Patología molecular y el Patología molecular y el Virus del papiloma humanoVirus del papiloma humano

Servicio de Anatomía PatológicaServicio de Anatomía PatológicaHospital General Universitario de Hospital General Universitario de Ciudad RealCiudad Real

El virus del El virus del papiloma papiloma humanohumano

Ciclo de vida del VPHCiclo de vida del VPH

Infección de células basales Infección de células basales Síntesis Pr. Síntesis Pr. precoces (E) no estructurales precoces (E) no estructurales Replicación Replicación episomal del ADN episomal del ADN (Hib. In situ)(Hib. In situ)

Infección latente Infección latente Coilocito Coilocito Integración Integración (Hib. In situ)(Hib. In situ) + +

Oncogenes + Genes supresores Oncogenes + Genes supresores Carcinoma infiltranteCarcinoma infiltrante

Coilocito Coilocito Síntesis productiva ADN Síntesis productiva ADN Síntesis Pr. tardías (L) cápside Síntesis Pr. tardías (L) cápside (IHQ)(IHQ) Partículas virales Partículas virales (M.E.)(M.E.) Transmisión…. Transmisión….

Hematoxilina-Eosina. Hematoxilina-Eosina. DisplasiaDisplasia

Hematoxilina-Eosina. Hematoxilina-Eosina. Carcinoma epidermoideCarcinoma epidermoide

High grade lesions. Pap High grade lesions. Pap smearsmear

p16

FASES DE LA TÉCNICA FASES DE LA TÉCNICA MOLECULAR VPHMOLECULAR VPH Extracción del ADNExtracción del ADN Amplificación del ADN (PCR)Amplificación del ADN (PCR) Detección del virus VPHDetección del virus VPH En los casos positivos: Tipificación del En los casos positivos: Tipificación del

VPHVPH

Toma cervico-vaginal para Toma cervico-vaginal para estudio ADNestudio ADN Abstinencia sexual de 72 horasAbstinencia sexual de 72 horas No exámenes digitales, colposcopia, lavados, No exámenes digitales, colposcopia, lavados,

medicación local ni estudios transvaginales previos.medicación local ni estudios transvaginales previos. Se aconseja realizarla 6 días anteriores y/o Se aconseja realizarla 6 días anteriores y/o

posteriores a la menstruación.posteriores a la menstruación. Si se han efectuado tomas de biopsia y/o terapias Si se han efectuado tomas de biopsia y/o terapias

locales, esperar 30 días.locales, esperar 30 días. Tras tratamientos (crioterapia, Leep, conización a Tras tratamientos (crioterapia, Leep, conización a

bisturí) se recomienda esperar 60 días.bisturí) se recomienda esperar 60 días.

1. Extracción de ADN

Citología líquidaCitología líquida

Cytyc PreservCytCytyc PreservCytDigene Cervical Sampler Digene Cervical Sampler

RECEPCIÓN DE RECEPCIÓN DE MUESTRASMUESTRAS Torundas de Torundas de

alginato o algodón alginato o algodón o envases de o envases de citología líquidacitología líquida

Congelador para:Congelador para:– Almacenar muestras Almacenar muestras

hasta su hasta su procesamientoprocesamiento

ExtracciónExtracción

Extracción de ADN (I)Extracción de ADN (I) Digestión proteinasa K: Calor (termoblock): 56º Digestión proteinasa K: Calor (termoblock): 56º

Torundas: 15 minutos; Biopsias: NocheTorundas: 15 minutos; Biopsias: Noche Centrífuga en algunos pasosCentrífuga en algunos pasos

Extracción ADN (y II)Extracción ADN (y II) Biorrobot QIAGEN EZ1 Biorrobot QIAGEN EZ1

(1/2 hora)(1/2 hora)

2. Amplificación del 2. Amplificación del ADN ADN PCRPCR

Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Polimerasa: amplificar ADNPolimerasa: amplificar ADN

Amplificación del ADNAmplificación del ADN Termociclador: 45 ciclos de 94º, 55º y 72º Termociclador: 45 ciclos de 94º, 55º y 72º

(6 horas)(6 horas)

PCRPCR

PCR PCR

Ciclos deCiclos dePCRPCR

Desnaturalización

94º C

Hibridación55º C

Síntesis74º C

Desnaturalización94º C

Hibridación55º C

Síntesis74º C

3. Detección y tipificación del Detección y tipificación del virus de papiloma humano virus de papiloma humano

3.a. Lectura3.a. Lectura(Lo que antes (Lo que antes

hacíamos)hacíamos)

Antes: Electroforesis en gel de Antes: Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro agarosa teñido con bromuro de etidio de etidio (calidad y (calidad y cantidad de cantidad de ADN)ADN)

Amplificación de HPV tipo 16. Amplicones de 217 bp en líneas 3, 4, 8 y 9. La línea 1 es un control negativo (ADN de placenta). La línea 2 es un control positivo.

KitsKits

Detección del VPH: Antes Detección del VPH: Antes usábamos gelesusábamos geles

Realizar Realizar gel de agarosagel de agarosa (1 (1 hora)hora)

Bromuro de etidio como Bromuro de etidio como marcador fluroescentemarcador fluroescente

Microondas, Cubeta de Microondas, Cubeta de electroforesiselectroforesis

Añadir solución de carga Añadir solución de carga y y conectarconectar corriente e. (2 corriente e. (2 horas)horas)

Detección de VPH: Detección de VPH: InterpretaciónInterpretación

Identificación del VPH: Identificación del VPH: TipadoTipado

Tipado del VPHTipado del VPH

Identificación del VPH: Identificación del VPH: TipadoTipado

DesnaturalizarDesnaturalizar HibridarHibridar CapturarCapturar DetectarDetectar LeerLeer

Otra técnica diferente: La Otra técnica diferente: La captura de híbridoscaptura de híbridos

3.b. Lo que ahora hacemos: 3.b. Lo que ahora hacemos: Automatización mediante Automatización mediante arrays de baja densidadarrays de baja densidad Clinical Arrays® (Genómica S.A.U.): Clinical Arrays® (Genómica S.A.U.): 120 pocillos con secuencias de ADN específicas120 pocillos con secuencias de ADN específicas

Lectura automatizadaLectura automatizada

Caso negativoCaso negativo VPH 16 positivoVPH 16 positivo

Leyenda:• R, marcas de posición del Array de ADN CI, control interno para la reacción de PCR ADN, control de calidad de ADN de la muestra

70 71 72 73 81 82 83 84 85 611

R

51 53 54 56 58 59 61 62 66 68

52 18 26 31 33 35 39 40 42 43 44 45

81 82 83 84 611

89 CI DNA 6 11 16

54 56 58 59 61 62 66 68 70 71 72 73

31 33 35 39 40 42 43 44 45 51 52 53

82 83 84 85 89 CI DNA 6 11 16 18 26

56 58 59 61 62 66 68 70 71 72 73 81

CI 39 40 42 611

44 45 51 52 53 54 35

R DNA 6 11 16 18 26 31 33 R

CLART HPV-2 (array strips)

Lectura automatizadaLectura automatizada

VPH 16VPH 16

Importancia de la determinación del VPH

Ejemplos de aplicación de Ejemplos de aplicación de PCRPCR

HPV L1 Virus-Like Particle HPV L1 Virus-Like Particle (VLP) Vaccine Synthesis(VLP) Vaccine Synthesis

L1 L1 gene gene

on on HPV HPV DNADNA

L1 gene L1 gene inserted into inserted into

genome of genome of yeast or BCVyeast or BCV

Yeast/BCV Yeast/BCV DNADNA

mRNmRNAAtRNAtRNA

rRNrRNAA

TranscriptioTranscriptionn

TranslatiTranslationon

Capsid Capsid proteinsproteins

Empty viral capsids

Elicits Elicits humoralhumoral

immune immune response response

in hostin host

VLP = Virus-like peptideYeast Cell (or Yeast Cell (or Baculovirus Expression System)

ConclusionesConclusiones

El potencial El potencial clínicoclínico de la detección del ADN-VPH de la detección del ADN-VPH en el presente contribuye: en el presente contribuye:

– Una mejor evaluación diagnóstica morfológica cito-Una mejor evaluación diagnóstica morfológica cito-colpo-histológica.colpo-histológica.

– Detección de tipos virales oncogénicos en pacientes con Detección de tipos virales oncogénicos en pacientes con citologías anormales y/o imágenes colposcópicas no citologías anormales y/o imágenes colposcópicas no concluyentes.concluyentes.

– Manejo y control posterapéutico de las lesiones Manejo y control posterapéutico de las lesiones intraepiteliales.  intraepiteliales. 

– Provee un método de control de calidad para los Provee un método de control de calidad para los exámenes cito-colpo-histológicos.exámenes cito-colpo-histológicos.

La detección del ADN-VPH puede utilizarse como La detección del ADN-VPH puede utilizarse como método de método de cribadocribado como complemento del como complemento del Papanicolaou.Papanicolaou.