo C). El

control negativo fue la omisión del cDNA para la amplificación por PCR. Como

gen control se amplifico la Histona 2 (Takahashi et al., 2015). Los productos de

PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con

SYBR Safe y el registro fotográfico se realizó con transiluminador (Biorad).

3.4 Resultados

Para determinar la expresión en ovocitos bovinos, de los genes que participan en

el transporte de los ácidos grasos de cadena larga al interior de la matriz

mitocondrial, se extrajo el RNA total y se sintetizo el cDNA, mediante la técnica

RT-PCR. Los genes seleccionados fueron CPT1A, CPT1B y CPT2, los cuales

codifican para la Carnitina palmitoil transferasas 1A, 1B y 2. Como control se

eligió el gen H2AFZ, el cual codifica para la Histona H2. Se utilizó 40 ng cDNA de

ovocitos madurados in vitro, con el que se realizó un PCR punto final. Los

productos amplificados específicos para cada transcripto fueron de CPT1A

181pb, CPT1B 218pb y CPT2 111pb (figura 13). En el gel de electroforesis de

agarosa al 2%, teñido con SYBR Safe (Invitrogen) se puede visualizar las bandas

31

del tamaño esperado correspondientes a cada gen evaluado, mostrando que en

el ovocito de bovino se expresan tanto las dos isoformas de los genes CPT1A y

CPT1B, como también el gen CPT2.

Figura 13. Electroforesis de los productos de amplificado por PCR punto final, todos los valores

están dados en pares de bases (pb), MP (Marcador de Peso).

3.5 Discusión

En este trabajo se detectó la presencia de los transcriptos Carnitina palmitoil

transferasa CPT1A, CPT1B y CPT2 en ovocitos bovinos madurados in vitro, los

cuales están asociados con el transporte de los ácidos grasos (AG) de cadena

larga al interior mitocondrial (Indiveri et al., 2011), dicho transporte requiere la

unión del AG con L-Carnitina por las enzimas Carnitina palmitoil transferasa 1A y

1B (CPT1A y CPT1B), enzimas que están relacionadas con un aumento en la β-

oxidación (Cook et al., 2001) y por lo tanto, con los niveles de ATP en la célula

(Sutton-McDowall et al., 2012). En este sistema de CPT1, se han descrito tres

isoformas, la tipo hepática (CPT1A), la tipo muscular (CPT1B) y recientemente la

tipo cerebral (CPT1C) (Jernberg et al., 2017). En los complejos CCO, se han

reportado las isoformas CPT1A y CPT1B (Sánchez-Lazo et al., 2014), mientras

otros trabajos encuentran la expresión de las tres enzimas (CPT1A, CPT1B y

CPT2) en células de la granulosa de bovinos (Elis et al., 2015), presentando

mayores niveles de expresión la CPT1A en células del cúmulo a las 24 horas de

la maduración in vitro (Sánchez-Lazo et al., 2014). Las enzimas CPT1 son claves

en procesos metabólicos y en la continuación de la meiosis, al utilizar el Etomoxir

(un inhibidor específico de la CPT1), en donde a bajas concentraciones (25 µM)

aumenta el consumo de glucosa, debido a que la generación de ATP a través de




la β-oxidación está comprometida (Paczokowski et al., 2013), pero al utilizar

concentraciones altas (150 µM), se disminuye drásticamente el porcentaje de

maduración nuclear hasta metafase II (Brisard et al., 2014). Por otro lado, la

CPT2, es la encargada de transferir la CoA al AG, generando acil-CoA y liberar la

L-Carnitina de los ácidos grasos, lo cual permite que los acil-CoA entren a la vía

de la β-oxidación (Dunning et al., 2010).

Aunque la expresión CSe ha observado que la expresión de CP1A y CPT1B es

modulada por suplementos del medio de cultivo (Schreurs et al., 2009) y diversas

hormonas (Cook et al., 2001), por ejemplo, en murinos, se ha encontrado que las

hormonas utilizadas en la maduración in vitro de ovocitos (eGC y hCG) inducen

un aumento de la expresión de CPT1B (Dunning et al., 2010). Adicionamente, los

niveles de RNAm que codifican para CPT1B en CCOs murinos son mayores en

CCOs madurados in vivo, con respecto a los madurados in vitro. En el caso del

modelo bovino se ha observado que existe un aumento en la expresión de los

tres genes, tanto in vivo como in vitro en células de la granulosa de complejos

maduros con respecto a los inmaduros (sanchez-lazo et al., 2014); la isoforma

que presenta el mayor número de transcriptos en las células de la granulosa de

los complejos madurados in vivo es CPT1A, lo cual sugiere que los CCOs

madurados in vitro presentan una deficiencia en el transporte de ácidos grasos

para la β-oxidación y la necesidad de mejorar su componente energético

(Dunning et al., 2014), por lo tanto, se deben buscar mecanismos que permitan

potenciar los niveles energéticos, entre ellos, la β-oxidación.

Teniendo en cuenta que la L-Carnitina es un factor limitante para la activación e

ingreso de los AG a la matriz mitocondrial, se ha evaluado este suplemento en

diferentes procesos de biotecnología reproductiva, tales como la PIVE, la

criopreservación (Held-Hoelker et al., 2017; Saraiva et al., 2018). Particularmente,

se ha demostrado la importancia de la L-Carnitina en la maduración nuclear del

ovocito de bovino, al utilizar Mildronate, un ihibidor de la biosíntesis de la L-C,

presentando un efecto de dosis sobre la disminución del porcentaje de

maduración del ovocito (Sanchez-Lazo et al., 2014). Por el contrario, la adición de

L-Carnitina en la MIV potencia o mejora el porcentaje de maduración nuclear

(Somfai et al., 2011; Zare et al., 2015), inclusive de CCOs de calidad intermedia

(Knitlova et al., 2017).

Con respecto al desarrollo embrionario, se ha reportado una posible correlación

entre los niveles de expresión de CPT2 y la competencia para el desarrollo

embrionario (Gentile et al., 2004), como también la regulación por la L-Carnitina,

de los niveles de CPT1 y CPT2 durante el desarrollo in vitro de embriones

33

bovinos y murinos (Paczkowski et al., 2013; Ghanem et al., 2014; Baldoceda et

al., 2015); mientras que en los porcinos se ve reducida su expresión, lo que indica

que esta especie es más suceptible a perturbaciones en la FAO (oxidation of fatty

acids) (Paczkowski et al., 2013).

Esta investigación corroborá la expresión de CPT2 y de las dos isoformas CPT1A

y CPT1B en el ovocito bovino, al presentar la expresión de ambas isoformas

podría favorecer el ingreso de ácidos grasos al interior mitocondrial, que

finalmente se verá reflejado en forma de energía disponible para su capacitación

y competencia para el desarrollo embrionario.




Capítulo 4: Evaluación de los niveles relativos de especies reactivas de oxígeno y de Glutation activado en ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina


La investigación se realizó en las instalaciones de los laboratorios de Genética de

la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y la consecución del material

biológico para la obtención de los complejos cúmulo ovocito (CCOs), fue

suministrado por la planta de faenado del municipio de Copacabana.


La obtención de los complejos y la MIV se realizó como se describió en el capitulo

2.

4.3 Determinación de la cantidad de glutatión activado en ovocitos cultivados en presencia de L-Carnitina

Para determinar la cantidad de glutatión reducido (γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine,

GSH) se procedió a teñir con el fluoróforo Monochlorobimane (mBCI) (Invitrogen

M1381MP, Molecular Probes), los ovocitos madurados cultivados con o sin L-

Carnitina; en grupos de 10 se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos

en gotas de 50 µl de mBCI (0,25 mM); pasado este tiempo se retiró el exceso de

35

colorante lavando con Hepes y en grupos de 3 se pusieron en gotas de 10 µl de

Hepes sobre portaobjetos (Ballard; 2007), y se observaron con un aumento de

200X en un microscopio de epifluorescencia (Nikon, eclipse 80i) con filtro C-FL

UV-2E/C con una longitud de excitación a 394 nm y de emisión a 490 nm. El área

de los ovocitos fue ajustada, las imágenes se guardaron como archivos gráficos

en formato TIFF. La intensidad de fluorescencia en ovocitos fue analizada como

se describió anteriormente (capítulo 2).

4.4 Determinación de EROs en ovocitos madurados en presencia de L-Carnitina

Para determinar la generación de EROs se tiñó con el fluoróforo

DicloroFluoreceína diacetato H2DCFDA (SIGMA-ALDRICH D6883, Molecular

Probes), los ovocitos madurados con o sin L-Carnitina; en grupos de 10 se

incubaron a temperatura ambiente por 20 minutos en gotas de 50 µl de

H2DCFDA (10µM), luego se lavaron en Hepes (Ballard; 2007), y se observaron

con un aumento de 200X en un microscopio de epifluorescencia (Nikon, eclipse

80i) con filtro FITC/FLUO-3 (B-4A) con una longitud de excitación a 490 nm y de

emisión a 514 nm. El área de los ovocitos fue ajustada, las imágenes se

guardaron como archivos gráficos en formato TIFF. La intensidad de

fluorescencia en ovocitos fue analizada como se describió anteriormente (capítulo

2).

4.5 Resultados

120 CCOs fueron madurados con y sin L-Carnitina, y teñidos con H2DCFDA para

determinar la producción relativa de EROs (figura 14), la intensidad de la

fluorescencia se normalizó con respecto al control (99.9%) y la obtenida para L-

Carnitina fue de 41.6% (tabla 4). En cuanto a la cantidad relativa de glutatión

GSH, se tiñeron con mBCI 60 ovocitos (figura 15), la intensidad de fluorescencia

obtenida para los ovoctos del tratamiento con L-Carnitina fue de 95.37% (tabla 4)

con respecto al control (100%) (tabla 4).




Figura 14. Producción relativa de EROs en ovocitos MIV. Tinción con H2DCFDA; (A) control (99.99%) y (B) L-Carnitina (41.7%).

Tabla 4. Parámetros estadísticos intensidad de fluorescencia por tratamiento

Tratamiento n Media (%) Desv Est. Error Est.

EROs L-C 30 41.7 0.121 0.022

C 30 99.9 0.246 0.045

GSH L-C 30 95.4 0.179 0.033

C 30 100 0.124 0.023

Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza, el cual muestra que hay

diferencia entre los tratamientos para la producción de EROs (p<0.05), teniendo

en cuenta un valor de significacia menor de 0.05 (tabla Anexo D), pero no la hay

para los niveles de GSH (p>0.05) (tabla Anexo D). Con base en lo anterior se

realizó una prueba de comparación de medias por el test Tukey (tabla 5).

Tabla 5. Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para EROs y

GSH.

Tratamiento Media (%) p

EROs L-C 41.6

0.000 C 99.9

GSH L-C 95.3

0.297 C 100

*Valores en negrilla indican diferencia estadística significativa p<0.05

A. B.

37

Figura 15. Cantidad relativa de GSH en ovocitos MIV. Intensidad de fluorescencia relativa (A) control (100%) y (B) L-Carnitina (95.3%).

Se encontró una disminución significativa (p<0.05) en la cantidad relativa de

EROs al interior de los ovocitos madurados en presencia de L-Carnitina

(58.343%), pero no hubo ninguna diferencia significativa (p>0.05) en la cantidad

de glutatión reducido GSH cuando se comparó con el control (100%) (tabla 5).

Figura 16. Producción relativa de EROs en ovocitos madurados con y sin L-Carnitina.

*Diferencia estadística significativa (p<0.05).

4.6 Discusión

A. B.




La producción in vitro de embriones bovinos, se realiza bajo condiciones que

aumentan la producción de EROs, tales como, la concentración de oxígeno, la

exposición a la luz (Du Plessis et al., 2008), y la formulación de los medios de

cultivo utilizados (Martin-Romero et al., 2008). Aunque se ha demostrado que las

EROs pueden modular diferentes funciones celulares (Scherz-Shouval et al.,

2007, Miller et al., 2010, Nemoto et al., 2000), un desbalance en la generación de

EROs tiene efectos deléteros sobre la zona pelucida, la dinámica de los

microtúbulos y granúlos corticales, lo cual compromete la calidad del ovocito

(Goud et al., 2008) y su competencia para el desarrollo embrionario (Gupta et al.,

2010, Covarrubias et al., 2008, Takahashi, 2012). En este trabajo se evalúo el

efecto antioxidante (Gülҫin, 2006.) de la L-Carnitina 3.8 mM durante la

maduración in vitro de los ovocitos de bovino, a través de diferentes parámetros

como la generación de EROs y los niveles de GSH.

Al madurar los ovocitos en presencia de L-Carnitina, los niveles relativos de

EROs se disminuyeron en un 58.33% con respecto al control (figura 14),

respuesta que puede deberse a las propiedades antioxidantes de la L-Carnitina

en sistemas acelulares (Gülçin, 2006), como en sistemas celulares (Somfai et al.,

2011), dismuniyendo los efectos nocivos inducidos por las EROs (Moawad et al.,

2014). Varias investigaciones han demostrado que la suplementación con L-

Carnitina reduce los niveles de EROs durante la maduración in vitro de ovocitos

de diferentes especies, en ovinos en un 40% (Mishra et al., 2016a), en bovinos de

13,72% (Takahashi et al., 2013), en porcinos entre un 40 y 60% (Wu et al., 2011,

You et al., 2012); Adicionalmente, también se ha encontrado este efecto

antioxidante de la L-C, sobre los niveles de EROs en embriones bovinos en el

estadio de 2 células, pero no disminuyó las EROs en en etapas porteriores del

desarrollo embronario (Takahashi et al., 2013). Otros antioxidantes se han

utilizado con el objetivo de disminuir las EROs tanto, en la maduración del ovocito

como en el desarrollo embrionario, favoreciendo diferentes parámetros de

eficiencia y calidad en la producción in vitro de embriones, como lo son el ácido

ascórbico (Vásquez et al., 2014), la melatonina (Yang et al., 2017), el α-tocoferol

(Li et al., 2014), quercetina y el resveratrol (Sovernigo et al., 2017), la cisteína y

cisteamina intracelulares (Rocha-Frigoni et al., 2016, Sovernigo et al., 2017), y la

catalasa extracelular (Rocha-Frigoni et al., 2016).

Por otra parte, el glutatión reducido (GSH), además de ser un cofactor para

múltiples enzimas, es fundamental para brindar protección de las EROs

(Espinosa-Diez et al., 2015; Khazaei & Aghaz, 2017). En ovocitos, la mayor

concentración de GSH se observa durante la metafase II, período crítico para la

39

formación del huso meiótico y para la remodelación de la cromatina espermática

(Zuelke et al., 2003; Salmen et al., 2005). Adicionalmente, la oxidación del

glutatión está asociada con la alteración de la función de los microtúbulos y la

interrupción de la fertilización en ovocitos (Luberda, 2005). También se ha

validado la importancia del GSH, al utilizar inhibidores de la síntesis de GSH

(butionina sulfoximina, BSO), demostrando su participación en la regulación de la

descondensación nuclear de los espermatozoides (De Matos & Fumus, 2000) y la

formación del pronúcleo del macho después de la penetración de los

espermatozoides en ovocitos caprinos (Rodriguez-Gonzalez et al., 2003).

Se ha reportado que la suplementación con L-Carnitina durante la maduración in

vitro de ovocitos aumenta los niveles de GSH, en ovinos en un 50% (Mishra et al.,

2016a), en porcinos 20 y 40% (Wu et al., 2011; You et al., 2012), en murinos

entre 8 y 10% (Zare et al., 2015). En contraste con lo reportado por la literatura,

en este trabajo los niveles intracelulares de GSH no cambiaron al madurar los

ovocitos en presencia de L-C 3.8 mM, del mismo modo, se ha reportado al

madurar los ovocitos de bovinos en presencia de otras moléculas antioxidantes,

tales como, quercetina, resveratrol y vitamina C, tampoco aumentan los niveles

de GSH (Sovernigo et al., 2017).

Cabe resaltar la importancia de continuar evaluando el potencial antioxidante de

estas moléculas durante el desarrollo embrionario, en donde se ha reportado un

efecto benéfico en los niveles intracelulares de GSH. Entre las moléculas

evaluadas están, la melatonina (Yang et al., 2017), extracto de té verde (Wang et

al., 2007; Wang et al., 2012), quercetina, α-tocoferol y el resveratrol (Sovernigo et

al., 2017), la cisteína y cisteamina intracelulares (Rocha-Frigoni et al., 2016,

Sovernigo et al., 2017), y la catalasa extracelular (Rocha-Frigoni et al., 2016) en

bovinos. Y el β-mercaptoetanol en bufalos (Patel et al., 2015) y ovinos (De Matos

et al., 2002). Sin embargo, en otros trabajos no se reporta efecto sobre los niveles

de GSH en embriones porcinos (Wu et al., 2011) y murinos (Truong et al., 2016).

Los resultados de este trabajo permiten concluir que la L-C a una concentración

de 3.8 mM durante la maduración in vitro de ovocitos de bovino, mejora la calidad

del ovocito, teniendo como parámetro, la disminución de la generación de EROs,

pero no la de GSH.

Capítulo 5: Determinación la competencia para el desarrollo embrionario de ovocitos bovinos madurados con L-Carnitina


La investigación se realizó en las instalaciones de los laboratorios de Genética y

Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y la

consecución del material biológico para la obtención de los complejos cúmulo

ovocito (CCOs), fue suministrado por la planta de faenado del municipio de

Copacabana.


La obtención de los complejos CCOs y la MIV, de acuerdo a los grupos de

estudio, se realizó como se describió en el capitulo 2, y al finalizar el tiempo de

maduración de 24 horas, los ovocitos fueron fertilizados.

5.3 Fertilización de ovocitos y cultivo de presuntos embriones

Los ovocitos maduros se transfirieron a gotas de 50 µl de medio TL-FERT

suplementado con Cafeina (1,4 mM), 1% de solución antibiótica (ICN 1670049

MP Biomedicals) y una concentración espermática de 2 x 106

espermatozoides/ml. Las condiciones de fertilización fueron de 38.5°C, 5% de

CO2 y 90% de humedad relativa durante 18 horas (Dode et al., 2002).



A las 18 horas post-inseminación (hpi), los presuntos cigotos se desnudaron de

las células del cúmulo y se cultivaron en gotas de 50 µl de medio de cultivo

KSOM-aa suplementado con 0.6 mg/ml de BSA-FAF, 1% de solución antibiótica y

3% de SBF, por 8 días. Las condiciones de cultivo fueron 38.5°C, 5% de CO2 y

90% de humedad relativa. La tasa de clivaje se determinó a las 48 horas de

cultivo sobre el total de ovocitos inseminados, y la tasa de blastocistos a los días

7 y 8, sobre el total de ovocitos inseminados y de embriones en etapa de clivaje

(Vásquez-Araque et al., 2014d).

5.4 Resultados

Para evaluar el efecto del suplemento L-Carnitina durante la maduración de los ovocitos bovinos, sobre la competencia para el desarrollo embrionario: 700 ovocitos se maduraron y fueron utilizados para evaluar la competencia para el desarrollo embrionario después de la fertilización. Se determinaron varios parámetros, como los porcentajes de clivaje, blastocistos a los días 7 y 8 a partir de ovocitos inseminados y de embriones en etapa de clivaje (tabla 6). Tabla 6. Parámetros estadísticos de desarrollo embrionario

Media (%) ± Desv. Std

Control L-C

%Clivaje 77.44 (4.66) 75.00 (11.71)

%Blas 7 ovo* 31.71 (3.65) 39.97 (3.65)

%Blas 8 ovo* 37.03 (6.62) 40.73 (4.04)

%Blas 7 cliv** 41.85 (2.65) 54.15 (6.54)

%Blas 8 cliv** 49.32 (7.39) 55.08 (6.46)

*: Porcentaje de Blastocistos con respecto a ovocitos inseminados **: Porcentaje de Blastocistos con respecto a los clivajes

Todos los datos fueron sometidos al test de Brown-Forsythe para determinar la

homogeneidad de las varianzas y para todos los parámetros evaluados se

obtuvieron valores de significancia (p< 0.05), lo que permitió realizar el análisis de

varianza, por que se cumple el criterio de homocedasticidad. El análisis de

varianza (ANOVA) mostró efecto en el porcentaje de blastocistos obtenidos al día

7 de cultivo, tanto a partir de ovocitos inseminados y de embriones clivados

(p<0.001) (tabla Anexo E).

Capítulo (…) 43

Al realizar la prueba de comparación de medias Tukey, se encontró que para el

porcentaje de clivaje, no hubo diferencia estadística (p>0.05) entre el tratamiento

L-C y el control (77.44 vs 75.00%) (Tabla 7), mientras que, el porcentaje de

blastocistos al día 7, a partir de ovocitos inseminados (L-C: 39.98%, C: 31.71%) y

de embriones en etapa de clivaje, presentaron diferencia significativa al

comparalos con el grupo control (p<0.05), pero no se encontró diferencia al día 8

de cultivo (Tabla 7).

Tabla 7. Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para los parámetros de desarrollo.

Tratamiento Media (%) p

%Clivaje L-C 75.00

0.640 C 77.44

% Blast Día 7 ovo* L-C 39.98

0.001 C 31.71

%Blast Día 8 ovo* L-C 40.37

0.219 C 37.03

% Blast Día 7 cliv** L-C 54.15

0.001 C 41.85

% Blast Día 8 cliv** L-C 55.08

0.147 C 49.32

Cifras en negrilla indican diferencia estadística significativa *: Porcentaje de Blastocistos con respecto a ovocitos inseminados **: Porcentaje de Blastocistos con respecto a los clivajes



Figura 17. Parametros evaluados de desarrollo embrionario *Diferencia estadística significativa (p<0.05).

5.5 Discusión

Entre los parámetros más relevantes que se tienen para determinar la calidad del

ovocito, se encuentran la morfología del CCO (De Wit et al., 2000), los niveles de

GSH (Salmen et al., 2005), expresión génica (Hosoe et al., 2011), la distribución

mitocondrial y cantidad ATP (Yu et al., 2010), su competencia para el desarrollo

embrionario es el parámetro que mejor refleja la calidad de éste (Gottardi &

Mingoti, 2009). Por lo tanto, en esta investigación se determinó el efecto del

porcentaje de desarrollo embrionario de ovocitos madurados en presencia de la

L-C, siendo mayor el porcentaje de blastocistos al día 7 de cultivo en el grupo

madurado con L-C, tanto a partir de ovocitos inseminados como de embriones

clivados (39.97% y 54.15%, respectivamente). Sin embargo, estos porcentajes

fueron similares al control, al día 8 de cultivo. Este resultado nos indica que los

embriones generados con ovocitos madurados con L-C tienen una cinética de

desarrollo mayor que los embriones control. Aunque se controlaron varios

factores que influyen en esta cinética, tales como el semen (del mismo individuo y

eyaculado) (Alomar et al., 2008), suplementos energéticos y condiciones de

Capítulo (…) 45

cultivo (Lonergan et al., 2003), el sexo del embrión no fue controlado, ya que los

embriones de sexo masculino tienen una cinética mayor (Alomar et al., 2008). Los

efectos benéficos de la maduración de ovocitos con L-Carnitina, sobre el

desarrollo embrionario han sido reportados en diferentes especies, como son

bovino (Phongnimitr et al., 2013; Ghanem et al., 2014; Baldoceda et al., 2016),

murino (Abdelrazik et al., 2009; Moawad et al., 2013; Zare et al., 2015), porcino

(Somfai et al., 2011; Lowe et al., 2017) y ovinos (Mishra et al., 2016a; Mishra et

al., 2016b), sin embargo, en esta última especie las concentraciones de L-C que

presentaron respuesta fueron 7.5 mM y 10 mM (Mishra et al., 2016a). Por otro

lado, algunos estudios no reportan efecto de la maduración de ovocitos bovinos

con L-C sobre el porcentaje de blastocistos (Chankitisakul et al., 2013,

McKeegan, 2015).

Aunque en este trabajo no se encontró diferencia en el porcentaje de clivaje, una

de las etapas criticas en la producción de embriones, es el freno o bloqueo del

desarrollo en los embriones en etapa de clivaje (Lonergan et al., 2003; Vigneault

et al., 2009), los cuales presentan una expresión génica diferencial asociada con

la activación del genoma embrionario y la cinética de desarrollo (Ripamonte et al.,

2011; Vigneault et al., 2009). Este bloqueo está relacionado principalmente con la

activación del genoma, la compactación y la diferenciación del embrión

(Wrenzycki et al., 2002), y la apoptosis (García et al., 2015). En el porcentaje de

embriones clivados que alcanzaron la etapa blastocisto (blastocisto/clivados) fue

mayor en los ovocitos madurados con L-C (L-C:54.15%), lo que indica que la L-

Carnitina puede mejorar la producción de embriones, a través de mecanismos

antioxidantes (You et al., 2012; Mishra et al., 2016a), modulación del metabolismo

(Moreira, 2015) y disminución del daño del DNA (Abdelrazik et al., 2009; Mishra et

al., 2016b). Además, de favorecer las condiciones de cultivo, que permiten la

expresión de genes implicados con el metabolismo lipídico (Sanchez-Lazo et al.,

2014; Ghanem et al., 2014; Baldoceda et al., 2016; Saraiva et al., 2018), la

replicación del DNA, factores de transcripción, quinasas (You et al., 2012), la

implantación del embrión y el mantenimiento de la preñez (Interferon Tau, IFNt)

(Ghanem et al., 2014).

La L-Carnitina se ha evaluado en procesos de biotecnología reproductiva

diferentes a la PIVE, como son el aumento de la criotolerancia de los ovocitos

bovinos (Chankitisakul et al., 2013) y porcinos madurados in vitro (Lowe et al.,

2017), determinada a través de las tasas de desarrollo embrionario, reexpansión

y eclosión (Ghanem et al., 2014). Como también en estrategias para mejorar el



ooplasma receptor para la transferencia nuclear en la clonación en porcinos (You

et al., 2012).

Bajo nuestras condiciones experimentales se determinó que la maduración in

vitro de ovocitos bovinos con el suplemento L-Carnitina a una concentración de

3.8 mM, aumenta el porcentaje de blastocistos al día 7 de cultivo, lo cual podría

estar asociado a su función antioxidante y metabólica, favoreciendo las

condiciones celulares y de cultivo para mejorar la producción de blastocistos.

Conclusiones

En conclusión, se demuestra la expresión de las enzimas carnitina palmitoil

transferasas CPT1A, CPT1B y CPT2 en ovocitos bovinos madurados in vitro con

L-Carnitina a una concentración de 3.8 mM, la cual mejora la calidad del ovocito,

teniendo como parámetros: la disminución en la cantidad relativa de lípidos y en

los niveles de especies reactivas de oxigeno, el aumento de la actividad

mitocondrial y el porcentaje de embriones en etapa de blastocisto al día 7 de

cultivo. Bajo nuestras condiciones recomendamos suplementar el medio de

maduración con L-Carnitina, para mejorar la eficiencia de biotecnologías como la

PIVE y la criopreservación de ovocitos y embriones bovinos.



Perspectivas

Se plantean dos mecanismos para explicar la disminución de la cantidad relativa

de lípidos (gotas lipídicas). En el primero, los ovocitos de bovino madurados con

L-Carnitina presentan una disminución de la expresión de los genes DGAT1 y

PLIN2, relacionados con la expansión o crecimiento de la gota lipídica, y de

DGAT2 relacionado con su biogénesis (Figura 18).

En el segundo mecanismo la reducción en la cantidad relativa de lipidos podría

explicarse por el aumento en la expresión de CPT1 y CPT2 (Sanchez-Lazo et al.,

2014), enzimas implicadas en el transporte de ácidos grasos activados al interior

mitocondrial, que sumadas a la disponibilidad de grupos acil-carnitina por la

presencia de L-C en el medio de maduración, aumentan dicho transporte y por

ende la actividad mitocondrial (Figura 19).

Figura 18. Biogénesis y expansión de las gotas lipídicas. Modificado de Thiam et al.,

2013.

Conclusiones

49

Figura 19. Mecanismo del transporte de los grupos acilo y de la actividad mitocondrial- Modelo

planteado

Anexos

A. Tabla: Prueba de comparación de medias por el Test de Tukey para Rojo Nilo y Mitotracker green

Tratamiento Media (%) P Contenido de

gotas lipídicas

L-C 91.19 0.033* C 100


L-C 260.12 0.000*

C 100

*Diferencia estadística significativa.

B. Tabla: Descripción de cebadores específicos para amplificación de los transcriptos

Gen Cebadores Tamaño

(pb) Referencia Código GenBank

CPT1A F 5´- TCCTGGTGGGCTACCAATTA–3´

R 5´- TGCGTCTGTAAAGCAGGATG–3´ 181

Sanchez-Lazo et al., 2014

FJ415874

CPT1B F 5´- TGCCTTTACGTGGTCTCCAA -3´ R 5´- GTGTTCTCACCCGCGATCAT-3´

218 Sanchez-Lazo

et al., 2014 NM_001034349

CPT2 F 5´- TGTGCCTTCCTTCCTGTCTTGG-3´ R 5´- CGATGGGGTCTGGGTAAACGA-3´

111 Sanchez-Lazo

et al., 2014 NM_001045889

H2AFZ F: 5´-AGGACGACTAGCCATGGACGTGTG-3´

R: 5´-CCACCACCAGCAATTGTAGCCTTG-3´ 209

Takahashi et al., 2015

NM_174809

52 Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para el desarrollo embrionario

de ovocitos bovinos madurados in vitro con L-Carnitina

C. Análisis de Primers

H2AFZ: H2A histone family. member Z (H2AFZ). transcript variant X1 (Takahashi

K. et al., 2015)

F: 5´-AGGACGACTAGCCATGGACGTGTG-3´

R: 5´-CCACCACCAGCAATTGTAGCCTTG-3´

1 tcccggatga gggaacattc tgcagtataa agggagcggg gaaggcggga gacagcgcag

61 tttgaatcgc ggtgcgacga aggagtaggc ggcgggtttt cgctgggtgt ctgactagtc

121 ctttctctgc cttgcttgtt tgagcttcag cagaattcga aatggctggc ggtaaggctg

181 ggaaggactc cggaaaggcc aagacaaagg cggtttcccg ctcgcagaga gccggtttgc

241 agttcccggt gggccgtatt catcgacacc tgaaatctag gacgactagc catggacgtg

301 tgggcgcgac tgccgctgtg tacagcgcag ccatcctgga gtacctcacc gcagaggtac

361 ttgaattggc aggaaatgca tcgaaagact tgaaggtaaa gcgtattacc cctcgtcact

421 tgcaacttgc tattcgtgga gatgaagaat tggactctct catcaaggct acaattgctg

481 gtggtggtgt cattccacac atccacaaat ctctgattgg aaagaaagga caacagaaga

541 ctgtctaaag gatgcctgga ttccttatta tctcaggact ctaaatactc taacagctgt

601 ccagtgttgg tgattccagt ggactgtatc tctgtgaaaa acacaatttt gcctttttgt

661 aattctattt gagaaagttg gaagtttaat tagctttcca accaaccaaa tttctgcatt

721 tgagtcttaa ccatatttaa gtgttactgt ggcttcaaag aagctattga ttctgaagta

781 gtgggttttg attgagttga ctgtttttaa aaaactgttt ggattttaat tgtgatgcag

841 aagttatagt aacaaacatt tggttttgta cagacattat ttccactctg gtggataagc

901 tcaataaagg tcatatccca aacta

CPT1A: Carnitine palmitoyltransferase 1A FJ415874 (Sanchez-Lazo et al., 2014)

F: 5´- TCCTGGTGGGCTACCAATTA–3´

R: 5´- TGCGTCTGTAAAGCAGGATG–3´

Anexo A. Analisis de Primers 53

1 cctccagttg gctcatcgtg gttgtgggcg tgatgtcgac catgtacgcc aagatcgacc

61 cctctttggg aataatcgct aagatcaacc ggaccctgga cacgacttta tggtcaagat

121 cttctcaggc cgaaaaccca tgttgtacag cttccagacg tctctgccgc gcctgcccgt

181 gccagctgtc caggacaccg tcaacaggta cttggaatct gtgaagcctc ttatgaagga

241 gggagacttt acacggatga cggctctggc acaagatttt gctgtcaatc tgggaccaag

301 attgcagtgg tatttgaagc taaaatcctg gtgggctacc aattatgtga gcgactggtg

361 ggaggaatac atctacctcc gaggacgagg gccgctgatg gtgaacagca actacttcgc

421 gatggacttg ctgtatatca taccgactca catccaggcg gcaagagctg gcaacgggat

481 ccacgccatc ctgctttaca gacgcaaact ggaccgggag gaaatcaaac cgattcttct

541 tctggggtct acgattccgc tctgctccgc ccagtgggag cgcatgttta atacttctcg

601 gatcccggga gaggagacag acaccatcca gcacctgagg gacagcaagc acatcgtcgt

661 cttccaccgg ggccgctact tcaaggtctg gctctaccac gacggccggc tgctgaggcc

721 ccgcgagatc gagcagcagg tgcagcggat cctggaggac ccgtcggagc cgcagcccgg

781 ggaggccaag ctggcggcgc ttacggcggc ggacagggtc ccctgggcca ggtgtcgcca

841 ggcctatttt ggacacggga aaaacaagca gtctctggat gccgtggaaa aagcagcgtt

901 cttcgtgacg ttagacgaaa ccgagcaggg atacagggag gaggacccgg aaacgtcgat

961 ggacagctac gccaagtccc tgctgcatgg caggtgtttc gacaggtggt ttgataaatc

1021 attcacgttt atcgtcttta aaaacggaaa gatgggcatt aatgcggagc actcctgggc

1081 cgatgcgccc atcatgggtc acctttggga gtacgtcatg gccacagaca gcttccagct

1141 gggttacacg gaggatggac actgtaaagg agacaccaac ccgaacatcc cgtaccctac

1201 ccggctgcag tgggacatcc cggaggaatg tcaggaggtc attgagactt cactgagcag

1261 tgccaacctc ctggccaacg acgtggattt ccactccttc ccattccgca ctttcggtaa

1321 agggctgatt aagaaatgta aaaccagccc ggacgccttc gtacagctct cgctccagct

1381 ggctcattac aaggacatgg gtaaattttc cctcacctac gaggcctcca tgacccggct

1441 gttccgagag ggcagaacgg agaccgtgcg ttcctgcacc gctgagtcgt gcagcttcgt

1501 gctggccatg gtagacccca cacagacggt tgaacagaag ctcaagttgt tcaggatcgc

1561 gtctgagaag catcagcttc tgtaccgcct ggcgatgacc ggtgcgggga tcgaccgcca

1621 cctcttctgc ctctacgtgg tgtccaagta cctcgcggtc gactcccctt tcctgaagga

1681 ggtcttagct gagccttgga gattatccac cagccagacc cctccacagc aggtggaact

1741 gttcaatttg gataggaatc cagactacgt gtcgtgcgga gggggcttcg ggccggttgc

1801 tgatgacggc tatggggtgt cgtacattct cgtcggtgag gacctcatca atttccatat

1861 atcctccaag ttctcctgtc ctgagacgga ttcgcatcgc ttcgggaaga acctgagaga

1921 agcaatgacc gacatcatca gtttgttcgg gttcagcccc aattccaaaa agtaaatctc

1981 ttagcacttc tgggaaggaa aagaagttct tctgatgaaa aaccaaatga aaaatagctc

2041 tgtgtcctga ctgtatttca ggatgaaaat ttgtttcctt ccagcgaagg tttggtgttt

2101 ttgcttttct aggacagcag gctccacgcc gtgaagtata accctactcc ttctaagcag

2161 ctcctaacct gggggacatt ggatgaagtc ccccctaaag tcttcccatc accttacatt

2221 ccttaaggga caagcgattt ttggaatgag tggggttgtg gcttcatact cgctggaacc

2281 agaccggcac gcttccttgg ctgccactgg acacctggta cttacgggca cttaatttta

2341 tcagagcagt gtaaacattt gtttccttcc aagagaaaag cctcttttaa gttgcagata

2401 ttagcagtta atagccgacg cacatgcagc gcactaaccg agacaagctt tgtgatttgg

2461 aatctgttct gtctgtggtc actctcactg tctagtccgg tcatctgctt ttgcctctcc

2521 gtgtttgaag tcttcaaaac ccggtgcctt aaaacagaag gccctaagca taagggaggc

2581 cacgcaagag atttatttta agtctttggg tggaattgtg ggtgtctcac tcccgtctca

2641 atttcctggg tggatatccc tgtgtaggga ttttcctgtc atgtccccat gtcccagagg

2701 gaccagtccc cttacaaggg cagctgtgag ccggattccc ttccatcaga ctgccttcct

2761 caagcttcat tgttaagcta cgaaaaaaga tgtgggcgcg tgtcagaaat ggggagcaag



2821 gcatgtgatg gttgaagata gcgtgtctgg ataacacaca tggtagatgc ttccggattc

2881 ctgcttaccc agcctgccag cagggataac aggacagtgg ccactgagaa aggaacaaac

2941 ttgagaagag cgaacctcag gtagtcaggg ctggccgtcc cacctgctga gagaggagac

3001 ccactcccgt ctccagggag acagagggag atgggtcatc tcggcgacct cctagaatgt

3061 cgcaggtgac gggtgctgag tttaacacag cctacccttc cgatgcgtgt gccttgctcg

3121 aaagagagat tgaccaaaaa gtgatgacgc gctgcatcgt cttcagtatt taatgcaaaa

3181 agaaagaatc atggagtgaa atagacccac tgcctctggg ctgtcatgac aggcttagct

3241 gtccattttt aaaatcatgt atttattttt ctgagcactc tgttctggtg gggctcatgt

3301 ctctaagagt cctgtactcc agtgatttgg tgatgaggct gaaccgatgg ggcaggggca

3361 aggcactggc cacagggcac gtgcatattt tattcgtgta catgttgtga tgtaaacccc

3421 ccctaaatgg gccaaagact ctttctgtta aaagcaagca gaaatgggaa cagacaaaaa

3481 agcaaaaaag gacatctaac caccatagca acaaaagatc ctgttcatct gtggtatgta

3541 gtcagggggg catcggggga tacgggagcc cccctgactc agccaggcgt ggcttccagt

3601 tgaagccagg gcccccaaat catgcactgt tgaccactga ccagtctgta ttatgattca

3661 cgggtgaatt cgagagcaga catgttagca ctcaaaccta tttgggcttg tctctcaggt

3721 tttaaatatt tcaaatgtaa ttttcactaa tccatgcagt catcaatgca attttatatt

3781 ccttaaaagg aagaagactg ggtttgtact gtacatgttg aaagcaggaa gttaagagta

3841 ttcatgtatt taatttaatt tggaacaagc catagtctta acagagctgt ggtctgaatt

3901 tgttatgttg gactggccat tgcatgtaaa tataaggtgc ccttttggat gtaaatctta

3961 gatacgcagt atgaatgtta ccattaataa aaacattaac caca

CPT1B: Carnitine palmitoyltransferase 1B NM_001034349 F: 5´- TGCCTTTACGTGGTCTCCAA–3´ R: 5´- GTGTTCTCACCCGCGATCAT–3´

1 atggcggaag cgcaccaggc tgtggccttc cagttcactg tgaccccaga gggggtcgac

61 ttccagctca gtcgggaggt gctgaaacac atctacctgt ccgtgatcag gtcctggaag

121 aaacgcctga ttcgcatcaa gaatggcatc ctcaggggcg tgtaccctgg cagccccacc

181 agctggctgg tcgtggttat ggcaacagcg ggttcctcct actacaacgt ggacatttcc

241 atgggcctgg tctattatat ccagagatgg cttcctgagg ggcgtcccta ccggacccca

301 tacacccgga cgcttttcag catggccatc ttctccacgg gggtctggat gatgggcatc

361 ttcttctttc gccaaaccct gaaactgctt ctttcctacc acggttggat gtttgagttg

421 cacggccaga ccagccactt gaccagagtc tgggctgtct gtgtccgcct tctgtctggc

481 cgacggccca tgctctacag cttccagacg tctctgccca agctgccggt gcccagcgtg

541 ccagccacag ttcatcggta cctagaatcc gtggaacact tgctggatga tgagcaatat

601 tatcgaatgg agacgctggc caaggagttc gaggagaaga ctgcccccag gctgcagaag

661 tacctggtac tcaagtcctg gtgggcaacc aactacgtga gcgactggtg ggaggagtac

721 gtctacctcc ggggcaggaa ccccatcgtg gtcaacagca actactacgt catggacctg

781 gtgctcgtca agaacacgga cgtgcaggct gcccgcctgg gaaatgctgt ccacgccatg

841 atcacgtatc gccgtaaact ggaccgtgaa gagatcaagc ctgtgatggc gctgggcctc

901 gtgcccatgt gctcctacca gatggagagg atgttcaaca ccactcgcat cccagggaag

961 gacacagatg tgctccagca cctcccggac agcaggcacg tggctgtcta ccacaagggc

1021 cgatttttca aggtgtggct ctacgagggc tcccgcctgc tcaagcctcg ggacctggag

1081 atgcagttcc agaggatcct ggacgacccc tccccacccc agcccgggga ggagagactg


1141 gcagccctca ctgcaggggg aagagtggag tgggcacagg cacgccaggc cttcttcagc

1201 tctggcaaga acaaggctgc cctggatgcc atcgagcgcg ctgcgttctt cgtggctctg

1261 gatgaggagt ctcaccacta tgacccggag gacgaggcca gcctcagcct ctacggcaag

1321 gccctgttgc acggcaactg ctacaacagg tggttcgaca agtccttcac actcatctct

1381 ttcaagaacg gccagctggg actcaacaca gagcacgcgt gggcagacgc ccctatcata

1441 gggcacctct gggagtttgt cctgggcacc gactccttcc atctgggcta cacagagacg

1501 gggcactgtc tgggcaaacc caaccctgtg ctgcccccac ctcagcgact ccagtgggac

1561 attcctaagc agtgccaggc ggtcatcgag agttcctacc aggtggccaa ggcgctggcg

1621 gacgatgtgg agctgtactg cttccagttc ctgccttttg gcaaaggcct catcaagaag

1681 tgccggacca gccctgacgc cttcgtgcag atcgccctgc agctggcgca cttccgggac

1741 aggggcaagt tctgcctgac ctatgaagcc tcaatgacta gaatgttccg agagggccgg

1801 acggagaccg tgcgctcctg cacccgcgag tccacagcct ttgtccaggc catggtgcag

1861 gggcgccacc tgaacgaaga cctccaacgt ctgttccgga aggctgctga gaagcaccag

1921 aatatgtacc gcctggccat gacaggggcg gggattgaca ggcacctctt ctgcctttac

1981 gtggtctcca agtacctggg agtcgaatcc cctttcctgg ctgaggtgct ctcagaaccc

2041 tggcgcctct ccactagcca gatcgctcaa ttccagatcc gtatgttcga cccaaacaag

2101 taccccaaac accttggtgc cggcggtggc tttggccctg tggcagatga cggctatgga

2161 gtttcctaca tgatcgcggg tgagaacacc atcttcttcc acgtctccag caagttctcc

2221 agctcagaga cagtgagtct gccctgctgc tactctgcct gaggagggtc ggcccaggaa

2281 tgcccagcgc tttgggaacc agatccgcca agctctgcta gacatcgcca atcttttcca

2341 agttcccaag gctgatggct aagggctgga gagatgccag ctgcccttct gtccccacag

2401 agtggaggag ggggcctgtg gtcggcctgc aggcacaggg gtggcagcgc ataggtgccc

2461 aggctccaag aacatctccg gaaacaagtg ctcccccagc tgacactgct ccctgagggc

2521 tcaggtggcg gaagtagggc tggagggaat cttgattttt tttttttctt gctagatgct

2581 aataaaaata aggctgtatg gttctgtttt agcccttaag tacctgtagg tttttttggg

2641 gggtggggga ctaggagtcc cttcccttgc tctagctcag gccagcaagg tggccaggga

2701 agggctaggg ctggagactg tgagaggctt ctgacctgct ttaaatatgg gtctctgctg

2761 tccacaccca cacatgcact tggaataaat tcttgcttta gaacttcca

CPT2: Carnitine palmitoyltransferase 2 NM_001045889 F: 5´- TGTGCCTTCCTTCCTGTCTTGG–3´ R: 5´- CGATGGGGTCTGGGTAAACGA–3´

1 gtcggacatg actgagcgac tgaactgaat tgaactgggc cccacccagg tttaggatca

61 gagggatttt ctccactgta gaattggaaa gctgagaaga atattaaagt caaggaatat

121 gaagatcatt tctttcactc tgcagaacaa atatcctgga gctacaaata gcacccatca

181 cctgttgtat aattctgtaa acaatgactc cctcaggcct ccacttcgtc acctgtatgt

241 tgagagttag atgagattcc ttatctctga gattctggaa aggtaaattg tattatcttt

301 acactcattt agatgtcaca cttaatgaaa agcccaggct tgaagtcctg tagaacttag

361 atttagattc cagatctgac actctataac ttcaggcagt tctgtccact tcttttgagc

421 ccagttctta cctgcaaagt agtatcagaa tgcacagttc atagggctgt tgtgagggta



481 gagtgaggta aaatgccaaa atagttggca tcttctcttg ttagttggca agagaaggac

541 tagcctctta atatcagtat taggtggtcc aactgggcct cccttcttcc ctcatccttt

601 ttctgtcata tccctgcctt ttagtcaagt gactttggac ttgctttctt ctaggaagcc

661 ttgcagtatc atttgcttgg tttccagcta ttatgttttt ttcctttgtt cttttttttt

721 gtggtcaaat atacaaaaca taaaatttac ccttttaact atttttaggt gtgcaattca

781 gttaagtgtt ttttttttca gggttatgtt ttatgcactg agaaattaat ctcagaatat

841 aaaaccgcaa gtctggagaa gacaaagggt ggatcagcct gatctacaca tttacattat

901 taacttgata aacattgatt gacatgaatt tggagaccag tcagtcatgg tgaggagtta

961 ctgtatagtg ggggagattc gacaggctgc ctattcccaa acttgaagac accattagaa

1021 gatacctcag tgcacagaag cctctgttgg atgacagcca gttcaggaaa acagaacagt

1081 tgtgtaagag ttttgaaact ggaattggaa aagaactgca tgagcagctg gtcactcagg

1141 acaagcagaa taaacataca agctacattt caggcccctg gtttgatatg tatttaactg

1201 ctcgagatcc tgttgtcctg aactttaatc cgtttatctc attcaaccct gatccaaagt

1261 ccgagtataa tgaccagctc acccgggcca ccaacatgac tgtctctgcc atccggtttc

1321 tgaagacact tcgggctgac cttctggagc cagaagtgtt ccatttgaac cctgccaaaa

1381 gtgataccga taccttcaag agattcatac gctttgtgcc ttccttcctg tcttggtatg

1441 gcgcctactt ggtcaatgca tatcccctgg acatgtccca gtattatcgg cttttcaatt

1501 caactcgttt acccagaccc catcgagatg aactcttcac cgatgacaag gccagacacc

1561 tcctggtcct aagaaaagga cacttctaca tctttgatgt cctggatcaa gatgggaaca

1621 ttgtgagtgc ctctgaaatc caggctcatc tgaagtacat tctgtcagac aatagcccgg

1681 cccccgagtt tccgctttcg tatctgacta gtgagaaccg ggacatctgg gcagagctca

1741 gacagaagct ggtgagtggt ggcaacgagg cgaccctggg gaaagtggac tcggctgtgt

1801 tctgtctctg cctagatgac ttccccatta gggactttgt ccacctgtcc cacagcatgc

1861 tgcatggtga cggcacaaac cgctggtttg acaaatcctt taacctcatt atagccaagg

1921 atggcactgc tgccatccac tttgagcatg cctggggcga tggtgttgca gtgctcaggt

1981 tttttaatga agtgtttaaa gatagcactc aggcccctgc catcactccc cagagccagc

2041 cggccagcac tgactcttct gtggctgtac aaaaactcaa cttcaagctg agcgatgctt

2101 taaagactgg cattagcgct gctaaagaaa aatttgatgc caccgtgaaa agcctcacca

2161 tcgactacat ccggtttcag agaggaggca gagaattcct gaagaagcag aagctgagcc

2221 ctgactcgat ggctcagctg gccttccaga tggccttcct gcggcagtac gggcagacgg

2281 tggccaccta tgagtcctgt agcactgcag cattcaagca cggccgcacc gagaccatcc

2341 gcccggcctc catcttcaca aagacgtgct ccgtggcctt tgtcagggag ccttccaagt

2401 atagcgctgg agagcttcag cagatgatgg ccaagtgctc cacataccac aaccagctga

2461 ccagagaagc agcaatgggc cagggctttg atcgacactt gtttgctctg cggtacctgg

2521 cagcagccag agggatcagc atgcccgagc tgttcctgga ccctgcatat aggcagataa

2581 accacaacat cctgtccacc agcacactga gcagcccagc agtgaacatc ggctgctttg

2641 cccccgtggt ccctgatggt tttggcattg ggtactccgt tcaggacaac tggataggct

2701 gcaacgtctc tgcctaccaa agccgcaatg cccgtgagtt tctccagtgt gtggagaagg

2761 ccttagaaga catgtttgat gccttggaag gcaaaatgat caaaacctag cttctaggtg

2821 agtgaaaagc ctctgtttca ccagcataaa aactggggcc tctgtagcca gtaagcacta

2881 ttctgtgact aatgaaacta attatgaggt gcctgagcac cattgctata agatttgagc

2941 cttaaaacca tagttttaaa gctaaacata tgatttccaa gaccatatct aaagatgctg

3001 taagattccg gttttaagga cattatcagg aggtaagact tggaaaataa ctcagatgta

3061 cttattgttg aagcagaaat aaaatttaat tctttctt

D. Tabla: Análisis de varianza-ANOVA para EROs y GSH

SS Df MS F p

EROs 5.106 1 5.106 136.041 0.000

GSH 0.032 1 0.032 1.348 0.250

*Valores en negrilla indican diferencia estadística significativa p<0.05


E. Tabla: Análisis de varianza (ANOVA) para las variables porcentaje de clivaje y de blastocistos

SS Degr. Of MS F p

%Clivaje 20.49 1 20.49 0.23 0.640

% Blast día 7 ovo* 233.95 1 233.95 17.54 0.001

% Blast día 8 ovo* 46.88 1 46.88 1.68 0.218

% Blast día 7 cliv** 518.72 1 518.72 18.59 0.001

% Blast día 8 cliv** 113.46 1 113.46 2.41 0.147

Cifras en negrilla indican diferencia estadística significativa *: Porcentaje de Blastocistos con respecto a ovocitos inseminados **: Porcentaje de Blastocistos con respecto a los clivajes

Bibliografía

Abdelrazik H. & Agarwal A. 2008. L-carnitine and assisted reproduction. Arch Med

Sci; 5:43–47.

Abdelrazik H, Sharma R, Mahfouz R, Agarwal A. 2009. L-Carnitine decreases

DNA damage and improves the in vitro blastocyst development rate in mouse

embryos. Fertil Steril; 91(2):589-596.

Abe H, Yamashita S, Satoh T, Hoshi H. 2002. Accumulation of Cytoplasmic Lipid

Droplets in Bovine Embryos and Cryotolerance of Embryos Developed in Different

Culture Systems Using Serum-Free or Serum-Containing Media. Mol Reprod Dev;

61:57-66.

Alomar M, Tasiaux H, Remacle S, George F, Paul D, Donnay I. 2008. Kinetics of

fertilization and development, and sex ratio of bovine embryos produced using the

semen of different bulls. Anim Reprod Sci; 107(1-2):48-61.

Aon M, Bhatt N, Cortassa S. 2014. Mitochondrial and celular mechanisms for

managing lipid excess. Front physiol; 5:1-13.

Apa R, zyüre M, Gü lü , apano lu E. 2016. Antioxidant Activity/Capacity

Measurement. 1. Classification, Physicochemical Principles, Mechanisms, and

Electron Transfer (ET)-Based Assays. J. Agric. Food Chem; 64:997−1027.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alomar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tasiaux%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Remacle%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=George%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Paul%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Donnay%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17629423



Augustin R, Pocar P, Wrenzycki C, Niemann H, Fischer B. Mitogenic and anti-

apoptotic activity of insulin on bovine embryos produced in vitro. Reproduction;

2003; 126:91–99.

Baldoceda L, Gagné D, Ferreira C, Robert C. 2016. Genetic influence on the

reduction in bovine embryo lipid content by l-carnitine. Reprod Fertil Dev;

28:1172–1184.

Ballard C. 2007. Intracellular lipids in Bos indicus and Bos taurus oocytes. Faculty

of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College. [Tesis

de Maestría].

Barcelo-Fimbres M. & Seidel G. 2007. Effects of Either Glucose or Fructose and

Metabolic Regulators on Bovine Embryo Development and Lipid Accumulation In

vitro. Mol Reprod Dev; 74:1406–1418.

Bertolini M, Bertolini L. 2009. Advances in reproductive technologies in cattle: from

artificial insemination to cloning. Rev Med Vet Zoot; 56(3):184–194.

Bettegowda A. & Smith GW. 2007. Mechanisms of Maternal mRNA regulation:

implications for mammalian early embryonic development. Front Biosci; 12:3713-

3726.

Bilodeau-Goeseels S; 2012. Bovine Oocyte Meiotic Inhibition Before In: vitro

Maturation and Its Value to In vitro Embryo Production: Does it Improve

Developmental Competence? Reprod Domest Anim; 47:687–693.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baldoceda%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25568931

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gagn%C3%A9%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25568931

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ferreira%20CR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25568931

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Robert%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25568931

Bibliografía 61

Block J, Hansen P, Loureiro B, Bonilla L. 2011. Improving post-transfer survival of

bovine embryos produced in vitro: actions of insulin-like growth factor-1, colony

stimulating factor-2 and hyaluronan. Theriogenology; 76(9):1602–1609.

Blondin P, Vigneault C, Nivet A, Sirard M. 2012. Improving oocyte quality in cows

and heifers - What have we learned so far?. Anim Reprod; 9(3):281-289.

Brisard D, Chesnel F, Elis S, Desmarchais A, Sánchez-Lazo L, Chasles M,

Maillard V, Uzbekova S. 2014. Tribbles expression in cumulus cells is related to

oocyte maturation and fatty acid metabolism. J Ovarian Res; 26:7-44.

Camargo O, Ruiz T, Olivera M. 2008. Modelo teórico para explicar la acumulación

de gotas lipídicas en embriones bovinos machos o hembras producidos in vitro.

Acta Biol Colomb; 13(2):89–102.

Camargo O. 2012. Dimorfismo sexual y desviación en la proporción de los sexos

en embriones preimplantatorios. Rev Vet Zootec; 7(1): 100-114.

Carrasco-Bravo R. 2012. Uso de azul brillante de cresilo en la selección de

ovocitos bovinos: implicancias en la maduración nuclear y citoplasmática in vitro.

Universidad Austral de Chile. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de

Ciencia Animal. [Tesis de pregrado].

Casado M. 2003. Regulación de la expresión génica por glucosa. Capítulo 4 de

Monografía XVIII de la real academia de farmacia. Mecanismos moleculares y

neuroendocrinos del balance energético: Patologías; España.



Cetica P, Pintos L, Dalvit G, Beconi M. 2002. Activity of key enzymes involved in

glucose and triglyceride catabolism during bovine oocyte maturation in vitro.

Reproduction; 124: 675–681.

Chankitisakul V, Somfai T, Inaba Y, Techakumphu M, Nagai T. 2013.

Supplementation of maturation medium with L-carnitine improves cryo-tolerance

of bovine in vitro matured oocytes. Theriogenology; 79:590–598.

Coelho M, Saraiva N, Da Cruz J, Oliveira C, Del Collado M, Fernandes M, De

Castro F, Garcia M. 2014. Effect of follicular fluid supplementation during in vitro

maturation on total cell number in bovine blastocysts produced in vitro. R. Bras.

Zootec; 43(3):120-126.

Cook G, Edwards T, Jansen M, Bahouth S, Wilcox H, Park E. 2001. Differential

Regulation of Carnitine Palmitoyltransferase-I Gene Isoforms (CPT-Iα and CPT-

Iβ) in the Rat Heart. J Mol Cell Cardiol; 33:317–329.

Covarrubias L, Hernández-García D, Schnabel D, Salas-Vidal E, Castro-Obregón

S. 2008. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive

or active? Develop Biol; 320:1–11.

Crocco M, Kelmansky D, Mariano M. 2013. Does serum cause lipid-droplet

accumulation in bovine embryos produced in vitro. during developmental days 1 to

4?. J Assist Reprod Genet; 30:1377–1388.

De la Torre-Sanchez J, Gardner D, Preis K, Gibbons J, Seidel G. 2006. Metabolic

regulation of in-vitro-produced bovine embryos. II. Effects of phenazine

ethosulfate, sodium azide and 2,4-dinitrophenol during post-compaction

development on glucose metabolism and lipid accumulation. Reprod Fertil Dev;

18(5):597-607.

Bibliografía 63

De Matos D. & Fumus C. 2000. The importance of having high glutathione (GSH)

level after bovine in vitro maturation on embryo development: effect of β-

mercaptoethanol, cysteine and cystine. Theriogenology; 53:761-771.

De Matos D, Gasparrini B, Pasqualini S, Thompson J. 2002. Effect of glutathione

synthesis stimulation during in vitro maturation of ovine oocytes on embryo

development and intracellular peroxide content. Theriogenology; 15; 57(5):1443-

1451.

De Wit A, Wurth Y, Kruip A, 2000. Effect of ovarian phase and follicle quality on

morphology and developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte complex. J

Anim Sci; 78:1277-1283.

Dode M, Rodovalho N, Ueno V, Fernandes C. 2002. The effect of sperm

preparation and co-incubation time on in vitro fertilization of Bos indicus oocytes.

Anim Reprod Sci; 69:15-23.

Du Plessis S, Makker K, Desai N, Agarwal A. Impact of oxidative stress on IVF.

Expert Rev Obstet Gynecol 2008; 3:539-554.

Dunning K, Cashman K, Russell D, Thompson J, Norman R, Robker R. 2010.

Beta-Oxidation Is Essential for Mouse Oocyte Developmental Competence and

Early Embryo Development. Biol Reprod; 83:909–918.

Dunning K, Akison L, Russell D, Norman R, Robker R. 2011. Increased Beta-

Oxidation and Improved Oocyte Developmental Competence in Response to L-

Carnitine During Ovarian In vitro Follicle Development in Mice. Biol Reprod;

85:548–555.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Matos%20DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12054203

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gasparrini%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12054203



Dunning K. & Robker R. 2012. Promoting lipid utilization with l-carnitine to improve

oocyte quality. Anim Reprod Sci; 134:69–75.

Elis S, Desmarchais A, Maillard V, Uzbekova S, Monget P, Dupont J. 2015. Cell

proliferation and progesterone synthesis depend on lipid metabolism in bovine

granulosa cells. Theriogenology; 83:840–853.

Espinosa-Diez C, Miguel V, Mennerich D, Kietzmann T, Sánchez-Pérez P,

Cadenas S, Lamas S. 2015. Antioxidant responses and cellular adjustments to

oxidative stress. RedoxBiology; 6:183–197.

Fair T; 2003. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental

competence. Anim Reprod Sci; 78:203–216.

Ferreira E, Vireque A, Adona P, Meirelles F, Ferriani R, Navarro P. 2009.

Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: Structural and biochemical

modifications and acquisition of developmental competence. Theriogenology;

71:836–848.

Fouladi-Nashta A, Alberio R, Kafi M, Nicholas B, Campbell K, Webb R. 2005.

Differential staining combined with TUNEL labelling to detect apoptosis in

preimplantation bovine embryos. Reprod BioMed; 10(4):497–502.

Fu X, Wu G, Li J, Hou Y, Zhou G, Lun-Suo, Wang Y, Zhu S. 2011. Positive effects

of Forskolin (stimulator of lipolysis) treatment on cryosurvival of in vitro matured

porcine oocytes. Theriogenology; 75(2):268-275.

Garcia S,Marinho L, Lunardelli P, Seneda M, Meirelles F. 2015. Developmental

block and programmed cell death in Bos indicus embryos: effects of

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X10004413#!








http://www.sciencedirect.com/science/journal/0093691X

http://www.sciencedirect.com/science/journal/0093691X/75/2

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marinho%20LS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25760989

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lunardelli%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25760989

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seneda%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25760989

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Meirelles%20FV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25760989

Bibliografía 65

proteinsupplementation source and developmental kinetics. PLoS One; 10(3):1-

16.

Garcia-Herreros M, Aparicio I, Rath D, Fair T, Lonergan P. 2012. Differential

glycolytic and glycogenogenic transduction pathways in male and female bovine

embryos produced in vitro. Reprod Fertil Dev; 24:344-352.

Gentile L, Monti M, Sebastiano V, Merico V, Nicolai R, Calvani M, Garagna S,

Redi C, Zuccotti M. 2004. Single-cell quantitative RT-PCR analysis of Cpt1b and

Cpt2 gene expression in mouse antral oocytes and in preimplantation embryos.

Cytogenet Genome Res; 105(2-4):215-21.

George F, Daniaux C, Genicot G, Verhaeghe B, Lambert P, Donnay I. 2008. Set

up of a serum-free culture system for bovine embryos: embryo development and

quality before and after transient transfer. Theriogenology; 15; 69(5):612-23.

Ghanem N, Ha A-Na, Fakruzzaman M, Bang Jae-Il, Lee Sang-Chan, Kong Il-

Keun. 2014. Differential expression of selected candidate genes in bovine

embryos produced in vitro and cultured with chemicals modulating lipid

metabolism. Theriogenology; 82:238–250.

Giraldo J. Ordoñez S, Álvarez A. 2012. La vitrificación como alternativa de

conservación de embriones producidos in vitro. Artículo de revisión. J Agric Anim

Sci.

Gómez M; 2014. Efecto de la glucosa, fructosa y del suplemento insulina-

transferrina-selenio ITS sobre el porcentaje de blastocistos. Universidad de

Antioquia. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Inst. de Biología. [Tesis de

pregrado].

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gentile%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Monti%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sebastiano%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Merico%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nicolai%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Calvani%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Garagna%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Redi%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zuccotti%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15237209

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=George%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Daniaux%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genicot%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Verhaeghe%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lambert%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Donnay%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18242668



González-Muñoz; 2007. Papel de las caveolas/caveolina-1 en la fisiología del

adipocito. Departamento de Bioquímica y Biología molecular. Facultad de

Biología. Universidad de Barcelona. [Tesis Doctoral].

Gottardi F. & Mingoti G. 2009. Maturação de oócitos bovinos e influência na

aquisição da competência para o desenvolvimento do embrião. Rev Bras Reprod

Anim; 33(2): 82-94.

Goud A, Goud P, Diamond M, Gonik B, Abu-Soud H. 2008. Reactive oxygen

species and oocyte aging: role of superoxide, hydrogen peroxide and

hypochlorous acid. Free Radic Biol Med; 44(7):1295–1304.

Gülҫin I. 2006. Antioxidant and Antiradical activities of L-carnitine. Life Sciences;

78:803-811.

Gupta S, Sekhon L, Kim Y, Agarwal A. 2010. The Role of Oxidative Stress and

Antioxidants in Assisted Reproduction. Current Women’s Health Reviews; 6:227-

238.

Halliwell B. & Gutteridge J. 1984. Oxygen toxicology. oxygen radicals. transition

metals and disease. Biochemical Journal; 219:1-4.

Held-Hoelker E, Klein S, Rings F, Salilew-Wondim D, Saeed-Zidane M, Neuhoff

C, Tesfaye D, Schellander K, Hoelker M. 2017. Cryosurvival of in vitro produced

bovine embryos supplemented with l-Carnitine and concurrent reduction of fatty

acids. Theriogenology; 96:145-152.

Hosoe M, Kaneyama K, Ushizawa K, Hayashi KG, Takahashi T. 2011.

Quantitative analysis of bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth

differentiation factor9 (GDF9) gene expression in calf and adult bovine ovaries.

Reprod Biol Endocrinol; 15: 9-33.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Held-Hoelker%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rings%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Salilew-Wondim%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saeed-Zidane%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Neuhoff%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Neuhoff%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tesfaye%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schellander%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hoelker%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28532831

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hosoe%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21401961

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kaneyama%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21401961

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ushizawa%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21401961

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hayashi%20KG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21401961

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Takahashi%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21401961

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Quantitative+analysis+of+bone+morphogenetic+protein+15+(BMP15)+and+growth+differentiation+factor+9+(GDF9)+gene+expression+in+calf+and+adult+bovine+ovaries

Bibliografía 67

Harmeyer J. 2003. Use of L-carnitine additions in domestic animal feeds.

Lohmann Information. Hannover. Germany. (28):1-9.

Huang I. & Chan W. 2012. Resveratrol protects against hazardous effects of 2-

bromopropane on maturation of mouse oocytes, fertilization and fetal

development. African Journal of Biotechnology; 11(44):10262-10271.

Ideta A, Aoyagi Y, Tsuchiya K, Kamijima T, Nishimiya T, Tsuda T. 2013. A simple

medium enables bovine embryos to be held for seven days at 4°C. Sci Rep;

3:1173.

Indiveri C, Iacobazzi V, Tonazzi A, Giangregorio N, Infantino V, Convertini P,

Console L, Palmieri F. 2011. The mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier:

Function. structure and physiopathology. Mol Aspects Med; 32:223–233.

Jeong W, Cho S, Lee H, Deb G, Lee Y, Kwon T, Kong I. 2009. Effect of

cytoplasmic lipid content on in vitro developmental efficiency of bovine IVP

embryos. Theriogenology; 72:584–589.

Jernberg J, Bowman C,Wolfgang M, Scafidi S. 2017. Developmental regulation

and localization of carnitinepalmitoyltransferases (CPTs) in rat brain. J

Neurochem; 142(3):407-419.

Kabashima T, Kawaguchi T, Uyeda K. 2003. Xylulose 5-phosphate mediates

glucose-induced lipogenesis by xylulose 5-phosphate-activated protein

phosphatase in rat liver. Proc Natl Acad Sci U S A; 100(9):5107–5112.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wolfgang%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28512781

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scafidi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28512781



Kang J, Kwon D, Park S, Kim S, Moon J, Koo O, Jang G, Lee B. 2013. Quercetin

improves the in vitro development of porcine oocytes by decreasing reactive

oxygen species levels. J. Vet. Sci; 14(1):15-20.

Khazaei M, Aghaz F. 2017. Reactive oxygen species generation and use of

antioxidants during in vitro maturation of oocytes. Int J Fertil Steril; 11(2):63-70.

Khurana N, Niemann H. 2000. Energy metabolism in preimplantation bovine

embryos derived in vitro or in vivo. Biol Reprod; 62: 847–856.

Kim J, Kinoshita M, Ohnishi M, Fukui Y. 2001. Lipid and fatty acid analysis of fresh

and frozen–thawed immature and in vitro matured bovine oocytes. Reproduction;

122:131–138.

Kimura K, Spate L, Green M, Roberts P, Michael R. 2005. Effects of D-Glucose

concentration, D-Fructose and inhibitors of enzymes of the pentose phosphate

pathway on the development and sex ratio of bovine blastocysts. Mol Reprod Dev;

72: 201-207.

Knitlova D, Hulinska P, Jeseta M, Hanzalova K, Kempisty B, Machatkova M. 2017.

Supplementation of l-carnitine during in vitro maturation improves embryo

development from less competent bovine oocytes. Theriogenology; 102:16-22.

Landazuri P, Quiñones M, Linares N, Gallego M, Restrepo B, López R. 2000. L-

Carnitina: Aspectos bioquímicos y clínicos. Rev. Universidad del Quindio; 2(06):

94-105.

Leidenfrost S, Boelhauve M, Reichenbach M, Güngör T, Reichenbach H,

Sinowatz F, Wolf E, Habermann F. 2011. Cell arrest and cell death in mammalian

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khazaei%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28670422

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Aghaz%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28670422

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Knitlova%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28719824

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hulinska%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28719824

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hanzalova%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28719824

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kempisty%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28719824

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Machatkova%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28719824

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Leidenfrost%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Boelhauve%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reichenbach%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=G%C3%BCng%C3%B6r%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reichenbach%20HD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sinowatz%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wolf%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Habermann%20FA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21811561

Bibliografía 69

preimplantation development: lessons from the bovine model. PLoS One; 6(7):

e22121.

Li Q, Yong-Sheng W, Li-Jun W, Hui Z, Rui-Zhe, Chen-Chen C, Wen-Zhe L, Yong

Z, Ya-Ping J. 2014. Vitamin C supplementation enhances compact morulae

formation but reduces the hatching blastocyst rate of bovine somatic cell nuclear

transfer embryos. Cell Reprogram; 16(4):290-7.

Lima M; 2015. Efeitos de reguladores do metabolismo lipídico no

desenvolvimento in vitro de embriões bovinos e na sobrevivência à vitrificação.

Universidade Estadual Paulista - UNESP Câmpus de Jaboticabal. Brasil. [Tesis

de Doctorado].

Lonergan P, Rizos D, Gutierrez-Adan A, Fair T, Boland M. 2003. Oocyte and

embryo quality: effect of origin, cultura conditions and gene expression patterns.

Reprod Domest Anim; 38(4):259-67.

Lowe J, Bartolac L, Bathgate R, Grupen C. 2017. Supplementation of culture

medium with L-carnitine improves the development and cryotolerance of in vitro-

produced porcine embryos. Reprod Fertil Dev; 29(12):2357-2366.

Luberda Z. 2005.The role of glutathione in mammalian gametes. Reproductive

Biology; 5(1):5-17. Department of Animal Biochemistry and Biotechnology,

University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Poland.

Mansour G, Abdelrazik H, Sharma R, Radwan E, Falcone T, Agarwal A. 2009. L-

carnitine supplementation reduces oocyte cytoskeleton damage and embryo

apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid from patients with

endometriosis. Fertil Steril; 91(5):2079-2086.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lonergan%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12887565

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rizos%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12887565

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gutierrez-Adan%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12887565

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fair%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12887565



Marí M, Morales A, Colell A, García-Ruiz C, Fernández-Checa J. 2009.

Mitochondrial Glutathione, a Key Survival Antioxidant. Antioxid Redox Signal;

11(11):2685- 2700.

Martin-Romero F, Miguel-Lasobras E, Dominguez J, González E, Álvarez I. 2008.

Contribution of culture media to oxidative stress and its effect on human oocytes.

Reprod Biomed Online; 17:652-661.

McFie P, Banman S, Kary S, Stone S. 2011. Murine Diacylglycerol

Acyltransferase-2 (DGAT2) Can Catalyze Triacylglycerol Synthesis and Promote

Lipid Droplet Formation Independent of Its Localization to the Endoplasmic

Reticulum. J Biol Chem; 286(32):28235-28246.

McKeegan P. 2015. Metabolic regulation during early embryo development. The

University of Hull and the University of York. Hull York Medical School. [Tesis de

Doctorado].

Meister A; 1994. Glutathione-Ascorbic Acid Antioxidant System in Animals. J

Biogical Chemistry; 269: (13):9397-9400.

Meneghel M, Dall’Acqua P, Ambrogi M, Leão B, Rocha-Frigoni N, Mingoti G.

2017. Lipid content and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated

with forskolin before vitrification. Pesq. Vet. Bras; 37(4):395-400.

Miller E, Dickinson B, Changa C. 2010. Aquaporin-3 mediates hydrogen peroxide

uptake to regulate downstream intracellular signaling. Proc Natl Acad Sci U S A;

107(36):15681–15686.

Bibliografía 71

Mishra A, Reddy I, Gupta P, Mondal S. 2016a. L-carnitine Mediated Reduction in

Oxidative Stress and Alteration in Transcript Level of Antioxidant Enzymes in

Sheep Embryos Produced in Vitro. Reprod Dom Anim doi: 10.1111/rda.12682.

Mishra A, Reddy I, Gupta P, Mondal S. 2016b. Developmental regulation and

modulation of apoptotic genes expression in sheep oocytes and embryos cultured

in vitro with L-carnitine. Reprod Domest Anim; 51(6):1020-1029.

Moawad A, Tan S, Xu B, Chen HY, Taketo T. 2013. L-carnitine supplementation

during vitrification of mouse oocytes at the germinal vesicle stageimproves

preimplantation development following maturation and fertilization in vitro. Biol

Reprod; 88(4):104.

Moawad A, Xu B, Tan S, Taketo T. 2014. L-carnitine supplementation during

vitrification of mouse germinal vesicle stage–oocytes and their subsequent in vitro

maturation improves meiotic spindle configuration and mitochondrial distribution in

metaphase II oocytes. Human Reprod; 29(10):2256–2268.

Moreira A; 2015. L-Carnitine and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid on in

vitro bovine embryo production and cryopreservation. Tesis de doctorado.

Universidad Federal de Viscosia. Departamento de zootecnia.

Nada M, Rhead W, Sprecher H, Schulz H, Roe C. 1995. Evidence for intermediate

channeling in mitochondrial beta-oxidation. J Biol Chem. 13; 270(2):530-5.

Nemoto S, Takeda K, Yu Z, Ferrans V, Finkel T. 2000. Role for Mitochondrial

Oxidants as Regulators of Cellular Metabolism. Mol Cell Biol; 20(19):7311–7318.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mishra%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27696553

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gupta%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27696553

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mondal%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27696553

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23446455

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20HY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23446455

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Taketo%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23446455

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23446455


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nada%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7822275

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rhead%20WJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7822275

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sprecher%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7822275

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schulz%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7822275

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Roe%20CR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7822275




Paczkowski M, Silva E, Schoolcraft W, Krisher R. 2013. Comparative Importance

of Fatty Acid Beta-Oxidation to Nuclear Maturation, Gene Expression, and

Glucose Metabolism in Mouse, Bovine, and Porcine Cumulus Oocyte Complexes.

Biol Reprod; 88(5):1–11.

Patel P, Chaudhary S, Puri G, Singh V, Odedara A. 2015. Effects of β-

mercaptoethanol on in vitro maturation and glutathione level of buffalo oocyte. Vet

World; 8(2):213-6.

Phongnimitr T, Liang Y, Srirattana K, Panyawai K, Sripunya N, Treetampinich C,

Parnpai R. 2013. Effect of L-carnitine on maturation, cryo-tolerance and embryo

developmental competence of bovine oocytes. Anim Sci J; 84:719–725.

Prates E, Nunes J, Pereira R. 2014. A Role of Lipid Metabolism during Cumulus-

Oocyte Complex Maturation: Impact of Lipid Modulators to Improve Embryo

Production.

Reader K, Cox N, Stanton J, Juengel J. 2015. Effects of Acetyl-L-carnitine on

lamb oocyte blastocyst rate, ultrastructure, and mitochondrial DNA copy number.

Theriogenology; 83:1484–1492.

Ripamonte P, Mesquita L, Cortezzi S, de Carvalho J, Fonseca G, Watanabe Y,

Caetano A, Meirelles F. 2012. Differential gene expression and developmental

competence in in vitro produced bovineembryos. Zygote; 20(3):281-90.

Rizos D, Gutiérrez-Adán A, Pérez-Garnelo S, de la Fuente J, Boland M, Lonergan

P. 2003. Bovine embryo culture in the presence or absence of serum: implications

for blastocyst development, cryotolerance and messenger RNA expression. Biol

Reprod; 68:236-243.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Puri%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27047075

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ripamonte%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21492504

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cortezzi%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21492504

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fonseca%20Merighe%20GK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21492504

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Meirelles%20FV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21492504

Bibliografía 73

Rocha-Frigoni N, Leão B, Dall'Acqua P, Mingoti G. 2016. Improving the

cytoplasmic maturation of bovine oocytes matured in vitro with intracellular and/or

extracellular antioxidants is not associated with increased rates of embryo

development. Theriogenology; 86(8):1897-905.

Rodriguez-Gonzalez E, Lopez-Bejar M, Merten M, Paramio M. 2003. Effects on In

Vitro Embryo Development and Intracellular Glutathione Content of the Presence

of Thiol Compounds During Maturation of Prepubertal Goat Oocytes. Mol Reprod

Dev; 65(4):446-53.

Salmen J, Skufca F, Matt A, Gushansky G, Mason A, Gardiner C. 2005. Role of

glutathione in reproductive tract secretions on mouse preimplantation embryo

development. Biol Reprod; 73(2):308-14.

Sanchez-Lazo L, Brisard D, Elis S, Maillard V, Uzbekov R, Labas V, Desmarchais

A, Papillier P, Monget P, Uzbekova S. 2014. Fatty Acid Synthesis and Oxidation in

Cumulus Cells Support Oocyte Maturation in Bovine. Mol Endocrinol; 28(9):1502–

1521.

Saraiva H, Batista R, Alfradique V, Pinto P, Ribeiro L, Oliveira C, Souza-Fabjan J,

Camargo L, Fonseca J, Brandão F. 2018. L-carnitine supplementation during

vitrification or warming of in vivoproduced ovine embryos does not affect

embryonic survival rates, but alters CrAT and PRDX1 expression. Theriogenology;

105:150-157.

Sastre D, Nogueira da Costa N, Alves de Sá A, Braga Conceição S, Chiaratti M,

Adona P, Guemra S, Vieira Meirelles F, Damasceno Santos SdS, Sena L, Ohashi

O, Melo dos Santos E, dos Santos Miranda M. 2014. Expression of PLIN2 and

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rocha-Frigoni%20NA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27474235

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Le%C3%A3o%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27474235

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dall%27Acqua%20PC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27474235

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mingoti%20GZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27474235

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Skufca%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15829622

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Matt%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15829622

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gushansky%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15829622

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mason%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15829622

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gardiner%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15829622



PLIN3 during oocyte maturation and early embryo development in cattle.

Theriogenology; 81:326–331.

Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, Shorer H, Gil L, Elazar Z. 2007. Reactive

oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of

Atg4. EMBO J; 26:1749–1760.

Schreurs M, Kuipers F, van der Leij F. 2009. Regulatory enzymes of mitochondrial

b-oxidation as targets for treatment of the metabolic syndromeobr. Obesity

Management; 642:380-388.

Shin E, Cho S, Lee E, Lee S, Chang I, Lee T. 2006. Positive regulation of hepatic

carnitine palmitoyl transferase 1A (CPT1A) activities by soy isoflavones and L-

carnitine. Eur J Nutr; 45:159–164.

Somfai T, Kaneda M, Akagi S, Watanabe S, Haraguchi S, Mizutani E, Dang-

Nguyen T, Geshi M, Kikuchi K, Nagai T. 2011. Enhancement of lipid metabolism

with L-carnitine during in vitro maturation improves nuclear maturation and

cleavage ability of follicular porcine oocytes. Reprod. Fertility and Develop;

23:912–920.

Sovernigo T, Adona P, Monzani P, Guemra S, Barros F, Lopes F, Leal C. 2017.

Effects of supplementation of medium with different antioxidants during in vitro

maturation of bovine oocytes on subsequent embryo production. Reprod Dom

Anim. 2017; 52:561–569.

Stinshoff H, Wilkening S, Hanstedt A, Brüning K, Wrenzycki C. 2011.

Cryopreservation affects the quality of in vitro produced bovine embryos at the

molecular level. Theriogenology; 76:1433–1441.

Bibliografía 75

Stojkovic M, Machado S, Stojkovic P, Zakhartchenko V, Hutzler P, Gonc¸alves P,

Wolf E. 2001. Mitochondrial Distribution and Adenosine Triphosphate Content of

Bovine Oocytes Before and After In vitro Maturation: Correlation with

Morphological Criteria and Developmental Capacity After In vitro Fertilization and

Culture. Biol Reprod; 64:904–909.

Sutton-McDowall M, Feil D, Robker R, Thompson J, Dunning K. 2012. Utilization

of endogenous fatty acid stores for energy production in bovine preimplantation

embryos. Theriogenology; 77:1632–1641.

Swain J, Bormann C, Clark S, Walters E, Wheeler M, Krisher R. 2002. Use of

energy substrates by various stage preimplantantion pig embryos produced in vivo

an in vitro. Reproduction; 123:253-260.

Ta-Chin L, Jui-Mei Y, Kun-Bing G, Teng-Tsao H. 2003. Lih-Ren C. IGF-1/IGFBP-1

increases blastocyst formation and total blastocyst cell number in mouse embryo

culture and facilitates the establishment of a stem-cell line. BMC Cell Biol; 4:14-

19.

Takahashi M. 2012. Oxidative stress and redox regulation on in vitro development

of mammalian embryos. J Reprod Dev; 58(1):1-9.

Takahashi T, Inaba Y, Somfai T, Kaneda M, Geshi M, Nagai T, Manabe N. 2013.

Supplementation of culture medium with L-carnitine improves development and

cryotolerance of bovine embryos produced in vitro. Reprod. Fertility and Develop;

25:589–599.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Takahashi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22450278




Takahashi K, Sakura N, Emura N, Hashizume T, Sawai K. 2015. Effects of

downregulating GLIS1 transcript on preimplantation development and gene

expression of bovine embryos. J Reprod Dev; 61(5):369-374.

Tamai I; 2013. Pharmacological and pathophysiological roles of carnitine/organic

cation transporters (OCTNs: SLC22A4. SLC22A5 and Slc22a21). Biopharm. Drug

Dispos; 34:29–44.

Thiam A, Farese R, Walther T. 2013. The biophysics and cell biology of lipid

droplets. Nat Rev Mol Cell Biol; 14:775-786.

Thomas R. Armstrong D. Gilchrist R. 2004. Bovine cumulus cell-oocyte gap

junctional communication during in vitro maturation in response to manipulation of

cell-specific cyclic adenosine 3.5-monophosophate levels. Biol Reprod; 70:548-

556.

Truong T, Soh Y, Gardner D. 2016. Antioxidants improve mouse preimplantation

embryo development and viability. Hum Reprod; 31(7):1445-54.

Tsujii H, Nakamura Y, Hamano K. 2002. In vitro effects of insulin on glucose and

lipid metabolism in rat embryos. Anim Sci J; 73:185–189.

Ushijima H, Akiyama K, Tajima T. 2008. Transition of Cell Numbers in Bovine

Preimplantation Embryos: In Vivo Collected and In vitro Produced Embryos. J

Reprod Dev; 54: 239-243.

Bibliografía 77

Uzun A, Rodriguez-Osorio N, Kaya A, Wang H, Parrish J, Ilyin A. 2009. Functional

Genomics of HMGN3a and SMARCAL1 in Early Mammalian Embryogenesis.

BMC Genomics; 10 -183.

Vasquez-Araque N; 2014a. Efecto del suplemento insulina-transferrina-selenio

(ITS) sobre la tasa de desarrollo y calidad de embriones bovinos producidos in

vitro. Memorias XXIII congreso Nacional y II Internacional de medicina veterinaria

y zootecnia. Santa Marta. Colombia.

Vásquez- Araque N, Torres V, Rojano B. 2014b. Efecto del Ácido Ascórbico

durante Maduración In Vitro de Oocitos Bovinos en la Producción de Especies

Reactivas de Oxígeno (ERO) y Competencia para el Desarrollo Embrionario.

Información tecnológica; 25(2): 141-150.

Vásquez-Araque N, Carrillo D, Torres V, Gutiérrez P, Rojano B, Maldonado-

Estrada J. 2014c. Specific Phosphodiesterase–4 inhibitor reduced reactive oxygen

species production during in vitro maturation of bovine oocytes and improved the

quality of in vitro produced embryos. Biol Reprod; 25(2):141-150.

Vásquez-Araque N, 2014d. Efecto de inhibidores específicos de fosfodiesterasa

tipo 4 y antioxidantes naturales sobre la calidad del ovocito y su competencia para

la producción in vitro de embriones bovinos. Universidad Nacional de Colombia.

[Tesis de doctorado].

Venereo J; 2002. Daño oxidativo, Radicales libres y Antioxidantes. Rev Cubana

Med Milit; 31(2):126-33.

Vigneault C, McGraw S, Sirard M. 2009. Spatiotemporal expression of

transcriptional regulators in concert with the maternal to embryonic transition

during bovine in vitro embryogenesis. Reproduction; 137(1):13-21.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vigneault%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18805820

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McGraw%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18805820

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sirard%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18805820



Walther T. & Farese R. 2012. Lipid droplets and cellular lipid metabolism. Annu

Rev Biochem; 81:687–714.

Wang ZG, Yu SD, Xu ZR. 2007. Improvement in bovine embryo production in vitro

by treatment with green tea polyphenols during in vitro maturation of oocytes.

Anim Reprod Sci; 100:22-31.

Wang Z, Fu C & Yu S. 2012. Effects of green tea polyphenols, insulin-like growth

factor I and glucose on developmental competence of bovine oocytes. R. Bras.

Zootec; 41(12): 2418-2423.

Warshaw J. & Curry E. 1980. Comparison of serum carnitine and ketone body

concentrations in breast- and in formula-fednewborn infants. J Pediatr; 97(1):122-

5.

Wrenzycki C, Hahn A, Lucas H, Lemme E, Korsawe K, Niemann H. 2002. In vitro

production and nuclear transfer affect dosage compensation of the X-linked gene

transcripts G6PD. PGK. and Xist in preimplantation bovine embryos. Biol Reprod;

66:127-134.

Wu G, Jia B, Li J, Fu X, Zhou G, Hou Y, Zhu S. 2011. L-carnitine enhances oocyte

maturation and development of parthenogenetic embryos in pigs. Theriogenology;

76:785–793.

Yang M, Tao J, Chai M, Wu H, Wang J, Li G, He C, Xie L, Ji P, Dai Y, Yang L, Liu

G. 2017. Melatonin Improves the Quality of Inferior Bovine Oocytes and Promoted

Their Subsequent IVF Embryo Development: Mechanisms and Results.

Molecules; 27:22(12).

javascript:__doLinkPostBack('','ss~~AU%20%22Warshaw%20JB%22%7C%7Csl~~rl','');

javascript:__doLinkPostBack('','ss~~AU%20%22Curry%20E%22%7C%7Csl~~rl','');

Bibliografía 79

You J, Lee J, Hyun S, Lee E. 2012. L-carnitine treatment during oocyte maturation

improves in vitro development of cloned pig embryos by influencing intracellular

glutathione synthesis and embryonic gene expression. Theriogenology; 78:235–

243.

Yu Y, Dumollard R, Rossbach A, Lai F, Swann K. 2010. Redistribution of

mitocondria leads to bursts of ATP production during spontaneous mouse oocyte

maturation. J Cell Physiol; 224(3):672-80.

Zannoni A, Spinaci M, Bernardini C, Bacci M, Seren E, Mattioli M, Forni M. 2006.

DNase I Activity in Pig MII Oocytes: Implications in Transgenesis. Reproduction;

131(3):461–468.

Zare Z, Farahani R, Salehi M, Piryaei A, Novin G, Fathabadi F, Mohammadi M,

Dehghani-Mohammadabadi M. 2015. Effect of L-carnitine supplementation on

maturation and early embryo development of immature mouse oocytes selected

by brilliant cresyle blue staining. J Assist Reprod Genet; 32:635–643.

Zuelke K, Jeffay S, Zucker R, Perreault S. 2003. Glutathione (GSH)

concentrations vary with the cell cycle in maturing hamster oocytes, zygotes, and

pre-implantation stage embryos. Mol Reprod Dev; 64(1):106-12.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20578238

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dumollard%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20578238

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rossbach%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20578238

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Swann%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20578238

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zuelke%20KA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12420305

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jeffay%20SC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12420305

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zucker%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12420305

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Perreault%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12420305

Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para ...

Documents

Transcript of Parámetros metabólicos, antioxidantes y competencia para ...