PCR digital y Ciencias Ómicas: aplicaciones en diagnóstico ...
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PCR digital y Ciencias Ómicas: aplicaciones en diagnóstico clínico
Ulises Carrasco Navarro
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Espectrometría de masas
Secuenciación de ácidos nucleícos
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PCR punto final PCR tiempo real
PCR digital (ddPCR)
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Para recordar:
Para la amplificación por PCR en tiempo real ademas de los reactivos que se emplean en la PCR punto final,
Debido a que la fluorescencia de estos aumenta conforme el producto se amplifica, se combinan los procesos
El sistema fluorométrico consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos (a una determinada
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Sondas de hidrólisis
Entre las mas utilizadas se encuentran las sondas TaqMan que se conocen también como
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¿Que es la PCR Digital?
●Es una método que emplea una tecnología basada en microfluidos para la formación de nano gotas
●Esta nueva tecnología es empleada para la identificación y cuantificación de secuencias de ADN o ARN
●La técnica es de alta resolución y absoluta cuantificación
En la PCR Digital, una muestra de PCR es particionada en aproximadamente
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El ddPCR fue desarrollado con el fin de obtener una cuantificación absoluta de secuencias de pacidos nucléicos
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Flujo de trabajo en la ddPCR
●Partición de la muestra en miles de gotas
●Llevar la muestra al termociclador (PCR punto final)
●Detección y cuantificación de gotas positivas (fluorescencia), y productos negativos de la PCR
●Lectura digital de las muestras: cuantificación de la(s) secuencia(s) de ADN de interés
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●Generación de gotas
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●Amplificación por PCR
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●Lectura de las gotas
Las gotas positivas contienen al menos una copia de de la secuencia de ADN de interés,
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●Análisis
Gotas positivas (incremento de fluorescencia)
Experimentos duplex: se visualiza dos secuencias diferentes
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Aplicaciones
●Carga Viral
●Identificación de microorganismos
●Expresión génica
●Detección de secuencias atípicas (células cancerígenas
en una población celular)
●Alteraciones genómicas
●Validación de edición genómica por CRISPR-Cas9
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Biopsias líquidas: uso potencial de la ddPCR
Nat Rev Clin Oncol. 2013 Aug;10(8):472-84
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●BRAF se encuentra mutado en alrededor
●Los inhibidores de esta proteína tienen
Nat Rev Cancer. 2013 Oct;13(10):714-2
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Considerar que:
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●La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular, su expresión, estructura
●El gran avance en los estudios proteómicos se da gracias al desarrollo y modernización de la espectrometría
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Clin Trans Med (2017) 6:9
Cell Reports 18, 3242–3256
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Agradecimientos