Producción de especies reactivas de oxígeno y sistema de defensa antioxidativo de la raíz de arveja

tratado con iones de plomo a nivel mitocondrial y peroximal”

Integrantes: Francisco Ortiz Valentina RomoKaren Venegas R

Introducción

Se ha demostrado que los metales pesados tales como Cd, Pb, Cu y Zn causan la generación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y contribuyen a la aparición de condiciones de estrés oxidativo en las células vegetales

Existen numerosas fuentes potenciales de ROS en las células vegetales, es decir, los cloroplastos, mitocondrias, los peroxisomas, la membrana celular, membrana nuclear y el retículo endoplásmico, y apoplasto.

El sistema enzimático en plantas se compone de: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), ascorbato peroxidasa (APOX), y el sistema no enzimático consiste en componentes de baja masa molecular (glutation, a-tocoferol, y ascorbato). Por otra parte, las mitocondrias de plantas tienen mecanismos para la regulación de la producción de ROS, como oxidasa alternativa (AOX).

Objetivos

Determinar que especies reactivas de oxígeno y sistema de defensa antioxidativo responde a distintas concentraciones de iones de plomo (Pb) [0.1 mM y 0.5 mM] a nivel de mitocondria y peroxisoma en el tejido de la raíz de arveja.

Materiales y métodos Materiales y métodos:  Plántulas de arvejas

hidropónicamente . Para plantas tratadas con Pb, la solución era complementada con los iones de plomo [0,1 ó 0,5 mM de Pb(NO3)2]. El aislamiento de las mitocondrias de las células de la raíz del guisante se llevó a a cabo con las raíces de las plantas frescas cosechadas después de 48 y 72 h de cultivo.

El aislamiento de las mitocondrias y los peroxisomas Se realizo mediante gradiente de Percoll.

Determinación de peróxido de hidrógenoEn las fracciones aisladas de las raíces de arvejas, mitocondriales, peroxisomales y citosomales, se determinó el nivel de peróxido de hidrógeno de acuerdo a Becana. 

 Determinación de la actividad de enzimas antioxidantesLa actividad de SOD fue ensayada mediante la medición de inhibir la reducción fotoquímica de nitro azul de tetrazolio (NBT), adoptando el método de Beauchamp y Fridovich. Para el CAT se uso el método de Aebi. En tanto para el APOX fue mediante el método de Nakano y Asada.

Electroforesis PAGE de las enzimas antioxidantes : Las fracciones de mitocondria purificada de peroxisomas y el citosol fueron analizadas por electroforesis. El SOD fue determinado mediante Beauchamp y Fridovich. APOX fue detectada siguiendo el procedimiento de Mittler y Zilinskas (1993), y la actividad de CAT se ha detectado de acuerdo a Woodbury.

  Aislamiento de RNA total y RT-PCR: En la reacción de PCR, se utilizó primers

específicos: AOX2d y AOX2r. Como gen de referencia, se utilizó el gen de la tubulina, (no hay cambio influenciado por el estrés frente al plomo). Las condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 94 ºC-2 min de desnaturalización, de alineamiento 54°C - 30 s de cebadores, 72 °C - 1 min de la elongación de primers, 10 min de la elongación final. Los ciclos fueron 30 veces.

Secuenciación de ADN : La ligadura con pGEM-T Easy (Promega). Se utilizó enzima restrictiva EcoRI. La secuenciación se realizó con un sistema de análisis de ADN secuenciador Beckman Coulter

Cuantificación de proteínas: El contenido total de proteínas solubles se determinaron de acuerdo con el método de Bradford, utilizando el ensayo de Bio-Rad kit con BSA como un patrón de calibración.

Resultados

Figura 1: Cambios ultraestructurales en la mitocondria y Peroxisomas de celulas de raiz de Pisum

sativum por Microscopia electronica de transmisión A. Mitocondria y peroxisoma de controlB. Mitocondria y peroxisoma de tratado con

iones de Pb [0.1 mM]C. Mitocondria y peroxisoma de tratado con

iones de Pb [0.5 mM]

Resultados

Figura 2: Efecto de la produccion de peroxido de hidrçogeno en el citosol (C), peroxisomas (P) y mitocondrias (P)en fracciones de 0.1 y 0.5 mM Pb(NO3)2 tratadas 48 y 72 horas en tejido de raiz de arvejas

Resultados

Discusiones

En el funcionamiento de una célula vegetal la presencia de Pb causa inactivación de enzimas, disminución de las crestas mitocondriales, trastornos en el funcionamiento de succinato deshidrogenasa, formación de ROS.

Como defensa se genera H2O2 en las mitocondrias. Así, la

mitocondria y peroxisoma son generadores básicos de peróxido de hidrógeno, lo cual está relacionado con la función de la oxidación mediante el uso de oxígeno molecular.

El estrés oxidativo, provocado por la influencia de plomo de 0,5 mM Pb(NO3)2, extendido a 72 horas resultó en una disminución de la

producción de H2O2 en todas las fracciones celulares, al mismo

tiempo se observó una disminución de la actividad de SOD y CAT en estas condiciones de estrés mas intensas.

Discusiones y conclusiones

Las células vegetales su protegen a sí mismos contra la influencia perjudicial de la los metales pesados mediante la activación de los mecanismos que van a restringir la fitotoxicidad de los metales a través de vacuolas de y reparar los efectos negativos que ha causado como es el caso de antioxidantes enzimáticos o no enzimáticos.

La protección eficaz contra el estrés causado por los metales pesados es posible debido a la presencia de mecanismo de defensa eficientes, con la participación tanto de desintoxicación y los procesos de antioxidantes. Los más activos en la protección antioxidante es la forma MnSOD mitocondrial y en el citosol, la forma Cu, ZnSOD.

Discusiones y conclusiones

De la secuenciación del gen AOX se encontró una similitud del 80% al genes AOX en A. thaliana y plantas de G. max, esto se debe a los dominios conservados.

La falta de similitud de aminoácidos de P. sativum y A. thaliana no es sorprendente ya que estas especies pertenecen a dos familias diferentes: Fabaceae y Brassicaceae.

Es necesario mantener el equilibrio intracelular entre la generación y eliminación de ROS. El mantenimiento del redox como la homeostasis requiere una coordinación eficaz de las reacciones que ocurren en los compartimentos celulares diferentes y también su mantenimiento a través de la cooperación compleja de pro y los sistemas antioxidantes.

No obstante, existen estudios que no confirman la participación de la mitocondria en la generación de ROS en respuesta al estrés.