REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

I. OBJETIVOS Conocer la tcnica de PCR Analizar e interpretar los resultados obtenidos por PCR Describir el proceso de la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR. Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.

II. INTRODUCCION La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica de biologa molecular que permite la rpida replicacin del ADN. Con la PCR, cantidades mnimas de material gentico pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas permitiendo la deteccin rpida y fiable de los marcadores genticos de enfermedades infecciosas, cncer y desrdenes genticos. El uso de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa ha aumentado mucho la capacidad de los cientficos para estudiar el material gentico. Desde su invencin por cientficos de Cetus Corporation en 1983, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigacin y diagnstico mdico. La capacidad de producir rpidamente grandes cantidades de material gentico ha permitido avances cientficos significativos, incluyendo huella dactilar del ADN y la secuenciacin el genoma humano. La PCR est diseada segn el principio natural de replicacin del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un nmero especfico de veces. Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos: 1. Desnaturalizacin 2. Alineacin 3. Extensin Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automticamente controla y alterna las temperaturas durante perodos programados de tiempo para el nmero apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucletidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unin de los cebadores al molde.

III. METODOS Y PROCEDIMIENTO

IV. RESULTADOS

AMPLIFICACION DEL GEN GAPDH POR PCR CONVENCIONAL C(-DNA) GAPDH C(-Primer)

Gen GAPDH amplificado por PCR

Gel al 1%Voltaje: 100VTiempo de Corrida: 35minGel teido con SYBR Safe 10,000X

V. CONCLUSION

CUESTIONARIO1.-Si no se contara con un kit de diagnstico. Cmo podra identificar malaria por PCR? Explique brevemente.Se utiliza una tcnica de PCR mltiple que permite la deteccin del DNA genmico de las cuatro especies parasitarias. La amplificacin por PCR permite incluso la deteccin de 3-4 parsitos/ l (parasitemias de 0,0005 a 0,0015%), as como la determinacin de infecciones mixtas. Al ser una tcnica potencialmente cuantitativa, permite controlar la eficacia del tratamiento, prediciendo las resistencias a los antipaldicos. Podra ser la tcnica de referencia por su altsima sensibilidad y especificidad pero, aparte de no estar comercializada, no est al alcance de todos los laboratorios y no se adapta al diagnstico d urgencia individualizada. 2.- Qu consideraciones se debe tener a la hora de disear los primers? Temperatura de anillamiento (Ta) Longitud del primer Temperatura y tiempo de elongacin Nmero de ciclos3.-Para que se realiza la extensin final a 72 C, que pasara si no se hubiera usado?Extensin final a 72C por 10 mn (aunque no es estrictamente necesario este ltimo paso, es slo para asegurar que los fragmentos incompletos se terminen de sintetizar);4.- Cuntos tipos de tcnicas de PCR existen? Cul es la aplicabilidad de la PCR en el diagnstico molecularPCR anidadaTcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. PCR de extensin solapada (Mutagnesis) Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin. PCRin situLa PCRin situconsiste en una reaccin de PCR en seccioneshistolgicasoclulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en unportaobjetos.

PCR mltiplePCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de lareaccinen cantidades suficientes, para amplificar simultneamente varios segmentos de ADN.PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamosARNcomo molde inicial en vez de ADN, y emplea unatranscriptasa inversa(como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera: 1.erpaso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3.erpaso: PCR estndar.PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR) Artculo principal:PCR en tiempo realReaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de sutemperatura de fusin(tambin denominado valorTm, del inglsmelting temperature).5.-comente un paper en el cual se haga diagnstico molecular de una enfermedad infecciosa por PCR?Enfermedad de chagas es causada por el parasito tripanosoma cruzi esta enfermedad comprende una fase aguda, seguida de una fase crnica, con una parasitemia escasa y una clnicaque va desde la ausencia de sntomas hasta una cardiopata severa. El diagnstico presentalimitaciones, debido a la baja sensibilidad de las tcnicas parasitolgicas y la baja especificidad de lasinmunolgicas. Las tcnicas de PCR son una alternativa, pero estas deben ser estandarizadas yvalidadas antes de su uso. El objetivo de este trabajo fue validar las tcnicas de PCR para laamplificacin de ADN de minicrculo de kinetoplasto (PCR-ADNk) y ADN satlite (PCR-ADNsat) de T,cruzi se utilizaron 29 muestras de sangre y 19 de suero de pacientes diagnosticados previamente y 3muestras de xenodiagnstico de un paciente en fase aguda, resultando positivas por PCR-ADNk26/29 (89,7%) y por PCR-ADNsat 23/29 (79,3%), mientras que utilizando suero resultaron positivaspor PCR-ADNk 5/19 (26,3%) y por PCR-ADNsat 7/19 (36,8%). Las 3 muestras de xenodiagnsticoresultaron positivas (100%) Adems, se analizaron 24 muestras de sangre y suero de individuos,negativos para las tcnicas de diagnstico parasitolgico e inmunolgico y sin factores de riesgo de laenfermedad, los cuales dieron negativo por ambas PCRs. La muestra de eleccin result ser sangre yse recomienda el uso de las dos tcnicas de PCR en conjunto, ya que todos los pacientes conenfermedad de Chagas confirmada resultaron positivos (100%) por lo menos en una de las PCRevaluadas en muestras de sangre.

TRABAJO ADICIONAL1. Cuntas copias de un amplicn pueden obtenerse despus de 35 ciclos de PCR? copias2. Veinte nanogramos de DNA genmico humano son necesarios para una PCR. La solucin stock del molde se encuentra a una concentracin de 0.2mg DNA/mL. Cuntos microlitros de la solucin stock deberan utilizarse?0.2 mg = 200 000 ng1 mL = 1000 L200 000 ng 1000 L20 ng xx = 0.1 LDebe usarse 0.1 L de solucin stock para obtener 20 ng de DNA genmico.3. Partiendo de 600 molculas de DNA molde, cuntos amplicones se generarn despus de 25 ciclos de PCR? amplicones4. Si la PCR mencionada en la pregunta 3 se lleva a cabo en una reaccin de 100L, cuntas molculas de producto amplificado estarn presentes en 0.001L?

x = 0.2013Habrn 0.2013 molculas de producto amplificado en 0.001L5. Un producto de PCR de 800bp que tiene un contenido de G + C del 55% es sintetizado en una reaccin que contiene 50mM KCl y 2.5mM MgCl2. Cul es la Tm del amplicn?

6. Un stock de cebadores que consiste en dos cebadores necesarios para una PCR tiene una concentracin de 25M. Qu volumen de stock de cebadores debera ser aadido a 100L de reaccin para que la concentracin de cebadores en la reaccin sea de 0.4M?V x C = V x C

V x 25 M = 100 L x 0.4 MV = 1.6 LSe necesitan 1.6 litros de stock de cebadores para conseguir una concentracin de 0.4 M