Plantas biofactoría Sector agroalimentario · La utilización de plantas como biofactorías de...

Sector agroalimentarioPlantas biofactoríaInforme de Vigilancia Tecnológica

Plantas biofactoríaInforme de VigilanciaTecnológica

El presente Informe de Vigilancia Tecnológica ha sido

realizado en el marco del convenio de colaboración

conjunta entre Genoma España y Parque Científico de

Madrid (PCM), entidad que, por delegación de la

Universidad Complutense de Madrid, gestiona el Círculo

de Innovación en Agroalimentación (CIAA), perteneciente

al Sistema de Promoción Regional madri+d.

Los autores de este informe agradecen la colaboración

ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial

para la realización de este informe, en especial a:

- Dra. Covadonga Alonso Martí (INIA)

- D.ª Isabel Bronchalo Bronchalo (AGRENVEC)

- Dra. Sonia Castañón de la Torre (NEIKER)

- Dr. Juan Antonio García Alvarez (CNB - CSIC)

- Dra. Dolors Ludevid Múgica (IBMB - CSIC)

- Dr. Luis Enjuanes Sánchez (CNB - CSIC)

- Dr. José Angel Martínez Escribano (INIA)

- Dr. Angel Mingo Castel (Univ. Pública de Navarra)

- Dr. Ignacio Moreno Echanove (Plant Bioproducts)

- Dr. Juan Plana Durán (Fort Dodge Veterinaria)

- Dr. Fernando Ponz Ascaso (INIA)

- Dr. Javier Pozueta Romero (Instituto de

Agrobiotecnología y Recursos Naturales. UPN)

- D.ª Lucía Roda Ghisleri (Ministerio de Medio Ambiente)

- Dra. Julia Rueda Muñoz de San Pedro

(Univ. Complutense de Madrid)

La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo

la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Plantas

Biofactoría. GENOMA ESPAÑA / CIAA-PCM.

Genoma España no se hace responsable del uso que se

realice de la información contenida en esta publicación. Las

opiniones que aparecen en este informe corresponden a los

expertos consultados y a los autores del mismo.

© Fundación Española para el Desarrollo

de la Investigación en Genómica

y Proteómica / Parque Científico de Madrid.

Autores: Olga Ruiz Galán (CIAA)

Esther García Iglesias (CIAA)

Lara Gago Cabezas (CIAA)

Víctor González Rumayor (CIAA)

Coordinador: Miguel Vega García (Genoma España)

Edición: Silvia Enríquez (Genoma España)

Referencia: GEN-ES05001

Fecha: Febrero 2005

Depósito Legal: M-10665-2005

ISBN: 84-609-4621-5

Diseño y realización: Spainfo, S.A.

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Índice de contenido

• RESUMEN EJECUTIVO 7

1. INTRODUCCIÓN. PLANTAS BIOFACTORÍA 9

2. TECNOLOGÍAS PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA 14

2.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes. 142.1.1. Transformación genética estable de las plantas. 152.1.2. Expresión transitoria. 21

2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtención de proteínas recombinantes en plantas. 242.2.1. Aumento del rendimiento de producción. 242.2.2. Autenticidad estructural. 32

3. CULTIVOS DE INTERÉS EN AGRICULTURA MOLECULAR 35

3.1. Plantas de hoja y forrajeras. 363.2. Semillas de cereales y leguminosas. 373.3. Frutas, tubérculos y hortalizas. 383.4. Oleaginosas y de fibra. 39

4. MOLÉCULAS DE INTERÉS 41

4.1. Proteínas recombinantes. 414.1.1. Proteínas de interés biosanitario. 414.1.2. Proteínas de interés industrial. 55

4.2. Ingeniería metabólica. 564.2.1. Modificación de rutas enzimáticas existentes. 564.2.2. Introducción de nuevas rutas enzimáticas. 60

5. LEGISLACIÓN 61

6. ASPECTOS DE MERCADO 67

7. ASPECTOS SOCIOECONÓMICOS 74

5

PLANTAS BIOFACTORÍA

8. EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIÓN ESPAÑOLES 78

9. CONCLUSIONES 92

10. ANEXOS 94

Anexo I. Proyecto Pharma-Planta. 94Anexo II. Proyectos financiados por la Unión Europea. 96Anexo III. Centros públicos de investigación y proyectos. 102Anexo IV. Empresas. 103Anexo V. Patentes. 108

11. REFERENCIAS 122

12. LISTA DE ABREVIATURAS 126

13. GLOSARIO 127

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La ingeniería genética de plantas surgió aprincipios de los años 80, cuando se descubrecómo transferir fragmentos de informacióngenética de un organismo vegetal a otro,permitiendo la expresión de caracteres deseables.Desde entonces, el desarrollo de las tecnologíasde transformación y regeneración de plantas hasido tal que ha permitido realizar modificacionesque parecían impensables.

Las primeras aplicaciones comerciales de lamodificación genética de plantas se encaminan ala obtención de cultivos que presenten ventajasagronómicas como tolerancias a herbicidas,resistencias a plagas y patógenos o tolerancia acondiciones adversas como salinidad o sequía. El cultivo de estas plantas proporciona beneficiosa los agricultores debido a que implican mayoresrendimientos y/o menores costes de producción.

La segunda generación de plantas transgénicascorresponde a plantas que presentan mejorespropiedades organolépticas y nutricionales. Lasmodificaciones que se realizan en estas plantasson más complejas, ya que se encuentra implicado un mayor número de genes. Se considera que los beneficios de este tipo deplantas repercuten tanto en los productores dealimentos como en el consumidor final.

En ambos casos se trata de plantas modificadasgenéticamente utilizadas para la elaboración dealimentos destinados al consumo humano y animal.

Existe una tercera generación de plantastransgénicas que corresponde a plantasmodificadas genéticamente para producircompuestos de alto valor añadido. En este caso nose busca la producción de alimentos, sino que sepretende que la planta se convierta en unabiofactoría de productos de interés en los camposbiosanitario, farmacéutico o industrial. Esteinforme pretende describir de manera detalladacuál es el estado en el que se encuentra eldesarrollo de esta tercera generación de plantastransgénicas, tanto en el ámbito tecnológico comoen lo referente a los aspectos legislativos,socioeconómicos y comerciales.

La primera parte del informe analiza lastecnologías que se están utilizando en laactualidad para la obtención plantas biofactoría. El proceso productivo, que incluye desde la

transformación del material vegetal hasta lacomercialización del producto final, presenta unaserie de factores críticos, que en ocasiones puedenllegar a ser limitantes (riesgos ambientales,

riesgos sobre la salud y rendimiento deproducción). Se han diseñado distintas estrategiastecnológicas que contribuyen a minimizar elimpacto de estos factores.

Las aplicaciones en el campo biofarmacéutico sonespecialmente interesantes. La utilización demicroorganismos modificados genéticamente

para la obtención de moléculas de interésterapéutico comenzó hace dos décadas con laproducción de insulina humana recombinante. En 2002, veinte años después, ya existían

aproximadamente 90 fármacos desarrollados y/oproducidos por métodos biotecnológicos en elmercado, que movieron cerca de 35 billones dedólares. Las estimaciones indican que en el año

2010 los biofármacos serán un 35% del mercadofarmacéutico, con unos beneficios estimados de20 billones de dólares.

Sin embargo, parece que el aumento de lademanda de este tipo de productos será tal quelos actuales sistemas de producción no podránhacer frente a la misma. Por ello, será necesario eldesarrollo de nuevos sistemas de producción quepermitan la obtención de estos biofármacos encantidades más elevadas y a un coste asequible.

La utilización de plantas como biofactorías deestos productos se perfila como una posiblesolución. En el campo específico de plantas comobiofactorías, se estima que los primeros productosllegarán al mercado en el año 2006, y que el valorde mercado, sólo en EE.UU., alcanzará los 2.200millones de euros en 2011.

El desarrollo de plataformas biotecnológicas deproducción de proteínas recombinantes en plantasse encuentra liderado por los Estados Unidos yCanadá, donde ya existen productos comerciales.

Europa sufre un retraso en la implantación deestos sistemas, debido fundamentalmente a lamoratoria que impedía el uso de nuevostransgénicos. El sector se encuentra formado por

grupos de investigación de centros públicos yuniversidades, y por empresas generalmente depequeño y mediano tamaño.

Con el fin de reflejar el estado en el que seencuentra actualmente este mercado se realiza

7


Resumen ejecutivo

una descripción de algunas de las empresas tipodedicadas a esta actividad. Dentro de estadescripción se incluyen las tecnologías queutilizan, los productos en desarrollo y la fase en laque se encuentran, así como las estrategias quesiguen en cuanto a la propiedad industrial.

La legislación aplicable a las plantas biofactoríacondiciona extraordinariamente los sistemas deproducción. La normativa europea referente alcontrol de las actividades en las que se produzcano empleen OMGs es muy estricta. Su objetivo esasegurar que estas actividades se lleven a cabo encondiciones en las que los riesgos para la salud ypara el medio ambiente sean mínimos. Se hadedicado un apartado a estudiar la legislación enel que se incluyen referencias a la normativaaplicable a la utilización confinada, liberación ycomercialización de OMGs, así como a losprocedimientos administrativos de autorización delas mismas.

Por último, se analizará cuál es la posición denuestro país en el desarrollo de plantastransgénicas de tercera generación. Para ello seha realizado un mapa de las empresas y gruposde investigación que en la actualidad desarrollansus actividades en este campo. Se han recogidolos datos referentes a las líneas y proyectos deinvestigación y patentes desarrolladas por estosgrupos, así como la percepción de losinvestigadores principales en cuanto al futuro delas plantas biofactoría en nuestro país.

8

La utilización de plantas como biofactorías deproductos de alto valor añadido despierta unelevado interés tanto en los científicos como en lasempresas de biotecnología, debido a las ventajasde tipo económico, técnico y de seguridad quepresentan las plantas para ser usadas comosistemas de producción1.

Cuando hablamos de plantas como biofactoríasnos referimos al cultivo a escala agrícola deplantas superiores que han sido transformadas demodo que pasen a expresar productos que noexpresaban anteriormente (o que expresaban encantidades muy pequeñas) y que poseen un

elevado valor añadido. Pueden usarse plantastradicionalmente utilizadas para la obtención dealimentos, piensos u otros productos como fibras,u otras especies.

La modificación genética de la planta da lugar a laexpresión de una nueva proteína que la planta noposeía. Esta proteína puede ser el producto de interésque se desea obtener, o bien puede ser una enzimaque modifique una ruta metabólica de la planta, ycomo consecuencia ésta pasa a expresar un nuevocompuesto que anteriormente no producía. En elprimer caso se habla de agricultura molecular y enel segundo de ingeniería metabólica.

Para que la planta exprese estos productos es necesario introducir los genes que los codifican, lo cual puedehacerse mediante distintos sistemas que se indicarán más adelante. La planta transformada podrá cultivarseen el campo tal y como se hace con los cultivos tradicionales, o bajo distintos sistemas de confinamiento ode contención y una vez que alcance el desarrollo adecuado se recolectará.

El material vegetal recolectado contendrá el compuesto de interés y en función de su uso, puede serpurificado para su envasado y comercialización en forma pura, o bien puede comercializarse sin purificar taly como ocurre con las vacunas comestibles.

9


Agricultura molecular

La expresión “agricultura molecular” procede de la expresión en inglés “molecular farming” y consisteen la aplicación de la biotecnología de plantas para introducir en una planta genes que codifican paradeterminadas proteínas con interés biomédico o industrial para el hombre, como vacunas,anticuerpos, biofármacos, polímeros o enzimas, de modo que la planta sea capaz de producirlos.

Ingeniería metabólica

La ingeniería metabólica consiste en la modificación de las rutas metabólicas de la planta paraincrementar la síntesis de moléculas deseables, bien mediante la introducción de genes que codificanpara enzimas que completan una ruta metabólica existente en la planta, o genes que codifican paratodas las enzimas de una ruta metabólica que no posee la planta.

1. Introducción. Plantas biofactoría

1 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems andexpression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578.

10

Figura 1. Esquema general

Construcción de unvector de transferencia

Introduccióndel vector en lacélula vegetal

Aislamiento delgen de interés

Célula modificadagenéticamente

Cultivo delas células

Trasplante a uncampo de cultivo

confinado

Consumodirecto

Consumo animal Consumo humano

Elaboración defármacos

Este informe se centra principalmente en laobtención de proteínas recombinantes de interésbiosanitario e industrial mediante agriculturamolecular, ya que es ésta la aplicación que concentramayor número de empresas y mayor cantidad deproductos cercanos a la comercialización. Nosreferiremos a la ingeniería metabólica en el apartadodedicado a los productos, explicando los puntos másimportantes.

Las proteínas recombinantes son moléculascomplejas cuya obtención a escala industrialmediante síntesis química es muy difícil o costosa.Por este motivo, en la actualidad se obtienenmediante la utilización de cultivos celulares demicroorganismos (bacterias, levaduras y hongos) o células de organismos superiores entre los que seincluyen insectos, mamíferos o plantas. Uno de losprincipales inconvenientes que presentan estossistemas es que implican costes elevados, debido aque requieren aportes de nutrientes y energía ydeben llevarse a cabo en condiciones de esterilidad.

Estos sistemas además presentan riesgos decontaminación de los productos con distintosagentes que pueden resultar peligrosos para la

salud de las personas y los animales. En el casode las bacterias estos agentes son las endotoxinasbacterianas, mientras que cuando se trata decélulas de mamíferos son virus, priones ysecuencias oncogénicas.

Una alternativa a los cultivos celulares es lautilización de plantas y animales completos. En elcaso de los animales se está investigando laexpresión de las proteínas en huevos o leche, porejemplo, lo cual permitiría una recoleccióncontinua relativamente sencilla. Sin embargo, estetipo de sistemas presenta inconvenientes relativosa la seguridad debido a la posible presencia deagentes contaminantes y patógenos.

La utilización de plantas completas presentaventajas de tipo económico, técnico y deseguridad del producto frente a los sistemas deexpresión que se utilizan en la actualidad paraobtener proteínas recombinantes, y ademáspresenta ventajas de seguridad frente losanimales transgénicos. A continuación se indicanlas principales ventajas que presentan las plantaspara su utilización como biofactorías.

11


• De tipo económico5, 6, 7

– Permiten usar los recursos y la infraestructura agrícola existente (maquinaria para la siembra,cosecha y procesado del material vegetal, silos, etc.), lo que resulta en una reducción del capitalinicial que se debe invertir.

– Presentan costes de producción bajos. La energía necesaria para el crecimiento del cultivoprocede del sol y los nutrientes son el dióxido de carbono atmosférico y los minerales del suelo oprocedentes de la fertilización.

– Permite un escalado sencillo tanto para aumentar la producción como para reducirla, simplementeaumentando o reduciendo la cantidad de terreno dedicada al cultivo.

– El cultivo de plantas produce una gran cantidad de biomasa en la que se acumula la proteínarecombinante, por lo que pueden alcanzarse producciones elevadas.

– Las líneas transgénicas pueden mantenerse durante un tiempo largo en forma de semillas, demodo que la planta se encuentra en un estado de latencia en el que no se necesitan condicionesde mantenimiento costosas. Por el contrario otros sistemas de expresión requieren condicionesmuy controladas o incluso es necesario reproducir las células con el consiguiente gasto denutrientes y energía.

– En el caso de proteínas que necesitan ser purificadas los costes de procesado son similares a los deotros sistemas de expresión, pero en el caso de proteínas que no se purifican estos costes se eliminan.

(continúa en pág. siguiente)

VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA2, 3, 4

2 Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep., 22,711-720.

3 Giddings, G. (2001). Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology, 12, 450–454.4 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals

and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226.5 Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and

Bioengineering, 90, 353-362.6 Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172.7 Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and

expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578.

Aunque la utilización de plantas completas comosistemas de expresión presenta ventajas muyimportantes, existe una serie de factores críticosque es necesario tener en cuenta, ya que tienenun papel fundamental en el éxito de la agriculturamolecular. Estos factores se refierenprincipalmente a problemas de seguridadambiental, posibles efectos negativos sobre lasalud humana y animal y retos técnicos,entendidos como aquellos que afectan al procesode producción y purificación.

De estos factores críticos, los retos técnicosestán siendo abordados mediante el desarrollode tecnologías que optimizan el procesoproductivo.

Sin embargo, parece que algunos factores críticosrelacionados con el medio ambiente y con la saludhumana y animal necesitarán de esfuerzosadicionales, ya que no siempre es posible eldesarrollo de tecnologías adecuadas que permitanreducir su impacto. Esto hace que, de momento,sea necesaria la utilización de buenas prácticas decultivo y de medidas de confinamiento para poderprevenir algunos de los riesgos asociados a estetipo de cultivos. Además, al tratarse de riesgossobre la salud y sobre el medio ambiente, entra enjuego la aceptación de estos cultivos por distintosagentes socioeconómicos. Dentro de éstos seincluyen agentes implicados en la cadenaalimentaria (agricultores y ganaderos,productores, distribuidores, consumidores, etc.),grupos ecologistas, legisladores y la opiniónpública en general.

12

8 Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine 19,2735–2741.

9 Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals.Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.

• De tipo técnico8, 9

– Las plantas son sistemas relativamente fáciles de transformar.

– Puede aumentarse la estabilidad de las proteínas recombinantes mediante su acumulación osíntesis en determinados compartimentos celulares (orgánulos subcelulares) donde se encuentranprotegidas de la degradación.

– La síntesis de proteínas y sus modificaciones postraduccionales son semejantes a las que realizanlos animales, existiendo sólo pequeñas diferencias en cuanto a glicosilación.

– La pared celular protege a la proteína contra la degradación en el tracto gastrointestinal,permitiendo la administración por vía oral sin purificación.

– Pueden utilizarse sistemas mediante los cuales las moléculas recombinantes se almacenen endeterminados órganos o tejidos de la planta como raíces, semillas, tubérculos, frutos, etc.

• Referentes a la seguridad de los productos obtenidos

– Las proteínas procedentes de plantas no son susceptibles de estar contaminadas por virusanimales o humanos, priones o secuencias oncogénicas que puedan afectar al ser humano o aanimales.

VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA (continuación)

13


FACTORES CRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA10, 11, 12

• Ambientales

– Riesgo de escapes por flujo de polen, que dan lugar a problemas de coexistencia con otroscultivos. El polen de las plantas modificadas genéticamente puede dispersarse por el viento, o a través de insectos polinizadores llegando a otros cultivos en los que podrá introducir lostransgenes que contiene.

– Contaminación cruzada por mezcla de semillas. Puede tener lugar en todas las fases del procesode cultivo incluyendo contaminación a través de la maquinaria agrícola durante la siembra yrecolección, y en el almacenamiento, transporte y procesado. Esta mezcla de semillas puedeocasionar problemas ambientales en caso de siembra de las mismas y podría tener implicacionesen la salud de animales y personas si se produjera el paso a la cadena alimentaria.

– Riesgo de ingestión por los animales que existan en el campo de cultivo, como pequeñosmamíferos, aves o invertebrados.

– Riesgo de permanencia en el suelo de restos procedentes de las plantas transformadas comosemillas o brotes, a partir de los que puede volver a crecer la planta.

– Riesgo de permanencia en el medio de proteínas transgénicas potencialmente peligrosas quepodrían acumularse en otros organismos.

• Salud humana y animal

– Posible riesgo de pasar a la cadena alimentaria. Este hecho podría producir distintos problemasen función del tipo de sustancia que se esté expresando (tolerancia en el caso de las vacunas uotros efectos en el caso de los fármacos).

– Riesgo de contaminación con herbicidas o insecticidas que se utilizan en el cultivo de plantas.Como consecuencia de la utilización de estos compuestos pueden quedar residuos que pueden serperjudiciales para la salud humana y animal en caso de ingestión.

– Riesgo de contaminación con micotoxinas. Son toxinas que se producen como consecuencia delcrecimiento de hongos sobre el material vegetal cosechado, principalmente durante elalmacenamiento. Son sustancias que presentan efectos nocivos sobre la salud animal y humana.

• Técnicos

– El tiempo necesario para la obtención de la primera cosecha de la planta que expresa la proteínarecombinante es mayor que en otros sistemas de expresión como microorganismos o células demamíferos. Es necesario preparar los vectores de expresión, transformar, regenerar y cultivar lasplantas, así como evaluar varias generaciones con el fin de asegurar que la expresión de estassustancias es estable y que la sustancia de interés es bioquímicamente activa.

– Pueden existir problemas de expresión baja para algunas proteínas.

– Las modificaciones postraduccionales que llevan a cabo las plantas no son exactas a las quellevan a cabo los mamíferos, siendo las diferencias principalmente en la glicosilación.

– Dificultad para la dosificación en el caso de vacunas comestibles. Cuando la administración de lamolécula es mediante la ingesta de la planta, es necesario conocer con seguridad los niveles deexpresión de la molécula en la planta con el fin de poder ajustar la dosis de manera adecuada.

10 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticalsand edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226.



A continuación se explican los sistemas más utilizados para la expresión de proteínas foráneas en plantas,así como aquellos sistemas que permiten la optimización de la producción de moléculas de interés enplantas, principalmente encaminados a aumentar el rendimiento de la proteína y a mejorar la autenticidadestructural.

14

2. Tecnologías para la obtenciónde plantas biofactoría

13 Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic andtherapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329.

14 Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine, 19,2735–2741.

VectorCélula

transformada

RegeneraciónPlanta

transformada

Nueva plantatransformada

Semillas

Figura 2. Transformación estable.

2.1. Sistemas de expresión de proteínasrecombinantes13, 14

La obtención de plantas para su utilización como

biofactorías de moléculas de interés se lleva a

cabo mediante el empleo de la tecnología del ADN

recombinante. Esta tecnología permite introducir

en una planta material genético procedente de

otros organismos (otras especies vegetales,

animales o microbianas), consiguiendo que la

planta modificada pase a expresar nuevas

proteínas o bien que modifique la expresión de sus

propias proteínas.

En este apartado distinguiremos entre las

modificaciones genéticas estables transmisibles a

la descendencia y modificaciones que dan lugar a

la expresión transitoria de proteínas

recombinantes, que no se transmiten a la

descendencia.

15


2.1.1. Transformación genéticaestable de las plantas

Mediante transformación genética estable seobtienen plantas modificadas genéticamente enlas que el material genético introducido apareceen todas las células de la planta y se transmite ala descendencia. Son lo que se denomina“plantas transgénicas”.

La principal ventaja que presenta este tipo detransformación es que la modificación se transmite ala descendencia, tanto por reproducción sexual(mediante semillas), como por reproducción asexual(mediante esquejes, micropropagación, etc.).

La transformación genética estable de plantas

puede realizarse mediante la introducción del

material genético en el núcleo celular o bien en los

plastos, que son orgánulos característicos de las

plantas que poseen material genético que puede

ser transformado.

Lo más frecuente es realizar la transformación del

material nuclear. Mediante distintas técnicas que

se explicarán a continuación es posible introducir

en el núcleo de la célula el transgén de interés y

conseguir que éste se exprese dando lugar a la

proteína foránea. A continuación se indican las

principales ventajas e inconvenientes de este tipo

de transformación.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓN NUCLEAR

Ventajas

• Existen protocolos de transformación y regeneración para muchos vegetales, entre los que seincluyen muchas especies comestibles.

Inconvenientes

• La inserción del material genético ocurre al azar, existiendo fenómenos que disminuyen laproducción como el efecto de posición o el silenciamiento.

• La acumulación de las proteínas recombinantes en el citoplasma puede tener efectos tóxicos para laplanta o interferir en el desarrollo.

• Es necesario utilizar marcadores para seleccionar las plantas transformadas.

• La modificación genética puede transmitirse a través del polen, lo que da lugar a riesgos de escape.

Vector

Plantatransformada

Semillas

Planta notransformada

Figura 3. Expresión transitoria.

La transformación de plastos es una técnica relativamente nueva muy interesante en agricultura molecular,debido a que presenta múltiples ventajas frente a la transformación nuclear, en lo referente a seguridadambiental o a los niveles de expresión.

Los plastos son orgánulos subcelulares característicos de las células vegetales, que poseen varias copias deun cromosoma circular de pequeño tamaño denominado plastoma. Se encuentran en los distintos tejidos yórganos de las plantas pudiendo presentar distintas morfologías y funciones. Algunos ejemplos de plastos

16

son los cloroplastos de tejidos verdes y hojas, que

realizan la fotosíntesis, los cromoplastos de flores

y frutas maduras, los amiloplastos, que aparecen

en órganos de almacén como tubérculos o los

leucoplastos, que aparecen en raíces15.

Aunque todos los tipos de plastos presentan

varias copias del plastoma, no todos poseen la

misma capacidad de expresar los genes

que contienen, siendo los cloroplastos los más

eficaces. Por este motivo, el interés principal

se está dirigiendo hacia la transformación

de cloroplastos, aunque el potencial de transformar

cromoplastos de frutas y verduras presenta ventajas

obvias para la obtención de vacunas de subunidades

comestibles16.

Las ventajas e inconvenientes que presenta la

transformación genética de cloroplastos frente a la

transformación nuclear son las siguientes:

15 Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161.16 Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals.

Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.17 Daniell, H.; Khan, M. S.; Alison. L. (2002). Milestones in chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly era

in biotechnology. Trends in Plant Science, 7, 84–91.18 Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172.19 Heifetz, P. B. (2000). Genetic engineering of the chloroplast. Biochimie, 82, 655-666.20 Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓNDE CLOROPLASTOS17, 18, 19, 20

Ventajas

• Integración del ADN transformante mediante recombinación homóloga, lo que previene el efecto deposición.

• Ausencia de efectos epigenéticos como silenciamiento, cosupresión, etc.

• Elevados niveles de expresión debido a que cada cloroplasto presenta un gran número de copias desu cromosoma, y cada célula presenta un número elevado de cloroplastos. El número copias delADN del cloroplasto por célula puede ser hasta 10.000, lo que puede dar como resultado unaacumulación de hasta el 47% de las proteínas totales solubles.

• Las proteínas recombinantes se acumulan en el interior del cloroplasto previniendo problemas detoxicidad o interferencia en el desarrollo de la planta.

• Permite la expresión de operones policistrónicos, por lo que se pueden introducir varios genes en unsolo evento de transformación bajo el control de un solo promotor. Esto puede ser muy interesanteen la ingeniería metabólica donde en ocasiones es necesario introducir varios genes que codificanpara enzimas distintas de una ruta metabólica y se desea que se sinteticen de manera coordinada.

• Los cloroplastos no se transmiten a través del polen ya que su herencia es materna en la mayorparte de las plantas, disminuyendo el riesgo de contaminación cruzada debido al aislamiento deltransgén en el cloroplasto.

• Permite eliminar los marcadores que se usan para seleccionar aquellas plantas en las que se haintroducido el ADN.

Inconvenientes

• Riesgo de transferencia horizontal de los transgenes a bacterias debido a la homología quepresentan el genoma bacteriano y el de los cloroplastos.

• La transformación de cloroplastos sólo se hace de manera rutinaria en tabaco y en el alga C. reinhardii y aunque se ha logrado transformar cloroplastos en algunas especies comestibles comozanahoria y tomate, todavía es necesario optimizar el proceso.

• Los cloroplastos no son capaces de llevar a cabo algunas modificaciones postraduccionales como laglicosilación.

• No se produce la exportación de las proteínas sintetizadas hacia otros orgánulos o compartimentoscelulares.

17


Existen algunos ejemplos de productos obtenidosde plantas de tabaco en las que se hantransformado los cloroplastos y se han conseguidorendimientos elevados21 como la producción dehormona del crecimiento humana (8% de laproteína soluble total o PST22), albúmina séricahumana (11% PST23), fragmentos de las toxinascolérica y tetánica (25% PST), y producción deuna xilanasa termoestable (6% PST)24.

La transformación de cloroplastos ha tomado ungran impulso en los dos últimos años. En 2002 seconstituyó una empresa llamada Chlorogendedicada a la obtención plantas transplastómicasmediante bombardeo con microproyectiles, para eldesarrollo de fármacos y otros productos.

A continuación se explican los sistemas detransformación estable más utilizados, entre losque se encuentran la transformación conAgrobacterium, microinyección, bombardeo conmicroproyectiles o transformación de protoplastos.Algunos de estos métodos permiten realizartransformación nuclear y de cloroplastos.

2.1.1.1. Transformación mediadapor Agrobacterium25

En la transformación mediada por Agrobacteriumse utiliza este microorganismo como vector paraintroducir el material genético recombinante en laplanta que se desea transformar.

Agrobacterium es una bacteria del suelo patógenapara plantas dicotiledóneas y algunas coníferas,capaz de inducir en estas plantas la formación denódulos y agallas que pueden producir incluso lamuerte de la planta. El mecanismo de infección deAgrobacterium consiste en la inserción en laplanta de una parte de su material genético,conocido como T-DNA, y contenido a su vez en el

denominado plásmido Ti. El plásmido Ti es unamolécula de ADN circular y contiene un grupo degenes denominados vir, que dirigen el proceso deinfección, junto con genes implicados en laformación de los nódulos en la planta y genesimplicados en la síntesis de aminoácidosdenominados opinas que sirven de nutrientes parala bacteria. La inserción del T-DNA en la plantaprovoca la formación de nódulos y la síntesis delas opinas.

Mediante manipulación genética del plásmido Ti,es posible eliminar los genes implicados en laformación de nódulos y de opinas y sustituirlospor los genes que deseamos que exprese laplanta. Junto con los genes de interés esnecesario introducir marcadores que permitiránseleccionar aquellas células que hayan sidoinfectadas y hayan integrado este materialgenético.

Con estas bacterias recombinantes se puedentransformar células, tejidos e incluso órganos deplantas completas. Posteriormente se seleccionanaquellas células que han sido transformadas y apartir de ellas se regeneran plantas completas quepresentarán la modificación en todas sus células.La regeneración de plantas es, en algunos casos,un proceso dificultoso que necesita un tiemporelativamente largo, respecto del cultivo demicroorganismos o células animales, lo cualencarece el producto final. Por otra parte, existenfenómenos de variación somaclonal asociadosal cultivo in vitro de células vegetales, que debenser tenidos en consideración, puesto que puedenafectar a la producción final.

Otro de los inconvenientes que plantea estesistema es que muchas monocotiledóneas se hanmostrado tradicionalmente como resistentes a lainfección por Agrobacterium. Lasmonocotiledóneas incluyen familias tan


22 Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.;Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobaccochloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338.

23 Fernández-San Millán, A.; Mingo-Castel, A.; Miller, M.; Daniell, H. (2003). A chloroplast transgenic approach to hyper-express and purify Human Serum Albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation. Plant BiotechnologyJournal, 1, 71-79.


25 Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.;Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobaccochloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338.

importantes como las gramíneas, por lo que hasido necesario desarrollar otros sistemas detransformación. No obstante se ha conseguidotransformar mediante este método algunasmonocotiledóneas muy importantes como maíz,trigo y arroz.

La inserción del material genético es aleatoria ypuede ocurrir en varios sitios dentro de unamisma célula, pudiendo originar problemas desilenciamiento o efectos posicionales. Por ello, esimportante seleccionar posteriormente plantas conelevados niveles de expresión.

18

Construcción del plásmido Ticon el gen interés

Agrobacterium Infección de la célula vegetal conAgrobacterium modificado

Integración del ADNexógeno en el núcleo

Figura 4. Transformación mediante Agrobacterium.

2.1.1.2. Transformación biolística26

La transformación biolística consiste en el bombardeo del tejido que se desea transformar con partículasmicrométricas o submicrométricas de oro o tungsteno recubiertas con el material genético que se deseainsertar en la planta. Estas partículas penetran a través de la pared celular y la membrana plasmáticallegando a zonas profundas de las células donde ocurre la inserción. Permite realizar la transformación delmaterial genético del núcleo o del sistema plastidial (de hecho, es la técnica más utilizada para latransformación de cloroplastos y se ha probado su éxito con varias especies). Como en el caso de latransformación con Agrobacterium, se introducen los genes con un marcador y se seleccionan aquellascélulas en las que se ha insertado el material correctamente y a partir de ellas se regeneran plantascompletas que presentarán la modificación en todas sus células.

Normalmente este método implica la integración de un número de copias elevado, lo que potencia laexpresión, aunque es necesario controlar el número de copias que se inserta, ya que un nivel de expresiónmuy elevado puede causar fenómenos de silenciamiento que llevan a una baja expresión. Por este motivo,se suelen seleccionar aquellas líneas que llevan entre una y tres copias del transgén, siempre y cuandoestén en tándem.

26 Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G.M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating Gene Expression for theMetabolic Engineering of Plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79.

19


Es el método de elección para la transformación de cereales como arroz, trigo y maíz, y para leguminosascomo la soja.

Percutor

Pólvora

Proyectil

Bolas de ADN

Célula vegetal

Se carga el proyectilcon los fragmentosde ADN de interés

Los fragmentos de ADNtraspasan las paredes ymembranas celulares

Inserción del ADN en elcloroplasto o núcleo

Figura 5. Transformación biolística.

2.1.1.3. Microinyección

La técnica de microinyección implica la inyección

directa del material genético mediante

microcapilares o microjeringas bajo control

microscópico en la célula. Resulta poco efectiva

porque es necesario inyectar las células una a una

y es necesario inyectar al menos 10.000 células

para tener la seguridad de que al menos una de

ellas ha incorporado el material genético.

Entre las ventajas principales de este sistema se

encuentra la posibilidad de introducir el material

genético en orgánulos distintos del núcleo como

los plastos.

2.1.1.4. Transformación

de protoplastos27

Los protoplastos son células de cualquier tejido

vegetal a las que se elimina la pared celular

mediante procesos químicos o enzimáticos, que en

suspensión son capaces de incorporar de manera

natural fragmentos de ADN que se encuentren en

el medio.

La incorporación del ADN puede facilitarsemediante distintos tratamientos que alteran lapermeablidad de la membrana. Entre estostratamientos se incluyen la aplicación de pulsoseléctricos de elevado voltaje que inducen laformación de poros reversibles en la membranadel protoplasto (electroporación), o tratamientoscon agentes químicos que desestabilizan lamembrana celular como el polietilenglicol (PEG).

En los protoplastos los plastos se sitúan cerca dela membrana celular, por lo que se puedeconseguir una permeabilización simultánea de lamembrana celular y de la doble membrana de losplastos que permita la introducción del materialgenético en estos orgánulos.

La obtención de protoplastos con capacidadregenerativa puede hacerse a partir de distintostejidos de la planta, aunque en el caso de cerealessólo ha sido posible obtenerlos a partir de tejidosinmaduros.

La principal desventaja de este sistema es ladificultad de regenerar plantas a partir deprotoplastos.

27 Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for themetabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79.

En algunos cereales como el maíz, se ha descrito una alternativa a la electroporación de protoplastos, queconsiste en la electroporación de tejidos. Este tipo de electroporación presenta la ventaja de que laregeneración de plantas a partir de estos tejidos es más sencilla que a partir de protoplastos.28

20

28 Alexander, P. Sorokin; Xia-Yi, Ke; Dong-Fang Chen and Malcolm C. Elliott (2000). Production of fertile transgenic wheatplants via tissue electroporation. Plant Science, 156, 227-233.

Ventajas Inconvenientes

Tra

nsf

orm

aci

ón

med

iad

a p

or

Ag

rob

act

eri

um

Bio

líst

ico

Mic

roin

yecc

ión

Pro

top

last

os

– Efectiva.

– Barata.

– Simple.

– Número de copias bajo.

– Eficiencia alta.

– Simple.

– Permite transformarmonocotiledóneas.

– Permite transformaciónplastidial.

– Puede optimizarse lacantidad de ADN que seintroduce.

– Permite la elección de lacélula a transformar.

– Descarga precisa ypredecible.

– Pueden transformarseplastos.

– Permite transformaciónplastidial.

– Equipos relativamentesencillos comparado conbiolísticos.

– Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos.

– Las plantas monocotiledóneas generalmente son reticentesa esta transformación.

– La integración del transgén se produce al azar pudiendodar lugar a efectos de posición, silenciamiento de genes,etc.

– Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos.

– Riesgo de silenciamiento y/o inestabilidad de genes.

– Riesgo de pérdida de material genético en el disparo opreparación de las partículas.

– Riesgo de modificación del ADN por ataque químico deltungsteno.

– Riesgo de inserción doble en plastos y núcleo.

– Requiere equipos costosos.

– En ocasiones puede conducir a una expresión transitoriadifícil de superar.

– Integración del transgén al azar.

– Requiere personal muy especializado.

– Requiere instrumental.

– Sólo una célula es transformada.


– Requiere regeneración.

– Sólo existen protocolos de regeneración paradeterminadas especies.


COMPARACIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN ESTABLE

Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos sistemas de transformación estable.

21


2.1.2. Expresión transitoria

La expresión transitoria de genes en plantas

implica la expresión de proteínas recombinantes

sin necesidad de transformación del material

genético de la planta. El ADN recombinante no se

inserta en el genoma o plastoma de la planta, sino

que mediante distintos métodos se consigue

producir grandes cantidades de ARN mensajero,

que se traduce a proteínas en el citoplasma de

parte de las células de la planta. Una vez que el

ARN mensajero es traducido a proteínas la planta

lo degrada, de modo que no se transmite a la

descendencia. Normalmente la expresión

transitoria no da rendimientos muy elevados y

requiere un procesado rápido del tejido vegetal

para evitar la degradación de la proteína

recombinante.

La expresión transitoria de genes generalmente se

utiliza para evaluar la funcionalidad de las

construcciones que se usan para transformar plantas

de manera estable, y para evaluar la calidad del

producto que se obtiene29. Sin embargo, debido a los

inconvenientes que presenta la transformación

nuclear estable, principalmente en cuanto a tiempo,

la expresión transitoria ha ido tomando mayor

importancia para su utilización como sistema de

producción de proteínas recombinantes30. Puede

llevarse a cabo mediante la utilización de vectores

virales o mediante agroinfiltración.

También es posible la expresión transitoria en

plastos, como los sistemas in organello de

introducción de ADN en plastos aislados y

métodos in vivo utilizando tecnologías de

bombardeo de microproyectiles o microinyección.

VENTAJAS DE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA

• Expresión rápida y flexible.

• No está influida por efectos de posición.

• Puede inducirse en plantas adultas, previniendo cualquier efecto negativo que la proteínarecombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta.

• No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es unaventaja.

• Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas31.


30 Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals.Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158..

31 Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Report, 22,711-720.

2.1.2.1. Agroinfiltración32, 33

Consiste en la infiltración mediante vacío de cepasde Agrobacterium tumefaciens recombinante quecontengan los genes que se desean expresar en laplanta. Como en el caso de la transformaciónestable mediada por Agrobacterium, las proteínasde la bacteria facilitan la transferencia de losgenes de interés a algunas de las células de lahoja. El transgén se introduce en el núcleo celular,pero no se integra en el material genético de laplanta.

En este caso, no es necesario incluir marcadorespara seleccionar las células transformadas, ya queno es preciso regenerar una planta, lo que permiteutilizar plásmidos de menor tamaño. La utilizaciónde plásmidos permite introducir construcciones demayor tamaño que utilizando vectores virales.

Un inconveniente de la agroinfiltración es quepermite producir elevados niveles de proteínarecombinante pero durante períodos de tiempo muycortos, que generalmente son insuficientes para laproducción a escala comercial. Este hecho se debe aque se producen fenómenos de silenciamientopostranscripcional. Existen datos que indican que elsilenciamiento postranscripcional puede reducirsemediante la coexpresión junto con la proteínarecombinante de proteínas virales supresoras deéste, como es el caso de la proteína p19 del virus delenanismo ramificado del tomate, que se hademostrado que es efectiva en Nicotianabenthamiana y en Arabidopsis34.

2.1.2.2. Vectores Virales35

La expresión transitoria de proteínas mediante

vectores virales consiste en la inoculación de la

planta con virus recombinantes, que contienen las

secuencias que se desean expresar en la planta

bajo el control de promotores fuertes.

Los virus infectan la planta y utilizan su

maquinaria de síntesis proteica para expresar la

secuencia que se ha introducido, dando como

resultado la acumulación de la proteína

recombinante36. La secuencia que se desea

expresar, por tanto, nunca se integra en el

genoma de la planta y se expresa sólo en la planta

infectada, sin que se transmita a la descendencia

por polen o semillas. Puede elegirse el momento

del desarrollo en el que se desea infectar la planta

con el fin de evitar posibles problemas que podría

causar en el desarrollo la acumulación de la

proteína recombinante.

Pueden usarse distintos tipos de virus vegetales

para la construcción de los vectores, aunque lo

más frecuente es utilizar virus de cadena sencilla

de ARN, como el virus del mosaico del tabaco, de

la alfalfa y del caupí, el virus X de la patata, el

virus del enanismo ramificado del tomate y el

potyvirus de la viruela del ciruelo. Las ventajas

que presentan los virus para ser utilizados como

sistemas de expresión se indican en la página

siguiente.

22


33 Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farmingin the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116.

34 Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based onsuppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956.

35 Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farmingin the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116.

36 Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S. (2003). Vaccine antigen production intransgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808.

23


Introduccióndel vectoren el virus

Virus transformado

Se pone en contactoel virus modificado

con la planta

Planta infectadacon un virustransformadogenéticamente

Figura 6. Expresión transitoria de proteínas mediante vectores virales.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA EXPRESIÓN MEDIANTE VECTORES VIRALES

Ventajas

• Presentan genomas pequeños fácilmente manipulables.

• Poseen un elevado nivel de multiplicación que permite altos rendimientos.

• Algunos tienen un rango de hospedadores elevado, lo que permite usar un mismo vector condistintas especies.

• Puede realizarse una infección simultánea con varios vectores, consiguiendo la producción dedistintas proteínas en una misma planta.

• Al ser virus vegetales, no existe riesgo de infección a animales o personas.

Inconvenientes

• Es necesario inocular cada generación de plantas.

• Algunas construcciones son inestables, existiendo el riesgo de que se pierdan los transgenes de untamaño superior a 1 kb.

24


Proteína recombinante(vacuna comestible)

Síntesis

Autenticidad estructural

Degradación

Purificación

Producto finalHum

an i zación

A continuación se indican las estrategias que se

han desarrollado que permiten aumentar el

rendimiento de la producción de proteínas en

plantas y asegurar la autenticidad estructural.

2.2.1. Aumento del rendimientode producción

Para conseguir que el rendimiento final de la

proteína recombinante sea elevado es necesario

optimizar todos los pasos implicados en su

síntesis, así como asegurar su estabilidad una vez

sintetizada protegiéndola de la degradación. Las

estrategias para conseguir una síntesis proteica

elevada se centran principalmente en optimizar la

expresión génica mediante un diseño cuidadoso

del transgén que se va a introducir. En cuanto a la

protección contra la degradación, la principal

estrategia consiste en el direccionamiento de las

proteínas hacia compartimentos celulares en los

que se encuentren protegidas de la degradación.

Además de obtener un rendimiento elevado de la

producción, en el caso de proteínas que serán

utilizadas en forma pura, es necesario optimizar la

purificación del producto final. A continuación se

explicarán de manera detallada las principales

estrategias desarrolladas encaminadas a aumentar

la síntesis de la proteína recombinante, reducir su

degradación y optimizar su purificación.

2.2.1.1. Aumento de la síntesis

Para obtener una elevada producción de la

proteína recombinante, en primer lugar es

necesario que la expresión de los genes

introducidos sea elevada.

El material genético que se introduce en la planta

incluye el gen o genes que codifican para la

proteína de interés junto con secuencias

reguladoras que permiten que estos genes se

expresen correctamente y den lugar a la proteína.

Para optimizar la expresión del gen introducido es

2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtenciónde proteínas recombinantes en plantas

Como se ha indicado, uno de los factores críticos en la agricultura molecular es la obtención de una cantidadde proteína suficientemente elevada37 y, en algunos casos, además es necesario que la proteína que seobtiene sea estructuralmente idéntica a la proteína nativa.

25


necesario elegir de manera adecuada estassecuencias. Las principales secuencias reguladorasde la expresión son secuencias promotoras,secuencias terminadoras, y otras secuencias notraducidas como secuencias líder e intrones38.

• Secuencias promotoras39. Son secuencias queregulan la transcripción del ADN a ARN.Permiten controlar en qué momento y lugar ybajo qué condiciones se expresa el genintroducido. Se pueden diferenciar varios tiposde promotores:

– Promotores constitutivos. Son aquellos quehacen que el gen se transcriba en todos lostejidos y en todo momento, sin necesidad deestímulos. Se utilizan cuando se desea que laplanta produzca la proteína recombinante entodos sus tejidos.

– Promotores (regulados) inducibles. Sonaquellos promotores que se activan bajodeterminados estímulos, que pueden serquímicos o físicos. En este tipo de promotoresse incluyen promotores regulados por factoresambientales o por condiciones fisiológicas dela planta, que se activan sólo en determinadosmomentos del desarrollo. Son especialmenteútiles para la producción de proteínasrecombinantes cuya acumulación en la plantatiene efectos desfavorables sobre elcrecimiento, o para prevenir escapes.

Un ejemplo de promotor inducible porestímulos físicos es el promotor de la enzimahidroxil-3-metilglutaril CoA reductasa 2(HMGR2) de tomate. Esta enzima se activacuando en la planta se produce un dañomecánico produciéndose la síntesis de la

proteína en aproximadamente 24 horas. La

empresa CropTech Corp. desarrolló un

sistema de producción utilizando este

promotor, que denominaron MeGa (mechanical

gene activation) para la producción de

glucocerebrosidasa en tabaco40, 41.

En cuanto a los promotores inducibles

químicamente existen varios tipos, pero no

todos pueden utilizarse en cultivo de campo.

Las características que debe tener este tipo

de promotores son: niveles basales de

expresión bajos, un tiempo de respuesta

rápido, elevada expresión una vez que se

activan y que el compuesto inductor no sea

tóxico. En la tabla 2 se indican algunos de

estos promotores42.

– Promotores específicos de tejido o de órgano.

Se trata de promotores que dirigen la

expresión del gen a determinados tejidos u

órganos. Se han identificado promotores

específicos de órganos como hojas, tubérculos,

frutos o semillas. Cada tipo de promotor

presenta distintas ventajas y la elección del

mismo dependerá del tipo de producto que se

desee obtener, así como de la plataforma de

producción. Así por ejemplo, pueden utilizarse

promotores que se expresen en órganos que

se forman antes de la floración como hojas y

tubérculos, previniendo la aparición en el

polen. O bien promotores específicos de

tejidos en los que la acumulación de proteínas

sea elevada, ya que estos órganos presentan

un ambiente protector frente a la degradación,

como es el caso de las semillas. La expresión

en órganos comestibles presenta ventajas para

la expresión de moléculas dirigidas a una

administración por vía oral43, 44.

38 Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production intransgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808.

39 Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience andBioengineering, 90, 353-362.

40 Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4,794-805.


42 Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre, P.; Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based onsuppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33, 949-956.



26

Promotores constitutivos

Promotores inducibles

Promotores específicos de tejido

Nombre

Nombre

Tejido Nombre

Inductor Probado en

Origen

35 S

Ubiquitina-1

Actina

GVHvEcR

Semillas

Fruto

Tubérculos

Hojas

Polen

β-conglicinina

Opaque-2

AmA27

OsGT1

Lox de guisante

Psl de guisante

NapA de colza

Bn-III de colza

Arc5-I de judía

Phas de judía

α-bcsp de soja

P-Lh de Lesquerella

Amy1A de arroz

GluB-1 de arroz

Z4 de maíz

Tapuro-b de trigo

2A11 de tomate

Patatin

StMPI

Lhcb3 de Arabidopsis

Lat52

GVCfEcR

AlcR

ADEI

PR-1a

In2-2

MeGa

Tebufenozida

Metoxifenozida

Etanol

Cobre

Benzotiadiazol

Agroquímicos

Daño mecánico

Tabaco

Maíz y tabaco

Arabidopsis, tabaco y patata

Arabidopsis y tabaco

Tabaco

Arabidopsis

Tabaco

Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV)

Vegetal

Vegetal

PROMOTORES UTILIZADOS EN AGRICULTURA MOLECULAR

Tabla 2. Ejemplos de promotores utilizados en agricultura molecular45, 46.



• Secuencias terminadoras de la transcripción.Son secuencias que influyen en la estabilidad delmRNA. Las secuencias terminadoras másutilizadas son las señales de poliadenilaciónderivadas del gen de la nopalina sintasa deAgrobacterium tumefaciens y del gen ssu delguisante47. Existen estudios que señalan otrosterminadores que podrían ser más efectivos, almenos en dicotiledóneas, como las regiones nocodificadoras en 3́ del gen Me1 y del gen H3 dela histona de trigo48.

• Otras secuencias. En este tipo de secuenciasse incluyen intrones y secuencias líder en 5’.

Los intrones son secuencias de ADN que sontranscritas a ARN y que posteriormente seeliminan durante el proceso de maduración, demodo que no se traducen a proteínas. No seconoce bien el mecanismo por el que producenel aumento de la expresión, pero distintosestudios señalan que influyen tanto el tipo deintrón del que se trate, como su posición, siendolos más adecuados los que se encuentran en laregión 5’ codificante. Algunos ejemplos deintrones que se han utilizado para aumentar laexpresión son el intrón 1 del gen de la actina dearroz, el intrón 1 del gen de la ubiquitina demaíz, el intrón 1 del gen de la sacarosa sintasade maíz y el intrón 1 del gen de la alcoholdeshidrogenasa de maíz49.

Entre las secuencias líder en 5’ no traducidasque aumentan la expresión se encuentra lasecuencia líder en 5’ derivada del virus delmosaico del tabaco, denominada secuenciaomega50.

• Eliminación del silenciamiento. Elsilenciamiento es un conjunto de fenómenosepigenéticos que pueden inhibir la expresión delos transgenes tanto a nivel transcripcional comopostranscripcional. Es muy importante tenerlo encuenta a la hora de diseñar una plantatransgénica, ya que puede dar lugar a laausencia de expresión de la proteínarecombinante.

El silenciamiento transcripcional se relaciona conla inserción del transgén cerca de zonas decromatina inactiva. La transformación decloroplastos es la principal estrategia paraeliminar este tipo de silenciamiento, ya que lainserción del transgén no se produce al azar,sino que ocurre por recombinación homóloga enlugares determinados51.

El silenciamiento postranscripcional en plantasparece estar relacionado con mecanismos dedefensa frente a virus vegetales, mediante ladegradación del material genético de losmismos. Existen investigaciones que señalan laexistencia de determinados virus que expresanproteínas virales supresoras del silenciamientocomo es el caso de la proteína p19 del virus delenanismo ramificado del tomate. Se hademostrado que la coexpresión de la proteínarecombinante de interés junto con esta proteínasupresora, es efectiva para reducir elsilenciamiento postranscripcional en Nicotianabenthamiana y en Arabidopsis52.

Se ha descrito otro tipo de secuenciasdenominadas MARS (matrix attachment regions)que facilitan la unión a la matriz nuclear. La

27


47 Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4,794-805.



50 Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health.Vaccine, 21, 820–825.


52 Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based onsuppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956.

inclusión de estas secuencias en los extremos del

trasgén no sólo parece aumentar la expresión del

gen, sino que además reduce los fenómenos de

silenciamiento.

2.2.1.2. Protección contra la degradación.

Aumento de la estabilidad53, 54

El rendimiento total se refiere a la proteína

almacenada en los tejidos de la planta, por lo que

además de conseguir una elevada síntesis de la

proteína recombinante, es necesario lograr que

permanezca estable y evitar que sea degradada

por los sistemas proteolíticos que posee la célula

para eliminar las proteínas foráneas.

La síntesis de las proteínas nativas de la planta se

produce en el citosol de la célula, donde pueden

ser liberadas o bien dirigirse hacia otros

compartimentos celulares. Uno de los principales

sistemas que permiten proteger a las proteínas de

la degradación es el direccionamiento hacia

compartimentos celulares u orgánulos en los que

ésta se encuentre protegida. El direccionamiento

de proteínas se lleva a cabo mediante secuencias

denominadas péptido señal que se encuentran en

la proteína y contienen información sobre el lugar

hacia el que debe dirigir55. Los compartimentos

celulares que presentan un ambiente favorable

para el almacenamiento de proteínas hacia los que

se puede realizar un direccionamiento de las

mismas son retículo endoplásmico (RE), vacuolas

y cloroplastos.

Existe otra estrategia para proteger a las proteínas

de la degradación que es la acumulación en

semillas. Las semillas son órganos de la planta

que presentan un alto contenido en proteínas y un

ambiente protector contra la degradación de las

mismas debido a su bajo contenido en humedad.

La acumulación en este órgano puede realizarse,

tal y como se ha indicado en el apartado dedicado

a los promotores, mediante el uso de promotores

específicos de semillas.

28






DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES

Retículo endoplásmico (RE)

Es un compartimento celular que presenta un ambiente favorable para la acumulación de proteínasdebido a la baja cantidad de proteasas que contiene, así como a su ambiente oxidante. Eldireccionamiento de proteínas hacia este orgánulo permite una acumulación de varios órdenes demagnitud mayor que la acumulación en el citoplasma. Presenta otras ventajas relacionadas con laconformación y maduración de la proteína, que se explicarán más adelante.

Para realizar el direccionamiento hacia el RE es necesario adicionar en el extremo amino terminal dela proteína péptidos señal. Una vez en el RE, en caso de que no existan más señales, la proteínapasará al aparato de Golgi y de aquí al espacio que existe entre la membrana plasmática y la paredcelular (apoplasto), desde donde las proteínas de menor tamaño serán secretadas y las de mayortamaño quedarán retenidas.

Para conseguir que las proteínas queden retenidas en el RE se adiciona un péptido denominado H/KDEL enel extremo carboxilo terminal, consiguiendo que las proteínas que han pasado al aparato de Golgi regresenal RE. Este péptido es la señal que llevan las proteínas residentes en el RE y su adición a las proteínas evitaque se produzcan las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi56, 57.

(continúa en página siguiente)

2.2.1.3. Aumento del rendimientode la purificación

Puede ocurrir que el producto de interés que seproduce en una planta pueda utilizarse sinpurificar, como sería el caso de la expresiónproductos de administración en tejidoscomestibles. No obstante, lo más frecuente es queel producto deba ser extraído y purificado.

La extracción del producto de interés incluye unaserie de etapas comunes en la extracción de laproteína que son el pre-procesamiento delmaterial mediante molienda o troceado, laextracción de las proteínas y una posteriorpurificación61.

La etapa de purificación de las proteínasrecombinantes es una etapa clave, debido a que el

coste de su extracción y purificación es muy

elevado, pudiendo llegar a ser el 95% del coste de

producción, principalmente en proteínas en las

que se requiere un grado de pureza alto. El grado

de pureza dependerá del tipo de uso que tendrá la

proteína recombinante. En el caso de productos de

uso terapéutico que se administrarán por vía

parenteral se necesita un grado de pureza muy

elevado y se deben cumplir las indicaciones de la

agencia de control correspondiente (FDA,

EMEA, etc.). En los productos para uso industrial

como enzimas, por ejemplo, generalmente no se

requiere un grado de pureza tan alto.

Un elevado contenido de proteína facilita la

purificación, pero como se ha indicado, no siempre

es posible conseguirlo, de modo que es necesario

el desarrollo de métodos de purificación que

permitan recuperar gran parte de la proteína a

29


DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES (continuación)

Vacuolas

Las células vegetales poseen distintos tipos de vacuolas con diferentes funciones, entre las que seincluyen vacuolas de acumulación de proteínas. La acumulación de proteínas en estas vacuolas seproduce mediante secuencias específicas denominadas determinantes de direccionamiento vacuolarC-terminal (ct-VSD en sus siglas en inglés), que dirigen a las proteínas procedentes del RE o delaparato de Golgi hacia la vacuola. Se han identificado secuencias ct-VSD en pro-regiones de proteínasde almacenamiento como en la lectina de la cebada y la albúmina 2S de la nuez de brasil, y enproteínas relacionadas con patogénesis como la osmotina, chitinasa y β-1,3-glucanasa.

A pesar de la identificación de estas secuencias, los datos sobre el direccionamiento de proteínasrecombinantes a este tipo de vacuolas parecen insuficientes para el desarrollo de un sistema deacumulación de proteínas en elevada concentración en estos orgánulos58, 59.

Cloroplastos

En el apartado dedicado a las tecnologías de transformación se han explicado en detalle lastecnologías que permiten la expresión de proteínas en cloroplastos mediante la inserción del materialgenético que codifica para las mismas en el material genético del cloroplasto. Otra alternativa quepermite acumular proteínas en este orgánulo es el direccionamiento de proteínas sintetizadas en elcitosol hacia el cloroplasto, mediante la adición en el extremo amino terminal de la secuencia de los23 primeros aminoácidos de la subunidad pequeña de la proteína rubisco de guisante60.

58 Yoshida, K.; Matsui, T.; Shinmyo, A. (2004). The plant vesicular transport engineering for production of usefulrecombinant proteins. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 28, 167-171.

59 Jiang, L.; Sun, S-M. (2002). Membrane anchors for vacuolar targeting: application in plant bioreactors. Trends inBiotechnology, 20, 99-102.


61 Nikolov, Z. L.; Woodard, S. L. (2004). Downstream processing of recombinant proteins from transgenic feedstock.Current Opinion in Biotechnology, 15, 479-486.

costes económicos. A continuación se indicanalgunas de las estrategias:

• Proteínas de fusión. Consiste en fusionar laproteína de interés a una proteína que presentaafinidad por distintos componentes celulares. A continuación se indican algunos ejemplos:

– Proteínas de fusión con oleosinas. Lasoleosinas son proteínas lipofílicas que seexpresan en semillas oleaginosas y formanparte de estructuras denominadas cuerposlipídicos, en los que se almacenan aceites. Lafusión se realiza mediante ingeniería genéticaañadiendo al gen de la proteína de interés elgen de la oleosina, y se combina con unaexpresión dirigida en el grano, donde laconcentración de aceite es mayor.

La presencia de la oleosina hace que laproteína de fusión se dirija hacia los cuerpos

lipídicos del grano, pasando a formar parte de

esta estructura. Posteriormente las semillas se

molturan y mediante centrifugación se separa

la fracción lipídica en la que está incluida la

proteína de fusión.

La purificación de la proteína recombinante se

realiza finalmente mediante tratamiento con

una endoproteasa que rompe la proteína de

fusión, quedando la proteína recombinante

libre y la oleosina unida a los cuerpos lipídicos,

que se separan de nuevo por centrifugación.

La proteína de fusión permanece estable en

las semillas desecadas durante largos períodos

de tiempo y en los cuerpos lipídicos durante

3 ó 4 semanas de media62. Es un método

patentado por la empresa SemBioSys

Genetics Inc.; que se ha utilizado para la

producción de hirudina, proteína

anticoagulante producida por las glándulas

salivares de la sanguijuela.

30

62 Van Rooijen, G. J.; Moloney, M. M. (1995). Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins. Biotechnology, 13, 72-77.

Secuencia genéticade la oleosina

Secuencia genéticade la proteína

de interés

Materialgenético

de la plantaCélula modificada

genéticamente

Proteína deinterés

Oleosina

Cuerpo lipídico

Cártamo modificadogenéticamente

Adición dela proteasa

Molturaciónde las semillas

Centrifugación

Fracción lipídica

Fracción proteica

Semillas

Cártamo

Figura 7. Proteínas de fusión con oleosinas.

– Fusión de oleosinas con la proteína A parapurificación de anticuerpos. Esta tecnología esuna adaptación de la fusión con oleosinas parala purificación de anticuerpos producidos encártamo. En la planta se producen dos proteínasrecombinantes que son el anticuerpo de interésy una proteína de fusión compuesta por unaoleosina fusionada a la proteína A, que es unaproteína con gran afinidad por los anticuerpos.La producción de las proteínas se dirige paraque se sinteticen en compartimentos celulares

distintos y no exista contacto entre ambasdurante el crecimiento de la planta. Una vez quese muele el grano y las proteínas entran encontacto, se forman complejos entre elanticuerpo y la proteína A que está anclada a loscuerpos lipídicos a través de la oleosina. Al igualque sucede con la hirudina, se separa la faselipídica y, en este caso, mediante tratamientocon ácido se produce la disociación de loscomplejos formados por el anticuerpo y laproteína A unida a la oleosina.

31


Secuencia genéticade la oleosina

Secuencia genéticade la Proteína A

Materialgenético

de la planta

Célula modificadagenéticamente

Anticuerpo

Retículo endoplásmico

Proteína AOleosina

Cuerpo lipídico

Semillas

Cártamo modificadogenéticamente

Complejos Anticuerpoy Proteína A-Oleosina Anticuerpos libres

Acidificacióny lavados

Anticuerpo

Proteína A

Oleosina

Molturaciónde las semillas

Cártamo

Figura 8. Fusión de oleosinas con la proteína A.

– Fusión de la proteína recombinante adominios de membrana. Los dominios demembrana permiten anclar la proteína defusión a la membrana plasmática, que sepuede aislar de una manera sencilla. Una vezaisladas las membranas en las que seencuentra la proteína de fusión, ésta se extraemediante el uso de detergentes y disolucionesreguladoras. Además, el anclaje de lasproteínas a la membrana las protege de ladegradación. Existen distintos dominios conestas funciones como el dominio de membranadel receptor de la célula T humana63, o losmotivos dilisina o diarginina64.

• Direccionamiento a la vía secretora. Existendos estrategias descritas recientemente que sonla rizosecreción y la filosecreción y consisten enla secreción de la proteína recombinante porexudados de las raíces o de las hojas. Estasestrategias permiten obviar el paso deextracción de los tejidos, aunque presentanotros inconvenientes relacionados con larecolección de los exudados.

En el caso de la rizosecreción puede dirigirse laproducción de la proteína recombinante hacia lasraíces e inducirse la formación de raíces aéreas,de modo que la proteína puede recuperarsemediante cultivo hidropónico.

En el caso de las secreciones por las hojas setrata de la gutación, que es un fenómeno queocurre de manera natural en las plantas. Lagutación consiste en el exudado de gotas delíquido en los márgenes de las hojas,principalmente en estructuras denominadashidátodos, aunque puede ocurrir también através de la cutícula y de los estomas. Medianteel direccionamiento de la proteína recombinantehacia el retículo endoplásmico, se consigue lasecreción de la proteína hacia el apoplasto de lashojas, de donde pasa al fluido secretadomediante la gutación65.

Ambos sistemas constituyen sistemas deproducción de proteínas recombinantescontinuos y no destructivos.

2.2.2. Autenticidad estructural66

Existen proteínas relativamente simples como es

el caso de la insulina, el interferón o la hormona

de crecimiento humano que no requieren un

procesamiento postraduccional o plegamientos

para tener actividad biológica, pero en la mayor

parte de los casos este tipo de modificaciones son

necesarias para que la proteína sea activa. Las

plantas son capaces de realizar algunas de estas

modificaciones postraduccionales, siendo ésta una

de sus principales ventajas frente a otros sistemas

de expresión como bacterias y levaduras.

Los anticuerpos son un ejemplo de proteínas

formadas por varias cadenas que deben plegarse y

ensamblarse con el fin de que la molécula sea

funcional. El retículo endoplásmico posee el

ambiente necesario para que se produzca el

plegado y ensamblado de las cadenas, por lo que

es preciso el direccionamiento de las cadenas que

forman los anticuerpos hacia este compartimento.

En el retículo endoplásmico además del plegado y

ensamblado de las cadenas de los anticuerpos se

produce una modificación postraduccional

denominada glicosilación.

La glicosilación consiste en la adición de

precursores de oligosacáridos, denominados

N-glicanos, en aminoácidos específicos de la

cadena polipeptídica. Las proteínas en el retículo

endoplásmico se van transportando hacia el

aparato de Golgi y durante este transporte el

N-glicano añadido va sufriendo reacciones de

maduración que consisten en la eliminación y

adición de distintos residuos de azúcares.

La N-glicosilación en plantas es ligeramente diferente

a la glicosilación que realizan los mamíferos debido a

las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi

lejano. Las diferencias consisten en la adición de

residuos de xilosa y cambios en los enlaces que unen

las fucosas, que en mamíferos son de tipo α-(1,6) y

en plantas son de tipo α-(1,3). Además, en el caso

de mamíferos se añade ácido siálico, que parece que

está implicado en tiempos más largos de eliminación

32



65 Komarnytsky, S.; Borisjuk, N. V.; Borisjuk, L. G.; Alam, M. Z.; Raskin, I. (2000). Production of Recombinant Proteins in TobaccoGuttation Fluid. Plant Physiology, 124, 927–933.

66 Gomord, V.; Faye, L. (2004). Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants. Current Opinion in PlantBiotechnology, 7, 171-181.

de las proteínas del torrente circulatorio. Estasdiferencias, aunque parecen pequeñas, podrían tenerefectos en la actividad, la distribución y la vida mediade las proteínas recombinantes.

Existen estudios que indican la existencia dediferencias en la glicosilación entre distintasespecies, y dentro de una misma especie endiferentes estados del desarrollo. Este hecho debeser tenido en cuenta a la hora de elegir la plantaque se usará como biofactoría, aunque todas lasespecies que se han usado hasta ahora paraproducir proteínas terapéuticas tienen lacapacidad de asociar los residuos de fucosa y dexilosa tal y como se ha indicado67.

Se ha considerado también la posibilidad de quelos glicanos específicos de las plantas pudiesen

dar lugar a la aparición de respuestas alérgicas en

personas, debido a que los residuos de fucosa

α-(1,3) y xilosa forman parte de epítopos de

determinados alérgenos de plantas y se han

encontrado anticuerpos en suero humano que son

reactivos contra estos residuos. Aunque la

existencia de anticuerpos contra este tipo de

glicanos en el suero no implica una reacción

adversa, parece que su presencia podría inducir

una eliminación más rápida de este tipo de

proteínas del torrente sanguíneo, lo cual unido a la

ausencia del ácido siálico, que aumenta el tiempo

de eliminación, podría comprometer su eficacia

terapéutica in vivo68.

Todo esto ha llevado a la búsqueda de estrategias

que permitan “humanizar” el patrón de

glicosilación de las proteínas en plantas.

33


67 Elbers, I. J. W.; Stoopen, G. M.; Bakker, H.; H. Stevens, L.; Bardor, M.; Molthoff, J. W.; Jordi, W. J. R. M.; Bosch, D.;Lommen, A. (2001). Influence of growth conditions and developmental stage on N-glycan heterogeneity of transgenicimmunoglobulin G and endogenous proteins in tobacco leaves. Plant Physiology, 126 1314–1322.


69 Stoger, E.; Sack, M.; Fischer, R.; Christou, P. (2002). Plantibodies: applications, advantages and bottlenecks. CurrentOpinion in Biotechnology, 13, 161-166.

ESTRATEGIAS DE “HUMANIZACIÓN” DE PROTEÍNAS EN PLANTAS

• Almacenamiento de las proteínas en el retículo endoplásmico, evitando que pasen al aparatode Golgi donde se añaden este tipo de residuos. Se consigue mediante la adición de secuenciasH/KDEL, como se ha explicado en el apartado de protección contra la degradación.

• Inhibición de las enzimas glicosiltransferasas de plantas, que son las enzimas que catalizanla unión de los residuos de N-glicanos. Se han clonado los genes de varias enzimas de este tipo y seha comprobado en el musgo Physcomitrella patens, que el bloqueo de los genes de dos de estasenzimas previene la producción de los epítopos específicos de plantas sin afectar a la secreción de laproteína.

• Expresión de glicosiltransferasas de mamíferos en las plantas. La expresión de estas enzimasen plantas permitiría completar la maquinaria del aparato de Golgi para la maduración de proteínasy podría competir con la maquinaria que realiza las modificaciones específicas de las plantas.

• Eliminación de las secuencias de reconocimiento para la N-glicosilación. Esta estrategia seutiliza en aquellos casos en los que no se requiere la glicosilación de la proteína para que seafuncional69.

34

Factores Críticos Tecnologías

Baja producción

Uso de promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejido.

Secuencias terminadoras.

Intrones y secuencias líder.

Eliminación del silenciamiento.

Direccionamiento a orgánulos (retículo endoplásmico, vacuolas,membranas celulares y cloroplastos).

Transformación de cloroplastos.

Proteínas de fusión.

Direccionamiento a la vía secretora.

Direccionamiento a retículo endoplásmico.

Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas.

Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos.

Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares deglicosilación.

Expresión transitoria.Tiempos de

desarrollo largos

Transformación de cloroplastos.Riesgos por flujo

de polenExpresión transitoria.

Androesterilidad.

Promotores inducibles tras el cosechado por daño mecánico.Riesgo de ingestiónpor animales

silvestresExpresión de la proteína en forma inactiva que debe ser procesada(proteínas de fusión).

Uso de genes “terminator”.Riesgo de

contaminaciónde semillas

Promotores inducibles tras el cosechado.Riesgo de entrada en la

cadena alimentaria

Direccionamiento a retículo endoplásmico.

Riesgos dealergias

Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas.

Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos.

Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares deglicosilación.

Autenticidadestructural

TECNOLOGÍAS DISEÑADAS PARA REDUCIR EL IMPACTO DE LOS FACTORESCRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA

Tabla 3. Resumen de las tecnologías diseñadas para reducir el impacto de los factores críticos de las plantas biofactoría.

Existe un número elevado de cultivos, entre losque se incluyen tabaco, cereales, leguminosas, frutas, hortalizas, etc., que sonsusceptibles de ser utilizados como biofactorías demoléculas de interés.

Aunque existen una serie de factores importantes atener en cuenta a la hora de realizar la elección delcultivo, como el rendimiento, la estabilidad del tejidoen el que se expresa la proteína, el coste dealmacenaje y distribución, la facilidad de purificación,riesgos ambientales, etc., no existe una normageneral que pueda seguirse, ya que no todas lasproteínas recombinantes tendrán el mismo precio enel mercado ni tienen los mismos requerimientos en

cuanto a pureza. Por ejemplo, para proteínas quetienen un elevado valor económico se podríajustificar la utilización de plantas cuyo cultivo resultemás caro, o para proteínas que se administren porvía oral sería necesario usar plantas comestibles70.Por tanto, la elección del cultivo que se va a utilizarpara la expresión de una proteína recombinantedebe hacerse de manera individual para cada tipo deproteína.

Una vez seleccionado el cultivo, en función delórgano o tejido en el que se desee expresar laproteína recombinante se deberán utilizar lospromotores más adecuados tal y como se haexplicado en el apartado de tecnologías.

35


3. Cultivos de interés en agriculturamolecular

FACTORES A TENER EN CUENTA PARA LA ELECCIÓN DE UN CULTIVO PARA SU USOCOMO UNA BIOFACTORÍA

• Disponibilidad de protocolos de transformación que permitan expresar la proteína que se deseaobtener de la manera más sencilla posible.

• Velocidad de escalado.

• Rendimiento del cultivo por unidad de superficie cultivada (rendimiento de biomasa).

• Rendimiento de la proteína transgénica por unidad de biomasa cosechada.

• Coste del cultivo (necesidad de invernaderos o requerimientos de nutrientes especiales).

• Existencia de infraestructura que permita la recolección y procesado.

• Estabilidad de la proteína en el tejido en el que se acumula.

• Coste del almacenamiento y transporte del órgano o tejido de la planta en el que se encuentra laproteína recombinante.

• Coste de purificación.

• Presencia de sustancias tóxicas que haya que eliminar en el procesado.

• Riesgos ambientales de escapes a través de polen o de consumo por animales herbívoros o insectosdel tejido que contiene la proteína recombinante.


A continuación se indican los cultivos más usados

en agricultura molecular. La clasificación no se ha

realizado teniendo en cuenta la familia a la que

pertenecen, sino el órgano en el que se expresan

las proteínas71.

3.1. Plantas de hojay forrajeras

En este grupo de cultivos se incluyen aquellas plantas

que se usan en agricultura molecular en las que se

produce la acumulación de proteínas en la parte aérea

de la planta, principalmente en el tejido foliar, como es

el caso del tabaco, alfalfa, lechuga o soja.

Las ventajas que presenta este tipo de plantas en

general son el elevado rendimiento en biomasa, el

gran potencial para escalado que poseen y la

existencia de infraestructura para su procesado.

El inconveniente principal que presentan es debido

al elevado contenido en agua que posee el tejido

foliar, que hace que las proteínas sean inestables y

pueda producirse una disminución del

rendimiento. Para evitar o reducir esta pérdida de

proteínas es necesario realizar un procesado

inmediato tras la recolección y, si esto no es

posible, debe desecarse o congelarse el tejido.

Otros posibles inconvenientes que puede presentar la

expresión de las proteínas recombinantes en las

hojas estarían relacionados con una posible

interferencia en el desarrollo de la planta o con

riesgos ambientales debido al consumo de estas

hojas por insectos o animales herbívoros.

Tabaco72

El tabaco (Nicotiana tabacum) es un cultivo con

una gran importancia en biotecnología de plantas

ya que se utiliza como modelo de experimentación

debido principalmente a la facilidad que presenta

para ser transformado. Éste es el motivo principal

por el que el tabaco es el cultivo más utilizado en

agricultura molecular, ya que existen distintos

protocolos de expresión de proteínas

recombinantes que pueden usarse de manera

rutinaria en este cultivo. En el siguiente cuadro se

indican las principales ventajas e inconvenientes

que presenta el tabaco para ser usado como

biofactoría de proteínas recombinantes.

36



VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL TABACO COMO BIOFACTORÍA

Ventajas

• Existe una tecnología muy desarrollada para la transferencia y expresión de genes en tabaco.

• Única especie en la que la transformación de cloroplastos se hace de manera rutinaria.

• Posee un alto rendimiento de biomasa.

• Produce gran cantidad de semillas.

• Fácil reproducción.

• Potencial para un escalado rápido.

• Disponibilidad de infraestructuras para el procesado a gran escala.

• No es una planta comestible, por lo que se reduce el riesgo de paso a la cadena alimentaria.

• No es necesario completar el ciclo biológico para obtener la proteína recombinante, lo quedisminuye el riesgo de contaminación cruzada.

Desventajas

• Baja estabilidad de las proteínas en el tejido una vez cosechado, por lo que debe ser congelado osecado para su transporte o procesado.

• Posee compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción de las proteínas recombinantes.

• Produce elevados niveles de alcaloides tóxicos, aunque existen variedades con bajo contenido en alcaloides.

• No es comestible, de modo que es necesario purificar la proteína.

En la mayor parte de los casos se usatransformación nuclear para la producción deproteínas en tejido foliar pero, como se haindicado en el apartado de tecnologías, puederealizarse un direccionamiento hacia la víasecretora consiguiendo que las proteínas seexuden por las hojas o por las raíces. Estatecnología está bajo desarrollo comercial para laproducción de fosfatasa alcalina humanasecretada por la empresa Phytomedics Inc.Otras empresas que han elegido el tabaco comoplataforma son Planet Biotechnology,Meristem Therapeutics, Plant BiotechnologyInc y Chlorogen, así como la empresa españolaPlant Bioproducts.

Como se ha indicado en el apartado de tecnologíasse puede hacer transformación de cloroplastos demanera rutinaria generalmente mediantebombardeo con microproyectiles con las ventajasque presenta este tipo de transformación.

Alfalfa

La alfalfa (Medicago sativa) es una plantaperteneciente a la familia de las leguminosas, queposee un enorme rendimiento de biomasa debidoa que es perenne. Esto significa que la plantapuede ser segada sin que muera, pudiendorealizarse hasta nueve siegas por año, tras lascuales la planta vuelve a crecer produciendo hojasexactamente iguales a las que se segaron.Además, se puede propagar de maneravegetativa, lo que permite la obtención de“clones” idénticos, sin necesidad de que existafloración o formación de semillas. Es además unaplanta capaz de fijar el nitrógeno atmosférico, demodo que permite reducir los aportes de nitrógenoen forma de abonos.

La alfalfa se emplea para alimentación animal, locual tiene la ventaja de que podría utilizarse parala expresión de vacunas comestibles paraanimales, pero tiene el inconveniente de quepuede pasar a la cadena alimentaria. Otroinconveniente que presenta esta planta es quecontiene grandes cantidades de ácido oxálico.

Existe una compañía canadiense llamada

Medicago, que ha aislado nuevos promotores que

permiten acumular niveles elevados de proteínas

en las hojas de alfalfa.

Otras especies

Existen otras especies de plantas de hoja que se

están usando para producir proteínas

recombinantes como por ejemplo la lechuga, la

soja y las espinacas. Estas plantas presentan la

ventaja frente a la alfalfa y el tabaco de ser

comestibles. Se están utilizando para la expresión

de antígenos para elaborar vacunas comestibles.

En el caso de la lechuga se han realizado ensayos

clínicos para una vacuna contra el virus de la

hepatitis B73 y el caso de las espinacas se ha

expresado un antígeno del antrax74.

La soja al igual que la alfalfa pertenece a la familia

de las leguminosas y puede fijar nitrógeno de la

atmósfera. Se ha utilizado para producir la fitasa

de un hongo llamado Aspergillus.

3.2. Semillas de cerealesy leguminosas

En este tipo de cultivos se incluyen plantas en las

que la acumulación de la proteína recombinante

se realiza en las semillas como es el caso de las

leguminosas de grano y los cereales. Estos

cultivos se caracterizan por producir semillas que

presentan un elevado contenido de proteínas, que

pueden secarse fácilmente y almacenarse a

temperatura ambiente sin pérdida de propiedades

durante muchos meses, debido a que presentan

un ambiente protector frente a la degradación

proteica. La utilización de promotores específicos

de semillas hace que la producción en este tipo de

cultivos pueda llegar a ser muy elevada.

Los cereales en los que se ha investigado son

arroz, trigo y maíz, y entre las leguminosas

destacan el guisante y la soja.

37


73 Kapusta, J.; Modelska, A.; Figlerowicz, M.; Pniewski, T.; Letellier, M.; Lisowa, O.; Yusibov, V.; Koprowski, H.;Plucienniczak, A.; Legocki, A. B. (1999). A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. The FASEB Journal, 13,1796-1799.

74 Sussman, H. E. (2003). Spinach makes a safer anthrax vaccine. Drug Discovery Today, 8, 428-430.

Desde el punto de vista económico la soja y el

maíz son los cultivos más eficientes para la

producción de proteínas recombinantes.

El maíz es el cereal elegido por Prodigene Inc

para la producción de proteínas. Las ventajas que

presenta este cereal son el elevado rendimiento

en biomasa y la existencia de infraestructuras y

maquinaria para su recolección y transformación.

3.3. Frutas, tubérculosy hortalizas75

En este grupo se incluyen plantas en las que la

acumulación de la proteína recombinante se hace

en órganos comestibles de la planta, que pueden

consumirse crudos o con un procesado mínimo,

como es el caso de las frutas, tubérculos y

hortalizas. El interés de expresar proteínas

recombinantes en órganos comestibles es la

obtención de productos que puedan administrarse

por vía oral sin necesidad de purificación, lo que

les hace especialmente útiles para la obtención de

vacunas de subunidades, aditivos y proteínas

utilizadas en inmunoterapia pasiva tópica.

Tubérculos

Los principales tubérculos en los que se pueden

expresar proteínas recombinantes son patatas y

zanahorias.

La patata es una planta muy útil para expresar

proteínas recombinantes, ya que es fácil de

transformar y existen promotores específicos que

permiten expresar las proteínas en el tubérculo.

Además se puede propagar de manera clonal

mediante la siembra de tubérculos sin que exista

floración ni formación de semillas, previniendo el

riesgo de contaminación cruzada.

La principal desventaja que presenta la patata es

que aunque los tubérculos pueden consumirse

crudos, son poco palatables, por lo que sería

necesario cocinarlos ligeramente lo que puede

llevar a una pérdida de proteínas por

desnaturalización.

Se han realizado al menos tres estudios clínicos

hasta el momento en los que se han administrado

patatas transgénicas que expresan proteínas de

interés biosanitario a personas.

Hortalizas

La hortaliza más utilizada para expresar proteínas

recombinantes es el tomate. Al igual que ocurre

con la patata, existen sistemas de expresión de

proteínas recombinantes muy eficientes y se

dispone de promotores específicos para la

expresión en el fruto. Otras ventajas son la

posibilidad de consumo en crudo y la posibilidad

de expresar varios antígenos en una misma planta

mediante cruzamiento.

Entre los inconvenientes principales se encuentra

el bajo contenido en proteínas que presenta el

fruto. Además algunos frutos pueden contener

elevadas cantidades de ácidos, que son

incompatibles con muchos antígenos y pueden

hacer que los frutos no sean adecuados para su

administración a niños de corta edad. Otro

inconveniente es la ausencia de un sistema

in vitro para evaluar la expresión de la proteína

recombinante en el fruto.

Frutas

Existe un gran interés en expresar proteínas

recombinantes en bananas, debido a que el

banano es un árbol muy cultivado en países en

38

75 Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic andtherapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329.

desarrollo. Este árbol puede ser propagado demanera clonal y una vez que ha alcanzado lamadurez produce frutos de manera abundante conciclos de 10 a 12 meses. Estos frutos pueden serconsumidos tanto por adultos como por niños.

Este cultivo presenta algunos inconvenientes yaque no existen sistemas de transformacióneficientes y se dispone de pocos datos sobreexpresión génica, especialmente en lo referente apromotores específicos del fruto. Además requiereespacios muy grandes que resultan muy caros sies necesario cultivar en invernadero.

3.4. Oleaginosas y fibra

En este apartado se incluyen especies que secaracterizan por producir semillas con un elevadocontenido en aceites como soja o cánola y otrasque además producen fibras como es el caso delalgodón y el lino. Este tipo de plantas es muyinteresante para su utilización en ingenieríametabólica de lípidos, ya que de manera naturalcontienen rutas de síntesis de compuestoslipídicos y producen éstos en cantidades elevadas.Además, como se ha indicado existen estrategiasde purificación que se basan en el anclaje de laproteína recombinante a cuerpos lipídicos queconviene utilizar en plantas que produzcansemillas con alto contenido en aceites.

Las especies productoras de fibras como el linotienen interés en ingeniería metabólica para laproducción de materiales formados porcombinación de fibras y bioplásticos76.

39


76 Wróbel, M.; Zebrowski, J.; Szopa, J. (2004). Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. Journal of Biotechnology,107, 41-54.

40

Plantas de hoja

Semillas de cereales y leguminosas

Frutas, tubérculos y hortalizas

Fibra y oleaginosas

Ven

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Ven

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– Elevado rendimiento de biomasa.

– Gran potencial para el escalado.

– Existencia de infraestructura para su procesamiento.

– Se puede cosechar antes de la floración previniendo la liberación de polen y los riesgos decontaminación cruzada que esto implica.

– Elevado contenido en agua que hace las proteínas inestables.

– Necesidad de congelado o desecación inmediatos de las hojas para evitar la degradación.

– La acumulación de proteínas recombinantes en las hojas podría interferir en el desarrollo de la planta.

– Riesgos ambientales por un posible consumo de las hojas por animales herbívoros o insectos.

– Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso atemperatura ambiente.

– No contienen los compuestos fenólicos que presentan las hojas de tabaco.

– La exposición a herbívoros es menor que en plantas de hoja.

– Son órganos que pueden consumirse crudos o semicocinados, permitiendo la producción devacunas de subunidades, nutracéuticos y anticuerpos para aplicaciones orales.

– Los tubérculos pueden almacenarse a temperatura ambiente.

– No presentan compuestos tóxicos.

– Purificación más económica que en semillas.

– Muchas necesitan cultivarse en invernadero, lo que aumenta el coste.

– Muy útiles para la purificación mediante fusión a oleosinas.

– Existencia de infraestructura para su procesamiento.

– Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso atemperatura ambiente.

– La fibra y el aceite pueden interferir en el procesado por lo que se aplica para proteínas que nonecesitan estar muy purificadas.

– Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas.

– Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas.

– La purificación es más compleja que en hojas y tiene un coste mayor.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS CULTIVOS UTILIZADOSEN AGRICULTURA MOLECULAR

Tabla 4. Ventajas e inconvenientes de los distintos cultivos utilizados en agricultura molecular.

El número de moléculas que potencialmente se pueden obtener utilizando plantas modificadasgenéticamente como biofactorías es muy elevado. Como se ha indicado se pueden diferenciar a grandesrasgos dos tipos de biofactorías. Por una parte, aquellas en las que la modificación genética conduce a laexpresión de una proteína foránea, que es la molécula de interés; y aquellas en las que la modificacióngenética conduce a la modificación del metabolismo de la planta, como resultado de la cual se sintetiza uncompuesto que es la molécula de interés.

41


Interésbiosanitario

Interésindustrial

Introducción denuevas rutasenzimáticas

Modificación derutas enzimáticas

existentes

Vacunas Anticuerpos Biofármacos

4. Moléculas de interés

Proteínasrecombinantes

MOLÉCULAS DE INTERÉS

Ingeniería metabólica

4.1. Proteínas recombinantes

Las proteínas son moléculas complejas formadaspor pequeñas subunidades denominadasaminoácidos, cuya secuencia se encuentracodificada en los genes. En muchos casos, paraque la proteína sea funcional, es necesario queocurra una serie de modificacionespostraduccionales. Éstas pueden ser relativamentesencillas como el establecimiento de puentesdisulfuro y puentes de hidrógeno entre distintosaminoácidos que conducen a la adquisición de unaestructura tridimensional adecuada. Otro tipo demodificaciones más complejas incluye lamodificación de aminoácidos concretos y la adiciónde determinados grupos como fosfatos(fosforilación) o hidratos de carbono(glicosilación), procesos proteolíticos y otrosprocesos no enzimáticos. Estas modificacionesmás complejas en muchas ocasiones ocurren endeterminados orgánulos subcelulares y no soncomunes en todos los organismos.

Esta complejidad estructural hace que la obtenciónde proteínas mediante síntesis química seaprácticamente imposible, excepto para pequeñascadenas peptídicas, de modo que sea necesarioutilizar sistemas vivos.

4.1.1. Proteínas de interésbiosanitario

Las plantas presentan un gran potencial para laobtención de moléculas para uso terapéuticodebido a sus ventajas en cuanto a seguridad,capacidad de producción y coste. Las principalesproteínas de interés biosanitario que puedenobtenerse mediante la modificación genética deplantas son antígenos para elaborar vacunas,anticuerpos y fragmentos de anticuerpos,proteínas estructurales y otro tipo de biofármacos.En la tabla 5 se incluyen las proteínas de interéssanitario que se están expresando actualmente enplantas.

42

Proteínas de Interés Biosanitario

Vacunas

Anticuerpos

Biofármacos

Contra enfermedades infecciosas.

Contra tumores.

Contra enfermedades autoinmunes.

Inmunoglobulina G.

Inmunoglobulina A secretora.

Fragmentos de anticuerpos.

Productos sanguíneos humanos.

Hormonas.

Reguladores del crecimiento.

Enzimas para uso terapéutico.

Antitumorales.

Antivirales.

Analgésicos opiáceos.

Colágeno y gelatina.Proteínas estructurales

PROTEÍNAS DE INTERÉS BIOSANITARIO EXPRESADAS EN PLANTAS

Tabla 5. Proteínas de interés biosanitario expresadas en plantas.

4.1.1.1. Vacunas77

Una vacuna consiste en una preparación de unorganismo patógeno completo (atenuado omuerto), o de alguno de sus componentes, que sedenominan antígenos, que administrado sea capazde inducir una respuesta inmune duradera yprotectora contra este patógeno. En el caso deque se administre el organismo completo muerto,se trata de vacunas inactivadas, y si está vivopero atenuado, se habla de vacunas atenuadas.En el caso de las vacunas elaboradas a partir decomponentes del patógeno que dan lugar a unarespuesta inmune en lugar del patógeno completo,se habla de vacunas de subunidades.

Mediante la tecnología del ADN recombinante esposible identificar y aislar los genes del organismopatógeno que codifican para proteínas capaces deinducir la respuesta inmune (antígenos). Estosgenes pueden introducirse en plantas y fabricaruna biofactoría capaz de producir grandes

cantidades del antígeno que servirán para elaborarla vacuna contra ese patógeno.

El antígeno producido en la planta puedepurificarse para su administración por víaparenteral, tal y como se hace en otros sistemasde expresión, o puede realizarse la expresión enplantas o en tejidos comestibles que puedanconsumirse crudos o con un procesado mínimo,evitando la etapa de purificación. En este últimocaso se habla de vacunas comestibles.

Además de las ventajas generales de la expresiónde proteínas en plantas, la expresión de proteínaso péptidos antigénicos en plantas comestiblespresenta ventajas adicionales relacionadas con lafacilidad de administración y almacenamiento ycon la eliminación de la fase de purificación, quesuponen una reducción en el coste. A continuaciónse incluye un cuadro con las principales ventajasde la expresión de antígenos en plantas para laelaboración de vacunas comestibles78.

77 Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production intransgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808.

78 Streatfield, S. J., Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

Todas estas características hacen que este tipo de

vacunas sea muy interesante para su aplicación a

gran escala, por ejemplo para realizar

vacunaciones en zonas subdesarrolladas o para

vacunaciones masivas en caso de epidemias o

riesgo de ataques terroristas.

Los principales retos técnicos de la expresión de

antígenos en plantas para elaborar vacunas

comestibles se refieren a la concentración de

antígeno. En primer lugar, es necesario conseguir

una concentración elevada del antígeno, con el fin

de reducir la cantidad de tejido vegetal que debe

ingerirse para obtener una dosis efectiva. Por otra

parte, debe conseguirse una concentración

homogénea para que se pueda ajustar la dosis de

manera adecuada.

La administración por vía oral supone que la

proteína debe ser resistente a los jugos gástricos

e intestinales, lo cual puede conseguirse mediante

la expresión de las proteínas en semillas, donde

existe una matriz de polímeros de hidratos de

carbono que la protegen.

Por último, la producción de vacunas en plantas

comestibles presenta el riesgo de que éstas pasen

a la cadena alimentaria con las implicaciones que

esto tendría para la salud de las personas. La

ingestión accidental de este tipo de plantas podría

dar lugar a la inducción de tolerancia oral, que

consiste en la inhibición de la respuesta inmune

del organismo frente a determinados antígenos

presentados por vía oral, como consecuencia de

una exposición repetida a los mismos. Para evitar

estos riesgos es necesario realizar un control muy

estricto de los cultivos y las plantas una vez

cosechadas.

A continuación se incluyen varias tablas en las que

se recogen los antígenos que se han expresado en

plantas para la elaboración de vacunas contra

enfermedades infecciosas. Las tablas 6 y 7

contienen información sobre plantas transgénicas

que expresan antígenos para elaborar vacunas

contra enfermedades humanas y animales. Las

tablas 8 y 9 se refieren a expresión mediante

vectores virales de antígenos para elaborar vacunas

contra enfermedades humanas y animales.

43


VENTAJAS DE LAS VACUNAS COMESTIBLES

• Permiten una administración en una forma segura y palatable, tal y como se hace con un alimento ocon un pienso en el caso de los animales.

• Al evitar el uso de jeringuillas y agujas se reducen los costes de material y personal asociados, asícomo los riesgos relacionados con este tipo de administración.

• Su expresión en órganos que se puedan almacenar a temperatura ambiente (semillas de cereales otubérculos) permitiría eliminar los costes que conlleva la cadena del frío.

• Es posible expresar más de un antígeno por planta pudiendo administrarse varias vacunas de formasimultánea.

• En el caso de los animales, al evitarse las inyecciones se previenen posibles pérdidas de calidad enlas canales de animales de abasto.

• Posibilidad de inmunización de animales silvestres reservorio de enfermedades como la rabia(murciélagos y ratas).

44

Enfermedades humanas

Nivel de expresión

Proteínasoluble total (%)

Peso fresco(g)

Agentepatógeno

Antígeno Planta Órgano

E. colienterotoxigénica79

(*)

E. colienteropatógena

Vibrio cholerae

Hepatitis B

Virus Norwalk

Sarampión

Citomegalovirushumano

Virus respiratoriosincitial

Bacillus anthracis

Clostridium tetani

VIH80

Rotavirus81

Subunidad B de latoxina termolábil

Subunidad Aestructural del BFP

Subunidad B de latoxina colérica

Antígeno desuperficie

Proteína media

Proteínade la cápsida

Hemaglutinina

Glicoproteína B

Proteína de fusión

Antígeno protector

Fragmento TetC dela toxina colérica

Péptido de la regiónV3 de la proteína

gp120 fusionada conla subunidad B de la

toxina colérica

VP7

Tabaco

Patata

Maíz

Tabaco

Patata

Tabaco

Tomate

Tabaco

Patata

Patata

Lechuga

Patata

Tabaco

Patata

Tabaco

Tabaco

Tomate

Tabaco

Tabaco

Patata

Patata

Hojas

Cloroplastos

Tubérculo

Semillas

Hojas

Tubérculo

Hojas

Hojas y frutos

Hojas

Tubérculo

Tubérculo

Hojas

Tubérculo

Hojas

Tubérculo

Hojas

Semillas

Fruto

Hojas

Cloroplastos

Tubérculos

Hojas

0,001

2,5

0,2

10

8

0,3

4

0,04

0,07

0,002

0,006

—

0,001

0,2

0,4

—

0,1

—

—

25

0,0041

38,4

0,0002

—

0,001

0,1

1

0,002

0,5

0,005

0,0008

—

0,00004

0,0000006

0,000009

0,03

0,003

—

0,00007

0,003

—

—

—

—

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADESHUMANAS EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS

Tabla 6. Antígenos de enfermedades humanas expresados en plantas transgénicas82.(*) Enfermedad humana y animal.

79 Tregoning, J.; Maliga, P.; Dougan, G.; Nixon, P. J. (2004). New advances in the production of edible plant vaccines:chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC. Phytochemistry, 65, 989-994.

80 Kim, T-G.; Gruber, A.; Langridge, W. H. R. (2004). HIV-1 gp120 V3 cholera toxin B subunit fusion gene expression intransgenic potato. Protein Expression and Purification, 37, 196-202.

81 Wu, Y-Z.; Li, J-T.; Mou, Z-R.; Fei, L.; Ni, B.; Geng, M.; Jia, Z-C.; Zhou, W.; Zou, L-Y.; Yan Tang, Y. (2003). Oral immunization withrotavirus VP7 expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizing IgA. Virology, 313, 337-342.

82 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

45


Enfermedades animales

Nivel de expresión


Peso fresco(g)

Agentepatógeno

Antígeno Planta Órgano

Virus de la rabia(*) Glicoproteína Tomate Hojas yfrutos 1 0,1

Fiebre aftosa

Proteína estructuralVP1

Arabidopsis Hojas — —

Alfalfa Hojas — —

Patata Hojas 0,01 0,001

Péptido de la proteínaestructural VP1

fusionadoa β-glucuronidasa

Alfalfa Hojas 0,004 0,0005

Virus de lagastroenteritis

transmisible porcinaGlicoproteína S

Arabidopsis Hojas 0,06 0,008

Patata Tubérculo 0,07 0,0005

Tabaco Hojas 0,2 0,03

Maíz Semillas 2 0,02

Patata Tubérculo 0,002 0,00001

Pasteurelosisneumónica bovina

Leucotoxina fusionadaa una proteínafluorescente

Trébolblanco Hojas 0,5 0,0009

Enfermedadhemorrágica de los

conejos

Proteína estructuralVP60 Patata Hojas 0,3 0,04

Parvovirus canino83

Péptido de la proteínade la cápsida VP2

fusionado aβ—glucuronidasa

Arabidopsis Hojas 0,1 0,0003

Péptido 2L21 fusionadocon la subunidad B de

la toxina coléricaTabaco Hojas 31 7,49 mg/g

Virus de la diarreaepidémica porcina84 Epítopo neutralizador Tabaco — — —

Virus de la bronquitisinfecciosa aviar85 Proteína S de IBV Patata Tubérculo — —

Peste bovina86, 87 HemaglutininaCacahuete Hojas — —

Tabaco — 0,75 —

Rotavirus grupo Abovino

Proteína VP6 de lacápsida

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADESANIMALES EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS

Tabla 7. Antígenos de enfermedades animales expresados en plantas transgénicas88.(*) Enfermedad humana y animal.

83 Molina, A.; Hervás-Stubbs, S.; Daniell, H.; Mingo-Castel, A. M.; Veramendi, J. (2004). High-yield expression of a viralpeptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts. Plant Biotechnology Journal, 2, 141-153.

84 Bae, J-L.; Lee, J-G.; Kang, T-J.; Jang, H-S.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2003). Induction of antigen-specific systemic andmucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen. Vaccine, 21, 4052–4058.

85 Ji-Yong Zhou, Li-Qin Cheng, Xiao-Juan Zheng, Jian-Xiang Wu, Shao-Bin Shang, Jin-Yong Wang and Ji-Gang Chen (2004).Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of infectious bronchitis virus. Journal ofBiotechnology, 111, 121-130.

86 Khandelwal, A.; Renukaradhya, G. J.; Rajasekhar, M.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2004). Systemic and oral immunogenicity ofhemagglutinin protein of rinderpest virus expressed by transgenic peanut plants in a mouse model. Virology, 323, 284-291.

87 Khandelwa,l A.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2003). Expression of hemagglutinin protein of rinderpest virus in transgenictobacco and immunogenicity of plant-derived protein in a mouse model. Virology, 308,207-215.


46

Enfermedades humanas

Nivel de expresión


Peso fresco(g)

Agentepatógeno

Antígeno Virus** Planta

E. colienterotoxigénica89

Subunidad B de latoxina termolábil TMV Tabaco 0,75 -

Hepatitis C

Región hipervariablede la proteína 2 de lacubierta fusionada a la

sub B de la toxinacolérica

TMV Hojas detabaco 0,04 0,005

Rotavirus Proteína VP6 PVX Hojas detabaco — 0,005

VIH tipo 1

Péptido de la proteínagp41 CMV Hojas

de caupí — —

Péptido de la regiónV3 de la proteína

gp120AMV Hojas de

tabaco — —

Péptido de la región V3de la proteína gp120 TBSV Hojas de

tabaco — 0,03

Péptido de la proteínatransmembrana gp41

CMV Hojas decaupí — 0,002

PVX Hojas detabaco — —

Nucleocápsidaproteína p24 TBSV Hojas de

tabaco 0,4 0,05

Rinovirus tipo 14

Proteína p2490 TMV Hojas detabaco

2,5 mg/25 g dehojas —

Péptido de la proteínaVP1 CMV Hojas de

caupí — —

Pseudomonasaeruginosa

Péptido de laproteína F

Staphylococcus aureusPéptido D2 de la

proteína de unión afibronectina FnBP

TMV

TMV

Hojas detabaco

Hojas detabaco

—

—

—

0,003

Virus respiratoriosincitial

Péptidos de la proteínaG AMV Hojas de

tabaco — 0,006

PVX Hojas detabaco — 0,0003


Plasmodiumfalciparum

Péptidos de la proteínadel Circumsporozoito

PVX Hojas detabaco — 0,0004Virus del papiloma

humano tipo 16 Oncoproteína E7

TMV Hojas detabaco — 0,003Linfoma de la célula B Fragmento Fv de la

inmunoglobulina


ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADESHUMANAS EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES

Tabla 8. Antígenos de enfermedades humanas expresados mediante vectores virales91.

89 Wagner, B.; Hufnagl, K.; Radauer, C.; Wagner, S.; Baier, K.; Scheiner, O.; Wiedermann, U.; Breiteneder, H. (2004). Expressionof the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in tobacco mosaic virus-infected Nicotiana benthamiana plantsand its characterization as mucosal immunogen and adjuvant. Journal of Immunological Methods, 287, 203-215.

90 Perez-Filgueira, D. M.; Brayfield, B. P.; Phiri, S.; Borca, M. V.; Wood, C.; Morris, T. J. (2004). Preserved antigenicity ofHIV-1 p24 produced and purified in high yields from plants inoculated with a tobacco mosaic virus (TMV)-derived vector.Journal of Virological Methods, 121, 201-208.


47


Enfermedades animales

Nivel de expresión


Peso fresco(g)

Agentepatógeno

Antígeno Virus** Planta

Virus de la rabia(*)Péptidos de laglicoproteína ynucleoproteína

TMV yAMV

Hojas detabaco yespinaca

- 0,0005

Fiebre aftosa

Proteína estructuralVP1 TMV Hojas de

tabaco - 0,02

Péptido de laproteína estructural

VP1CMV Hojas de

caupí - -

Virus de la enteritisdel visón (visones,

gatos y perros)

Péptido de laproteína de lacápsida VP2

CMV Hojas decaupí - 0,002

Enfermedadhemorrágica de los

conejos

Proteína estructuralVP60 PPP Hojas de

tabaco - -

Virus de la hepatitisdel ratón

Péptido de laglicoproteína S TMV Hojas de

tabaco - -

Parvovirus canino(perros)

Péptido de laproteína de lacápsida VP2

PPP Hojas detabaco - -

CMV Hojas decaupí - 0,002

Herpesvirus bovinotipo I92 Glicoproteína D TMV Hojas de

tabaco - -

Virus de la diarreaepidémica porcina93

Epítoponeutralizador TMV Hojas de

tabaco 5 -

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADESANIMALES EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES

Tabla 9. Antígenos de enfermedades animales expresados mediante vectores virales94.(*) Enfermedad humana y animal.**

AMV: Virus del mosaico de la alfalfa.CMV: Virus del mosaico del caupí.PPP: Potyvirus de la viruela del ciruelo.PVX: Virus X de la patata.TBSV: Virus del enanismo ramificado del tomate.TMV: Virus del mosaico del tabaco.

92 Pérez-Filgueira, D.M.; Zamorano, P.I.; Domınguez, M.G.; Taboga, O.A.; del Médico Zajac, M.P.; Puntel, M.; Romera, S.A.;Morris, T.J.; Borca, M.V.; Sadir, A.M.; (2003). Bovine Herpes Virus gD protein produced in plants using a recombinant tobaccomosaic virus (TMV) vector possesses authentic antigenicity. Vaccine, 21, 4201–4209.

93 Kang, T-J.; Kang, K-H.; Kim, J-A.; Kwon, T-H.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2004). High-level expression of the neutralizingepitope of porcine epidemic diarrhea virus by a tobacco mosaic virus-based vector. Protein Expression and Purification, 38,129–135.


Además de la expresión de antígenos para la elaboración de vacunas contra patógenos bacterianos y virales,es posible expresar antígenos para elaborar vacunas contra otro tipo de afecciones como enfermedadesautoinmunes y contra tumores humanos95.

48

VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES AUTOINMUNES

Las enfermedades autoinmunes son aquellas en las que el sistema inmune reconoce como extrañasalgunas estructuras propias y reacciona contra ellas produciendo lo que se conoce comoautoanticuerpos. Algunos ejemplos son la artritis, la esclerosis múltiple, la miastenia gravis o ladiabetes tipo I.

Como se ha indicado, la administración por vía oral de antígenos puede dar lugar a fenómenos detolerancia. En el caso de las enfermedades autoinmunes, el fenómeno de tolerancia oral provocadopor la administración de autoantígenos por vía oral podría conducir a una disminución de la respuestainmune alterada, lo cual podría mejorar los síntomas.

Existen trabajos pioneros en la producción de autoantígenos en plantas, principalmente contra ladiabetes tipo I, como la expresión de la enzima ácido glutámico decarboxilasa (GAD, en sus siglas eninglés) y la IL-4, que se expresan mediante fusión con la subunidad B de la toxina colérica96.

También se ha producido la expresión en plantas de alérgenos, que podrían aplicarse para eldesarrollo de vacunas para el tratamiento de las alergias tipo I, mediante la inducción de toleranciapor vía oral. Algunos ejemplos son la expresión mediante un vector viral de alérgenos del abedul (laproteína Bet v 1), del látex (las proteínas Hev b 3 y Hev b 1), y de la manzana (la proteína Mal d 2),en N.benthamiana97.

VACUNAS ANTITUMORALES

En la superficie de algunos tumores, como melanoma y cáncer de mama, aparecen determinadasproteínas denominadas antígenos tumorales contra los que algunas personas pueden desarrollaranticuerpos. En la actualidad se está investigando sobre la posibilidad de usar estos antígenos para laelaboración de vacunas y sobre su producción mediante distintos sistemas. Un ejemplo de unantígeno de este tipo es el antígeno GA733-2, producido en plantas de tabaco mediante la utilizacióndel virus del mosaico del tabaco como vector viral98.

95 Sala, F.; Rigano, M.M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A.M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenicplants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808.

96 Ma, S.; Huang, Y.; Yin, Z.; Menassa, R.; Brandle, J. E.; Jevnikar, A. M. (2004). Induction of oral tolerance to prevent diabeteswith transgenic plants requires glutamic acid decarboxylase (GAD) and IL-4, human GAD65. PNAS, 101, 5680-5685.

97 Wagner, B.; Fuchs, H.; Adhami, F.; Ma, Y.; Scheiner, O.; Breiteneder, H. (2004). Plant virus expression systems for transientproduction of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana. Methods, 32, 227-234.

98 Verch, T,, Hooper, D. C.; Kiyatkin, A.; Steplewski, Z.; Koprowski, H. (2004). Immunization with a plant-produced colorectalcancer antigen. Cancer Immunology, Immunotherapy, 53, 92-99.

4.1.1.2. Anticuerpos99

Los anticuerpos son glicoproteínas producidas porel sistema inmune de los vertebrados superiores,capaces de reconocer y unir antígenos diana demanera altamente específica. Esta capacidad dereconocer y unir de manera específica distintasmoléculas hace que los anticuerpos puedanutilizarse para gran cantidad de aplicaciones queincluyen el diagnóstico, tratamiento y prevenciónde distintas enfermedades infecciosas,autoinmunes y otro tipo de trastornos100.

Son moléculas complejas formadas por distintascadenas polipeptídicas que se encuentranplegadas y ensambladas. Es fundamental que elplegamiento y ensamblaje sean correctos, ya quede lo contrario el reconocimiento del antígeno nose producirá de manera adecuada. La estructuratípica de un anticuerpo es la de lasinmunoglobulinas (Igs) séricas. Consisten entetrámeros formados por dos cadenas pesadas

idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, unidasmediante puentes disulfuro. Cada tipo de cadenapresenta una serie de dominios constantes y otrosdominios variables, que son los responsables delreconocimiento y unión del antígeno. Las cadenaspesadas presentan cuatro dominios, dos de loscuales forman una bisagra denominada región Fc,que permite que el anticuerpo adopte unaestructura típica en forma de Y. En la región Fc seencuentra un residuo de asparagina conservadoque es el lugar en el que se produce laglicosilación.

Además de este tipo de Igs existen otrasmoléculas derivadas con capacidad de unir elantígeno. Dentro de estas moléculas derivadas seincluyen moléculas de menor tamaño (fragmentosde anticuerpos), así como otras de mayor tamañocomo la IgA secretora que es un dímero de las Igstípicas. En la figura 9 se incluyen algunos tipos deanticuerpos y fragmentos de anticuerposexpresados en plantas.

49


99 Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health.Vaccine 21, 820–825.


50

Fragmentos de anticuerpode tipo camélidoIgG

Fragmento Fab’

scFv

scFv unido alpéptido líder

scFv unido a lospéptidos líder y KDEL

IgA. Dímero de IgG unidas por los extremosconstantes mediante dos cadenas polipeptídicasdenominadas componente secretor y cadena J.

Fragmentos de anticuerpos tipo camélido. Igscaracterísticas de los camélidos, formadasexclusivamente por dos cadenas pesadas quecarecen de uno de los dominios.

Fragmentos Fab y F(ab’). Extremos N terminal de lasdos cadenas pesadas y de las dos cadenas ligeras.

Minibodis y diabodis. Dímeros que se forman de manera espontánea.

Fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv). Contienenregiones variables de las cadenas ligera y pesadaunidas por una cadena peptídica flexible. Existentambién scFv biespecíficos y de fusión con proteínascomo enzimas o toxinas.

Región constante dela cadena pesada

Región variable dela cadena pesada

Región constante dela cadena ligera

Región variable dela cadena ligera

Bisagra

Puente disulfuro

Cadena J

Componentesecretor

Punto deglicosilación

Proteína defusión

Péptido líder

Péptido KDEL

IgA

scFv biespecífico scFv de fusión scAbs

Dominiovariablesencillo

Fragmento Fab Minibody Diabody

Cadena larga sencilla

Figura 9. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos producidos en plantas.

Los fragmentos de anticuerpos en ocasiones sonmás efectivos como fármacos que los anticuerposcompletos, ya que penetran mejor en los tejidosque los anticuerpos completos y se eliminan de lostejidos de manera más rápida.

Las cadenas ligeras, pesadas y el componentesecretor y la cadena de ensamblaje de losanticuerpos secretores están codificadas pordistintos genes, de modo que para conseguir queuna planta exprese este tipo de moléculas esnecesario introducir todos los genes en la plantaque se desea usar como biofactoría. Existen dosestrategias para conseguirlo. La primera consisteen introducir los genes que codifican para lascadenas en distintas plantas y luego realizarcruzamientos entre las plantas, seleccionandoaquellas que posean todos los transgenes que sedesea. Otra estrategia es utilizar métodos quepermitan introducir todos los transgenesnecesarios, como por ejemplo la coinfección de laplanta con distintos vectores virales. La síntesis deeste tipo de inmunoglobulinas mediante células demamíferos requiere de dos tipos celularesdistintos.

La acumulación de anticuerpos en el citosol de lacélula no es posible, debido a que en esteambiente no se produce un ensamblado correcto o

completo de las cadenas ligeras y pesadas queforman el anticuerpo, lo que lleva a sudegradación. Tan solo se ha conseguido unaacumulación de anticuerpos recombinantes en elcitosol en el caso de cadenas polipeptídicassencillas o scFvs. Para que se produzca un plegadoy ensamblaje correcto de las cadenaspolipeptídicas es necesario dirigirlas hacia elretículo endoplásmico tal y como se ha indicadoen el apartado de tecnologías, mediante la adiciónde secuencias diseñadas a este efecto en elextremo amino terminal de la proteína.

La glicosilación es especialmente importante enlos anticuerpos y, como se ha indicado en elapartado de tecnologías, el direccionamiento haciael retículo endoplásmico permite que se realiceuna glicosilación adecuada.

Se han utilizado distintas plantas para expresaranticuerpos y se han llevado a cabo numerosascomparaciones para determinar los parámetrosóptimos para la expresión. Existen varios tipos deanticuerpos recombinantes producidos en plantasque han pasado la fase preclínica de ensayos y seencuentran en fases de ensayo clínico, algunos enfase II101. A continuación se incluye una tabla con losanticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se hanobtenido utilizando plantas como biofactorías.

51



52

ÓrganoNivel de

expresiónmáximo

Aplicación Antígeno Nombre o tipode anticuerpo Planta

Tratamiento contrala caries dental

Antígenoestreptocócicosuperficial I/ II

Guy 13 (IgAS)Nicotiana tabacum Hojas

500 µg/g

IgG 1 1,1% en PST

Tratamiento delcáncer

Antígenocarcinoembriónico

(CEA)

scFvT84.66(scFv)

TrigoHojas 900 ng/g

Diagnóstico glóbulosrojos de donantes y

receptoresIgG anti-humano C5-1 (IgG) Alfalfa — 1% PST

Semillas 1,5 µg/g

T84.66 (IgG)

T84.66/GS8102

ArrozHojas

29,0 µg/g

Nicotiana tabacumagroinfiltrado con

Agrobacterium

27,0 µg/g

Hojas

Hojas

1,0 µg/g

—

Afecciones cardiacas,miastenia,

polimiosistis,enfermedad de

McArdle, miopatíasinflamatorias y

desórdenesmitocondriales,

distrofia muscular

Creatina kinasahumana

scFv Nicotiana tabacum Hojas 0,01% PST

MAK33 IgG1Nicotiana tabacum

Arabidopsis thaliana

Hojas

Hojas

0,044% PST

0,2-0,4% PST

MAK33 Fab Arabidopsis thaliana

N. tabacum

Arabidopsis thaliana

N. tabacum

Nicotianabenthamiana


Arabidopsisthaliana

Tabaco infectadocon el TMV*

— 6,53% PST

MAK33 scFv — 6-25 µg/mgPST

Fab— 1,3% PST

— 0,044% PST

— Sustancia P(neuropéptido) dAb Hojas 1% PST

Actividad antirrábica Virus de la rabiaAnticuerpomonoclonalmAb S057

Hojas 0,07% PST

Inmunización pasivade los animales Zealerona scFv — —

Vacunas inmuno-contraceptivas para

herbívorosEpítopo ZP3 ZP3 — —

Virus del herpessimplex 2 Proteína HSV-2 Anti-HSV-2

(IgG) Soja — —

Vacuna contrael linfoma

no-Hodgkins103

Tratamiento delcáncer de colon

—

Antígeno de superficie

scFv

CO17-1A (IgG)

Tabaco infectadocon el TMV


—

—

100 µg/ml enfluido

intersticial

—

Tratamiento dellinfoma de célula B Vacuna idiotípica 38C13 (scFv) Nicotiana

benthamiana

Guisante

Hojas

Semillas

Semillas

30,2 µg/g

9 µg/g

32 µg/g

ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS OBTENIDOS UTILIZANDOPLANTAS BIOFACTORÍA

Tabla 10. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos expresados en plantas104, 105, 106. *TMV: Virus del mosaico del tabaco.

102 Vaquero, C.; Sack, M. Schuster, F.; Finnern, R.; Drossard, J.; Schumann, D.; Reimann, A.; Fischer, R. (2002). A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco. FASEB J., 16, 408-410.

103 McCormic, A. A.; Reinl, S. J.; Cameron, T. I.; Vojdani, F.; Fronefield, M.; Levy, R.; Tusé, D. (2003). Individualized human scFvvaccines produced in plants: humoral anti-idiotype responses in vaccinated mice confirm relevance to the tumor Ig. Journal ofImmunological Methods, 278, 95-104.

(Ver notas 104, 105 y 106 en página siguiente)

4.1.1.3. Biofármacos

Además de anticuerpos y vacunas existen otras

proteínas con interés biosanitario que pueden

expresarse en plantas como productos

sanguíneos, hormonas, reguladores del

crecimiento y enzimas con potencial terapéutico

para tratar distintas enfermedades.

Según la Sociedad Española de Biotecnología en el

año 2000 el número de proteínas y péptidos

terapéuticos fabricados mediante técnicas de

ingeniería genética en el mercado eran

aproximadamente 50, con unas ventas anuales del

orden de decenas de miles de millones de dólares.

En la mayor parte de los casos no se trata de

fármacos nuevos, sino que son proteínas humanas,

que hasta la década de los 80 se obtenían en

muchos casos a partir de sangre de donantes o de

órganos humanos, o a partir de animales, con el

consiguiente riesgo de contaminación.

La utilización de la biotecnología permitió obtener

estos productos de forma más segura, a través del

cultivo en biorreactores de células de

microorganismos o de mamíferos modificados

genéticamente, pero aún así estos sistemas

presentan riesgos de contaminación con toxinas o

virus peligrosos para la salud de las personas y los

animales. Además, según algunas previsiones, se

estima que para 2010 este tipo de fármacos

ocupará un 35% del mercado farmacéutico. Este

aumento de la demanda posiblemente no pueda

ser cubierto por los actuales sistemas de

obtención.

Las plantas debido a sus características

de seguridad, capacidad de producción

y coste, podrían ser muy adecuadas para la

producción de este tipo de productos.

A continuación en la tabla 11 se indican las

proteínas de interés biosanitario que se han

expresado en plantas modificadas.

53


104 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming: production of antibodies,biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226.

105 Gomord, V.; Sourrouielle, C.; Fitchette, A-C.; Bardor, M.; Pagny, S.; Lerouge, P.; Faye, L. (2004). Production and glycosilationof plant-made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge. Plant Biotechnology Journal, 2, 83-100.

106 Schillberg, S.; Fischer, R.; Emans, N. (2003). “Molecular farming” of antibodies in plants. Naturwissenschaften, 90, 145-155.

54

PROTEÍNAS BIOFARMACÉUTICAS EXPRESADAS EN PLANTAS

Proteína Aplicación Planta Nivel de expresión

Proteína C humana

Hirudina humana

Somatotropina humana

Factor estimulante de las coloniasde granulocitos macrófagos

Factor de necrosis tumoral α

Eritropoyetina humana

Encefalinas humanas

Interferón α

Albúmina sérica humana

Hemoglobina α y β humanas

Lactoferrina humana

Tricosantina

Glucocerebrosidasa

Anticoagulante

Inhibidor de la trombina

Hormona de crecimiento

Tratamiento de la neutropenia

Tratamiento contra tumores yenfermedades infecciosas

Anemia

Analgésicos opiáceos

Tratamiento de la hepatitisC y B

Cirrosis hepática, quemaduras,cirugía

Sustituto sanguíneo

AntimicrobianoFortificación de fórmulas

infantiles

Terapia VIH

Enfermedad de Gaucher

Tabaco

Cánola

Tabaco

Cloroplastosde tabaco107,108

Tabaco

Patata109

Tabaco

Arabidopsis

Arroz, cánola

Tabaco

Tabaco

Patata

Nicotianabethamiana

Tabaco

<0,1%PST

0,3% proteínade la semilla

7% PST

8% PST

—

15 µg/g

<0,01% PST

0,1% de la proteínade la semilla

—

Interferón β Tabaco <0,01% PF

0,02% PST

Tabaco110 11% PST

0,05% PS

0,1% PST

Arroz111 0,5% arroz descascarillado

2% PST

1-10% PST

Lipasa gástrica de perro112 Insuficiencia pancreática ligadaa fibrosis quística Tabaco 0,5-1 mg PF

Enzima conversora de laangiotensina Hipertensión Tabaco,

tomate —

Aprotinina humana Inhibidor de la tripsina paracirugía de transplantes Maíz —

Antitripsina α-1 humanaFibrosis quística,

enfermedades hepáticas yhemorragias

Arroz —

Colágeno homotriméricohumano Colágeno Tabaco <0,01% PF

Factor de crecimientoepidérmico humano

Reparación de heridas ycontrol de proliferación celular Tabaco <0,01% PST

Tabla 11. Proteínas de interés biofarmacéutico expresadas en plantas113.


108 Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.;Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. NatureBiotechnology, 18, 333-338.

109 Ohya, K.; Itchoda, N.; Ohashi, K.; Onuma, M.; Sugimoto, C.; Matsumura, T. (2002). Expression of biologically active humantumor necrosis factor-alpha in transgenic potato plant. Journal of Interferon and Cytokine Research. 22, 371-378.

110 Fernández-San Millán, A.; Mingo-Castel, A.; Miller, M, Daniell, H. (2003). A chloroplast transgenic approach to hyper-express andpurify Human Serum Albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation. Plant Biotechnology Journal, 1, 71-79.

111 Nandi, S.; Suzuki, Y. A.; Huang, J.; Yalda, D.; Pham, P.; Wu, L.; Bartley, G.; Huang, N.; Lönnerdal, B. (2002). Expression ofhuman lactoferrin in transgenic rice grains for the application in infant formula. Plant Science, 163, 713-722.

112 Mokrzycki-Issartel, N, Bouchon, B.; Farrer, S.; Berland, P.; Laparra, H, Madelmont, J-C.; Theisen, M. (2003). A transient tobaccoexpression system coupled to MALDI-TOF-MS allows validation of the impact of differential targeting on structure and activity ofa recombinant therapeutic glycoprotein produced in plants. FEBS Letters, 552, 170-176.

113 Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals andedible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226.

4.1.2. Proteínas de interésindustrial

Existen distintas proteínas que pueden obtenerse mediante la utilización de plantas con aplicaciones en la industria. Eneste tipo de proteínas se incluyen enzimas deinterés industrial, péptidos capaces de formarpolímeros y otras proteínas que pueden utilizarsecomo suplementos para alimentación animal yhumana como por ejemplo las proteínas de laleche.

Las enzimas se utilizan en muchos procesos

industriales, siendo de gran importancia en

industrias como las del papel y la madera,

industria textil, industria química, elaboración de

detergentes y producción de alimentos y piensos

para animales114. En estas industrias las enzimas

se necesitan en cantidades elevadas, lo que hace

necesario que su coste sea bajo115.

En la tabla 12 se incluyen ejemplos de enzimas de

interés industrial producidas en plantas, así como

sus aplicaciones.

55


ENZIMAS DE INTERÉS INDUSTRIAL EXPRESADAS EN PLANTAS

Enzima Aplicación industrial Planta Cantidad

Lacasa

α-amilasa

Industria textil (decoloración defibras), clarificación de zumos y

“bioglue” para madera

Procesado del almidón,clarificación de vinos y zumos,

industria de detergentes

Maíz

Tabaco


Vicianarbonensis

10 g/kg grano

0,3% PST

5,0% PST

5 U/kg semillas

Glucanasa

Producción de etanol, industriatextil, de papel y pulpa y

producción de piensos paraanimales

Tabaco 0,3% PST

Cebada —

Arabidopsis 26% PST

XilanasaBioconversión de paredes

celulares, eliminación de ligninaresidual en producción de papel ymejora de la digestibilidad de las

plantas para piensos animales

Tabaco

4,1% PST

—

3-6%

Xilanasatermoestable

Colza

Guisante

Cloroplastosde tabaco

2 kU/kg semilla

8 kU/kg semilla

6% PST

FitasaElaboración de piensos para

animales. Liberación del fósforode los fitatos

Tabaco

Soja

14,4%

—

Quimosina Elaboración de quesoTabacoPatata

1-0,5%

Transglutaminasa116 Procesado de alimentos Arroz —

Tabla 12. Enzimas de interés industrial expresadas en plantas117.

114 Giddings, G. (2001). Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology, 12, 450–454.115 Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep.; 22,

711-720.116 Capell, T.; Claparols, I.; Del Duca, S.; Bassie, L.; Miro, B.; Rodriguez-Montesinos, J.; Christou, P.; Serafini-Fracassini, D.

(2004) Producing transglutaminases by molecular farming in plants. Amino Acids, 26, 419-423.117 Biesgen, C.; Hillebrand, H.; Herbers, K. (2002). Technical enzymes produced in transgenic plants. Phytochemistry

Reviews 1, 79–85.

Entre los polímeros basados en proteínas

recombinantes se encuentran la elastina, el

colágeno y las proteínas de la seda de la araña.

El colágeno es una proteína estructural muy utilizada

en las industrias cosmética, farmacéutica y médica,

para la elaboración de implantes, piel y cartílago

artificial, injertos de huesos, etc. Un producto

relacionado muy utilizado es la gelatina, que tiene

aplicaciones como estabilizante de vacunas y

fármacos, para elaborar cápsulas, etc. En la

actualidad su obtención es a partir de fuentes

animales lo cual lleva asociado riesgos de transmisión

de enfermedades y de rechazos en el caso de los

implantes debido a que pueden desencadenar una

respuesta inmune en las personas.

El colágeno está formado por tres cadenas que se

asocian formando una triple hélice. Mediante la

introducción de los genes de las cadenas que

forman la molécula se ha conseguido expresar en

plantas de tabaco las cadenas, que de manera

espontánea se ensamblan adquiriendo la

conformación en triple hélice de colágeno. En la

actualidad hay varias empresas interesadas en

llevar al mercado esta molécula118 (ProdiGene,Medicago, Meristem Therapeutics).

Otras proteínas con interés para la elaboración de

polímeros son las espidroinas, proteínas que forman

la seda de la tela de las arañas. La seda de la araña

se considera que es la fibra natural más fuerte que

existe, es insoluble en la mayor parte de los

disolventes, incluyendo ácidos y bases diluidas, y

resistente a gran cantidad de enzimas proteolíticas,

por lo que tiene un gran interés industrial. Su

obtención en cantidades elevadas a partir de arañas

no es posible, por lo que su producción mediante

plantas sería muy importante. De momento se han

conseguido expresar dos tipos de espidroinas en

tabaco y patata acumulando más del 2% de la

proteína soluble total, aunque no se ha logrado

formar fibras a partir de ellas.

4.2. Ingeniería metabólica

La ingeniería metabólica de plantas consiste en

la modificación de las rutas enzimáticas de la

planta con el fin de modificar el contenido de

determinados compuestos. Las modificaciones

que pueden realizarse incluyen el aumento del

contenido de productos deseables, la

disminución del contenido de productos

indeseables o la producción de nuevos

compuestos que la planta no sintetizaba

anteriormente. Para ello, puede actuarse sobre

las rutas existentes en la planta o introducir

rutas metabólicas completas que den lugar a la

producción de compuestos nuevos.

4.2.1. Modificación de rutasenzimáticas existentes119, 120

Aunque el término “ingeniería metabólica” da idea

de un conocimiento preciso de los sistemas que se

están modificando, esto no siempre es así. Las

plantas pueden producir una gran cantidad de

compuestos de cuyas rutas de síntesis se conoce

muy poco. Existe una regulación muy estricta para

conseguir que en la planta exista un equilibrio

entre los distintos compuestos y el conocimiento

de estos mecanismos de regulación es muy

limitado. Muchas de las rutas se encuentran

relacionadas de manera que los productos de unas

son los sustratos de otras y, en ocasiones, varias

rutas distintas conducen a la obtención del mismo

producto. En este caso, la actuación sobre una

ruta podría provocar que se active otra para

compensar el cambio. Por estos motivos en la

mayor parte de los casos las modificaciones se

hacen por “ensayo y error”.

Las estrategias que pueden usarse para modificar

el metabolismo de las plantas dependen del tipo

de modificación que se desee hacer.

56

118 Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805.

119 Capell, T.; Christou, P. (2004). Progress in plant metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology, 15,148–154.120 Trethewey, R. N. (2004). Metabolite profiling as an aid to metabolic engineering in plants. Current Opinion in Plant

Biology, 7, 196–201.

57


Estrategias para disminuir la cantidad deun compuesto no deseado.

• Bloqueo de la síntesis de una de las enzimasde la ruta enzimática. Puede hacersereduciendo el nivel de ARN mensajeromediante antisentidos, cosupresión otecnologías de interferencia de ARN.

• Bloqueo de algunas de las enzimas de laruta mediante expresión de anticuerposdirigidos contra ella.

• Diversificación del flujo hacia una rutacompetitiva.

• Incremento de la degradación delcompuesto que se desea eliminar.

Estrategias para aumentar la producciónde compuestos normalmente producidospor la planta. Es lo más frecuente.

• Transferencia de una ruta o parte de unaruta metabólica de otro organismo.

• Superación de pasos limitantes de la rutamediante el bloqueo de rutas competitivas ydisminución de la degradación delcompuesto de interés mediantemodificaciones de la expresión de uno ovarios genes.

• Modificación de la expresión de los genesreguladores que controlan los genes debiosíntesis de las distintas enzimas de la ruta.

La regulación de los flujos metabólicos no está

sólo limitada por la expresión de los genes de las

enzimas. Existen otros factores que influyen de

manera muy importante como son la regulación

de la actividad enzimática y la compartimentación

y transporte, tanto de las enzimas como de los

precursores para la síntesis de los productos

finales (puede ocurrir que se exprese una enzima

en un lugar de la célula en el que no tenga acceso

a los sustratos adecuados). Por este motivo, es

necesario un mayor conocimiento de las rutas de

síntesis de compuestos para poder realizarmodificaciones.

Pueden modificarse las rutas de síntesis decomponentes esenciales para la supervivencia dela célula vegetal (metabolismo primario) o lasrutas de síntesis de otros componentes que no sonimprescindibles para la supervivencia de la célula,pero sí para la supervivencia de la planta completa(metabolismo secundario).

Los componentes del metabolismo primario cuyamodificación mediante ingeniería genéticadespierta mayor interés son los hidratos decarbono y los lípidos debido a sus aplicacionesalimentarias e industriales.

Hidratos de carbono

El hidrato de carbono de reserva más abundanteen las plantas es el almidón y se encuentra endistintos órganos como semillas, frutas, tubérculosy raíces. Se utiliza en la industria alimentaria y enla elaboración de adhesivos, plásticos y polímeros,y como sustrato fermentable para la obtención deetanol y otro tipo de compuestos químicos.

El almidón es un polímero de glucosa formado pordos tipos de moléculas denominadas amilosa yamilopectina. La diferencia entre estas moléculases que la amilosa es una cadena lineal de glucosa,mientras que la amilopectina presentaramificaciones. Debido a esta diferencia, cada tipode molécula tiene distintas propiedades físico-químicas y el contenido relativo de cada una deellas determinará las propiedades físico-químicasdel almidón121.

En su forma nativa el almidón tiene un número deaplicaciones limitadas. Para conseguir que tengapropiedades adecuadas para otro tipo deaplicaciones debe someterse a distintostratamientos y en ocasiones es necesario realizarmodificaciones químicas.

Mediante la ingeniería metabólica es posiblemodificar la composición del contenido de amilosay amilopectina del almidón, consiguiendoalmidones que poseen propiedades funcionalesmejoradas sin necesidad de realizarmodificaciones químicas.

121 Jobling, S. (2004). Improving starch for food and industrial applications. Current Opinion in Plant Biology, 7, 210-218.

En maíz y trigo existen mutantes naturales que

producen almidón que contiene exclusivamente

amilopectina. Esto se debe a que presentan daños

en los genes que codifican para una enzima

involucrada específicamente en la síntesis de

amilosa y, como consecuencia, sólo pueden

sintetizar amilopectina. Mediante la inhibición de

los genes que codifican para esta enzima se ha

conseguido obtener variedades de patata que no

contienen amilosa.

Otro ejemplo es la obtención de tubérculos de

patata con mayor contenido en amilosa mediante

el bloqueo de la síntesis de las enzimas

ramificantes responsables de la síntesis de

amilopectina. Estos almidones con alto contenido

en amilosa se utilizan por ejemplo para la

elaboración de cartón corrugado y papel y para la

elaboración de caramelos.

Otro hidrato de carbono con importancia es la

inulina, que es un compuesto de reserva que se

utiliza como sustituto de grasas en la elaboración

de alimentos bajos en calorías. Este hidrato de

carbono sólo se puede obtener de manera

comercial de la achicoria. Mediante ingeniería

metabólica se han introducido los genes que

codifican para las enzimas de la ruta de síntesis de

la inulina en otras plantas como patata o

remolacha.

Lípidos

Los lípidos tienen gran importancia para su

utilización, no solo en la industria alimentaria, sino

también para la elaboración de productos que se

utilizan en otras industrias como detergentes y

jabones, recubrimientos, pinturas, lubricantes,

plásticos, derivados químicos, etc.

Los objetivos de la ingeniería metabólica de lípidos

se refieren al contenido y composición de ácidos

grasos, y a la modificación de otros lípidos

minoritarios. Se busca incrementar el contenido

de determinados ácidos grasos y aumentar el

contenido en aceite de las semillas.

Los componentes principales de los aceites

vegetales son los ácidos grasos. Existen más de

200 tipos de ácidos grasos, que se diferencian en

la longitud de la cadena y la presencia de dobles

enlaces o grupos químicos como hidroxilos, epoxi,

acetilenos, ciclopropenos, furanos, etc., algunas

de cuyas rutas de síntesis se han conseguido

identificar. Dentro de estos ácidos grasos sólo

unos pocos se producen en cantidades elevadas

(esteárico, linoleico, palmítico, laúrico y oleíco),

mientras que el resto son muy raros.

En el caso de la industria alimentaria interesa

aumentar el nivel de determinados ácidos grasos

saludables, entre los que se incluyen los ácidos

grasos poliinsaturados, y mejorar la estabilidad de

los aceites para reducir la necesidad de

hidrogenación. En cuanto a los ácidos grasos con

propiedades saludables se han modificado plantas

del género Brassica y tabaco para que produzcan

ácido γ-linoleico.

Para las aplicaciones industriales el interés se

centra en aumentar la expresión de ácidos grasos

poco frecuentes con propiedades funcionales

atractivas e incrementar el contenido de aceite en

las semillas para reducir los costes de producción.

Algunos ejemplos de cultivos de oleaginosas con

contenido en ácidos grasos modificado son cánola

con alto contenido en ácido laúrico para elaborar

detergentes, con alto contenido en ácido esteárico

para elaboración de grasas, y con alto contenido

en oleato para usos en alimentación y como aceite

hidráulico.

Por último, señalar la introducción de dos genes

implicados en la síntesis de ceras en jojoba, que es

la única planta capaz de acumular este tipo de

compuestos, en Arabidopsis, consiguiéndose en esta

planta una acumulación de hasta un 70% de ceras

en las semillas maduras. La transferencia de estos

genes a otros cultivos comerciales permitiría la

obtención de estos compuestos para distintas

aplicaciones entre las que se encuentran la

elaboración de lubricantes industriales y cosméticos.

58

El Dr. Pozueta (CSIC y Universidad Públicade Navarra) es uno de los líderes a nivelmundial en ingeniería metabólica enalmidón. Su grupo ha descubierto las rutasenzimáticas precursoras de la producción dealmidón en plantas, habiendo conseguidoplantas transgénicas con un alto contenidoen almidón y alto balanceamilosa/amilopectina.

Productos del metabolismo secundario

En el metabolismo secundario se incluyen aquellasrutas de síntesis de moléculas que no sonimportantes para la supervivencia de la célula,pero sí para la supervivencia de la plantacompleta, como pigmentos de flores y frutos,aromas, sabores, componentes tóxicos, etc.Muchas de estas sustancias se utilizan para laproducción de medicinas, colorantes, insecticidas,aromas y fragancias, y para enriquecer alimentos

o producir suplementos dietéticos122. Las rutas

mejor conocidas son las de la formación de

flavonoides y antocianinas y las de los alcaloides,

debido a que existen sustancias de interés

farmacéutico que pertenecen a estos grupos de

compuestos.

A continuación, en la tabla 13 se indican algunas de

las modificaciones que se han realizado en plantas

mediante ingeniería metabólica para acumular

compuestos del metabolismo secundario.

59


122 Verpoorte, S. R.; Memelink, J. (2002). Engineering secondary metabolite production in plant. Current Opinion in Biotechnology,13, 181-187.

123 Tucker, G. (2003). Nutritional enhancement of plants. Current Opinion in Biotechnology, 14, 221-225.124 Forkmann, G.; Martens, S. (2001). Metabolic engineering and applications of flavonoids. Current Opinion in Biotechnology, 12,

155-60.125 Mckeon, T. A. (2003). 4. Genetically modified crops for industrial products and processes and their effects on human health.

Trends in Food Science & Technology, 14, 229-241.126 Capell, T.; Christou, P. (2004). Progress in plant metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology, 15, 148–154.127 Peña, L.; and Séguin, A. (2001). Recent advances in the genetic transformation of trees. Trends in Biotechnology, 19, 500-506.

EXPRESIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Compuesto Enzima Planta

Licopeno

Vitamina E (tocoferol)

Vitamina A (β-caroteno)

Fitoeno sintasa de Erwinia uredovora

γ-tocoferol metil transferasa

Fitoeno sintasa de narciso yfitoeno desaturasa de Erwinia uredovora

Licopeno-β-ciclasa de narciso

Tomate

Arabidopsis

Maíz

Arroz

Astaxantina β-Caroteno cetolasa de algas Tabaco

Flavonol Chalcona isomerasa de petunia Tomate

Isoflavonas Isoflavona sintasa

Arabidopsis

Tabaco

Maíz

Caempferol Genes reguladores Lc y C1 de maíz Tomate

Quercetina Genes CH1 de petunia Tomate

S-adenosil metionina descarboxilasa Tomate

Tabla 13. Ingeniería metabólica de plantas para la expresión de metabolitos secundarios123, 124.

Lignina

Un ejemplo de la utilización de la ingeniería

metabólica para disminuir el contenido de un

compuesto en una planta es la reducción de

lignina. La lignina es un polímero complejo que

impregna la pared celular de muchas células

vegetales confiriéndoles resistencia mecánica,

siendo responsable de la dureza de la madera.

Para la producción de pulpa y papel a partir de la

madera es necesario extraer este compuesto, lo

cual resulta costoso y da lugar a la formación de

compuestos químicos contaminantes, por lo que

existe interés en eliminar o reducir su contenido.

Se han caracterizado varias enzimas de su ruta

de síntesis y se ha conseguido reducir el

contenido de la lignina mediante la regulación de

las enzimas 4-coumarata-CoA ligasa (4CL) o la

cinnamil alcohol deshidrogenasa (CAD). Existen

ensayos de campo con álamo temblón con

contenido en lignina modificado. Otras especies

que se están barajando para realizar

modificaciones de este tipo son chopos,

eucaliptos y pinos125, 126, 127.

4.2.2. Introducción de nuevas rutasenzimáticas128

La introducción en la planta de nuevas rutas que éstano poseía de manera natural, es la aplicación de laingeniería metabólica que mayor éxito ha tenido.Esto se debe a que, generalmente, la planta nodispone de métodos de regulación endógena sobrerutas que no posee de manera natural.

Por tanto, para conseguir una producción adecuadaes necesario asegurar que la actividad enzimáticaque se ha introducido es suficiente y que existensustratos disponibles. Además es necesario prevenirla degradación del producto por las enzimasendógenas de la planta.

Existen distintos ejemplos de rutas completas que sehan introducido en plantas que permiten que seanutilizadas como biofactorías de compuestos deinterés, como la producción de bioplásticos endistintas especies, la producción de vitamina A enarroz y la alteración de la composición de los ácidosgrasos.

Bioplásticos129

Un ejemplo de introducción de una ruta biosintéticacompleta es la producción de polímeros depolihidroxialcanoatos (PHAs) en plantas transgénicas.Los PHAs son macromoléculas sintetizadas porbacterias que se acumulan en el citoplasmaformando gránulos y pueden alcanzar hasta un 90%del peso seco celular. Estas moléculas muestranpropiedades parecidas a algunos plásticos como elpolipropileno, por lo que han despertado graninterés, debido a que son biodegradables yreciclables.

El PHA mejor estudiado es el poli(3-hidroxibutirato)(PHB). En la síntesis de este compuesto estánimplicadas tres enzimas, que son la 3-cetotiolasa, la

acetacetil-CoA reductasa y la PHA sintasa. Mediantela introducción de los tres genes bacterianos quecodifican para las enzimas implicadas en su síntesisen plastos de Arabidopsis, se ha conseguido laacumulación de este polímero en una cantidadsuperior al 40% en peso seco. La acumulación deeste polímero en Arabidopsis no da lugar aproblemas de fertilidad o crecimiento, pero en lasplantas que presentan altos contenidos se observanfenómenos de clorosis.

Este polímero se ha conseguido expresar en otrasplantas como alfalfa, mediante transformacióncloroplástica de hoja, pero no se han logradoproducciones tan elevadas como en Arabidopsis.Otras especies que se han considerado interesantespara la producción de este compuesto son lasoleaginosas, ya que el PHB deriva del mismoprecursor que los aceites.

Recientemente se ha realizado la introducción de losgenes de la síntesis del PHB en plantas de linooleaginoso (Linum usitatissimum). El lino oleaginosoes una planta que se utiliza para producir fibras deestopa. La producción en una misma planta de fibrasde estopa y PHB es muy interesante ya que seobtienen materiales formados por una matriz delpolímero reforzada con las fibras del lino, que segúnlos resultados parece que mejoran las propiedadesextensibles de estas fibras130.

El inconveniente que presenta el PHB es que es unpolímero frágil con pocos usos potenciales. Existeotro copolímero denominado poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxilvalerato) conocido con el nombre deBiopol, con propiedades más adecuadas que el PHB,que se ha producido en Arabidopsis y colza.

Algunas de las compañías interesadas en laproducción de PHAs son Monsanto, que estátrabajando en soja y colza, Zeneca Seeds, quetrabaja con colza131 y la empresa Metabolix, que seencuentra trabajando con mijo perenne, tabaco yalfalfa.

60

128 Trethewey, R. N. (2004). Metabolite profiling as an aid to metabolic engineering in plants. Current Opinion in PlantBiology, 7, 196–201.

129 Capell, T.; Christou, P. (2004). Progress in plant metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology, 15, 148–154.130 Wróbel, M.; Zebrowski, J.; Szopa, J. (2004). Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. Journal of Biotechnology,

107, 41-54.131 Reddy, C. S. K.; Rashmi, R. G.; Kalia, V. C. (2003). Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource Technology, 87,

137-146.

Para asegurar que la aplicación de las técnicas demodificación genética para obtener organismosmodificados genéticamente se hace en condicionesen las que los riesgos para la salud o para el medioambiente sean mínimos, se ha adoptado una seriede medidas de garantía y control de las actividadesen las que se produzcan o empleen OMG.

La regulación en el ámbito de la Unión Europea serealiza a través de dos Directivas básicas, que hansido modificadas posteriormente debido adesarrollos y adaptaciones al progreso técnico:

• Directiva 90/219/CEE modificada por laDirectiva 98/81/CE relativa a la utilizaciónconfinada de microorganismos modificadosgenéticamente.

• Directiva 2001/18/CE sobre la liberaciónintencional en el medio ambiente de organismosmodificados genéticamente por la que se derogala Directiva 90/220/CEE. Es el principalinstrumento legislativo en virtud del cual losensayos experimentales y el comercio de OMG yde productos que contengan OMG sonautorizados en la Comunidad Europea.

Estas Directivas han sido incorporadas a lalegislación española a través de la Ley 9/2003, yel Real Decreto 178/2004. La Ley 9/2003establece el régimen jurídico de la utilizaciónconfinada, liberación voluntaria y comercializaciónde organismos modificados genéticamente y elReal Decreto 178/2004 incorpora las Directivas yDecisiones de la Comisión de desarrollo yadaptación posteriores y aprueba el ReglamentoGeneral para el Desarrollo y Ejecución de la Ley9/2003.

En este Reglamento se contemplan los aspectos

necesarios para la aplicación de la Ley. Incluye las

normas sobre información, vigilancia y control de

las actividades de utilización confinada, liberación

voluntaria y comercialización de OMGs, las

responsabilidades, infracciones y sanciones, así

como la composición y competencias del Consejo

Interministerial de Organismos Modificados

Genéticamente y de la Comisión Nacional de

Bioseguridad.

Este Reglamento define la utilización confinada

como “cualquier actividad por la que se modifique

el material genético de un organismo o por la que

éste, así modificado, se cultive, almacene,

emplee, transporte, destruya o elimine, siempre

que en la realización de tales actividades se

utilicen medidas de confinamiento, con el fin de

limitar su contacto con la población y el medio

ambiente”.

Las actividades de utilización confinada se

clasifican en cuatro tipos en función del riesgo

para la salud humana y el medio ambiente. A cada

uno de estos tipos se le asigna el grado de

confinamiento suficiente para proteger la salud

humana y el medio ambiente. El Reglamento

incluye los requisitos habituales mínimos y las

medidas necesarias para cada grado de

confinamiento para las actividades de laboratorio,

las actividades en invernaderos y semilleros y

para actividades distintas de las de laboratorio.

A continuación se incluye una tabla con las

notificaciones de utilizaciones confinadas llevadas a

cabo en España relacionadas con la agricultura

molecular.

61


5. Legislación

62

NOTIFICACIONES DE UTILIZACIONES CONFINADAS LLEVADAS A CABO EN ESPAÑARELACIONADAS CON LA AGRICULTURA MOLECULAR

Nº denotificación

Fecharecepción Empresa Lugar OMG Objeto de

modificaciónTipo

OMG*Comunicacióno autorización

A/ES/02/04(a, b, c, d)

A/ES/02/06

A/ES/02/12

A/ES/03/15

A/ES/03/17

10-02-02

27-06-02

29-11-02

20-11-03

Dpto. MejoraGenética y

Biotecnología(INIA)

UniversidadPública deNavarra

Agrenvec

Agrenvec

Instituto deBiología

Molecular deBarcelona

Madrid

Navarra

Madrid

Tarragona

Barcelona

Diversos

Nicotianatabacum

E. coliArabidopsisthaliana

Potyvirusdel

mosaicodel nabo

Arroz ytabaco

Diversos

Producciónde proteínas

humanas

Produccióninóculo devector viral

TuMVEvaluacióninfectividad

de plásmidos

Inoculacióndel potyvirus

MG enplantas del

géneroBrassica

Producciónde proteínasde interésterapéutico

1 y 2

1

1

1

1

A C Navarra

A C Madrid

A C Cataluña01-12-03

Tabla 14. Notificaciones de utilizaciones confinadas llevadas a cabo en España relacionadas con la agricultura molecular.

*Tipo 1: riesgo nulo o insignificante.Tipo 2: bajo riesgo.Tipo 3: riesgo moderado.Tipo 4: alto riesgo.

En este Reglamento se define la liberación

voluntaria como “la introducción deliberada en el

medio ambiente de un organismo o combinación

de OMGs, sin que hayan sido adoptadas medidas

específicas de confinamiento para limitar su

contacto con la población y el medio ambiente y

proporcionar a éstos un elevado nivel de

seguridad”.

No será de aplicación a las sustancias y

compuestos medicinales de uso humano que

consistan en OMGs o en combinaciones de éstos,

o que contengan dichos organismos, siempre que

su liberación voluntaria sea distinta a su

comercialización y esté autorizada por otras

normas comunitarias o por la legislación española

dictada para su cumplimiento. Estas normas

deben prever una evaluación del riesgo para la

salud humana y el medio ambiente, una

autorización expresa previa a la liberación y unplan de seguimiento con vistas a detectar losefectos de los OMGs sobre la salud humana o elmedio ambiente equivalentes, al menos, a losprevistos en la Ley 9/2003 y en este Reglamento.Además, deben prever los requisitos oportunos deltratamiento de nuevos datos, información alpúblico, datos sobre resultados de la liberación eintercambios de información.

En este caso, el órgano competente para suautorización solicitará al Consejo Interministerialde OMGs un informe sobre la evaluación del riesgopara la salud humana y el medio ambiente.

A continuación, en la tabla 15 se incluyen lasnotificaciones de liberaciones voluntarias llevadasa cabo en España relacionadas con la agriculturamolecular.

Según el artículo 3 de la Ley 9/2003, laautorización de comercialización de OMGs oproductos que los contengan, la autorización delos ensayos de campo relacionados con el examentécnico para la inscripción en el Registro deVariedades Comerciales y la vigilancia, control ysanción, son competencias de la AdministraciónGeneral del Estado (AGE).

También corresponde a la Administración Generaldel Estado la concesión de autorizaciones deutilización confinada y de liberación voluntaria deOMGs en los siguientes casos:

• Incorporación a medicamentos de uso humano oveterinario, a productos y artículos sanitarios y aaquellos que por afectar al ser humano puedensuponer un riesgo para la salud de las personas.

• Supuestos derivados de la Ley 13/1986 deFomento y Coordinación de la InvestigaciónCientífica y Técnica cuando los programas deinvestigación sean ejecutados por lasinstituciones, entes u órganos del propio Estado.

Estas autorizaciones son otorgadas por elConsejo Interministerial de Organismos

Modificados Genéticamente, adscrito alMinisterio de Medio Ambiente. Dicho Consejo estácompuesto por representantes de los Ministeriosde Medio Ambiente; Agricultura, Pesca yAlimentación; Sanidad y Consumo; Economía yHacienda; Industria, Turismo y Comercio;Educación y Ciencia e Interior, todos ellos conrango de Director General. El Consejo funciona encoordinación con la Comisión Nacional deBioseguridad, y es responsable de la coordinacióne intercambio de información con las ComunidadesAutónomas y con la Comisión Europea.

Las Comunidades Autónomas son competentesen la concesión de autorizaciones, (salvo los casosque corresponden a la Administración General delEstado) de utilización confinada y de liberaciónvoluntaria de OMGs con fines de investigación ydesarrollo y cualquier otro distinto de lacomercialización; y en la vigilancia, el control, y laimposición de sanciones de estas actividades, conexcepción de las que son de competencia estatal,según lo que se ha indicado anteriormente.

Las actividades de evaluación de riesgo de losorganismos modificados genéticamente estánadscritas al Ministerio de Medio Ambiente,

63


NOTIFICACIONES DE LIBERACIONES VOLUNTARIAS LLEVADAS A CABO EN ESPAÑARELACIONADAS CON LA AGRICULTURA MOLECULAR

Nº denotificación Empresa OMG Comunidad

AutónomaObjeto de

modificaciónPeríodo deliberación

Superficiede

liberación

Fechaaprobación

B/ES/97/24

B/ES/97/32

B/ES/97/33

B/ES/99/15

B/ES/03/40

TEZIERIBERICA

CLAUSEIbérica/BIOCEM

CLAUSEIbérica/BIOCEM

Univ.Pública deNavarra

Agrenvec,S. L.

Tabaco

Tabaco

Tabaco

Patata

Potyvirusdel mosaico

del nabo(TuMV)

Valencia

Andalucía

Andalucía

Navarra

Cataluña

Expresión lipasagástrica de

perro

Resistencia akanamicina

Producción decolágeno

Expresión lipasagástrica de

perro

Cambio demetabolismo decarbohidratos

Producción de proteínas

a partir de la

inoculación delvirus modificadoen plantas del

género Brassica

Abril-octubre1997

Mayo-octubre1997

Abril-octubre1997

Mayo-agosto1999

15 de junio-15 de

septiembre2003

2.000 m2

60.000 m2

300 m2

30.000 m2

SustituidaB/ES/97/33

7/31/1997

7/31/1997

Nav:23/06/99

Cat:19/03/04

Tabla 15. Notificaciones de liberaciones voluntarias llevadas a cabo en España relacionadas con la agricultura molecular.

conforme a lo establecido en el Real Decreto1477/2004 por el que se desarrolla la estructuraorgánica básica del Ministerio de Medio Ambiente.

La Comisión Nacional de Bioseguridad es unórgano colegiado de carácter consultivo cuyafunción es informar sobre las solicitudes deautorización correspondientes a organismosmodificados genéticamente. Está adscrita alMinisterio de Medio Ambiente y compuesta porrepresentantes de los diferentes Ministeriosimplicados y por representantes de lasComunidades Autónomas, así como de personas einstituciones expertas en la materia.

Además de esta normativa encaminada agarantizar que los riesgos para la salud o el medioambiente derivados de las actividades en las quese produzcan o empleen OMGs sean mínimos, esnecesaria la regulación de la coexistencia de loscultivos de OMGs y otros tipos de cultivosincluidos los convencionales y los ecológicos.

No existe una normativa que regule este aspecto,pero sí se ha elaborado una Recomendación de laComisión (2003/556/CE), sobre las Directricespara la elaboración de estrategias y mejoresprácticas nacionales a fin de garantizar lacoexistencia de los cultivos modificadosgenéticamente con la agricultura convencional yla agricultura ecológica. Debido a las condicionesespecíficas de cada país miembro, la Comisión noes partidaria de la elaboración de una normativacomunitaria, sino que deja libertad a cada estadomiembro para elaborar su propia normativanacional. Esta Recomendación ofrece una seriede principios y factores que deben tenerse encuenta para la elaboración de estrategias decoexistencia.

En España aún no se ha aprobado una normativasobre coexistencia aunque existe un borrador muyavanzado del Ministerio de Agricultura, Pesca yAlimentación.

A continuación se incluyen tres cuadros en los quese indican los procedimientos administrativos deautorización de las actividades de utilizaciónconfinada, liberación voluntaria y comercializaciónde organismos modificados genéticamente.

64

Resumenen inglés

65


UTILIZACIÓN CONFINADA DE ORGANISMOS MODIFICADOSGENÉTICAMENTE - RD 178/2004

Evaluación del riesgo de la actividadpara la salud humana y el medio

ambiente

Comunicación a la Administraciónde la utilización de instalaciones

específicas

TIPO 1 TIPO 2 TIPOS 3 y 4

Comisión Regionalde Bioseguridad

Comprobacióndocumental

Director General deCalidad y Evaluación

Ambiental

Secretario del ConsejoInterministerial de OGMs

Comisión Nacional deBioseguridad

Informe de conformidad

* Administración General del Estado.

TIPO DE ACTIVIDADES:

TIPO 1: RIESGO NULO O INSIGNIFICANTETIPO 2: BAJO RIESGOTIPO 3: RIESGO MODERADOTIPO 4: ALTO RIESGO

Fuente: AGRENVEC.

Fuente: AGRENVEC.

Comunicación de primera utilización de instalaciones.Comunicación de utilizaciones confinadas sucesivas.Inicio de la actividad en primera utilización.Inicio de actividad en utilizaciones sucesivas.Autorización expresa para primera utilización.Autorización expresa para sucesivas utilizaciones.

Mínimo45 días

Mínimo90 días

Mínimo45 días

RESOLUCIÓN DE AUTORIZACIÓN

Art. 3 Ley 9/2003

Recibo tasas

Emisión resolución

SOLICITANTE CC.AA. AGE*

LIBERACIÓN VOLUNTARIA EN EL MEDIO AMBIENTE DE OGMs CON FINESDISTINTOS A LA COMERCIALIZACIÓN - RD 178/2004

Comisión Regionalde Bioseguridad

Comprobacióndocumental

Solicitud de autorización de liberación voluntaria en el medio ambiente.Autorización expresa con condiciones particulares.Inicio de la liberación voluntaria.

Mínimo90 días

RESOLUCIÓN DE AUTORIZACIÓN

Art. 3 Ley 9/2003

Recibo tasas

Emisión resolución

SOLICITANTE CC.AA. AGE

Estudiotécnico

Evaluacióndel riesgo

Solicitud de autorización

Informe de resultados

Director Generalde Calidad yEvaluaciónAmbiental

Secretario del ConsejoInterministerial de OGMs

Comisión Nacionalde Bioseguridad

COMISIÓNEUROPEA

30 días

Informaciónpública

Informe de conformidad

€

€

66

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(60 d

ías)

Formulación de observacionesy/u objeciones, petición de

información adicional (60 días)

Est

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Descripción del sector

La agricultura molecular puede considerarse un

subsector dentro de la biotecnología formado

principalmente por grupos de investigación de

centros públicos y de universidades y por

empresas, en su mayoría de pequeño tamaño,

aunque existen algunas con un tamaño mayor y

un número de empleados en torno a 50 personas.

La relación entre los centros de investigación y las

empresas es muy estrecha, y en muchos casos los

centros de investigación proporcionan a las

empresas distintos servicios o los componentes

técnicos de la plataforma de producción,

incluyendo herramientas de transformación,

expresión, etc.

Como se ha indicado, el principal interés

de la utilización de plantas como biofactorías

es la obtención de proteínas recombinantes de

interés biosanitario, debido a la creciente

demanda de este tipo de productos y a la

dificultad que entraña su obtención, y es en este

sentido en el que se orientan la mayor parte de

las empresas.

No obstante, las primeras moléculas procedentes de

plantas como biofactorías que se han comercializado

no han sido biofármacos, sino las enzimas

producidas por Prodigene y comercializadas por

Sigma Aldrich. Esto se debe a que a la producción

de moléculas de interés industrial se le aplica una

normativa menos estricta que la que se aplica a

moléculas biofarmacéuticas.

Empresas

La base del sector la constituyen las denominadas

“empresas plataforma”, que son aquellas

capaces de llevar a cabo la mayor parte de los

procesos necesarios para la obtención de

proteínas recombinantes en plantas (incluyendo

las tecnologías básicas de transformación y los

sistemas que permiten optimizar la producción y

purificación). Para poder operar con libertad

necesitan tener el control sobre la propiedad

industrial, lo cual puede hacerse a través del

desarrollo de tecnología o bien licenciando la que

otros han patentado. Dentro de las empresas

plataforma se diferencian dos grupos:

67


6. Aspectos de mercado132

132 Arcand, F.; Arnison, P. (2004). Development of Novel Protein-Production Systems and Economic Opportunities &Regulatory Challenges for Canada. www.plantpharma.org/documents/NPPS_040412.pdf.

• Empresas con experiencia, con productos en fase de ensayo clínico o cercanos a esta fase. Seformaron a finales de los años 90, son de tamaño mediano y contienen en sus plantillas científicoscualificados, expertos en normativa y empresarios. Operan como plataformas de produccióncompletas y son capaces de producir moléculas a pequeña escala. Muchas de estas empresas hantenido problemas financieros y la mayor parte dependen de inversores privados. A medida que losproductos avancen en los ensayos clínicos el valor de estas empresas irá aumentando, aunque esposible que algunas desaparezcan, como ha ocurrido con CropTech. Algunos ejemplos son LargeScale Biology, Meristem Therapeutics, Planet Biotechnology, Prodigene, SembiosysGenetics, Icon Genetics, Medicago, Plantechno y SunGene.

• Empresas de reciente creación, de pequeño tamaño, con menos de 10 empleados. Sonprincipalmente “spin-off” de centros de investigación de universidades o centros públicos. Dentro deeste grupo se incluyen desde empresas que desarrollan tecnologías hasta empresas que desarrollanproductos. Su financiación es mediante inversores semilla y subvenciones de gobiernos locales. Esposible que aquellas empresas que desarrollan tecnologías en un futuro sean capaces de desarrollarplataformas de producción completas o bien que se integren en empresas de mayor tamañodedicadas a la agricultura molecular. Dentro de este grupo se encuentran las empresas españolasque en la actualidad se dedican a agricultura molecular como Agrenvec, Era Plantech y PlantBioproducts.

www.plantpharma.org/documents/NPPS_040412.pdf

Existe otro tipo de empresas dedicadas aldesarrollo de productos, creadas específicamentepara este fin como “spin-out” o filiales a partir deotras empresas del sector farmacéutico o de labiotecnología en general. No poseen unaplataforma completa de producción y su objetivoes el desarrollo de nuevos sistemas de produccióno de nuevos productos de su propiedad. Es posibleque el número de empresas de este tipo aumentedebido a alianzas y acuerdos de licencia depatentes en el caso de que continúe la tendenciaal desarrollo de este tipo de productos. Algunosejemplos son Agracetus o Calgene.

Propiedad Industrial

Como se ha indicado para la obtención de unaplanta que pueda usarse como una biofactoría demoléculas de interés es necesaria la utilización dedistintas tecnologías. Por una parte se encuentranlas tecnologías de transformación, más generalesy menos dominantes; y por otra, tecnologíasrelacionadas con la optimización de la produccióny la mejora de la purificación y el confinamiento,que son más específicas para cada combinación deplanta/plataforma.

La libertad de operación puede conseguirsemediante el desarrollo de actividadesinvestigadoras que conduzcan a la obtención depatentes. En caso de que la tecnología que senecesite pertenezca a otra organización tambiénpuede lograrse estableciendo acuerdos o alianzas,o a través del pago de licencias. Es necesarioevaluar el coste que implica el desarrollo detecnologías originales patentables, frente al costeque supone licenciar tecnologías ya existentes. Esposible que el establecimiento de acuerdos con lospropietarios de la tecnología o incluso la licenciade la patente, sean más beneficiosos que lainversión que supone el desarrollo de latecnología.

Sin embargo, la obtención de patentes detecnologías originales permite a la empresa elegirentre varias posibilidades:

• Una estrategia monopolista para evitar que otrosexploten su tecnología.

• Una estrategia de licencias que les proporcioneingresos procedentes de las ventas de otrasempresas.

• El establecimiento de colaboraciones que lespermitan acceder a la tecnología de otrasempresas.

La estrategia más adecuada para empresaspequeñas y centros de investigación parece ser eldesarrollo de la mayor cantidad posible depatentes en las áreas donde existan menos. Estopermitiría establecer acuerdos de co-licencia conlos dueños de patentes dominantes, situándose enuna posición defensiva más fuerte en tecnologíasque facilitan la aprobación del producto, laseguridad y eficacia y la producción de biomasa.

Evolución del sector

Como se ha indicado a lo largo del informe, elprincipal interés del sector se centra en eldesarrollo de moléculas de interés biosanitario.Existen ya algunos productos que han superadolas etapas preclínicas y en la actualidad están enfase de ensayo clínico, por lo que es posible queen los próximos años algunos de ellos alcancen elmercado. El tiempo empleado en el desarrollo deeste tipo de productos implica la inmovilización delcapital durante periodos relativamente largos.

A medida que se avanza en las investigaciones esnecesario realizar nuevos aportes de capital. Poreste motivo es posible que algunas empresaspasen a desarrollar productos no farmacéuticoscon un tiempo de aprobación menor y una entradaen el mercado más rápida, que generarábeneficios de manera más temprana.

Teniendo en cuenta estos puntos es previsible quela evolución del sector se oriente hacia:

• La continuación en el desarrollo de productosfarmacéuticos, solos o en sociedad con compañíasbiofarmacéuticas. Pueden establecerse relacionesentre empresas, incluyendo la subcontratación deempresas de agricultura molecular porfarmacéuticas para el desarrollo de productosconcretos y, en algunos casos, la compra de estasempresas de modo que pasen a ser unidadesintegradas dentro de las biofarmacéuticas.Excepcionalmente, algunas empresas dedicadas aldesarrollo de plantas como biofactorías demoléculas de interés terapéutico, crecerán paraconvertirse en empresas farmacéuticas integradas.

• El desarrollo de productos no farmacéuticos. Eneste tipo de productos se incluyen productos deinterés industrial, productos dedicados alcuidado personal y reactivos de laboratorio. Sonproductos que requieren un tiempo deaprobación menor que los farmacéuticos, demodo que podrán entrar antes en el mercado ygenerar ingresos.

68

• El desarrollo de productos en tejidos comestibles

para la elaboración de productos farmacéuticos o no

farmacéuticos cuya administración pueda realizarse

sin necesidad de purificación, bien por vía oral o por

vía dérmica. Este tipo de productos, como se ha

indicado, presentan ventajas económicas porque

evitan la etapa de purificación, pero existen algunos

retos técnicos y obstáculos legislativos.

A continuación se indican algunos ejemplos de

empresas que poseen productos en fase de

ensayo clínico, relativamente cercanos a la

comercialización.

LARGE SCALE BIOLOGY CORP.

California, Estados Unidos

www.lsbc.com

Es una empresa estadounidense de tamaño

medio, con 130 profesionales, fundada en 1987.

Se dedica a la investigación, análisis,

manufactura y comercialización de proteínas.

Mantiene colaboraciones con distintos centros y

empresas entre los que se encuentran algunas

relacionadas con la agricultura molecular como

Dow AgroSciences LLC, Prodigene Inc. o

Plant Bioscience Ltd.

Poseen una tecnología basada en la utilización

de vectores virales denominada GENEWARE®.

Ésta permite testar la función de nuevos genes,

las proteínas codificadas por ellos, la producción

en masa y purificación de proteínas

recombinantes en plantas de tabaco y la

evaluación de la expresión transitoria de genes

foráneos. Usan el virus del mosaico del tabaco y

tienen autorización de APHIS (Animal and Plant

Health Inspection Service) para realizar ensayos

de campo con este virus.

Poseen varios productos en distintas fases de

desarrollo y colaboraciones para el desarrollo de

otros productos nuevos:

Desarrollo de productos:

• α-galactosidasa A para el tratamiento de la

enfermedad de Fabry (en fase de ensayo

clínico), lipasa ácida lisosomal (LAL en sus

siglas en inglés), para terapia cardiovascular y

una nueva generación de compuestos

biológicos como aprotinina e interferón.

• Vacunas personalizadas contra el linfoma

no-Hodgkins (en la actualidad se ha

completado la fase I de ensayo clínico), contra

papilomavirus y contra parvovirus.

Colaboraciones:

• Colaboración con ProdiGene Inc., para el

desarrollo de anticuerpos terapéuticos.

Prodigene desarrollará las construcciones

genéticas para la transformación y Large

Scale Biology Corp. usará sus tecnologías de

bioprocesamiento y extracción para purificar

los anticuerpos de manera eficiente y

económica.

• Colaboración con el US Naval Medical Research

Center, en el estudio de nuevas proteínas

capaces de estimular el crecimento de las células

de la médula ósea y células madre.

Su estrategia de protección de su propiedad

industrial está encaminada a asegurarse libertad

de operación en todas sus áreas de negocio. En el

campo de GENEWARE® poseen 17 patentes

estadounidenses y 47 en otros países, cuyas

duraciones están entre 2011 y 2018. Poseen otras

patentes relacionadas con proteómica, genómica y

biomanufactura.

MERISTEM THERAPEUTICS

Clermont-Ferrand, Francia (subsidiaria en

Massachusetts, Estados Unidos)

www.meristem-therapeutics.com

Es una empresa de tamaño medio con alrededor

de 60 trabajadores, de los cuales 40 son

científicos. Fundada en 1997 para desarrollar un

programa de investigación denominado Molecular

Pharming®, que se inició en 1992 por el Grupo

Limagrain y cuyo objetivo se centraba en la

producción de proteínas terapéuticas

recombinantes derivadas de plantas. El Grupo

Limagrain contribuyó con su propiedad industrial,

resultados científicos, material y know-how. En la

actualidad es líder en la producción de proteínas

terapéuticas recombinantes en plantas para la

industria farmacéutica.

Mantiene colaboraciones con distintas empresas

como Stallergenes, para evaluar la viabilidad

industrial y producción de dos alérgenos de

ácaros en plantas; con Mitsubishi Pharma

Corp y Eli Lilly Co., para la producción de

proteínas recombinantes en plantas, y con el

Grupo Limagrain, que les proporciona

infraestructuras agrícolas y su banco de

germoplasma.

69


www.lsbc.com


Posee una plataforma denominada Molecular

Pharming® Platform Technology, que incluye

desde la tecnología de transformación

(agroinfiltración y transformación estable de

tabaco y maíz) hasta la fase final de purificación.

Poseen varios productos en distintas fases de

desarrollo:

• Lipasa gástrica para el tratamiento de la

insuficiencia exocrina pancreática en pacientes

afectados por fibrosis quística o patologías

pancreáticas, expresada en maíz. Se han

realizado los ensayos clínicos en fase I siendo

satisfactorios, por lo que en la actualidad se

encuentra en fase II en Alemania y Francia y

se espera que esté en el mercado en Europa

entre 2007-2008. Han obtenido el “orphan

drug status” en Europa.

• Albúmina sérica humana. Han conseguido

producir cantidades de miligramos en tabaco,

con un correcto patrón de plegado. Colaboran

con la empresa Pangene, para el desarrollo de

una técnica que permita su expresión en maíz.

• Lactoferrina en fase I de ensayos clínicos, para

tratamiento de infecciones gastrointestinales y

síndrome del ojo seco en maíz.

• Alérgenos recombinantes de los ácaros del

polvo.

• Producción de colágeno humano en plantas.

Han conseguido producir cantidades de

gramos en tabaco. Producen dos tipos de

colágeno, una forma hidroxilada, que forma

fibras y es estable a temperaturas con

relevancia biológica y un tipo no hidroxilado

que podría usarse como pegamento biológico.

• Se encuentran investigando la producción de

otras proteínas recombinantes complejas

como la hemoglobina humana en tabaco y

anticuerpos monoclonales, de los que han

conseguido obtener cantidades de miligramos

de anticuerpos monoclonales completos y

conformados en tabaco.

Poseen una autorización de APHIS para realizar

ensayos de campo con maíz.

En cuanto a su estrategia en el ámbito de la

propiedad industrial, poseen patentes pertenecientes

a distintas familias, entre las que se incluyen:

• Patentes que cubren la producción y

aislamiento de distintas clases de proteínas en

plantas (incluyendo lipasa, lactoferrina,

hemoglobina y colágeno) y herramientas de la

biología molecular (promotores y vectores

para aumentar la expresión de proteínas

recombinantes en plantas dicotiledóneas y

monocotiledóneas).

• Patentes relacionadas con la extracción y

purificación.

• Patentes relacionadas con la producción de

plantas (aumento de la producción e inhibición

de la germinación).

Además han firmado acuerdos de licencia

exclusivos y no exclusivos de patentes con otras

empresas como Von Schawen, Japan

Tobacco, Pangene, Calgene y Mogen

Licensing y con la fundación Cornell Research

Foundation.

PLANET BIOTECHNOLOGY INC.

California, Estados Unidos

www.planetbiotechnology.com

Es una empresa estadounidense

dedicada a la investigación, desarrollo y

comercialización de nuevos productos

terapéuticos y preventivos basados en

anticuerpos monoclonales obtenidos de plantas

genéticamente modificadas.

Poseen una tecnología para la producción de

inmunoglobulina A (Protected-SIgA™) en

plantas transgénicas. Es la primera empresa en

el mundo que ha conseguido producir y testar

clínicamente de manera exitosa un anticuerpo

en plantas de tabaco.

Se han centrado en el desarrollo de drogas

preventivas y terapéuticas en tres mercados

médicos amplios no referidos a enfermedades

mortales. Poseen tres productos en desarrollo:

• CaroRx™. Anticuerpo para prevenir la caries

dental. Están en ensayos en fase II para

desarrollar IgGs.

• RhinoRx™. Anticuerpo para tratar los

catarros debidos a rinovirus. Ensayos en fase

I. Anti-ICAM-1 SIgA tópico para rinovirus en

tabaco.

• DoxoRx™. Anticuerpo para el tratamiento de

la alopecia inducida por el tratamiento

quimioterapéutico.

70


PRODIGENE INC

Texas, Estados Unidos

www.prodigene.com

Es una empresa estadounidense pionera en el

uso de plantas transgénicas para producir

proteínas recombinantes con uso en el campo

farmacéutico, industrial y de la salud animal. Es

la primera empresa que ha desarrollado y

comercializado este tipo de productos.

Han colaborado con empresas farmacéuticas y

dedicadas a la agricultura molecular como

Genencor Inc, Pharmaceutical Inc., Large

Scale Biology Corp., AvantImmunotherapeutics Inc., Eli Lilly & Co. y

Stauffer Biotech.

Son propietarios de una plataforma tecnológica

para la expresión de proteínas recombinantes en

maíz. Su sistema de producción abarca desde el

aislamiento del gen de interés hasta la purificación

de la proteína producida por este gen.

Poseen una gran cantidad de productos en

desarrollo:

• Vacunas. Han desarrollado vacunas contra la

hepatitis B y contra la gastroenteritisbacteriana (gastroenteritis del “viajero”) que

se encuentran en fase I de ensayo clínico.

Están desarrollando otras vacunas contra elvirus de la gastroenteritis transmisible porcina

y se encuentran colaborando en proyectos

para el desarrollo de otras vacunas animales

que son confidenciales.

• Productos terapéuticos humanos. Han

comercializado una proteína terapéutica que

se utiliza en cirugía para prevenir las pérdidas

de sangre denominada aprotinina bajo el

nombre de AproliZean™.

• Anticuerpos.

• Productos para usos no clínicos:

– TrypZean™ (tripsina). Es una enzima

proteasa que se utiliza como intermediario

en la industria farmacéutica en el proceso de

fabricación de determinados productos.

– AproliZean™ (aprotinina). Es un inhibidor de

proteasas que se usa como reactivo en

cultivos celulares.

– Avidina. Es una molécula utilizada como

reactivo de diagnóstico y posee aplicaciones

en la purificación de proteínas.

– Lacasa. Es una enzima redox que se usacomo blanqueante en distintas industrias.

Su propiedad industrial les permite tener unaposición fuerte frente a empresas competidoras.Combinan el desarrollo y comercialización de losproductos de los que son propietarios demanera independiente, con colaboraciones yalianzas con otras compañías para la fabricaciónde proteínas de interés terapéutico e industrial.

Existen otras empresas que han desarrolladotecnologías específicas para mejorar alguno de lospuntos para optimizar la producción de proteínasrecombinantes en plantas. A continuación seindican algunas de ellas:

SEMBIOSYS GENETICS INC.Alberta, Canadáwww.sembiosys.ca

Es una empresa canadiense cuya actividad secentra en el desarrollo, comercialización yproducción de proteínas de interés farmacéuticoy no farmacéutico en plantas mediante lautilización de herramientas de la ingenieríagenética y su plataforma tecnológicadenominada cuerpo lipídico-oleosina.

La plataforma cuerpo lipídico-oleosina estádirigida a la producción y purificación deproteínas recombinantes en cártamo, que esuna planta oleaginosa. Esta plataforma permiteuna purificación eficiente y económica de lasproteínas recombinantes mediante el anclaje delas mismas a los cuerpos lipídicos lo que permiteuna recuperación y purificación simultánea,junto con una producción a gran escala.

Poseen colaboraciones con Dow Agrosciencesy en 2003 firmaron un acuerdo con SyngentaParticipation AG, que le permite a Syngentausar su tecnología para la producción de suscompuestos biológicos.

Han desarrollado varios productos y sistemas dedesarrollo de productos basados en estaplataforma:

• Stratosome™ Biologics System y AffinityCapture System. Esta tecnología permite laproducción y purificación de proteínasrecombinantes dirigiendo las mismas hacia loscuerpos lipídicos y purificando éstosposteriormente.

71


www.prodigene.com

www.sembiosys.ca

• StratoCapture™ Purification System. Sistema

basado en la unión de la proteína A a las

oleosinas que permite la purificación sencilla

de anticuerpos producidos en plantas.

Además pretenden utilizar su plataforma para

optimizar la producción de las siguientes

proteínas:

• Insulina. Se encuentra en fase de

investigación, y creen que podría estar en el

mercado a partir de 2008-2009.

• Apolipoproteína A-I y A-IMIlano para reducir y

estabilizar la formación de placas de ateroma

que se asocian con enfermedades

cardiovasculares. Estos productos se

encuentran en fase de investigación y se

espera que puedan estar en el mercado en

2011.

Poseen una cartera de patentes que les permite

la comercialización en exclusiva de su

plataforma de producción.

CHLOROGEN

Missouri, Estados Unidos

www.chlorogen.com

Empresa estadounidense fundada en 2002 que

se dedica a la transformación de cloroplastos

para el desarrollo de fármacos y otros

productos.

Ha conseguido expresar distintos tipos de

proteínas con interés terapéutico e industrial en

cloroplastos de tabaco, entre los que se

encuentran:

• Medicamentos y vacunas: albúmina sérica

humana para usos terapéuticos y no

terapéuticos, interferón para enfermedades

hepáticas, factor de crecimiento tipo insulina

(insulin-like growth factor) para tratamiento

de diabetes, y vacunas contra cólera, antrax y

peste.

• Biopolímeros: han expresado en tabaco

proteínas que producen polímeros para usos

industriales, como la elastina y el 4HB, que es

un componente de un polímero de cristal

líquido denominado zenita.

Poseen una autorización de APHIS para el

cultivo de tabaco.

El científico principal y creador de la empresa,Henry Daniell, patentó por primera vez laexpresión de genes en cloroplastos en 1988.Desde entonces, ha patentado distintastecnologías relacionadas con la transformaciónde cloroplastos y secuencias reguladoras de laexpresión de los genes introducidosexclusivamente en estos orgánulos. Por tanto,las patentes más antiguas y dominantes en estecampo son de su propiedad.

Sus estrategias de mercado se centran en eldesarrollo de proteínas de interés farmacéutico,bien mediante la licencia de su tecnología paraco-desarrollar estos productos o bienproporcionando la tecnología a empresas delsector farmacéutico para el desarrollo yfabricación de proteínas de interés sin licenciarsu tecnología. Otra posibilidad que barajan es laasociación con otras empresas pertenecientes amercados distintos del farmacéutico, como eldesarrollo de alimentos o piensos, y productosindustriales, con posibilidad de licenciar sutecnología de transformación de cloroplastos.

Por último, mencionaremos tres empresasespañolas dedicadas a la agricultura molecular:

AGRENVECMadrid, Españawww.agrenvec.es

Nace en 2001 como una spin-off, a partir de lalicencia de una patente del INIA (InstitutoNacional de Investigación y Tecnología Agraria yAlimentaria) y con la participación de laempresa de capital riesgo NAJETI España. Lainiciativa de Agrenvec ha sido respaldada por elCDTI (Centro para el Desarrollo TecnológicoIndustrial), del Ministerio de Ciencia yTecnología, a través de la concesión de unproyecto NEOTEC, para la creación de nuevasempresas de base tecnológica.

Poseen una plataforma tecnológica basada en lautilización de vectores virales para la utilizaciónde plantas como biofactorías. Utilizan el vectorviral p35Tunos-vec01 derivado del virus delmosaico del nabo (virus TuMV).

Las moléculas producidas en plantas biofactoríade interés para esta empresa sonprincipalmente enzimas con aplicaciones en loscampos industrial, agrícola, terapéutico ymedioambiental.

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www.chlorogen.com

www.agrenvec.es

Ha establecido colaboraciones con centros públicosde investigación y con empresas privadas debiotecnología, lo que le permite el uso detecnologías complementarias y el desarrollo denuevos productos no disponibles en el mercado.

ERA PLANTECHBarcelona, Españawww.eraplantech.com

Es una empresa ubicada en la Bioincubadora delParque Científico de Barcelona, que producepéptidos y proteínas recombinantes de interésterapéutico o industrial en plantas.

Sus principales socios son Advancell —gestióny desarrollo de negocio— y BCN Emprèn, quees una empresa de capital riesgo.

Posee una plataforma tecnológica denominadaZERA™, que permite la acumulación deproteínas y péptidos en las plantas. Utilizadominios de almacenamiento en el retículoendoplásmico, consiguiendo una acumulaciónelevada de la proteína recombinante. Laplataforma incluye todas las etapas del procesode obtención de proteínas recombinantes enplantas, incluyendo la transformación medianteAgrobacterium, la purificación y la validación delas proteínas diana. Ha conseguido producir conéxito calcitonina en plantas de tabaco.

En la actualidad se encuentra optimizando latecnología ZERA™ para asegurar su viabilidad ycompetitividad, para lo cual se le ha concedidoun proyecto NEOTEC. Está investigando ennuevos sistemas de expresión constitutiva,expresión específica en semillas y la elaboraciónde una cartera de productos propios.

Sus científicos fundadores son Dolors Ludevid yMargarita Torrent, y cuenta con losinvestigadores Blanca Llompart y MiriamBastida. En Biospain 2004 se realizó lapresentación del nuevo Director General de laempresa, François Arcand.

Posee una solicitud de patente para laproducción de péptidos y proteínas poracumulación de las mismas en cuerpos proteicosderivados del retículo endoplásmico, mediante lautilización de dominios de la proteína γ-zeina,capaz de dirigir y retener la proteína hacia elretículo endoplásmico. (US 20040005660:Production of peptides and proteins byaccumulation in plant endoplasmic reticulum-derived protein bodies).

PLANT BIOPRODUCTS, S.L.Madrid, España

www.plantbioproducts.com

Es una empresa creada en marzo de 2003 a

partir de una idea empresarial de Ignacio

Moreno Echanove.

En junio de 2004 firmaron un convenio de

colaboración con el departamento de

Biotecnología del Instituto Nacional de

Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria

(INIA) que permite la incubación de su proyecto

de I+D en dicho centro. La firma de este

convenio fue auspiciada por la Fundación

Genoma España, que además le presta apoyo

financiero y oferta de servicios. Posteriormente

se han sumado a este proyecto el InstitutoNacional de Investigaciones Agropecuarias de

Argentina (INTA) y un profesor titular de la

Universidad Pública de Navarra.

El proyecto consiste en el desarrollo de unaplataforma tecnológica basada en la

modificación genética de cloroplastos de plantas

superiores para producción de aplicaciones

comerciales en las que se utilizará el material

vegetal en bruto. Algunos ejemplos de estas

aplicaciones son la utilización de celulasas para

la conversión de biomasa celulásica en

bioalcohol o la producción de antígenos

vacunales de administración oral.

En la actualidad se encuentra trabajando en

varios productos con el fin de validar sus logrostecnológicos, a la vez que desarrolla susprimeras aplicaciones industriales. Estosproductos son un antígeno que protege frente ala enfermedad hemorrágica del conejo y unantígeno inmunocompetente para el control de

la fiebre aftosa bovina.

Se encuentra interesada en colaborar conempresas e instituciones que dispongan de

productos y/o aplicaciones de su propiedad

compatibles con la expresión genética en

cloroplastos y que deseen utilizar una

plataforma sencilla de producción para validar

sus aplicaciones.

Sus colaboradores científicos son José Ángel

Martínez Escribano (investigador del Dpto. de

Biotecnología del INIA), Daniel Mariano Pérez

Filgueira (investigador asociado del INIA) y Jon

Veramendi Charola (profesor titular de laUniversidad Pública de Navarra).

73


www.eraplantech.com


La utilización de plantas como biofactorías tiene múltiples ventajas sobre otros tipos de sistemas deproducción, pero presenta una serie de factores críticos que deben ser tenidos en cuenta. Entre ellos seencuentran los riesgos para el medio ambiente y para la salud que puedan producirse como consecuenciadel cultivo de este tipo de plantas al aire libre. Otros derivan de la posibilidad de pasar a la cadenaalimentaria133.

El abordaje de algunos de estos factores críticos puede llevarse a cabo mediante el desarrollo de estrategiastecnológicas. En otros casos, será necesario el establecimiento de técnicas de cultivo especiales como el cultivocon medidas de confinamiento, como invernaderos con barreras contra polen y animales, túneles de plástico eincluso minas y cuevas. En cualquier caso, la adopción de estas medidas lleva asociada un coste económico.

74

7. Aspectos socioeconómicos

En 2002 la empresa Prodigene se vio implicada en dos casos de contaminación de cultivos de sojacon maíz modificado genéticamente que se había cultivado anteriormente en esos campos. Laempresa realizó ensayos de campo con un maíz modificado para producir un antígeno para elaboraruna vacuna contra el virus de la gastroenteritis transmisible porcina. Tras la recolección de este maízse realizó una nueva siembra, que en este caso fue de soja, pero no se llevó a cabo una limpiezacorrecta de dos de los campos, de modo que quedaron restos de maíz transgénico, que creció juntocon la soja contaminando este cultivo. Inspectores del APHIS que realizaban controles de campo,detectaron la contaminación e indicaron la necesidad de destruir las semillas y plantas dentro de unradio de 1.320 pies del lugar donde se había realizado el ensayo. En uno de los campos se llevó acabo esta destrucción, bajo la supervisión de inspectores del APHIS, pero en el otro se llegó arecolectar la soja. Esta soja contaminada con el maíz transgénico fue enviada a un elevador de grano,donde se mezcló con 500.000 celemines de soja procedente de otros campos, por lo que fuenecesario que el USDA destruyese toda la soja que había en el elevador. Como consecuencia de estosincidentes, la empresa Prodigene fue condenada a pagar una multa de 250.000 dólares y ha debidoreembolsar al USDA el coste que tuvo la adquisición y destrucción de la soja contaminada en loselevadores de grano134.

En el incidente que ocurrió con la empresa

Prodigene la cantidad de maíz que contaminó el

elevador de grano fue muy pequeña, ya que en el

campo de cultivo se contabilizaron menos de 10

plantas. Se estima que al elevador de grano debió

llegar aproximadamente el equivalente a 650

gramos de tejido de maíz, ya que durante la

recolección de la soja se separan las hojas de las

legumbres, que son las que se llevan al silo, de

modo que la mayor parte de las plantas de maíz

se debieron eliminar durante el cosechado.

Además, la proteína transgénica que producían

estas plantas llevaba un promotor específico de

semilla, por lo que era en este tejido en el que se

acumulaba. Las plantas de maíz en el momento de

la recolección no habían alcanzado la madurez y

todavía no presentaban semillas por lo que la

cantidad de proteína que se encontraba en esos

650 gramos de tejido era realmente muy

pequeña, y en 500.000 celemines de soja era una

cantidad casi inapreciable. Posteriormente la FDA

admitió en una nota de prensa que aunque el

material procedente del maíz nunca debió haber

contaminado la soja, no había existido riesgo para

la salud humana ya que éste se hubiese derivado

de una ingesta elevada del producto que podría

haber provocado reacciones alérgicas135.

Este incidente ha marcado un hito importante.

Para algunos grupos demuestra el gran riesgo que

supone el cultivo de plantas como biofactorías de

productos farmacéuticos, frente a otros para los

133 Huot, M. F (2003). Plant Molecular Farming: Issues and Challenges for Canadian Regulators. Option Consommateurs.134 www.aphis.usda.gov/brs/compliance9.html135 U.S. Food and Drug Administration. FDA Action on Corn Bioengineered to Produce Pharmaceutical Material. November

19, 2002. www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/2002/ANS01174.html

www.aphis.usda.gov/brs/compliance9.html

www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/2002/ANS01174.html

que se demuestra la eficacia de las medidas de

control de las autoridades. En cualquier caso,

parece que este incidente se derivó de unas malas

prácticas agrícolas, más que de otro tipo de

factores críticos.

El grupo de trabajo de la Biotechnology Industry

Organization (BIO en sus siglas en inglés) ha

desarrollado guías de prácticas genéricas de

confinamiento, que contienen una serie de

medidas de control de la exposición

complementarias que incluyen:

• Aplicación de sistemas de Análisis de Contención

y Puntos de Control Crítico (CACCP en sus siglas

en inglés) para el diseño de prácticas de cultivo

que aseguren un alto grado de seguridad,

adaptados a cada combinación de planta,

plataforma y producto.

• Medidas de confinamiento agronómico. Son

procedimientos estándar de operación

específicos para cada combinación de planta y

plataforma de producción, que se pueden

considerar el equivalente a las Buenas Prácticas

de Fabricación y por analogía se llaman Buenas

Prácticas Agronómicas. Su diseño debe hacerse

en función de la naturaleza y riesgo del producto

que se desea producir.

• Medidas de bioconfinamiento. Son propiedades

de la biofactoría que previenen algunos riesgos

de escape, como la transformación de

cloroplastos, la utilización de promotores

inducibles tras la recolección o la esterilidad

masculina, que se utiliza para evitar el flujo de

polen.

Estas medidas han sido adoptadas por la gran

mayoría de las empresas pertenecientes a esta

organización dedicadas a la agricultura molecular

y es probable que se conviertan en estándares

industriales y que sean adoptadas por otras

empresas no pertenecientes a esta organización y

por centros de investigación públicos.

Como se ha indicado, unas malas prácticas

agrícolas pueden dar lugar a problemas muy

serios que pueden llegar a hundir a una pequeña

empresa. Es muy importante aplicar todas las

medidas necesarias para evitar posibles

contaminaciones. Para ello, es necesario realizar

una adaptación de las infraestructuras y desarrollar

nuevos procedimientos de cultivo y recolección, que

cambiarían el concepto que se tiene actualmente de

la agricultura. En el caso de plantas biofactoría, la

empresa propietaria es dueña no sólo de las

semillas, sino de todo lo que se produzca a partir

de ellas. El cultivo de estas plantas debe realizarse

tal y como la empresa indique.

Las relaciones que se establecen entre las

empresas propietarias de las plantas y los

agricultores pueden ser de varios tipos. Una

posibilidad es que el agricultor propietario de la

tierra realice el cultivo de las plantas transgénicas

siguiendo las normas marcadas por la empresa,

que debe encargarse de su entrenamiento. Otra

opción es que la empresa se encargue de todo el

proceso de cultivo de las plantas mediante la

contratación y entrenamiento de personal y pague

un precio al agricultor por el uso de sus tierras.

Para analizar la rentabilidad de la agricultura

molecular para el agricultor, en el caso de que sea

éste el que se encargue de cultivar las plantas

transgénicas, es necesario tener en cuenta

distintos factores:136

• Cantidad de terreno dedicado.

• Viabilidad del sistema de producción.

• Inversiones del productor en tiempo y dinero

que requiera el cultivo.

• Responsabilidad del agricultor en caso de

contaminación.

• Seguros.

• Implicación en la distribución.

• Pérdida de independencia.

• Efectos potenciales de la agricultura molecular

en la salud del agricultor.

• Infraestructura administrativa, científica y

reglamentación.

Aunque existen empresas propietarias de

biofactorías que han optado por este tipo de

relación con grupos de agricultores especializados,

parece que la tendencia se dirige hacia el alquiler

de las tierras al agricultor y contratación de

personal especializado para las labores de cultivo.

75


136 Huot, M. F. (2003). Plant Molecular Farming: Issues and Challenges for Canadian Regulators. Option Consommateurs.

Otro de los factores críticos que se indicaban es elriesgo de contaminación de la cadena alimentaria.Esto hace que, a la hora de evaluar la aceptaciónde las plantas como biofactorías, sea necesario

tener en cuenta a otros agentes muy importantes

que son aquellos implicados en la producción de

alimentos. La US National Food Processing

Association137 (NFPA en sus siglas en inglés), ha

manifestado su opinión con respecto a la

utilización de plantas para producir compuestos de

interés farmacéutico e industrial. En esta

asociación, aunque entienden los beneficios de la

producción de dichos compuestos en plantas,

creen que el principal objetivo del gobierno debe

ser mantener un suministro de alimentos seguro y

sano. Opinan que la presencia accidental de este

tipo de productos en la cadena alimentaria, debido

a los riesgos para la salud que presentan, podría

desencadenar nuevas crisis alimentarias como las

que han sucedido en los últimos años

(encefalopatía espongiforme bovina, dioxinas en

pollos, etc). Por este motivo, demandan unatolerancia cero a la presencia de estos compuestosen los alimentos. Para conseguir esto exigen quese asegure una protección contra la contaminacióndel 100%, mediante el empleo de plantas no

comestibles para la expresión de proteínas

recombinantes. Sólo en el caso de que esto no

fuese posible aceptarían la utilización de especies

comestibles, pero con unas medidas de control

muy estrictas entre las que incluyen138:

• Sistemas de contención redundantes en función

del riesgo, que deben incluir tanto el riesgo

debido a la especificidad biológica de la planta(exposición) como el riesgo debido a la proteínaque se está produciendo.

• Segregación geográfica de cultivos.

• Fenotipos diferenciales que permitan distinguir a

simple vista las biofactorías de la planta no

transformada.

• Desarrollo de normativas de obligado

cumplimiento en lugar de guías de

recomendaciones.

• Seguros de responsabilidades.

• Certificación de las fuentes de la cadena

alimentaria.

• Monitorización y control rigurosos con

programas de auditoría que permitan verificar

que las medidas de contención y confinamiento

son efectivas.

• Mejora de las actividades de inspección.

Sugieren que las inspecciones deben llevarse a

cabo al menos en las fases críticas de la

producción, incluyendo etapas como el cultivo,

polinización y cosechado de las plantas, así

como en el procesado y eliminación de los

residuos.

• Establecimiento de un sistema de análisis de

peligros y puntos de control crítico semejante al

que se utiliza en la industria alimentaria para

realizar un análisis sistemático que permita

detectar los peligros potenciales y las medidas

de prevención relevantes.

Como se ha indicado, algunas de estas medidas

como la monitorización, la redundancia en los

sistemas de confinamiento, la segregación

geográfica de cosechas en el caso del maíz y la

aplicación de sistemas de Análisis de Contención y

Puntos de Control Crítico, están siendo llevadas a

cabo por las empresas pertenecientes a la

Biotechnology Industry Organization139.

Por último, es necesario tener en cuenta cuál es la

opinión de los consumidores sobre este tipo de

plantas. La percepción social de los OMGs es muy

diferente en función de cuál sea su uso. Según el

Comité Asesor de Ética en la Investigación

Científica y Técnica de la Fundación Española para

la Ciencia y la Tecnología (FECYT), en el caso de

las plantas modificadas genéticamente para la

producción de alimentos existe una percepción

negativa y un cierto rechazo que en algunos casos

se deben a cierta subjetividad, desinformación e

incluso manipulación. En este tipo de plantas las

modificaciones genéticas realizadas le

proporcionan a la planta ventajas para el

desarrollo y supervivencia de los cultivos, como

tolerancia a herbicidas o resistencia frente a

76

137 Asociación estadounidense representante de una gran parte de la industria de transformación de alimentos en temas depolítica científica y pública, relacionados con la seguridad alimentaria, la nutrición y otros aspectos relacionados con elconsumidor.

138 www.nfpa-food.org/content/regulatory/comments_view.asp?id=43139 Arcand, F.; Arnison, P. (2004). Development of Novel Protein-Production Systems and Economic Opportunities &

Regulatory Challenges for Canada. www.plantpharma.org/documents/NPPS_040412.pdf.

www.nfpa-food.org/content/regulatory/comments_view.asp?id=43


plagas, que los consumidores no consideran comoun beneficio directo. En muchos casos,únicamente perciben los riesgos medioambientalesy sanitarios, debidos a la posibilidad de que seproduzcan alergias u otras reacciones adversaspor el consumo de estos organismos. Tambiéncreen que sólo se benefician las grandescompañías propietarias de las semillas. Sinembargo, en el caso de los OMGs para usofarmacéutico no existe esta percepción negativa yel consumidor considera que hay beneficiosdirectos y se posiciona favorablemente frente aeste tipo de productos140.

En el caso de la utilización de plantas comobiofactorías para producir compuestos de interésfarmacéutico es difícil saber en qué sentido sedecantará la opinión pública. Por una parte, cabríaesperar la aceptación de los productos finales ypor otra, es posible que la liberación al medioambiente de este tipo de plantas genere ciertorechazo debido a los efectos que podrían tenersobre el medio ambiente y al riesgo que existe depasar a la cadena alimentaria.

77


140 Comité Asesor de Ética en la Investigación Científica y Técnica (2004) Informe sobre OMGs en la agricultura y laalimentación. Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología.

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8. Ejemplos de gruposde investigación españoles

CASO PRÁCTICO 1

Nombre de la institución o empresa: Universidad Pública de Navarra, Dpto. Producción Agraria,Área de Producción Vegetal.

Dirección web: www.unavarra.es/produccionagraria

GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Agrobiotecnología Vegetal. Investigador principal: Ángel Mingo Castel

PRINCIPALES LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN DEL GRUPO

PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS Y COSTE

OFERTA DE SERVICIOS A EMPRESAS

BARRERAS Y LIMITACIONES EN LA INVESTIGACIÓN

DIFICULTADES PARA EL DESARROLLO E IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR

HITOS Y PLAZOS EN LA IMPLANTACIÓN DE LA AGRICULTURA MOLECULAR

Personal:1 Catedrático, 1 Titular, 1Ayudante, 1 Asociado y 5

BecariosColaboración externa:

1 Ayudante1 Técnico

Proyecto de investigación:– Producción de antígenos vacunales en plantas mediante transformación

cloroplástica (2003-05).– Producción de cardiotrofina-1 en plantas de tabaco mediante

transformación plastidial (2004-05).– Producción de albúmina humana, factor insulínico (IGF-I) e interferón

(IFN alfa 2b) en plantas transplastómicas de tabaco (2005-2006).

Organismo

CICYT

Gobierno de Navarra

Gobierno de Navarra

Coste

69.920 €

29.345 €

50.000 €

Formación:2 Biólogos

7 IngenierosAgrónomos

BiólogoIngeniero Agrónomo

Área de experiencia:Común a todo el personal:

Transformación genética nuclear y plastidialBiotecnología vegetal

InmunologíaAgronomía

– Producción de proteínas de interés farmacéutico mediante transformación plastidial en tabaco.– Producción de vacunas en plantas mediante transformación cloroplástica en tabaco.– Transformación plastidial de maíz.

Transformación plastidial de plantas en las que el “riesgo ambiental” es despreciable y los rendimientos obtenidos son “record”.

– Falta de “masa crítica mínima necesaria” en investigadores postdoctorales para competir a nivel internacional y que permitasuplir áreas de conocimiento colaterales deficitarias, pero necesarias para entrar en la fase de “desarrollo del producto”, talescomo la de ingeniería químico-farmacéutica.

– Falta de financiación suficiente.– Dificultad en la transformación plastidial de especies distintas del tabaco.– Vacunación con plantas por vía oral: baja inducción de respuesta inmune con respecto a la vía parenteral.

– No existe legislación europea específica para la producción de biofármacos en plantas. Un aspecto clave es si se va a permitir elempleo de platas comestibles o sólo plantas que no entran en la cadena alimentaria. Este aspecto supedita la investigacióndesde su inicio. Esta legislación es demasiado restrictiva y no está justificada por datos científicos, lo que constituye una pesadae innecesaria carga para el progreso.

– Bajos niveles de expresión de la proteína recombinante.– Alto coste de los sistemas de purificación.

Si se eliminan las barreras legislativas actuales:– Primeras explotaciones comerciales: 3 años.– Primeros fármacos en el mercado: 5 años.

www.unavarra.es/produccionagraria

79


CASO PRÁCTICO 2Nombre de la institución o empresa: Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales.

Universidad Pública de Navarra.Dirección web: www.unavarra.es/invest/biotec.htm

GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Metabolismo. Investigador principal: Javier Pozueta Romero*



PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES


LÍNEAS FUTURAS DE INTERÉS




Personal:1 Investigador Científico2 “Ramón y Cajal” y 2 pre-docs

Proyecto de investigación:Nudix hidrolasas: nuevas herramientas moleculares para elcontrol de los niveles intracelulares de azúcares-nucleótidosy del metabolismo glucídico en plantas transgénicas.

OrganismoComisión Interministerial de Ciencia yTecnología (CICYT).Empresas privadas (farmacéuticas yagroalimentarias).

Coste140.000 euros(2005-2007)

40.000 euros/año

Formación:Biólogos

Área de experiencia:Ingeniería metabólica (biología molecular, bioquímica y

metabolismo), en plantas y bacterias: metabolismo glucídico.

Metabolismo del almidón y glucógeno en plantas y bacterias, respectivamente.

Número Título AñoPCT/ES01/00021 Plant ADPglucose pyrophosphatase, method for the production thereof, its use in the production 2000

of assay devices and for obtaining transgenic plants.PCT/ES02/00174 Bacterial ADPglucose pyrophosphatase, method of production, use in the manufacture of testing 2001

devices and in the production of transgenic plants and bacteria.PCT/JP03/03189 Production of UDPglucose pyrophosphatase. 2001PCT/ES03/00363 Azúcar-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa vegetal, procedimiento de obtención, uso en la

fabricación de dispositivos de ensayo y en la obtención de plantas transgénicas.ES200400257 Procedimiento de producción de sacarosa sintasa recombinante a partir de Escherichia coli y su uso 2004

en la fabricación de kits de determinación de sacarosa, producción de azúcares-nucleótidos y obtención de plantas transgénicas con alto contenido en almidón y alto balance amilosa/amilopectina.

Nuestro equipo no presta servicios a empresas. Sin embargo, hemos firmado 2 contratos de colaboración con sendas empresas cuyoobjeto es identificar y expresar genes que codifican para enzimas reguladoras del metabolismo glucídico en plantas y en mamíferos.

– Aunque no se trata de una línea de investigación, creemos que la metabolómica es una herramienta futura cuya utilizaciónenglobará a un prometedor y amplio conjunto de líneas de investigación.

– La creación de nanobiosensores y dispositivos dependientes de reacciones enzimáticas para la medida de metabolitos resulta atractiva ymuy vinculada al tipo de investigación llevada a cabo en nuestro laboratorio. En colaboración con un equipo de ingenieros de la UniversidadPública de Navarra, acabamos de solicitar un proyecto de investigación correspondiente a la Acción Estratégica de Nanociencia yNanotecnología en el marco del Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (2004-2007).

– Obtención de plantas transgénicas productoras de almidones con cantidades y calidades alteradas. Nos gustaría desarrollar enmúltiples especies la tecnología ya disponible en nuestro laboratorio. Garantizando la productividad actual, tal tecnologíapermitiría reducir la superficie de cultivo del planeta a una superficie equivalente a la península Ibérica.

– Ausencia de planes estratégicos sólidos y definidos en centros tecnológicos que orienten sus investigaciones hacia problemas concretos.Esto dificulta la creación de grupos y líneas de investigación cohesionados, con capacidad de generar alianzas y actividadescomplementarias, debidamente apoyados por personal técnico y con especializaciones definidas.

– Dificultad en transmisión del conocimiento a la sociedad. Los centros tecnológicos no están debidamente dotados de personal adecuadopara esta actividad. Ello limita en gran medida la interacción entre los centros tecnológicos.

– Ausencia de estímulos para la figura del “investigador emprendedor”. La mayor parte de los investigadores españoles llevan a cabo suinvestigación dentro del ámbito de lo público. La legislación actual impide en gran medida que el investigador “público” puedadesarrollar sus ideas e invenciones en el ámbito privado. Por tanto, investigadores pertenecientes a los Centros Tecnológicos Públicos(acaparadores de una gran cantidad del conocimiento) se ven impedidos para generar más investigación fuera del ámbito público.Finalmente la investigación llevada a cabo en España está delimitada por la inversión del estado.

Rechazo social a “lo molecular”, “lo manipulable” y “lo intangible”. Es preciso educar, informar y hacer ver la necesidad de la implantaciónde la agricultura molecular. Los programas de enseñanza y los medios de comunicación serán fundamentales.

– Comunicación y educación: 5 años.– Legislación: 10 años.– Primeras explotaciones comerciales: 15 años.

* Este grupo de investigación colabora con PLANT BIOPRODUCTS, S.L.

www.unavarra.es/invest/biotec.htm

80

CASO PRÁCTICO 3Nombre de la institución o empresa: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria

y Alimentaria (INIA), Dpto. Biotecnología.Dirección web: www.inia.es

GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Grupo de Vacunas. Investigador principal: José Ángel Martínez Escribano




TENDENCIAS EN LA INVESTIGACIÓN EN AGRICULTURA MOLECULAR






Personal:1 Investigador A2 3 Posdoctorales1 Predoctoral

1 Técnico de laboratorio

Proyecto de investigación:– Producción de reactivos para el control y profilaxis del síndrome

respiratorio y reproductivo del ganado porcino (PRRS) en unsistema libre de cultivos celulares. Años 2003-2004.

– Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable deplantas como biofactorías. Años 2004-2008.

– Desarrollo de vacunas recombinantes mejoradas.Años 2002-2004.

– Caracterización de los mecanismos inmunológicos relevantesen protección frente al virus de la Peste porcina africana:desarrollo de nuevas estrategias vacunales. Años 2004-2007.

– Development of African swine fever virus vaccines.Referencia: 75813. Años 2005-2009.

Organismo

Proyecto PETRI95-0624-OP.

Proyecto del plan estratégicodel INIA CPE03-022-C5.

Proyecto Sectorial de Recursos yTecnologías Agrarias RTA01-057

Proyecto CICYT. AGL 2004 -07857-C03-02/GAN.

Wellcome Trust Foundation.

Coste

115.000 €

160.000 €

125.000 €

130.000 €

309.000 €


VeterinariosOtros

Área de experiencia:Virología

BiofactoríasDiagnóstico

Vacunas

Vacunas de nueva generación.Interacción virus-célula y Biofactorías.

Número Título Año200302845 Sistema para producir péptidos y proteínas multiméricos y sus aplicaciones. 2003200302958 Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras 2003

de antígeno y sus aplicaciones.200302634 Dispositivo para cría de larvas. 2003

– Producción de vacunas.– Producción de moléculas terapéuticas.– Producción de enzimas industriales.

– Moléculas de fusión que mejoran eficacia inmunológica.– Estrategias para acumular establemente proteínas expresadas en plantas.– Transformación nuclear y cloroplástica.– Vector derivado del virus del mosaico del tabaco como sistema de expresión transitoria en plantas.

– Desarrollo de tecnología de transformación cloroplástica propia para producción de vacunas y enzimas industriales.

– Personal.– Instalaciones adecuadas fundamentalmente para el escalado semiproductivo.– Falta de interés por parte de empresas farmacéuticas e industriales de diverso tipo para la financiación de proyectos de desarrollo con

esta tecnología.

– Percepción social negativa con repercusión en la legislación.– Inmovilismo dentro del sector agrícola para cambiar procesos productivos.

– Legislación: 5 años– Primeras explotaciones comerciales: 7 años– Primeros fármacos o productos industriales en el mercado: 10 años

www.inia.es

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CASO PRÁCTICO 4Nombre de la institución o empresa: AGRENVEC S.L.

Dirección web: www.agrenvec.es

Investigador principal: Alicia Romero Lorca










Personal:2 Doctores

2 Ingenieros2 Técnicos Laboratorio

Proyecto de investigación:– Generación de un nuevo vector viral basado en MVCV.– Utilización de plantas como biofactorías para la producción de enzimas industriales.

OrganismoIMADE

MIN-PROFIT

Coste26.188 €53.156 €


Ingenieros Agrónomos

Área de experiencia:Biotecnología vegetal

Virología vegetalAgronomía

Expresión de proteínas recombinantes en plantas mediante vectores virales.

Número Título AñoES2125842 Clones y vectores infectivos de plantas derivados del Virus del Mosaico del Nabo (TuMV) 1997

(explotación de la licencia INIA).

– Incremento en el rendimiento: aumento del nivel de expresión y de la estabilidad de la proteína recombinante.– Generación de nuevos vectores virales. – Duplicación de las características de bioseguridad de la tecnología.

– Expresión de proteínas recombinantes en plantas, de manera muy rápida y económica, sin limitación en la cantidad de producto.– Realización de proyectos de I+D cooperativa bajo contrato.

– Expresión de proteínas terapéuticas y anticuerpos.– Biorremediación.

– Infracapitalización: falta de acceso a financiación. Capital riesgo poco desarrollado y business angels poco familiarizados con el sector ycon la tecnología. Falta de adecuación de las convocatorias de ayudas públicas a las características y posibilidades de las empresas debase tecnológica. Demasiada orientación hacia empresas de estructura “tradicional”. Burocratización excesiva de los procedimientosadministrativos en la gestión de ayudas.

– El procedimiento administrativo en la obtención de permisos para trabajar con organismos recombinantes puede generar retrasos deaños en los planes de I+D, imposibles de soportar por empresas de reciente creación, ya lastradas con los problemas añadidos en elpunto anterior. De nada sirve financiar parcialmente proyectos de I+D si no se pueden ejecutar por la falta de permisos.

– Falta de adaptación de las condiciones marcadas en los permisos a los ciclos de cultivo de las distintas especies vegetales.– Falta de coordinación entre los distintos programas e iniciativas nacionales y regionales.– Falta de instalaciones de apoyo (Parques científicos, clusters, etc). – Atomización del sector.

– Legislación restrictiva y procedimientos esclerotizados, tanto en la evaluación previa del riesgo como en los protocolos de control yseguimiento. Alto riesgo de deslocalización hacia países que apuestan decididamente por la biotecnología y con costes menores.

– Falta de interés REAL de las Administraciones y del sector Agrario por reconvertir una parte de la agricultura convencional, dependientede ayudas europeas, hacia una agricultura dirigida a la obtención de moléculas de alto valor añadido para los mercados farmacéutico,químico, industrial, etc.

– Desconocimiento tecnológico por parte de los agentes que participarían en ese proceso de implantación: cooperativas, agricultores,Administraciones, Industria, etc.

– Legislación: 3 años– Primeras explotaciones comerciales: 1 año– Primeros fármacos en el mercado: 5 años

www.agrenvec.es

82

CASO PRÁCTICO 5

Nombre de la institución o empresa: PLANT BIOPRODUCTS, S.L.

Dirección web: www.plantbioproducts.com

Investigador principal: Ignacio Moreno Echanove









Personal:1 investigador

Proyecto de investigación– Expresión de enzimas en cloroplastos de tabaco.

OrganismoGenoma España

Coste110.000 €


Ingenieros Agrónomos

Área de experiencia:Transformación genética

Biotecnología vegetalVirología

Desarrollo de sistemas de expresión mediante transformación genética de cloroplastos. Extracción y ensayo de enzimas yantígenos vacunales expresados en cloroplastos de tabaco.

– Utilización de extractos de producción agraria en bruto con fines industriales.– Utilización de extractos de producción agraria en bruto para sanidad animal.

– Extractos de plantas enriquecidos en actividades enzimáticas de interés industrial.– Servicio de expresión genética en cloroplastos utilizando nuestros vectores de transformación.

– Obtención de otras enzimas de interés industrial.– Producción de vacunas y otros productos para sanidad humana.

– Falta de financiación, especialmente para la contratación de personal cualificado para I+D y suficientemente motivado económicamente.– Costes y tiempo necesario para registrar productos, autorizaciones para cultivo y comercialización de productos derivados de OMGs.

– Desarrollo de sistemas industriales de producción vegetal en condiciones de confinamiento (ingeniería): necesidades financieras para laconstrucción de plantas piloto para cultivo continuo en condiciones de confinamiento.

– Novedad de la Legislación e inseguridad en la forma de aplicación de ésta.

– Desarrollo de producción industrial (escala piloto): 2-3 años– Desarrollo de producción industrial (escala comercial): 3-5 años


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CASO PRÁCTICO 6Nombre de la institución o empresa: Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario-Neiker.

Dirección web: www.neiker.net

Área: Transformación Genética del Dpto. Biotecnología. Investigador principal: Enrique Ritter Azpitarte






Personal:1 Jefe de Departamento

3 Investigadores Doctores4 Becarios pre-doctorales

Proyecto de investigación– Identificación y Producción de proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario,

utilizando técnicas recombinantes. 2005-2007.– Desarrollo de prototipos de “biofactorias” para “molecular farming” basado en plantas

lactíferas y análisis de su potencial como nuevas fuentes de péptidos antimicrobianos.2005-2007.

– Nuevas tecnologías para la elaboración de medicamentos de última generación ycompuestos biotecnológicos. CIC-BIOGUNE 2003-2004.

– Producción de enzimas para aplicaciones en el sector agroalimentario mediante técnicasrecombinantes. CIC-BIOGUNE 2003-2004.

– Resistant wild potatoes as source for novel genes mediating resistance against fungal,viral and nematode diseases. INCO-Project PL ICA4-1999-30052. 2000-2003.

– Novel approaches for the control of fungal disease. QLK2-2000-2003.– Molecular analysis of biofilm formation in the human pathogenic fungi Candida albicans

and Candida glabrata. IP-DCPTR50. 2001-2004.– Negative regulation of hyphal development in Candida albicans. 1999-2001.

– New targets for antifungal therapy- molecular biology of dimorphism in the humanpathogen Candida albicans. BIOMED N. BMH4-CT96-0310. 1996-1999.

OrganismoDepartamento Industriadel Gobierno Vasco.

Departamento Industriadel Gobierno Vasco.

Comisión Europea

Comisión Europea

Instituto Pasteur (París)

Wellcome Trust

Unión Europea

Unión EuropeaDepartamento deAgricultura y Pesca delGobierno Vasco.

Coste

427.182 €

509.450 €

150.000 €

40.000 €

219.195 €

1.000.000 €

100.000 €

—

—


BioquímicosIngenieros agrónomos

Área de experiencia:Biotecnología vegetal Transformación genética

Biología MolecularGenómica Funcional

Microbiología

– Producción de proteínas con actividad farmacológica en sistemas vegetales y bacterianos.– Producción de enzimas industriales de interés agronómico en sistemas heterólogos.– Aislamiento de nuevos genes de resistencia frente a estrés biótico y abiótico.– Estudio de las MLPs de diferentes plantas lactíferas y desarrollo de un sistema de producción de proteínas heterólogas basado en

estos genes.– Desarrollo de herramientas genómicas y post-genómicas en hongos patógenos, análisis del transcriptoma mediante microarrays,

biofilms fúngicos, proteomics en hongos patógenos, dimorfismo en hongos patógenos, expresión heteróloga en levaduras deinterés industrial, mecanismos de resistencia al cobre en Yarrowia lipolytica.

Número Título AñoES 2094 088 Identificación, clonación y utilización de una región de DNA amplificada en cepas de Penicillium 1994

chrysogenum superproductoras de penicilina.P9701346 Un procedimiento para incrementar la producción de penicilina en Penicillium chrysogenum mediante 1997

la inactivación del gen Lys2”.P9900731 Una proteasa extracelular de Acremonium chrysogenum con actividad CPC-acetilhidrolasa y su utilización 1999

para la síntesis de derivados desacetilados de cefalosporina C e inactivación del gen para aumentarla producción de cefalosporina.

WO 00/61767 Extracellular protease from Acremonium chrysogenum with CPC-acetyl hydrolase activity and its 2000utilization in the synthesis of deacetylated derivatives of cephalosporin C and inactivationof the gene for increasing production of cephalosporin.

SD-07 Génes impliqués dans la formation de biofilms par la levure pathogène Candida albicans. 2003

– Desarrollo de sistemas de transformación de plantas para la producción de proteínas y sustancias de interés farmacológico oagroalimentario.

– Cribado de genotecas de origen vegetal mediante Phage display para la obtención de péptidos antimicrobianos: Nuevasaproximaciones para el control de las enfermedades fúngicas humanas.

Detección de transgenes en alimentos comercializados.

(Continúa en página siguiente)

www.neiker.net

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– Utilización de plantas como “biofactorías” para la producción de diferentes sustancias de interés, principalmente proteínas y péptidos deinterés alimenticio y/o farmacológico.

– Establecimiento de cultivos in vitro de plantas lactíferas y sistemas de transformación específicos.– Exploración y explotación de genomas vegetales mediante aproximaciones “genome-wide” para búsqueda de proteínas antibióticas y

nuevos productos de interés farmacológico.

– Falta de financiación.– Voluntad política negativa ante el cultivo de plantas transgénicas en el campo.– Limitación de ensayos en sistemas confinados.– Falta de tradición en el empleo de la biología molecular como herramienta para investigaciones agronómicas.

– Ausencia de legislación que regule el cultivo de transgénicos. Aparición y desaparición de moratorias no válidas ante la ausenciade legislación.

– Percepción negativa de la manipulación molecular entre los propios agentes encargados de su implantación.– Falta de información o información sesgada hacia la opinión pública.– Percepción negativa por parte de los agricultores ante el cultivo de transgénicos.– Percepción negativa por parte de los consumidores ante los alimentos transgénicos.

– Decreto Ley que regule la convivencia entre alimentos transgénicos y no transgénicos: 1 año– Legislación que regule el cultivo de plantas transgénicas: 3 años– Primeras explotaciones comerciales de plantas transgénicas productoras de proteínas de interés para uso humano: 10 años– Primeros productos purificados para uso humano en el mercado: 15 años

CASO PRÁCTICO 6 (continuación)

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CASO PRÁCTICO 7Nombre de la institución o empresa: Centro Nacional de Biotecnología (CNB) – CSIC,

Dpto. Genética Molecular de Plantas.Dirección web: www.cnb.uam.es

Investigador principal: Juan Antonio García Álvarez








Personal:1 Profesor de Investigación CSIC

1 Contratada Ramón y Cajal3 Investigadores post-doctorales

4 becarios pre-doctorales1 Ayudante titulada CSIC

Proyecto de investigación– El virus de la sharka como agente patógeno y como vector de expresión:

factores implicados en su interacción con las plantas.– Virus-induced gene silencing: unravelling the basis of a mechanism and its

exploitation for the analysis of a multitude of individual gene functions in plants.– Targeting immunostimulating-structure production in plants.– Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinese

taskforce.

Organismo

Plan Nacional de I+D+I

Unión Europea

Unión Europea

Unión Europea

Coste

260.100 €

285.305 €

243.549 €

260.052 €


BioquímicosIngenieros Agrónomos

Área de experiencia:Biotecnología vegetal

Virología

– Silenciamiento de RNA y otros mecanismos de defensa de las plantas frente a virus.– Mecanismo de infección de virus de plantas.– Determinantes de patogenicidad virales.– Vectores de expresión en plantas basados en virus.

Número Título AñoP9800623 Sistema de presentación de antígenos basado en el virus de la sharka. 1998P9900698 DNA recombinante derivado del virus de la sharka y vector de expresión de proteínas heterólogas 1999

basado en dicho DNA recombinante.PCT/EP 01/10026 Producción del antígeno VP60, o de un fragmento del mismo, del virus de la enfermedad 2001

hemorrágica de los conejos en plantas y vacuna contra la enfermedad hemorrágica víricade los conejos que comprende dicho antígeno.

– Mejoras agronómicas de las plantas.– Mejora de la calidad de los productos de las plantas.– Las plantas como biofactorías de nuevos productos.

– Desarrollo de vectores de expresión en plantas.– Desarrollo de estrategias para interferir con enfermedades virales de plantas.

– Falta de estabilidad en las fuentes de financiación.– Falta de plazas estables para el personal científico.

Aceptación social.

www.cnb.uam.es

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Grupo: Biotecnología de Virus Vegetales. Investigador principal: Fernando Ponz Ascaso









Personal:2 investigadores, 1 técnico grado medio

2 investigadores postdoctorales1 becario predoctoral

(sólo 1,5 personas dedicadas a Agricultura Molecular)

Proyecto de investigaciónDesarrollos biotecnológicos para la utilización rentable deplantas como biofactorías (CPE03-022-C5-5).

Organismo

INIA

Coste

74.100 €

Formación:2 químicos3 biólogos

1 ing. técnico agrícola

Área de experiencia:Biotecnología de virus vegetales

Plantas como biofactorías empleando vectores virales.

Número Título Año9701522 Clones y vectores infectivos de plantas derivados del virus del mosaico del nabo. —

– Mejoras de la capacidad de expresión de proteínas foráneas en plantas empleando los vectores derivados del virus del mosaico del nabo.– Expresión de proteínas de distintos orígenes con utilidades diversas.

Los vectores están licenciados por el INIA a la empresa AGRENVEC.

La principal barrera que nosotros experimentamos en esta área es la falta de financiación específica. Al tratarse de proyectosfundamentalmente de desarrollo tecnológico, al no haber fuentes específicas de financiación para ellos, profundizar en ellos con lasfuentes normales de financiación del Plan Nacional nos obligaría a renunciar (problema de los EJCs) a trabajar en los proyectos deinvestigación de naturaleza más básica, cosa que no deseamos hacer. La sensación en el grupo es que, pese a que éste es un casoclaro de un desarrollo tecnológico derivado de un esfuerzo de investigación básica, no está previsto en un grupo de un OPI públicocomo el nuestro que se pueda continuar en la profundización de la D, si no es renunciando a hacer más I, lo cual encontramosbastante paradójico, puesto que no podríamos haber hecho esta D concreta si no hubiéramos estado muy implicados en la I.

En el ámbito de los grupos de investigación, lo expresado en el cuadro anterior. En el campo de las aplicaciones prácticas, elprincipal obstáculo es la deficiente estructura empresarial del sector de la producción agraria (fragmentación y pequeño tamaño delas empresas, falta de capitalización, ausencia de mentalidad innovadora, etc.). La producción agraria española está diseñada deuna manera no sostenible, muy subvencionada y sin un buen entorno de implementación de nuevas ideas tecnológicas. Enresumen, el ambiente productor es muy adecuado para la agricultura molecular.

Sin un cambio casi drástico de escenario empresarial agrario, lo más probable es que la implantación no se produzca. Si seprodujese (muy improbable) un cambio efectivo de actitud por parte de los poderes públicos de tal forma que se pudiera crear unentorno favorable a la inversión en agricultura molecular, quizá se podrían apreciar mejoras en unos 3-5 años. La legislación yotras cuestiones relacionadas pueden mejorar, pero no son en estos momentos el principal obstáculo. La estructura empresarial dela producción agraria española es poco compatible con el desarrollo biotecnológico propio. Cultivar plantas transgénicas decompañías multinacionales no exige demasiado cambio en las estructuras productivas, pero implementar desarrollos propios esotra historia.

www.inia.es

87


CASO PRÁCTICO 9Nombre de la institución o empresa: Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB)-CSIC,

Dpto. de Genética Molecular.Dirección web: www.ibmb.csic.es

Grupo: Transporte subcelular de proteínas vegetales. Investigador principal: Dolores Ludevid Múgica








Personal:2 investigadores

4 becarios pre-post

Proyecto de investigaciónMolecular Farming: Producción de proteínas de interés terapéutico enplantas (BIO-2004-03202). Producción de proteínas de interés terapéutico en plantas de arroz y tabaco.

Organismo

CYCIT(2004-7)

Empresa ERA PLANTECH S.L (2004-6)

Coste

158.000 €

71.000 €

Formación:Bioquímicos

BiólogosIngenieros agrónomos


Biotecnología vegetalBiología celular vegetal

Expresión proteínas heterólogas en plantas

Señales de transporte subcelular de proteínas vegetales. Expresión de proteínas terapéuticas en plantas. Biología celular vegetal.Proteómica.

Número Título AñoWO2004 003207 Production of peptides and proteins by accumulation in plant endoplasmic reticulum-derived 2002US2004 005660 protein bodies.

WO97 28247 — —

Las tendencias generales se focalizan fundamentalmente en los siguientes objetivos: 1) Resistencia a patógenos 2) Mejoraproductiva/nutritiva de plantas comestibles (food/feed) 3) Resistencia a sequedad y suelos salinos 4) Producción de proteínasterapéuticas. Nuestro grupo trabaja en esta última.Herramientas que se utilizan:– Genómica: secuenciación de genomas vegetales de interés agroalimentario. Nodulación.– Genómica funcional: genes implicados en resistencia a patógenos, sequedad, salinidad, fotosíntesis.– Proteómica.– Metabolómica: regulación de rutas metabólicas y metabolitos secundarios.– Genética/Desarrollo vegetal/floración.

– Secuencias reguladoras: Promotores (FTO).– Nuevas tecnologías de transformación vegetal. (FTO).– Diversidad vegetal: identificación y cultivo de nuevas especies vegetales con rasgos de interés comercial.– Tecnologías de producción de proteínas terapéuticas de alto valor añadido a costes bajos/ vacunas comestibles/productos

industriales/nutritivos. – Marcadores genéticos para cultivares de interés agroalimentario. Mejora genética.– Interés en la maduración de frutos.– Know-how relativos al down-processing de biomasa vegetal: sistemas de homogenización, tratamiento de sólidos, bioquímica

(purificación de extractos proteicos, lípidos, azúcares y metabolitos secundarios).– Interés en algas (biomasa). Por ejemplo: empresas de cosmética, alimentación animal.

– Plantas GM de cultivos extensivos para la producción de productos industriales (biopolímeros, enzimas industriales,…).– Plantas GM para la producción de proteínas terapéuticas (vacunas, anticuerpos, citoquinas, hormonas).– Plantas GM productoras de complementos alimentarios para alimentación humana y animal.– Agricultura sostenible. Aprovechamiento de biomasa-energía.– Plantas GM para cultivo extensivo de plantas resistentes a desecación.

– Escasa dotación presupuestaria por parte de la administración en proyectos de investigación de agricultura molecular. Esteaspecto es especialmente grave en un país con una climatología idónea para cultivos sostenibles.

– Falta de flexibilidad y dinero para la contratación de personal cualificado.– Falta de contacto con la realidad: interacción agricultor/empresa-investigador. – Crear puestos de trabajo especializados y multidisciplinares (abogado/científico) que detecten y gestionen posibles transferencias

de tecnología (para la propia institución pública o para empresas interesadas).

(Continúa en página siguiente)

www.ibmb.csic.es

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– Legislación compleja y poco clara.– Falta de mecanismos de control sanitario y medioambiental. Mecanismos de control científicamente rigurosos y reconocidos

socialmente. Acompañados además por un seguimiento en campo/ invernadero, durante el procesamiento del vegetal y delproducto final (controles moleculares específicos, analítica concreta….).

– Falta de información al consumidor. – Desarrollo de Sistemas seguros de confinamiento.

– Legislación: 3 años– Primeras explotaciones comerciales: 5 años– Primeros fármacos en el mercado: 10 años

CASO PRÁCTICO 9 (continuación)

89


CASO PRÁCTICO 10Nombre de la institución o empresa: FORT DODGE VETERINARIA, S.A.

Investigador principal: Juan Plana Durán (Departamento de I+D)









Personal:15 investigadores

Proyecto de investigación:Biosafe coronavirus vaccine vector for the prevention of human infectionsof the enteric and respiratory tract. Referencia: QLRT-2000-00874. 1999-2002. 2000-2003. Biosafe coronavirus vector-based vaccine for prevention of foot-and-mouthdisease. Referencia: QLRT-2001-00825. 2001-2004.Trageting immunocomplex production in plants.Referencia:QLRT-2001-01050. 2001-2004. Epidemiology and control of classical swine fever (CSF) in wild boar andpotential use of a newly developed live marker vaccine. Referencia: SSPE-CT-2003-501599. 2004-2008.Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinesetaskforce. Referencia: FP6-2003-SSP-SARS. 2004-2007.

Organismo

European CommissionFramework Program





Coste

—

—

—

—

—


Ingenieros agrónomosVeterinariosBioquímicos


Biotecnología vegetalVirología

Vacunas:– Convencionales.– DNA Recombinantes.

Número Título AñoP 9301973 Vaccine for preventing the porcine reproductive and respiratory syndrome. 1994P 9401493 Recombinant rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) capsids and proteins, diagnostic kits 1995

and vaccines containing said recombinant products. P 9502370 Recombinant adenoviruses which express antigens of the porcine transmissible gastroenteritis 1995

PCT/ES96/00185 virus (TGEV) and their use in the formulation of vaccines. 9600620 Vectors based on recombinant defective viral genomes and their use in the formulation of vaccines. 1996P9902673 Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. 1999

P200002161 Producción del antígeno VP60, o de un fragmento del mismo, del virus de la enfermedad 2000hemorrágica de los conejos en plantas y vacuna contra la enfermedad hemorrágica víricade los conejos que comprende dicho antígeno.

Expresión de proteínas y anticuerpos en plantas.

Desarrollo de “edible vaccines” (vacunas comestibles).

Ninguna dificultad en nuestra empresa.

Dificultad para registro.

– Primeras explotaciones comerciales: 5 años

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CASO PRÁCTICO 11Nombre de la institución o empresa: Centro Nacional de Biotecnología (CNB). CSIC,

Dpto. Biología Molecular y Celular.Dirección web: www.cnb.uam.es

Investigador principal: Luis Enjuanes Sánchez



PATENTES O SOLICITUDES DE PATENTES:







Personal:1 profesores titulares

6 investigadores5 becarios pre-post

Proyecto de investigaciónDiseño de vacunas para la protección del ganado porcino frente a infeccionesentéricas y respiratorias. 1999-2000.Desarrollo de un vector vacunal para la especie porcina basado en genomas decoronavirus. Referencia: CAM 07B/0020/99. 2000.Generic coronavirus vaccine vectors for protection of farm animals againstmucosal infections. Referencia: QLRT-1999-00002. 2000-2002.Immunotherapy of enteric infections by rotaviruses and coronaviruses usingplantibodies. Referencia: QLRT-1999-30739. 2000-2002.Biosafe coronavirus vaccine vector for the prevention of human infections of theenteric and respiratory tracts. Referencia: QLRT-2000-00874. 2001-2004.Ingeniería de genomas de coronavirus para el diseño de vectores bioseguros.Referencia: BIO2001-1699. 2001-2004Biosafe coronavirus vector-based vaccine for prevention of foot-and-mouthdisease. Referencia: QLRT-2001-00825. 2002-2005.Targeting immunocomplex production in plants. Referencia: QLRT-2001-01050. 2002-2005.Development of intervention strategies against SARS in a European-Chinesetaskforce. Referencia: FP6-2003-SSP-2.2-SARS. 2004-2007.

Organismo

—

CAM

UE

UE

UE

CICYT

UE

UE

UE

Coste

—

28.940 €

238.000 €

246.730 €

263.860 €

252.570 €

256.742 €

248.105 €

380.000 €


Área de experiencia:Virología

Biología de coronavirus, incluyendo mecanismos de replicación, transcripción, encapsidación, desarrollo de vectores para vacunas.

Número Título AñoPCT/EP 00/12063 Infectious clone. 2000

(P 55171)200200158 Secuencia de ácido nucleico que comprende la señal de encapsidación del RNA de un coronavirus 2002

del grupo 1 y sus aplicaciones.

Diseño de vacunas para salud animal, caracterización del genoma de las especies de interés en alimentación, mejora y transferencia deembriones, proteómica, genómica.

Diseño de vacunas recombinantes seguras.

Estudios básicos sobre la biología de coronavirus (incluyendo coronavirus porcinos y humanos).

– Falta de instalaciones de seguridad biológica.– Dificultad en las autorizaciones para el trabajo con patógenos.

Mejora del sistema de patentes europeo en comparación con el americano.

– Legislación: 1 año– Primeras explotaciones comerciales: 3 años– Primeros fármacos en el mercado: 5 años

www.cnb.uam.es

91




Investigador principal: Covadonga Alonso Martí









Personal:1 Contratado posdoctoral

1 becario predoctoral

Proyecto de investigaciónEstudio de las interacciones patógeno- hospedador del virus de la Peste porcinaafricana mediante técnicas de proteómica y microscopía confocal IO2004-00690.Año 2005.Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas comobiofactorías. Años 2004-2008.Estudio de la interacción virus-célula mediante análisis proteómico de lainfección por el virus de la Peste porcina africana. AGL2002-00668.Development of African swine fever virus vaccines. Referencia: 75813. Años 2005-2009.Producción de reactivos para el control y profilaxis del síndrome respiratorio yreproductivo del ganado porcino (PRRS) en un sistema libre de cultivoscelulares. Años 2003-2004. 95-0624-OP.

Organismo

Proyecto CICYTProyecto del plan

estratégico del INIACPE03-022-C5

Proyecto CICYT

Wellcome TrustFoundation

Proyecto PETRI

Coste

46.000 €

160.000 €

133.500 €

309.000 €

115.000 €


Área de experiencia:Virología molecularBiología Molecular

Identificación de dianas terapeúticas para estrategias de interferencia antiviral mediante:– Estudios proteómicos de las interacciones virus-hospedador.– Caracterización de los mecanismos de apoptosis. – Función de las proteínas motoras microtubulares en el transporte intracelular de los virus.

– Vacunas.– Biofactorías en la producción de moléculas de interés diagnóstico o terapéutico.

Identificación de moléculas diana de interés diagnóstico o terapéutico mediante estudios proteómicos.

Desarrollo de moléculas antivirales.

– Falta de financiación.– Falta de personal.

– Legislación más permisiva. – Falta de implantación de la innovación en el sector agrícola.

– Legislación: 5 años– Primeras explotaciones comerciales: 5 años– Primeros fármacos en el mercado: 10 años

www.inia.es

La ingeniería genética ha permitido convertir enbiofactorías de productos como enzimas,antibióticos, vacunas, anticuerpos u hormonas, adistintos organismos entre los que se incluyenbacterias o levaduras, o a cultivos celulares deanimales como insectos o mamíferos.

Desde hace años se investiga la posibilidad deutilizar plantas completas para la producción deestos compuestos de interés, debido a quepresentan múltiples ventajas económicas, técnicasy de seguridad, que hacen que puedanconsiderarse como una alternativa a otrossistemas de producción más costosos o conriesgos de contaminación por agentes patógenos:

• Ventajas técnicas. Las plantas son sistemassencillos de transformar genéticamente, yexisten protocolos de transformación yregeneración para múltiples especies. Seconocen secuencias específicas que permiten laacumulación de proteínas en tejidos y órganosfáciles de recolectar, almacenar y procesar, o enorgánulos donde las proteínas se encuentranprotegidas de la degradación, lo cual aumentasu rendimiento de producción.

• Ventajas económicas. El cultivo de plantas eseconómico y sencillo, ya que existeninfraestructuras y maquinaria específica para sucultivo, recolección y procesado.

• Ventajas referentes a la seguridad del producto.Se trata de organismos eucariotas, máscercanos a los seres humanos que bacterias ylevaduras, que no presentan patógenos quepuedan afectar al hombre o los animales, comoes el caso de las toxinas bacterianas, virus,priones o secuencias oncogénicas.

Sin embargo, existen una serie de retos que puedentener una incidencia en el desarrollo de plantasbiofactoría. Estos retos derivan, por una parte, deaspectos relacionados con la seguridad, tantomedioambiental como sanitaria (salud humana yanimal). En segundo lugar existen una serie de retosrelacionados con el proceso productivo, referentes arendimiento de la producción y purificación de losproductos de interés.

Se han desarrollado distintas tecnologías quepermiten aumentar la expresión de proteínas ymejorar la purificación, situando el rendimientodel conjunto del proceso en niveles competitivoscon los sistemas tradicionales de producción.Asimismo se han desarrollado estrategias

tecnológicas que permiten eliminar algunos

riesgos ambientales, como la expresión transitoria

de las proteínas recombinantes, su confinamiento

en orgánulos como cloroplastos, que no se

transmiten por polen o la utilización de

promotores que sólo se activan ante determinados

estímulos físicos o químicos, limitando su

producción a momentos determinados.

De estos desarrollos tecnológicos, la expresión de

proteínas foráneas en cloroplastos de tabaco aparece

como uno de los más ventajosos. Los cloroplastos son

orgánulos que no se transmiten a través del polen, ya

que su herencia es materna, de modo que el riesgo de

contaminación de otros cultivos es muy pequeño. La

transformación de cloroplastos permite niveles de

expresión elevados, ya que cada célula vegetal

contiene gran cantidad de estos orgánulos. Además, la

proteína recombinante se encuentra protegida de la

degradación y su acumulación dentro del cloroplasto

no afecta al desarrollo normal de la planta.

El tabaco se utiliza como modelo de experimentación

debido a que es fácilmente transformable y existe

una tecnología muy avanzada para la transferencia y

expresión de genes. Por otra parte se trata de una

planta no comestible, claramente diferenciada de las

que lo son, por lo que el riesgo de contaminación de

la cadena alimentaria es muy bajo. Además, produce

un elevado rendimiento de biomasa y se dispone de

infraestructuras para su cultivo y procesado a gran

escala.

Por otra parte, la transformación de otros tipos de

plastos de frutas despierta un gran interés para la

obtención de vacunas comestibles.

El número de empresas dedicadas al desarrollo de

plataformas biotecnológicas de producción de

proteínas recombinantes en plantas se encuentra

liderado por Estados Unidos y Canadá, donde se

sitúan aproximadamente el 60%. En Europa,

aunque existen empresas que están realizando

investigaciones, y algunas ya tienen productos en

fase de ensayo clínico, la situación es de retraso

frente a estos países.

El principal motivo de este retraso es la moratoria

que hasta hace unos meses impedía la aprobación

de nuevos transgénicos en Europa, lo cual ha

condicionado profundamente el sector

biotecnológico en los países miembros. Esta

moratoria ha tenido una influencia notable en

retrasar el desarrollo de la agricultura molecular en

Europa, dado que las plantas biofactoría se

92

9. Conclusiones

encuentran en una fase más temprana de

desarrollo que otros OGMs (Organismos

Modificados Genéticamente). La incidencia de la

moratoria se ha visto reflejada en tres ejes clave: la

planificación de la política científica, la inversión

privada y la masa crítica del sector.

Por una parte ha afectado a la planificación de la

política científica, tanto europea, a través de sus

Programas Marco, como a las políticas científicas

de los estados miembros. Así, el apoyo a la

investigación en plantas transgénicas ha quedado

relegado a la investigación con fines básicos y los

proyectos con fines aplicados como el desarrollo

de plantas biofactoría se han visto excluidos de las

áreas prioritarias de I+D+i.

En segundo lugar, la combinación de la moratoria

con las barreras administrativas ha provocado que

las industrias farmacéuticas y agroalimentarias no

apuesten por la utilización de estos sistemas para

la obtención de productos, con la consiguiente

desinversión privada en la I+D de este sector. De

hecho, algunas de las empresas europeas de

mayor tamaño han decidido trasladarse a Estados

Unidos y Canadá, donde tienen más facilidades

para llevar a cabo sus investigaciones y desarrollar

sus productos.

Por último, y como resultado de este ambiente de

incertidumbre y de la falta de financiación tanto

pública como privada en Europa, se ha producido

un abandono paulatino por parte de algunos

grupos de las líneas de investigación relacionadas

con la agricultura molecular, lo que ha conducido a

una pérdida de masa crítica, imprescindible para

asegurar la competitividad del sector.

Los investigadores españoles consultados acerca

de las plantas biofactoría coinciden al señalar que

la falta de financiación pública o procedente de

empresas farmacéuticas, junto con la dificultad

para la autorización de usos confinados y

liberaciones voluntarias, son las principales

barreras y limitaciones con las que se encuentran

en la investigación.

Otro punto de coincidencia es el rechazo por parte

de la opinión pública de este tipo de plantas.

Cuando se habla de plantas modificadas

genéticamente se genera un cierto temor o

rechazo en la opinión pública, debido a que la

aplicación principal de las plantas es la obtención

de alimentos. El riesgo de que estos productos

puedan contaminar la cadena alimentaria hace

que productores de alimentos y consumidores se

opongan a su uso. Sin embargo, las plantas

biofactoría no están destinadas a la producción de

alimentos, sino que se trata de biofactorías, tal y

como lo son los biorreactores en los que se

cultivan microorganismos o células animales.

Por otra parte se encuentra la gran barrera que

supone la ausencia de una legislación específica

para uso no alimentario. Algunos investigadores

consideran que la normativa actual que regula las

actividades en las que se produzcan o empleen

OMGs es demasiado restrictiva y no está

justificada por datos científicos. Esta normativa

condiciona extraordinariamente la investigación, lo

cual unido a la falta de financiación ha llevado a

algunos grupos a abandonar sus líneas de

investigación en este campo.

No obstante, parece que en Europa se están

produciendo ciertos cambios que podrían auspiciar

un mejor futuro. La moratoria finalizó el 19 de

mayo del pasado año, con la autorización por la

Comisión Europea de la importación y procesado

de maíz dulce modificado genéticamente de la

línea Bt11 de Syngenta, aunque todavía no se ha

concedido la autorización para su cultivo.

Por otra parte, existe un proyecto europeo

denominado Consorcio Pharma-Planta, fundado por

la Comisión Europea como parte del Sexto Programa

Marco en el área denominada “Plant Platforms for

Immunotherapeutic Biomolecule Production”. Este

proyecto cuenta con 12 millones de euros y en él

participan 39 equipos de investigación de 11 países

europeos (ninguno español) y Sudáfrica. Su objetivo

es el desarrollo de estrategias eficientes y seguras

para la producción de proteínas terapéuticas en

plantas para la obtención de tratamientos para

enfermedades humanas como SIDA, diabetes, rabia

o tuberculosis.

Por último, es imprescindible disponer de un

entorno legal y administrativo claramente definido

y estable que permita la participación de los

distintos agentes del sector (empresas, grupos de

investigación, inversores privados) desde el

perfecto conocimiento de las reglas del juego. Esto

permitirá la correcta valoración de las

oportunidades de futuro y ayudará a definir y

afianzar sus posicionamientos.

A efectos de aprobación y coexistencia será

necesario considerar cada plataforma de manera

independiente, entendiendo una plataforma como la

combinación de planta, tecnología y producto, ya que

es esta combinación la que determina los riesgos

para la salud y el medio ambiente. Por otro lado,

resulta altamente conveniente la definición de

estrategias específicas de apoyo al desarrollo de

estas tecnologías por parte de las Administraciones

Públicas, así como el establecimiento de programas

de información pública.

93


ANEXO I. Proyecto Pharma-Planta

www.pharma-planta.org

El Proyecto Pharma-Planta es un consorcio de 39 equipos de investigación académicos y deempresas, de 11 países europeos y Sudáfrica. Elproyecto ha sido fundado por la Comisión Europeacomo parte del Sexto Programa Marco en el áreadenominada “Plant platforms forimmunotherapeutic biomolecule production” ycuenta con 12 millones de Euros para lainvestigación del uso de plantas modificadasgenéticamente para el desarrollo de tratamientospara enfermedades humanas como SIDA,diabetes, rabia y tuberculosis.

Sus objetivos son el desarrollo de estrategiaseficientes y seguras para la producción deproteínas terapéuticas en plantas, así como ladefinición de los procedimientos y métodos quepermitan la producción de estas proteínas deacuerdo con la normativa, de modo quefinalmente puedan obtenerse productos con unapureza y calidad suficiente para poder realizarensayos clínicos.

El proyecto se encuentra coordinado por el St Georges Hospital en Londres y por el InstitutoFraunhofer en Alemania y en él participanexpertos en las áreas de biología molecular,biología de plantas, inmunología, tecnologías deexpresión de proteínas recombinantes,biotecnología de plantas, vacunas, evaluación deriesgos y gestión de la propiedad industrial. A continuación se incluye una tabla con losparticipantes en este proyecto.

94

10. Anexos

95


País

CENTROS DE INVESTIGACIÓN DEL CONSORCIO PHARMA-PLANTA

Institución Página web

Alemania

Austria

Bélgica

Francia

Grecia

Irlanda

Italia

ReinoUnido

Suiza

Fraunhofer Institute of Molecular Biology and Applied Ecology

Institute of Molecular Biotechnology,RWTH - University of Aachen

University of Heidelberg

University of Münster

Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research(IPK)

University of Natural Resources and Applied LifeSciences

Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology

Université Catholique de Louvain

Centre de Coopération Internationale en RechercheAgronomique pour le Développment (CIRAD)

Université Blaise Pascal Clermont-Ferrand II

Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)

Agricultural University of Athens

National University of Ireland

Trinity College

Universita Degli Studi di Verona

Centre for the Management of Intellectual Propertyin Health Research and Development (MIHR)

St George's Hospital Medical School

www.ime.fraunhofer.de

www.biotec.rwth-aachen.de

www.uni-heidelberg.de

www.uni-muenster.de

www.ipk-gatersleben.de

www.boku.ac.at

www.vib.be

www.ucl.ac.be

www.cirad.fr

www2.univ-bpclermont.fr

www.inra.fr

www.aua.gr

www.nui.ie

www.tcd.ie

www.univr.it

Ente per le Nuove Tecnologie, l'Energia e l'Ambiente www.enea.it

Consiglio Nazionale Delle Ricerche

John Innes Centre

www.cnr.it

www.jic.bbsrc.ac.uk

www.mihr.org

www.sghms.ac.uk

Oxford Brookes University www.brookes.ac.uk

University of Warwick www.warwick.ac.uk

University of Cambridge www.cam.ac.uk

University of Glasgow www.gla.ac.uk

University of Leeds www.leeds.ac.uk

Université de Neuchâtel www.unine.ch

www.ime.fraunhofer.de

www.biotec.rwth-aachen.de

www.uni-heidelberg.de

www.uni-muenster.de

www.ipk-gatersleben.de

www.boku.ac.at

www.vib.be

www.ucl.ac.be

www.cirad.fr

www2.univ-bpclermont.fr

www.inra.fr

www.aua.gr

www.nui.ie

www.tcd.ie

www.univr.it

www.enea.it

www.cnr.it

www.jic.bbsrc.ac.uk

www.mihr.org

www.sghms.ac.uk

www.brookes.ac.uk

www.warwick.ac.uk

www.cam.ac.uk

www.gla.ac.uk

www.leeds.ac.uk

www.unine.ch

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103


EMPRESA PAÍSSISTEMA DEEXPRESIÓN

MOLÉCULAS

Agracetuswww.agracetus.com

Agrenvecwww.agrenvec.es

USA

España

Maíz y algodón Proteínas terapéuticas

Enzimas industrialesVirus TuMV

Bayer Cropsciencewww.bayercropscience.com

Chlorogenwww.chlorogen.com

Alemania

USA

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Cánola, algodóny arroz

Tabaco

Ceres Incwww.ceresbiotechnology.com USA ——

Dow Agroscienceswww.dowagro.com USA

Vacunas de uso veterinario

Anticuerpos de uso veterinario

Transcobalamina humana

Interferones

Factores de crecimiento

Biopolímeros (elastina)

Vacunas contra antrax,peste y cólera

Maíz

ANEXO IV. Empresas

Basf Plant Science GmbHwww.basf.de/en Alemania

Biopolímeros Cánola

Vitaminas

Biocem S.A./Biogemma S.A. Francia

Lactoferrina humana

Maíz y tabaco Lipasa gástrica

Vacuna contra la rabia

Biolex (Epicyte)www.biolex.com USA

Anticuerpos del VIH

Maíz Anticuerpos del Herpes Simplex

Microbicidas

Bioplanta Gmbhwww.bioplanta-leipzig.de Alemania AnticuerposTabaco

Biosecure Cropswww.growmax.biz Canadá Anticuerpos monoclonalesPatata

Calgene Inc USA XilanasasCloroplasto

Cellectis S.A.www.cellectis.com Francia FármacosPlantas

Chromatin Incwww.chromatininc.com USA Fármacos

Cobento Biotech Apswww.cobento.com Dinamarca

Factor intrínseco humanoArabidopsis

CropDesignwww.cropdesign.com Bélgica —Arroz

www.agracetus.com

www.agrenvec.es

www.bayercropscience.com

www.basf.de/en

www.biolex.com

www.bioplanta-leipzig.de

www.growmax.biz

www.cellectis.com

www.ceresbiotechnology.com

www.chlorogen.com

www.chromatininc.com

www.cobento.com

www.cropdesign.com

www.dowagro.com

104


MOLÉCULAS

Emlay And Associates

Era Plantechwww.eraplantech.com

USA

España

Cártamo Fármacos

CalcitoninaTabaco

Farmacule BioindustriesPty Ltdwww.farmacule.com

Australia Biopolímeros y proteínas deinterés terapéutico e industrial

Tabaco, banana,caña de azúcar y

leguminosas

Fibrogen Incwww.fibrogen.com USA Colágeno y gelatina

recombinantesTabaco y cebada

KWS Saat AG.www.kws.de Alemania Inulina

Maíz, trigo, cebada,caña de azúcar y

patata

Fort Dodge Veterianaria España Proteína VP60 de la fiebrehemorrágica del conejo

Potyvirus de laviruela del ciruelo

Genecor Internationalwww.genencor.com USA Enzimas industriales—

Genomine Incwww.genomine.com Corea del Sur Vacunas animales y

humanas comestiblesTomates y tabaco

Greenovation Biotech GmbHwww.greenovation.com Alemania Factor IXMaíz

Greentec GmbH Alemania Colágeno y gelatina bovina—

Guardian Biotechnologieswww.guardianbio.com Canadá

Fármacos

Vacunas

Hormonas

Melón coreano,tabaco, cánola y

mostaza

Icon Genetics Agwww.icongenetics.com Alemania/USA

Enzimas de restricción

Interferón α y β

Somatotropina

Anticuerpos de cadena sencilla

Anticuerpos monoclonales

Antígenos

Glucocerebrosidasa

Taumatina

Álbumina

ADNasa

Inhibidor de ARNasa

Insulina

Tabaco

Ingenasawww.ingenasa.es España ——

www.eraplantech.com

www.farmacule.com

www.fibrogen.com

www.genencor.com

www.genomine.com

www.greenovation.com

www.guardianbio.com

www.icongenetics.com

www.ingenasa.es

www.kws.de

105


MPB Cologne GmbH Alemania Anticuerpos y fragmentos deanticuerposPatata y cánola

Novartiswww.novartis.com

Nexgen Biotechnologies, Incwww.nexgenbiotech.com

Neorx Corporationwww.neorx.com

Monsanto Protein Technologywww.mpt.monsanto.com

Multinacional

Corea del Sur

USA

USA

Enzimas

Hormonas (diagnóstico del hipoe hipertiroidismo)

Proteínas para eldiagnóstico de HFRS

EGF

Vacunas comestibles de usoveterinario

Proteínas terapéuticas contra el cáncer. Avidicina

Avicidina (MAbs)

Plantas

Melón coreano

—

Maíz


MOLÉCULAS

Kosan Bioscience Inc.www.kosan.com USA Enzimas

(poliquétido sintasas)Tabaco

Metabolixwww.metabolix.com USA Biopolímeros (PHAs)Tabaco, alfalfa

y mijo

Large Scale Biologywww.lsbc.com USA

Vacuna contra el cáncerTabaco

α-Galactosidasa

Limagrain Groupwww.limagrain.com Francia —Maíz

Maltagen Forschung GmbHwww.maltagen.de Alemania

Lactoferrina

CebadaLisozima


Vacuna contra hepatitis

Maxigen Incwww.maxygen.com USA ——

Medicagowww.medicago.com Canadá

Proteínas plasmáticas

Nutracéuticos

Enzimas industriales

Colágeno

Anticuerpos monoclonales

Alfalfa

Mendel Biotechnologywww.mendelbio.com USA ——

Meristem Therapeuticswww.meristem-therapeutics.com Francia

Lipasa gástrica

Tabaco y maíz HSA como excipientepara vacunas

Lactoferrina

www.kosan.com

www.lsbc.com

www.limagrain.com

www.maltagen.de

www.maxygen.com

www.medicago.com

www.mendelbio.com


www.metabolix.com

www.mpt.monsanto.com

www.neorx.com

www.nexgenbiotech.com

www.novartis.com

106


MOLÉCULAS

Novoplant GmbHwww.novoplant.com Alemania

Anticuerpos recombinantes decadena sencilla de usoveterinario

Guisante,patata y soja

Serological Corporationwww.serologicals.com

Plantigen Incwww.lhsc.on.ca/plantigen

Planton GmbHwww.planton.de

Planet Biotechnologywww.planetbiotechnology.com

Progenco Cowww.progenco.com

Phytomedicswww.phytomedics.com

Phylogixwww.phylogix.com

USA

Canadá

Alemania

USA

ReinoUnido

USA

USA

—

Cuerpos lipídicos

GAD & citoquininas contradiabetes tipo I

Proteínas humanas terapéuticasy de diagnóstico

Péptidos antimicrobianos

IL-10

IgGs contra la caries yresfriado común

Enzimas

Proteínas terapéuticas

Proteínas terapéuticas

—

Stem cell factor (SCF)

Factor estimulante de lascolonias de granulocitosmacrófagos

—

Tabaco

Plantgenixwww.plantgenix.com USA ——

Plantechno Srlwww.plantechno.com Italia

Enzimas con aplicacionesindustriales

Arroz y trigo

Prairie Plant Systems Incwww.prairieplant.com Canadá Glicoproteína B

de hCMVTabaco

Patata

Plant Bioproducts, S. L.www.plantbioproducts.com España

Antígenos de la enfermedadhemorrágica del conejo y fiebreaftosa bovina

Cloroplastos

Tabaco

Girasol, maíz ytabaco

Pioneer Hi-BredInternational Incwww.pioneer.com

MultinacionalBiopolímeros

Cánola

Tabaco ytomate

—

Orf Geneticswww.orfgenetics.com Islandia

Interleukina-3

Lechugay cebada

Interferón β

Eritropoyetina

Prodigenewww.prodigene.com USA

Vacunas contra Hepatitis BMaíz

Aprotinina

Sembiosys Genetics Inc.www.sembiosys.ca Canadá

FármacosCártamo

www.novoplant.com

www.orfgenetics.com

www.phylogix.com

www.phytomedics.com

www.pioneer.com



www.plantechno.com

www.plantgenix.com

www.lhsc.on.ca/plantigen

www.planton.de

www.prairieplant.com

www.prodigene.com

www.progenco.com

www.sembiosys.ca

www.serologicals.com

107



MOLÉCULAS

Stauffer Biotech

Yissum ResearchDevelopment Cowww.yissum.co.il

USA

Israel

Avidina

Clorofilasa recombinanteterapéutica

Maíz

Tabacoy tomate

β-Glucuronidasa

Subterra*www.subterrallc.com USA Glicoproteína B de hCMVTabaco

Sungene GmbH & Co.www.sungene.de Alemania

Tocoferoles

Vitamina K

Enzimas industriales

Tomate,patatas, tabaco,

cánola yArabidopsis

Syngene Biotek Canadá PéptidosantimicrobianosTabaco y patatas

Syngenta Biopharmawww.syngenta.com/en/biopharma Suiza AnticuerposCártamo

Toxin Alertwww.toxinalert.com Canadá AnticuerposTabaco y patata

Unicropwww.unicrop.fi Finlandia

Anticuerpos monoclonalesCebada

Proteínas de interés terapéuticos

Ventria Biosciencewww.ventriabio.com USA

Alternativos a antibióticos de uso veterinario: lactoferrina y lisozima

Arroz

* Joint venture con Prairie Plant Systems Inc.

www.subterrallc.com

www.sungene.de

www.syngenta.com/en/biopharma

www.toxinalert.com

www.unicrop.fi

www.ventriabio.com

www.yissum.co.il

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2002

US6420548

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US6388068

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2001

WO

0120974

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US6288302

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109


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US6210742

US6183762

WO

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US6146645

US6066781

US6020169

CA2385348

WO

9916890

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37532

US5994628

US5948682

US5939288

US5990385

US5889189

US5888789

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CA2353071

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US5763748

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Intl.

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Intl.

Mogen

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2001

2001

2000

2000

2000

2000

2000

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1999

1998

1998

1998

1998

1998

141

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1998

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1997

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1997

1997

1997

1997

1996

1996

1996

1995

1995

1995

111


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WO

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WO

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US6218145

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2000

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WO

199910513

US5932479

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WO

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1998

WO

9732977

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.1997

US5693507

Gen

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.1997

US5576198

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Prodig

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2003

2003

WO

02068927

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2002

WO

0205922

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1997

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2003

2003

WO

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ADN Ácido desoxirribonucleico.

AGE Administración General del Estado.

AMV Virus del mosaico de la alfalfa.

APHIS Animal and Plant Health Inspection Service.

ARN Ácido ribonucleico.

BIO Biotechnology Industry Organization.

CACCP Análisis de contención y puntos de control crítico.

CICYT Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología.

CMV Virus del mosaico del caupí.

EMEA European Medicines Agency.

FECYT Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología.

FDA Food and Drug Administration.

HMGR2 Hidroxil-3-metilglutaril Coenzima A reductasa 2.

Ig Inmunoglobulina.

MARS Matrix attachment regions.

mRNA ARN mensajero.

NFPA United States National Food Processing Association.

OMG Organismo modificado genéticamente.

PHA Polihidroxilalcanoato.

PHB Poli (3-hidroxibutirato).

PPP Potyvirus de la viruela del ciruelo.

PST Proteína soluble total.

PVX Virus X de la patata.

RE Retículo endoplásmico.

TBSV Virus del enanismo ramificado del tomate.

TMV Virus del mosaico del tabaco.

TuMV Potyvirus del mosaico del nabo.

USDA United States Department of Agriculture.

126

12. Lista de abreviaturas

• Agrobacterium tumefaciens: Bacteriapatógena de plantas capaz de insertar en éstasuna parte de su material genético a través deheridas. Esta capacidad se aprovecha paraintroducir genes en plantas, sustituyendoalgunos de los genes que contiene la bacteriapor los genes de interés.

• Alérgeno: Sustancia capaz de desencadenaruna respuesta inmune en determinadosorganismos.

• Anticuerpo: Proteína sintetizada por el sistemainmunológico como respuesta a la presencia deuna sustancia extraña, a la que se une demanera selectiva.

• Antígeno: Sustancia capaz de desencadenar laproducción de anticuerpos por el sistemainmunológico.

• Aparato de Golgi: Compartimento celularimplicado en la glicosilación y direccionamientode proteínas, formado por un conjunto devesículas y sacos aplanados limitados pormembranas.

• Apoplasto: Espacio que existe entre la paredcelular y la membrana plasmática en la célulavegetal.

• Ácido ribonucleico mensajero (mRNA):Molécula de ARN transcrita a partir de unamolécula de ADN, que puede ser traducida a unacadena polipéptidica cuya secuencia deaminoácidos viene codificada en su secuencia.

• Autenticidad estructural: Característica de laproteína recombinante por la que su estructuraes idéntica a la de la proteína nativa,conservando su función biológica.

• Citosol: Porción fluida del citoplasma.

• Cloroplasto: Orgánulo subcelular característicode las células vegetales en cuyo interior serealiza la fotosíntesis, que contiene su propiomaterial genético.

• Confinamiento: Se refiere a las medidas detipo agronómico o biológico que se utilizan conel fin de limitar el contacto de un organismocuyo material genético ha sido modificado con lapoblación y el medio ambiente.

• Cultivo hidropónico: Sistema de cultivo deplantas en el que el suministro de los nutrientesse realiza a través de una disolución embebidaen un sustrato inerte.

• Efectos de posición: Variaciones en los nivelesde expresión de un transgén debidos al lugar deinserción del mismo en el genoma de la planta.

• Efectos epigenéticos: Modificaciones nomutacionales, generalmente no heredables y decarácter no permanente.

• Electroporación: Aplicación de pulsos eléctricosde elevado voltaje que inducen la formación deporos reversibles en la membrana deprotoplastos u otras células, a través de loscuales puede introducirse material genético en lacélula.

• Epítopo: Cualquier estructura o secuencia quees reconocida por un anticuerpo. Tambiéndenominado determinante antigénico.

• Expresión transitoria: Expresión de genesforáneos sin necesidad de que se produzcaintegración de estos genes en el genoma de lacélula transformada.

• Glicosilación: Adición covalente de moléculasde azúcares denominadas glicanos adeterminados aminoácidos de cadenaspolipeptídicas.

• Hirudina: Anticoagulante natural obtenido apartir de la sanguijuela.

• Intrón: Fragmento de ADN de los genes deeucariotas que se transcribe a ARN y eseliminado durante la maduración del mRNA, porlo que no se traduce a proteínas.

• Lignina: Molécula orgánica compleja queimparte rigidez y fortaleza a las paredessecundarias de la célula vegetal.

• Lipofílico: Que presenta afinidad por las grasas.

• Micotoxina: Sustancia tóxica producida porhongos que tiene efectos negativos agudos y/ocrónicos sobre la salud de los animales y de losseres humanos. Varias de ellas están clasificadascomo carcinógenos o posibles carcinógenos paralos seres humanos.

127


13. Glosario

• Micropropagación: Multiplicación in vitro y/oregeneración de materiales vegetales encondiciones asépticas en medios de cultivo quecontienen los nutrientes esenciales para elcrecimiento.

• Modificaciones postraduccionales: Conjuntode modificaciones que pueden producirse en lasproteínas una vez sintetizadas, encaminadas aque adquieran una configuración adecuada.

• Neutropenia: Déficit anormal de célulasneutrófilas en la sangre como consecuencia delcual las personas afectadas son mássusceptibles a infecciones.

• Oleosinas: Proteínas lipofílicas implicadas en laformación de estructuras de almacén de lípidos.

• Oligosacárido: Hidrato de carbono formado porla unión de entre dos y diez monosacáridos.

• Operón policistrónico: Conjunto de genescontrolados por un único promotor que setranscriben en un único mRNA.

• Péptido señal: Secuencia de 15 a 30aminoácidos situada en el extremo aminoterminal de una proteína que contieneinformación acerca del destino final de laproteína en la célula.

• Plantas transplastómicas: Plantastransgénicas en las que el gen foráneo se hainsertado en el material genético de loscloroplastos en lugar de en el núcleo celular.

• Plásmido Ti: Molécula de ADN circular de labacteria Agrobacterium tumefaciens quecontiene los genes responsables de la inducciónde tumores en plantas. Se utiliza como vectorpara introducir ADN foráneo en plantas.

• Plastoma: Material genético de los cloroplastos.

• Prión: Agente infeccioso responsable de variasenfermedades neurodegenerativas en losmamíferos entre las que se encuentra laencefalopatía espongiforme bovina o “mal de lasvacas locas”.

• Promotor: Secuencia de ADN adyacente al gennecesaria para que éste sea transcrito a ARN.También denominado secuencia promotora.

• Proteína recombinante: Proteína cuyasecuencia de aminoácidos está codificada por ungen clonado.

• Proteína foránea: Proteína procedente de otroorganismo.

• Protoplasto: Célula a la que se ha eliminado lapared celular mediante procesos químicos oenzimáticos. En suspensión son capaces deincorporar de manera natural fragmentos deADN que se encuentren en el medio.

• Recombinación homóloga: Proceso por el cualse pueden intercambiar fragmentos entre dosmoléculas de ADN a través de secuenciasidénticas de nucleótidos.

• Retículo endoplásmico: Sistema membranosoformado por una red de sáculos o cisternasaplanados y vesículas que se encuentra en elcitoplasma celular. Interviene en la síntesis y eltransporte de proteínas.

• Secuencia líder: Secuencia que aparece en elmRNA en el extremo 5’ que no es traducida aproteínas.

• Secuencias oncogénicas: Secuencias quecodifican genes que estimulan la reproduccióncelular provocando crecimientos incontroladosque causan la formación de tumores.

• Silenciamiento: Conjunto de fenómenos quepueden inhibir la expresión de los transgenesinsertados en una planta.

• Somatotropina: Hormona secretada pormamíferos que estimula la síntesis de proteínasy el crecimiento de los huesos largos en piernasy brazos. También denominada hormona decrecimiento.

• Traducción: Proceso mediante el cual seproduce la síntesis de polipéptidos a partir de unmRNA que codifica la secuencia de aminoácidosde los mismos.

• Transcripción: Proceso mediante el cual seforma una molécula de mRNA a partir de unmolde de ADN.

• Transgén: Gen procedente de un organismoque se ha incorporado en el genoma de otro.

• Vacuna: Preparación de un organismo patógenomuerto o atenuado, o de determinantesantigénicos derivados, capaz de inducir unarespuesta inmune duradera y protectora contraese patógeno.

• Vacuna atenuada: Vacuna producida a partirde un organismo patógeno vivo que ha sido

128

modificado para obtener una forma menosvirulenta.

• Vacuna de subunidades: Vacuna elaborada apartir de proteínas u otras moléculasprocedentes de un organismo patógeno, capacesde inducir una respuesta inmune. Estasmoléculas pueden obtenerse mediantepurificación a partir del organismo patógeno opueden sintetizarse artificialmente.

• Vacuna inactivada: Vacuna elaborada a partirde organismos patógenos completos tratadospara eliminar su capacidad infectiva.

• Vacuola: Estructura muy abundante en célulasvegetales, que consiste en una cavidad rodeadade una membrana en la que se acumulandistintos productos.

• Variación somaclonal: Cambios genéticos oepigenéticos que aparecen de forma espontáneaen el cultivo in vitro de tejidos.

• Vector: Vehículo de transferencia de un genforáneo a un organismo hospedador, quecontiene todos los elementos necesarios para suexpresión. Suelen ser virus o plásmidosmodificados por ingeniería genética.

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Plantas biofactoría Sector agroalimentario · La utilización de plantas como biofactorías de...

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