CEDEÑO RUIZ JUAN RAMON 8PM3

TÉCNICAS PARA DETERMINAR EL GRADO DE METILACIÓN

La metilación del ADN consiste en la transferencia de grupos metilos (-CH3) a algunas de las

bases citosinas (C) del ADN situadas previa y contiguamente a una guanina (G). Estas islas CpG

son regiones entre 0.5 y 5.5 kb con un contenido de dinucleotidos CG de al menos 55% (suponen

un 1% del genoma y no suelen estar metiladas). Se concentran especialmente en la región

promotora de los genes. Los promotores son secuencias específicas de ADN localizadas en los

extremos 5'-terminales de los genes y contiene la información necesaria para activar o desactivar

el gen que regula. La ARN polimerasa se une a las secuencias de dichos promotores iniciando el

proceso de la transcripción.

Las células malignas van acompañadas de una hipometilación global que está asociada a la

activación de los genes necesarios para la invasión y metástasis –vía oncogenética- (técnicas de

cuantificación de la metilación) y de una hipermetilación local (islas CpG) relacionada con la

represión de los genes supresores de tumor –vía supresora- (técnicas para la detección de CpG de

determinados genes)

Existen múltiples técnicas aplicables para el análisis de la hipermetilación de promotores o

hipometilación general de ADN y basadas generalmente en diferentes métodos de electroforesis

capilar de alta resolución o mediante el uso de estrategias enzimáticas y químicas. Para elegir la

más adecuada hay que tener en cuenta tanto la naturaleza de la muestra como los resultados que

pretendemos obtener.

1. TÉNICAS PARA DETECTAR EL ESTADO DE METILACIÓN DE UN GEN EN

CONCRETO

El proceso de amplificación del ADN (PCR) hace que se pierda toda la información sobre la

metilación. Es necesario traducir un cambio epigenético en una modificación de la

secuencia para identificar la información epigenética.

MSP (Methyl spcecific PCR). En la técnica de MSP el ADN es tratado previamente con

bisulfito sódico, reactivo que transforma las citosinas no metiladas en uracilos, mientras

que la metilación protege a las citosinas de la transformación. Por tanto, se produce un

cambio de secuencia entre el ADN metilado y no metilado (Figura 1). A partir de aquí,

cualquier método para detectar una mutación puede ser utilizado para identificar la

metilación de una secuencia

MSP + ANALISIS DE RESTRICCIÓN

• COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) Combina la conversión del ADN por el

bisulfito y la digestión con enzimas de restricción que reconoce las secuencias modificadas.

• MS-MLPA (Methylation Specific-Multiple Ligation Probe Amplification). En el ensayo de MS-

MLPA, el set de sondas para la detección de metilación (llamadas “SALSAS”) contienen un

sitio de restricción de la enzima endonucleasa HhaI, sensible a la metilación. La reacción

genera dos muestras: una muestra sin digerir para la detección del número de copias mediante

MLPA y otra muestra digerida para la detección de metilación.: Las sondas digeridas no

pueden ser amplificadas de manera exponencial durante la PCR y por lo tanto, no producirá

señal durante la electroforesis capilar. Por el contrario, si el ADN de la muestra está metilado,

está protegido contra la digestión de HhaI y generará señal en la electroforesis (Figura 2).

MSP + PCR CUANTITATIVA

• MS-QPCR (Methylation Specific Quantitative PCR) Método basado en PCR a tiempo real en

ADN tratado con bisulfito. El producto de PCR se somete a un gradiente creciente de

temperatura a la vez que se detecta la fluorescencia emitida (curva de temperatura de fusión).

Según incrementa la temperatura, el producto de PCR se desnaturaliza, el fluorocromo se

libera y deja de emitir fluorescencia. El cambio de secuencia dará lugar a una diferente

temperatura de fusión, siendo mayor en el ADN metilado que en el no metilado.

MSP + DESNATURALIZACIÓN DEL ADN

• MS-DGGE (Methylation Specific Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Este método se

basa en las propiedades inherentes a la secuencia de los productos amplificados mediante

MSP, que les hacen ser fácilmente reconocibles en un gel de poliacrilamida sometido a un

gradiente de temperatura.

• MS-DHPLC (Methylation-Specific Denaturing High Performance Liquid Chromatography) En

esta técnica, muy similar a la anterior, los fragmentos de ADN obtenidos tras MSP se

desnaturalizan por calor y se vuelven a hibridar. La Temperatura de fusión de los fragmentos

rehibridados define el tiempo que son retenidos en la columna cromatográfica.

• MS–SSCA (Methylation-Specific Singlestrand Conformation Analysis) Se basa en la diferente

movilidad de las cadenas sencillas de ADN previamente tratadas por MSP. El producto de la

PCR se desnaturaliza y se realiza una separación electroforética en condiciones

desnaturalizantes.

MSP + ASO-PCR

• MS-SNuPE (Methylation Sensitive Single Nucleotide Primer Extension) Se basa en un

tratamiento inicial con bisulfito y después una PCR con un primer que acaba inmediatamente

antes de cada isla CpG a estudiar. Se utilizan nucleótidos marcados (ddCTP y ddTTP).

Después de la electroforesis, los productos son analizados por fosfo-imagen. Se pueden

analizar de dos a cuatro islas CPG en más de 40 muestras en sólo 5 horas. MSP +

SECUENCIACION

• PIROSECUENCIACIÓN DE BISULFITO

Después del tratamiento de bisulfito se realiza el análisis en tiempo real de secuencias de DNA

de una longitud relativamente corta (hasta 80 pb) mediante un proceso enzimático.

2. TÉNICAS PARA CUANTIFICACIÓN DEL ESTADO DE METILACIÓN.

El objetivo de estas técnicas es obtener el perfil de metilación de múltiples genes. El soporte

para el análisis de este perfil suele ser los microarrays debido a su cada vez más bajo coste y

la posibilidad de estudiar las islas CpG de cientos de genes al mismo tiempo en el mismo

ensayo (Figura 3).

MICROARRAYS + MSE

• MS-ARRAYS (Methil Sensitive Array) Incorpora el tratamiento de bisulfito previo a cada una

de las PCR que deben ser diseñadas especialmente para arrays Aunque requiere una PCR

específica para cada gen, el método puede analizar varios islas CpG dentro de cientos de

genes al mismo tiempo;

MICROARRAYS + ENZIMAS DE RESTRICCION

• DMH-ARRAYS (Differential Methylation Hybridization Array) El ADN es digerido por

endonucleasas (Mse I, Tsp509I, Nla III o BfaI), en las islas CpG no son frecuentes los sitios de

restricción de estas enzimas por lo que tras una combinación de las mismas se obtienen

fragmentos de entre 0.2 y 2kb enriquecidos en islas CpG. Estos fragmentos son nuevamente

digeridos por enzimas sensibles a la metilación (BstUI y Hpa II). Los fragmentos hipermetilados

resisten a la digestión y pueden ser amplificados. Los resultados comparados con un control

son visualizados en un microarray.

• RLGS (Restriction landmarks genome scaning) es un método para detectar una gran cantidad

de señales de restricción en un solo experimento. Combina una electroforesis en un gel de dos

dimensiones de alta resolución, en vez de un array, con la metilación y digestión con enzimas

de restricción (NotI y ASCI). Permite establecer los perfiles de metilación de miles de loci a la

vez.

MICRO-ARRAYS +INMUNOPRECIPITACIÓN

• MeDIP (Methylated DNA inmunoprecipitation). El ADN total es sonicado y el metilado se

inmunoprecipita utilizando anticuerpos anti-methylcytosine Los ADN se diferencian por distintos

fluorocromos y cohibridan en microarrays de ADN.