PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

GERARDO D. MENDOZA GARCÍA

DR. KARY MULLIS

1983:conceptualizó la PCR

1993: recibió el premio Nobel por su invención

 Multiplicar una hebra de ADN millones de

veces

Polymerase chain reaction

EL MÉTODO DE PCR

Técnica enzimática in vitro utilizada para amplificar una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN, cuya secuencia se conoce, a partir de una mezcla compleja de ácidos nucleicos.

Molde para las copias

2 oligonucleótidos (cebadores)

ADN polimerasa

Deoxinucleotidos cadenas nacientes

= varios millones de copias del ADN

PASOS / FASES

Fase Lag 5-10 ciclos

Fase Exponencial Duplicacion de fragmentos

Fase Plateau No hay mas amplificacion

CADA CICLO SE DIVIDE EN 3 PARTES

Desnaturalización ADN molde se separa 94°C

Anillado/annealing Temperatura Cebadores se unan a su región blanco

Extensión Actividad optima de la polimerasa presente en la reacción

CEBADORES

Iniciadores de la reacción Veinte nucleótidospermiten una alta

especificidad

ADN POLIMERASAS

Replicación de ADN

Adicionar dNTPS a partir de un cebador y copiar una secuencia molde.

5’ 3’

Cebador/primer

Magnesio

Conceptualmente, la técnica de la reacción en cadena de polimerasa es sumamente sencilla, sin embargo la puesta a punto de una reacción en particular debe considerar algunos aspectos, para ser exitosa como:a) componentesb)ciclos y temperaturac) diseño de cebadores

COMPONENTESUna reacción convencional de PCR se puede realizar con la siguiente fórmula:

La cantidad de molde requerida depende del tipo de ADN que se trate (ADN genómico, plasmídico, etc)

Los tampones de reacción que se incluyen con las enzimas comercialmente disponible incluye una concentración estándar de Cloruro de Magnesio, que permite una actividad completa de la enzima.La concentración de MgCl2 presente en la reacción es una de las variables con las cuales se pueden poner a punto algunas reacciones. En la realización de la reacción, un punto importante es la homogenización de los reactivos. Las enzimas se encuentran en glicerol lo cual las hace más densas y tienden a estar en el fondo del tubo de reacción.

CICLOS Y TEMPERATURA

Una reacción convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos. El tiempo de extensión también varía de acuerdo al tamaño del fragmento que se desea amplificar y la velocidad de la enzima con la cual estamos realizando la reacción. Cuando los fragmentos que se desea amplificar son mayores a 5000 bases, la extensión puede necesitar de 5 a 10 minutos.Las temperaturas de desnaturalización utilizadas son en general 94 o 95 oC, y la de extensión depende de la enzima utilizada, comúnmente si se utiliza la Taq se recomienda una temperatura de extensión de 72 oC.

DISEÑO DE CEBADORES

La secuencia de los cebadores deberá tener una composición de bases tal que su contenido GC se encuentre entre 40 y 60 % (esto dependerá de la complejidad del ADN blanco a partir del cual realizaremos la amplificación, por lo que no siempre lo podemos respetar). Ambos cebadores deben tener una composición de bases, o al menos un contenido GC, y un largo similar. Estos factores están implicados en la temperatura de melting, que no debería variar más de 5 oC entre un cebador y el otro. El extremo 3’ del cebador es muy importante y se busca que sea una base G o C (lo cual provoca mayor especificidad, debido a que son bases que se unen mediante 3 puentes de hidrógeno, en contraste con A y T que se unen mediante 2 puentes de hidrógeno).

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VARIANTES DE PCR

RT PCR

Se utiliza ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa reversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc).

• En esta primera ronda, como cebador se pueden utilizar hexámeros que se unen al azar en cualquier región del ARN molde, o un oligonucleótido que permite la captura y la realización del ADNc a partir del ARNm o ARN con colas poliA.

• Una vez que se obtiene el ADNc, se realiza la reacción de PCR convencional.

PCR ANIDADA O NESTED

Técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR. En este caso se trabaja con 4 celadores 1. Se amplifica de manera convencional con los dos cebadores más externos a la región que

se desea amplificar. 2. El producto de este primer PCR se utiliza como molde para una segunda ronda que utiliza

cebadores internos a la región previamente amplificada.

… La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de contaminación, y además no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde presenta en la muestra analizada.

PCR IN SITU

En secciones histológicas o células.

1. Ampliación de ADN blanco2. Detección mediante hibridación in situ convencional.

Con sonda de ADN/ARN

Permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra.

Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.

PCR MÚLTIPLEX

Consiste en combinar en un único tubo de reacción todos los pares de cebadores de las secuencias que queremos amplificar, junto con el resto de los reactivos en cantidades suficientes.

Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, requiere menor cantidad de molde para el análisis y menor cantidad de reactivos.

Los ejemplos de PCR múltiplex son muy comunes en el diagnóstico de agentes infecciosos, donde se intenta amplificar varios tipos virales en el mismo tubo y al mismo tiempo.

PCR EN TIEMPO REAL La cuantificación de los productos de amplificación, es muy utilizada

en lo que refiere al análisis de expresión génica. Reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y

colaboradores Utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante

el curso del termociclado. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el

número, de copias de la molécula que está siendo amplificada. Cuantificación sensible y especifica del blanco E N 1997 surgen los primeros equipos de PCR en tiempo real,

producidos por Applied Biosystems

Cinética de reacciones y concepto de ciclo umbral• Es lo que observamos en cada corrida de PCR en

tiempo real que realizamos• Diluciones seriadas en base 1:10 del molde inicial y

sus curvas de amplificación• Valor de umbral de intensidad (línea roja) de donde

inicia la fase exponencial de amplificación• Ciclo umbral indicado con círculo rojo• A mayor concentración, amplificará la muestra y

menor será su ciclo umbral

AGENTES INTERCALANTESutilizan moléculas

fluorescentes que aumentan su emisión cuando se unen al ADN

doble cadena, es el caso del Bromuro de Etidio y SYBR

Green.

inespecificidad, ya que los agentes intercalantes se unen a cualquier producto que este siendo producido durante la

reacción, ya sea el específico que queremos medir, como

productos inespecíficos, dímeros de cebadores, etc.

no puede utilizarse en reacciones multiplex.

es posible realizar curvas de desnaturalización y evidenciar

presencia de dímeros de cebadores, aunque no es

posible eliminar esa señal que será un ruido en nuestras

medidas, cuando deseemos cuantificar. La ventaja de

utilizar agentes intercalantes radica en qu

puede utilizarse para cualquier reacción de

PCR es económico

Sondas

mejora sensiblemente la especificidad del método.

sondas de hidrólisis (ej.: Taqman) y las de hibridación

(ej.: FRET) son las más utilizadas

marcadas con dos tipos de fluoróforos, un donador y un

aceptor

también se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante

resonancia (FRET) entre las dos moléculas.

C. CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Y RELATIVA La cual se utiliza una curva estándar construida a partir de concentraciones

conocidas del blanco que se desea amplificar y cuantificar. Muchos kits comerciales de PCR en tiempo real. Las curvas de calibración son altamente reproducibles, específicas y

sensibles. El rango dinámico de cuantificación puede llegar a 9 órdenes de magnitud (ej.

102 – 1011 copias iniciales de ácido nucleico). Los kits de diagnóstico, muchas veces se utiliza un control interno que se

agrega a la muestra antes de ser extraído el ácido nucleico (ARN o ADN), que sigue todo el proceso de extracción y amplificación.

Se utilizan sondas Dos curvas estándar

Interes Control interno

La cuantificación relativa es la estrategia utilizada para estudiar los cambios en la expresión génica entre diferentes muestras. una RT‐PCR en tiempo real Existen diferentes modelos matemáticos para hacer estudios de expresión génica

diferencial mediante cuantificación relativa.

En el primer caso se asume una eficiencia de 100 % (es decir que el blanco de amplificación se duplica en cada ciclo): Ecuación 1.Ecuación 1. R = 2 –(ΔCt gdi – ΔCt gh)Experimental – (ΔCt gdi – ΔCt gh)Control = 2 –( ΔΔCt )

Dónde gdi=gen de interés y gh =gen housekeeping

En el segundo caso, se realiza una corrección basándose en la eficiencia de cada reacción (para el gen de interés y para el gen normalizador): Ecuación 2. Ecuación 2. R = Eficiencia gdi –(ΔCt gdi Control – ΔCt gdi Muestra) /

Eficiencia gh –(ΔCt gh Control – ΔCt gh Muestra) ) Curva de calibración

Ecuación 3. Eficiencia (E) = [10 (‐1/pendiente)] ‐1 De esta manera se realiza una aproximación más realista, ya que la

eficiencia de un experimento de PCR difícilmente alcance el 100% como plantea el primer método.

D. CURVAS DE DESNATURALIZACIÓN Y DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS PUNTUALES.

cuando se utilizan agentes intercalantes y en estrategias con sondas de hibridación.

al finalizar la reacción = fase plateau. Aumento de temperatura. Se separen de su blanco = disminución de la señal de fluorescencia. punto de inflexión .

Al calcular la derivada de la Intensidad de fluorescencia

FUENTES DE REFERENCIA

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/realtime_pcr.pdf http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/pcr.pdf