19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 263 50251© Int. Cl.:

C12N 15/82 (2006.01)

A01H 5/00 (2006.01)

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 00977181 .786© Fecha de presentación : 13.11.200087© Número de publicación de la solicitud: 124260487© Fecha de publicación de la solicitud: 25.09.2002

54© Título: Promotor inducible químicamente usado para obtener plantas transgénicas con un marcador silen-cioso y procedimiento de uso del mismo.

30© Prioridad: 12.11.1999 US 438392

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:16.12.2006

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:16.12.2006

73© Titular/es: The Rockefeller University1230 York AvenueNew York, New York 10021-6399, US

72© Inventor/es: Zuo, Jianru yChua, Nam-Hai

74© Agente: Carpintero López, Francisco

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

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DESCRIPCIÓN

Promotor inducible químicamente usado para obtener plantas transgénicas con un marcador silencioso y procedi-miento de uso del mismo.

Antecedentes de la invención

Las técnicas transgénicas se han convertido en una potente herramienta para abordar los importantes problemasbiológicos en los organismos multicelulares, y esto es particularmente cierto en el sector de las plantas. Muchosenfoques que era imposible implementar mediante la genética tradicional se pueden realizar ahora mediante técnicastransgénicas, incluida la introducción de genes homólogos o heterólogos en las plantas, Con funciones modificadas ypatrones de expresión alterados. El éxito de tales técnicas a menudo depende del uso de marcadores para identificarlas plantas transgénicas y los promotores para controlar la expresión de los transgenes.

Los marcadores seleccionables se usan ampliamente en la transformación de plantas. Históricamente, tales marca-dores a menudo han sido genes dominantes que codifican resistencia a antibióticos o a herbicidas (Yoder yGoldsbrough, 1994). Aunque tales marcadores son muy útiles, sí presentan algunos inconvenientes. Los antibióticosy herbicidas usados para seleccionar las células transformadas en general poseen efectos negativos sobre la prolifera-ción y la diferenciación y pueden retrasar la diferenciación de brotes esporádicos durante el proceso de transformación(Ebinuma y col., 1997). Asimismo, algunas especies vegetales son insensibles o tolerantes a estos agentes selectivosy, por tanto, es difícil separar las células o tejidos transformadas y no transformadas (Ebinuma y col., 1997). Además,estos genes se expresan de forma constitutiva y la inserción de tales genes de expresión constitutiva en plantas quese cultivan fuera de un contexto de laboratorio supone un problema ambiental y sanitario (Bryant y Leather, 1992;Gressel, 1992; Flavell y col., 1992).

Un marcador que no es un antibiótico ni un herbicida es el gen ipt del plásmido Ti de Agrobacterium tumefa-ciens. Este gen codifica la isopenteniltransferasa, que se usa en la síntesis de citoquinina (Barry y col., 1984). Laisopenteniltransferasa usa 5’-AMP y difosfato de isopentenilo para catalizar la formación de isopentenil-adenosina-5’-monofsofato, el primer producto intermedio en la biosíntesis de la citoquinina. La sobreexpresión del gen ipt con-duce a niveles elevados de citoquinina (Medford y col., 1989; McKenzie y col., 1998; Faiss y col., 1997; Redig y col.,1996; Ebinuma y col., 1997). Las citoquininas son hormonas vegetales que desempeñan un importante papel en eldesarrollo de la planta mediando en una serie de cambios morfológicos (Mok y Mok, 1994; Davies, 1995; Coenen yLoma, 1997). Por ejemplo, las citoquininas son capaces de estimular la expansión de la hoja y el retraso de la senes-cencia de la hoja (Kuraish y Okumura, 1956; Wingler y col., 1998; Gan y Amasino, 1995). En plántulas jóvenes encrecimiento oscuros, los niveles elevados de citoquinina puede producir un fenotipo deetiolado, similar a la morfologíade las plántulas en crecimiento claro con hipocotilos cortos, ganchos abiertos y cotiledones expandidos (Chaudhuryy col., 1993; Miklashevichs y Walden, 1997). Las citoquininas también pueden emitir yemas laterales de dominanciaapical, y estimular de novo la formación de yemas (Cline, 1991; Skoog y Miller, 1957; Sachs y Thimmann, 1967).Por tanto, esta clase de hormonas desempeña un papel crítico en la formación de brotes extraños. Como demostraronSkoog y Miller (1957), los niveles elevados de citoquinina pueden inducir la diferenciación del SHOT de los callos detabaco, un requisito previo para la regeneración de plantas transgénicas. Además de soportar el crecimiento tumoral, laintroducción de t-ADN en una célula vegetal también puede inducir regeneración de brotes fisiológicamente anómalosa partir de protoplastos transformados o de discos de hojas.

La sobreexpresión del gen ipt (Akiyoshi y col., 1984; Barry y col., 1984), un componente del ADN-T conduce a unincremento de la citoquinina con respecto a la auxina, lo que desencadena la regeneración del brote (Tran Thanh Van,1981). Esta sobreproducción de brotes puede tener como resultado un fenotipo de un gran número de brotes (en losucesivo “fenotipo en brote”. Este fenotipo se puede usar como marcador (Ebinuma y col., 1997). Los estudios usandoel gen ipt bajo el control de promotores constitutivos mostraron que la sobreexpresión de ipt causa niveles elevadosde citoquinina en plantas transgénicas (Smigocki y Owens, 1988; Medford y col., 1989). Un gen ipt quimérico bajo elcontrol del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) se ha introducido en células de patata (Ooms y col, 1983), de pepino(Smigocki y Owens, 1988) y varias especies de Nicotiana (Smigocki y Owens, 1988) y estas células transgénicasproliferaron y exhibieron un fenotipo en brote extremo y pérdida de dominancia apical en medio sin hormonas. Losestudios han mostrado que en plantas transformadas con ipt para sobreproducir citoquininas, las citoquininas sólofuncionan localmente como hormona paracrina (Faiss y col., 1997). Los experimentos de injertos realizados conplantas de tabaco de tipo salvaje y plantas de tabaco en las que el gen ipt se había sobreexpresado mostraron que losmayores niveles de citoquinina permanecían restringidos a la parte de la planta que sobreexpresó ipt (Faiss y col.,1997).

Un problema con el uso de ipt expresado de forma constitutiva como marcador es que las plantas transgénicasresultantes pierden la dominancia apical y son incapaces de enraizar debido a la sobreproducción de citoquininas(Ebinuma y col., 1997), Además, las plantas que sobreexpresan de forma constitutiva ipt poseen una morfologíaalterada de las hojas y una senescencia de las hojas retrasada. Tales plantas muestran poco crecimiento de la raíz ymala elongación de los internódulos, exhiben un retraso en la senescencia de las hojas y, muy a menudo, son estériles(Mok y Mok, 1994; Klee y col., 1987; Ebinuma y col., 1997).

Ebinuma y col. (1997) desarrollaron un procedimiento para usar el marcador ipt para superar los problemas asocia-dos con la sobreexpresión constitutiva de ipt. Desarrollaron un vector en el que el gen ipt se insertó en un plásmido que

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incluía el elemento de trasposición Ac. El constructo incluyó el ADN-T (porción del plásmido Ti que se transfiere a lascélulas vegetales) y el promotor 35S del CaMV. Este constructo se transformó en A. tumefaciens. Segmentos de hojasse inocularon con las bacterias transformadas y se cultivaron en medios no selectivos. En casos raros, el elemento Acno se reintegró o se integró en una cromátida hermana tras su escisión. Los brotes anómalos con un fenotipo en broteadicional se seleccionaron y cultivaron durante seis meses más. De estos, crecieron varios brotes normales. Algunosde estos fueron el resultado de la escisión del elemento de trasposición Ac del genoma junto con el gen ipt, comodeterminan los análisis de ADN. Algunas de estas plantas conservaron los otros marcadores necesarios, que tambiénse habían incluido en el plásmido. Por tanto, este procedimiento supera los problemas de tener presente un gen iptexpresado de forma constitutiva. Por desgracia, este procedimiento requiere muchos meses de cultivo y tiene comoresultado únicamente algunas plantas que han perdido el gen ipt. Ebinuma y col., (1997) informan que 6 meses des-pués de la infección, la frecuencia de plantas sin marcador era de 0,032%. Además la selección de brotes “normales”de entre los regenerantes anómalos se basó en un criterio morfológico variable. La selección morfológica tampocodistingue entre plantas que han perdido el gen ipt-35S y plantas quiméricas o plantas con un nivel de expresión de iptmuy bajo.

El uso de promotores inducibles es otro medio que se ha usado para superar los problemas asociados con lasobreexpresión constitutiva del gen ipt en plantas transgénicas. El uso de un promotor inducible con cobre para regularla expresión de ipt condujo a la expresión específica del gen ipt en las raíces, el órgano principal para la biosíntesis decitoquinina (McKenzie y col., 1998). Además„ la expresión de ipt regulada por el sistema inducible de tetraciclinas(Gatz y col., 1992) proporcionó datos sobre los efectos biológicos de las citoquininas en plantas y su transporte a travésdel sistema vascular (Faiss y col., 1997; Redig y col., 1996). También se han comunicado plantas transgénicas queportan el gen ipt bajo el control de promotores inducibles del shock térmico (Medford y col., 1989) y ligeros (Redig ycol., 1996). Todos estos sistemas se usaron para estudiar los efectos biológicos de las citoquininas y no se usaron parala transformación.

Recientemente se ha identificado el gen CKI1 (Kakimoto, 1996). La sobreproducción de este gen en las plantastiene como resultado plantas que exhiben respuestas de citoquinina típicas, incluida la división celular rápida y laformación de brotes en cultivo tisular en ausencia de citoquinina exógena (Kakimoto, 1996). El gen CKI1 se puedeusar como marcador seleccionable de un modo similar al ipt, es decir el gen CKI1 se puede colocar bajo el control deun promotor y sobreexpresarse en células de plantas transgénicas, induciendo de este modo la formación de brotes enausencia de hormonas vegetales exógenas. Tales brotes se pueden escindir, con lo que se obtienen plantas transgénicas.Tales brotes, obtenidos de células transformadas con ipt o con CKI1, no pueden cultivarse con normalidad mientraslas células sobreexpresan estos transgenes.

El gen knotted y los genes de tipo knotted son un tercer grupo de genes que cuando se sobreexpresan puedenconducir a la producción ectópica de brotes accidentales (Chuck y col., 1996; Lincoln y col., 1994; Matsuoka y col.,1993). Estos se pueden usar como marcadores seleccionables del mismo modo que los genes ipt y CKI1. En general,todos los genes de plantas que puedan inducir la regeneración y desarrollo de brotes se pueden usar como marcadoresseleccionables del mismo modo que los genes ipt, CKI1 y de tipo knotted.

Además del uso de marcadores para identificar plantas transgénicas, el uso de promotores para controlar la expre-sión de los transgenes es una parte normal de dichos experimentos. En la mayoría de los experimentos, los transgenesse transcriben a partir de un promotor fuerte, tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Sinembargo, se necesita un sistema de expresión génica más flexible para extraer beneficios de la tecnología transgénica.Se desean buenos sistemas de transcripción inducible porque las plantas transgénicas con fenotipos inducibles sonútiles como mutantes condicionales aislados mediante genética tradicional. A este respecto, se han comunicado y sehan usado con éxito varios sistemas de inducción (Ainley y Key, 1990; Gatz y col., 1992; Mett y col, 1993; Weinmanny col., 1994). Entre estos, los sistemas de expresión dependientes de tetraciclinas son los más avanzados (para unarevisión, véase Gatz, 1996).

El receptor de glucocorticoides (GR) es un miembro de la familia de los receptores de hormonas esteroides ani-males. El GR no sólo es una molécula receptora sino también un factor de transcripción que, en presencia de unglucocorticoide, activa la transcripción desde promotores que contienen elementos de respuesta a glucocorticoides(GRE) (para revisiones, véase Beato, 1989; Picard, 1993). Se ha pensado que el sistema GR podría ser un buensistema de inducción en plantas porque es sencillo, y el propio glucocorticoide no causa ningún efecto pleiotrópi-co en las plantas. No obstante, anteriormente no se ha construido un sistema general y eficaz inducible por gluco-corticoides usando GR para plantas transgénicas, aunque se ha demostrado que un sistema que comprenda GR yGRE podría funcionar en un sistema de expresión transitorio con células vegetales cultivadas (Schena y col., 1991).Por otro lado, se ha comunicado que la región reguladora (hormonal) (o dominios) de GR podrían regular la fun-ción de los factores de transcripción vegetales en plantas transgénicas (Aoyma y col., 1995; Lloyd y col., 1994).Lloyd y col. (1994) mostraron que el desarrollo del tricoma en Arabidopsis podrían controlarse de forma satisfac-toria mediante una proteína quimérica que comprende dominios reguladores de glucocorticoides y el regulador dela transcripción de maíz R. sin embargo, la construcción de tal factor de transcripción quimérico cuya actividad es-tá estrechamente regulada por el dominio receptor del glucocorticoide no siempre es fácil ni se puede conseguir encada caso. La regulación estrecha parece depender críticamente de la estructura intramolecular de la proteína quimé-rica, especialmente la posición relativa entre el dominio receptor del glucocorticoide y el dominio cuya función deberegularse.

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Se piensa que la región reguladora de los receptores de hormonas esteroideas animales, que incluye un dominio deunión a hormona (HBD) y sitios de unión para HSP90, posee efectos represivos sobre los dominios adyacentes cova-lentemente unidos en ausencia de sus ligandos relacionados, y la unión del ligando adecuado a un HBD tiene comoresultado desrepresión (Picard, 1993). Se obtuvieron ventajas de este mecanismo mediante el diseño de un factor detranscripción en el que una función de transactivación constitutivamente activa estaba regulada por la región regula-dora del GR de rata en cis (Picard y col., 1988; Rusconi y Yamamoto, 1987). Como una función de transactivaciónconstitutivamente activa se escogió un factor de transcripción quimérico que comprende el dominio de unión a ADNdel factor de transcripción de levaduras GAL4 (Keegan y col., 1986) y el dominio de transactivación de la proteínadel herpes viral VP16 (Triezenberg y col., 1988). Se pensó que la proteína quimérica GAL4-VP16 actuaba como unfactor de transcripción fuerte en todos los tipos de células porque se sabe que el dominio de VP16 interacciona direc-tamente con los factores de transcripción generales, que se piensa que se han conservado durante la evolución entre loseucariotas (Goodrich y col., 1993; Lin y col., 1991; Sadowski y col., 1988). Se ha mostrado que la región reguladoradel receptor de estrógenos humano podría regular factores de transcripción quiméricos similares en células de cultivotisular de levaduras y animales (Braselmann y col., 1993; Louvion y col., 1993). La región reguladora del GR de ratase añadió al factor de transcripción quimérico y el factor de transcripción híbrido resultante se denominó “GVG” por-que consiste en un dominio de cada GAL4, VP16 y GR. Un fragmento de ADN que codifica el factor de transcripciónGVG se colocó entre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell y col., 1985) y la secuencia de adiciónde poli(A) del gen rbcS-E9 de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilada de guisantes (Coruzzi y col.,1984). Como sitio de unión para GVG, un fragmento de ADN que contiene seis copias de GAL4 UAS (Giniger y col.,1985) se fusionó en 5’ con el promotor mínimo 35S del CaMV (-46 a +9).

El análisis genético es una de las piedras angulares más importantes que se han construido en las ciencias dela vida moderna. Históricamente, los estudios genéticos se basan ampliamente en la selección de mutaciones depérdida de función, y este enfoque es en la actualidad la principal herramienta para la disección genética de unavía. No obstante, las selecciones de pérdida de función presentan dos desventajas mayoritarias. Primero, este tipode selección es incapaz de identificar genes que sean funcionalmente redundantes. Los análisis genéticos y fun-cionales del la vía de señalización del etileno ilustraron tal ejemplo. Se han identificado varias histidina quinasasde tipo receptor en Arabidopsis, y muestran una elevada homología entre sí. Se sugirió que estas proteínas esta-ban implicadas en la señalización del etileno, probablemente para servir como receptores de la hormona. Mientrasque ninguna de las mutaciones nulas de estos genes poseía ningún fenotipo aparente, las plantas transgénicas queportan los transgenes antisentido 35S para todos estos genes muestran algún fenotipo de pérdida de fundón parala respuesta al etileno (Hua y Meyerowitz, 1998). Sin embargo, las mutaciones positivas dominantes o de ganan-cia de función en cualquiera de estos genes conducen a la represión constitutiva de la respuesta a etileno. Comolos proyectos de la secuencia genómica han revelado la presencia de muchos genes multicopia en una variedad deespecies (Lin y col., 1999; Mayer y col., 1999), el problema de la redundancia funcional se ha puesto más de ma-nifiesto. Una segunda limitación para las selecciones de pérdida de función se debe al hecho de que algunas mu-taciones producen letalidad gameotofítica o embrionaria, lo que hace extremadamente difícil o incluso imposibleidentificar tal gen o mutación. Por ejemplo, muchos de los mutantes de Arabidopsis defectivos en embriones (emb)y relacionados, se identificaron mediante disección microscópica de embriones individuales realizada por Meinke ycolaboradores (Meinke, 1985; Meinke, 1995), lo que indica la existencia de dificultades técnicas para tales selec-ciones.

Como alternativa, en los últimos años se han desarrollado y usado selecciones positivas-dominantes o de gananciade función. En plantas, el primero en intentar la selección de mutaciones de ganancia de función, también conocidacomo marcaje de activación, fue Hayashi y col. (1992), que usó cuatro copias del potenciado 35S para activar genescerca de una inserción de ADN-T que porta el potenciador. El ejemplo más satisfactorio fue la identificación del genCKI1 (Independiente de citoquinina 1) de Arabidopsis, cuya sobreexpresión conduce a la regeneración de brotes apartir de explantes en ausencia de citoquininas externas (Kakimoto, 1996). Más recientemente, se han usado construc-tos marcaje de activación similar para generar un gran número de plantas transgénicas de Arabidopsis, de las cualesse han aislado alrededor de 30 mutantes dominantes (Weigel y col., 2000), De forma análoga a las selecciones dela pérdida de función, el principal inconveniente del marcaje de activación es la letalidad debida a la sobreexpresiónconstitutiva de algunos genes, lo que las convierte en incapaces de identificar estos genes. De hecho, sólo se aislaron deesta selección a gran escala las mutaciones relacionadas con las alteraciones morfológicas o el tiempo de florecimiento(Weigel y col., 2000), lo que sugiere que es más probable que ciertas mutaciones dominantes, en particular aquéllasque afectan gravemente al desarrollo de la planta (por ejemplo, a la embriogénesis), no se puedan recuperar mediantetales procedimientos.

Mientras que el marcaje de activación puede probar el significado funcional de algunos genes, las mutaciones depérdida de función pueden proporcionar perspectivas más directas de las funciones para la mayoría de los genes. Portanto, la combinación de ambos enfoques ganancia y pérdida de función, debería ser potente durante la era posgenómi-ca. En esta descripción, los inventores han expuesto una nueva estrategia para generar mutantes de plantas que portanambas mutaciones condicionales, Ganancia y Pérdida de Función, denominadas GLF, en un único locus genético. Laganancia o pérdida de función de un locus diana se controlará recíproca y estrechamente mediante el sistema de ex-presión inducible-químico XVE, lo que permite la expresión del fenotipo de un locus diana a un tiempo de desarrollodado de interés. La expresión controlable del fenotipo de tanto ganancia como pérdida de función en un locus dianapermitirá una comprensión más exhaustiva de la función génica en comparación con el uso de enfoques individuales.En principio, este procedimiento es más aplicable a especies en las que es posible la recombinación homóloga de altafrecuencia, por ejemplo células de mamífero y de levaduras. Esto se puede realizar mediante la alteración específica

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de un promotor natural y sustituyéndolo con un promotor inducible adecuadamente funcional en células de mamíferoy de levaduras.

Sumario de la invención

La sobreexpresión del gen de la isopentenil transferasa (ipt) del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens puedeincrementar el nivel endógeno de citoquinina en plantas transgénicas, lo que conduce a la regeneración de brotes de lascélulas vegetales transformadas. Cuando se combina con un sistema inducible de dexametasona (DEX), se puede usarla expresión controlada del gen ipt para seleccionar de forma específica los regenerantes transgénicos sin la necesidadde un marcador de resistencia a antibiótico. El sistema combinado permite la cotransformación de alta eficacia congenes adicionales y produce plantas transgénicas sin defectos morfológicos o del desarrollo.

En un aspecto, la invención se refiere a un vector que es útil para hacer plantas transgénicas. El vector comprendeuna secuencia de ADN que codifica un factor de transcripción, que tiene los siguientes elementos en la dirección 5’a 3’, (i) un promotor, (ii) ADN que codifica un dominio de unión a ADN del represor bacteriano LexA, (iii) ADNque codifica un dominio de transactivación de VP16, (iv) ADN que codifica el dominio regulador de un receptor deestrógenos. El vector está diseñado de forma que pueda incluir un gen que codifique un marcador seleccionable, cuyaexpresión se controla mediante el factor de transcripción.

Opcionalmente, el gen es ipt, CKI1, luciferasa, un miembro de la familia knotted o un gen cuya expresión puedeestimular la regeneración y el desarrollo de los brotes.

La invención está además dirigida a un ácido nucleico que comprende i) un promotor constitutivo, ii) ADN que co-difica un dominio de unión a ADN del represor bacteriano LexA, iii) ADN que codifica un dominio de transactivaciónde VP16 y iv) ADN que codifica un receptor de estrógenos.

La invención se refiere, en otro aspecto, a una planta transgénica o una célula de planta transgénica que compren-de el ácido nucleico, y que opcionalmente comprende un gen seleccionado del grupo compuesto por ipt, CKI1, unmiembro de la familia knotted o un gen cuya expresión puede estimular la regeneración y el desarrollo de brotes.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática del inserto entre los bordes izquierdo y derecho en Pta7002. RBrepresenta el borde derecho y LB representa el borde izquierdo, Los puntos de las enzimas de restricción se muestranencima de la figura. Los puntos de las enzimas de restricción representados por abreviaturas son: B-BamHI, H.HindIII,E-EcoRI.

La figura 2 ilustra los puntos de inserción en pMON721 de la luciferasa y los constructos GVG. LA luciferasa seinserta en el punto de restricción NotI. El GVG se inserta en el sitio de multiclonación del vector.

La figura 3A es una escala que muestra la intensidad de luminiscencia desde el gris oscuro (menor) al blanco(mayor). Aunque se muestra en forma de una escala de gris oscuro a blando, de hecho la luminiscencia es de un colorazul. Esta escala se usa para interpretar los resultados de la Figura 3B. La Figura 3B muestra los niveles de expresiónen equilibrio de la actividad de luciferasa inducida por concentraciones diferentes de DEX. La figura 3C muestra losresultados de la Figura 3B representados frente a las concentraciones de DEX. El valor obtenido a DEX 0 µM (el nivelbasal, de no inducción) se estableció de forma arbitraria en 1.

Las Figuras 4A-C representan la inducción de la actividad de la luciferasa en Arabidopsis. La Figura 4A es unaescala de color que muestra la intensidad de la luminiscencia desde gris oscuro (menor) a blanco (mayor) (comoen la figura 3, la luminiscencia es azul, No gris como se muestra en la figura). La Figura 4B representa una plantatransgénica cultivada en una maceta durante 3 semanas y después rociada con una solución que contiene luciferinapotásica 0,5 mM y 0,01% (p/v) de Tween-20. Veinticuatro horas más tarde, la planta se volvió a rociar con la soluciónde luciferina y se analizó. Para las Figuras 4B y 4C, la luminiscencia de la planta se observó usando un sistema decámara de alta sensibilidad (Hamamatsu Photonic Systems). La heterogeneidad de la luminiscencia observada en laplanta tratada con DEX se debió a la absorción no uniforme de luciferina.

Las Figuras 5A-B representan la cinética del nivel de ARNm de luc inducido por la DEX. Las plantas transgénicasde tabaco que portaban el gen GVG y el gen indicador de luc se cultivaron primero en medio agar durante 14 díasy después se adaptaron para cultivar en un medio hidropónico durante 3 días. El tratamiento con DEX se comenzóañadiendo DEX al medio a una concentración final de 10 µM (tiempo indicado como 0). Tras 24 horas de tratamientose eliminó DEX del medio. El ARN total se preparó a partir de 20 plantas a cada tiempo indicado y se sometieron aanálisis de tipo Northern. Los fragmentos de ADNc de la luciferasa de luciérnaga (Figura 5A) y el gen GVG (Figura5B) se usaron como sondas. Las señales se observaron mediante el sistema BAS-2000 (Fuji Photo Films co.). Laflechas cerradas y abiertas indican los puntos de tiempo de la adición y eliminación de DEX, respectivamente.

La Figura 6 muestra la intensidad y sostenibilidad de la inducción por varios glucocorticoides. Las plantas trans-génicas de tabaco que portaban el gen GVG y el gen indicador de luc se cultivaron primero en medio agar durante 14días y después se transfirieron a un medio agar recién preparado que contiene 30 µM de diferentes glucocorticoides

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durante 2 días adicionales. Tras la inducción, las plantas se volvieron a transferir al medio agar sin glucocorticoides(tiempo indicado como 0). Se representan gráficamente las actividades relativas de la luciferasa inducidas por DEX(•), acetonido de triamcinolona (�), betametasona (�) e hidrocortisona (@). El valor obtenido sin glucocorticoides(nivel de no inducción) se estableció de forma arbitraria en 1.

La Figura 7 muestra la inducción local de la expresión de luciferasa por el rociado de glucocorticoi-des.

La Figura 8 muestra la regeneración dependiente de dexametasona de brotes de tabaco y de lechuga. Discos dehojas de tabaco (hilera superior) y de lechuga (hilera inferior) se transformaron con el casete de transformación quese muestra en la Figura 12. A continuación, los materiales vegetales se cultivaron durante 40 días en condiciones deinducción (DEX 10 µm) o no inducción (DEX 0 µm).

Las Figuras 9A-F muestran la actividad luciferasa en regenerantes de tabaco y lechuga. Las actividades de lucife-rasa se midieron en regenerantes de 40 días cultivadas en condiciones de inducción (DEX 10 µm) para la expresión delgen ipt. La actividad luciferasa en regenerantes se midió usando una sistema de imagen por vídeo con las medicionesintegradas en 5 minutos y la sustracción del fondo de las imágenes. Las imágenes de luciferasa se transformaron enimágenes de 16 a 8 bit y se colorearon artificialmente para su presentación. Los revestimientos rojo/verde muestrauna superposición de las imágenes de campo claro y de actividad de luciferasa para permitir la fácil detección delos regenerantes positivos y negativos para luc. Las Figuras 9A, 9C y 9E son tabaco y las Figuras 9B 9D y 9F sonlechuga. Las Figuras 9A-B muestran imágenes de campo claro, las 9C-D son imágenes de la luciferasa y las 9E-F sonrevestimientos de color rojo/verde.

Las Figuras 10A-D muestran el análisis Northern de los transcritos ipt y luc de tabaco. Se muestra el nivel de lostranscritos ipt y luc de los regenerantes de 30 días que presentaban (+1 a +10) o no (-a a -g) actividad detectable deluciferasa. Los regenerantes se cultivaron en presencia de dexametasona 10 µm. Las Figuras 10A y 10C muestran losniveles del trascrito de ipt y las Figuras 10B y 10D muestran los niveles del trascrito de luc.

Las Figuras 11A-C muestran la segregación y el análisis de tipo Southern del gen luc en las plántulas de tabacotransgénico. La actividad luciferasa se midió en 44 plántulas seleccionadas al azar. Treinta y tres de las plántulasexhibieron actividad luciferasa y once de las plántulas no exhibieron actividad luciferasa (compárese las Figuras 11Ay 11B). que demuestra una segregación de 3:1 del gen dominante luc. Los análisis de tipo Southern del ADN delas plántulas se muestran en la Figura 11c. Se detectaron bandas sencillas con ADN sin fragmentar (U) y despuésde la digestión del ADN con Bam HI (B), SacI (S), Nco (N) y XbaI (X) y la hibridación con fragmentos marcadosradiactivamente del gen luc.

La figura 12 muestra el casete de transformación para la expresión inducible del gen ipt. El gen ipt de Agrobac-terium tumefaciens se clonó bajo el control de un promotor de respuesta a glucocorticoides (6XUAS fusionado con-46 del promotor mínimo de 35S del CaMV) para permitir la expresión regulada del gen. La expresión del gen iptestá mediada por un factor de transcripción activado por glucocorticoides (GVG) como han descrito Aoyama y Chua(1997). Los genes que codifican la higromicina fosfotransferasa (hpt) (Waldron y col., 1985) y luciferasa de luciérnaga(luc) (Millar y col., 1992) se clonaron bajo el control de promotores constitutivos (NP, promotor NOS; 35S; promotor35 S del CaMV) para permitir la fácil detección de eficacias de transformación y cotransformación. Los genes ante-riores se clonaron entre el borde izquierdo y derecho (LB, RB) del ADN-t (Klee y col., 1987; Beavan y Chilton, 1982)(pBI 101, Clontech, Inc.) del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens para permitir la transformación mediada porAgrobacterium.

La Figura 13 es un mapa esquemático de los vectores XVE (Zuo y col., 2000). Sólo se muestran las regiones quese deben integran en el genoma de la planta (entre el borde derecho o RB y el borde izquierdo o LB) (no a escala).G1090: un promotor sintético (Ishige y col., 1999) estimula XVE; XVE: secuencias de ADN que codifican un factorde transcripción quimérico que contiene un dominio de unión a ADN (DBD) de LexA (residuos 1-87). Dominio deactivación de la transcripción de VP16 (413-490) y la región reguladora del receptor de estrógenos humanos (272-595); E9T; rbcs E9 secuencia de adición de poli A; NOS: promotor de la nopalina sintasa; HPT: marcador de selecciónde higromicina; KAN: marcador de selección de kanamicina; NOST: secuencia de adición de poliA de la nopalinasintasa; 8XLexA: 8 copias de los sitios de unión represores de LExA; -46: promotor mínimo de 35S; 3AT: secuenciade adición de poli A rbc 3A; MCS: sitio de multiclonación.

Las Figuras 14A-B muestran la expresión del gen GFP controlada por el sistema XVE inducible. La Figura 14Amuestra raíces de una línea de Arabidopsis pER8-GFP transgénica. Las señales de GFP (verde) emitidas desde lasmismas raíces se vieron con microscopio de fluorescencia como se muestra en la Figura 14B.

La Figura 15 muestra la dependencia de la dosis de 17-β-estradiol del sistema inducible de XVE. Las plantastransgénicas pER8-GFP de tres semanas de edad cultivadas en ausencia del inductor se transfirieron a medio convarias concentraciones de 17-β-estradiol y se incubaron durante 16 horas. Los ARN se prepararon a partir de plantassin tratar (calle 0; control) o tratadas con 17-β-estradiol y se analizaron mediante la técnica tipo Northern usando elADN c de GFP como sonda. Los números por encima de cada calle indican las concentraciones (en micromolar) deltratamiento.

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La Figura 16 muestra en tiempo de inducción-curso del sistema XVE. Las plantas transgénicas pER8-GFP de tressemanas de edad cultivadas en ausencia del inductor se transfirieron a medio 17-β-estradiol 2 µM y se incubó a variostiempos (indicados en horas encima de cada calle). El análisis de los transcritos de GFP se llevó a cabo como se hadescrito en la Figura 15.

La Figura 17 es un diagrama esquemático del vector del marcaje de activación de XVE pER16. Sólo se muestrala región entre el Borde Derecho (RB) y el borde izquierdo (LB) (no a escala). Entre el RB y el LB se localizan dosunidades de transcripción y el promotor OLEXA-46. En la primera unidad de transcripción, el promotor G10-90 (Ishigey col., 1999) dirige el gen de fusión XVE terminado por la secuencia de adición de poliA rbc E9. La segunda unidadde transcripción consiste en el promotor del gen de la Nopalina sintasa (NOS), la secuencia codificadora del gen de laneomicina transferasa II (NPT II) y la secuencia de poliadenilación NOS. El promotor OLEXA-46 está formado por 8copias de la secuencia operador LexA fusionada con el promotor -46CaMV35S. Tras la integración en el genoma de laplanta, el promotor OLEXA-46 puede activar la transcripción de secuencias fusionadas en sentido en dirección 3’ desdepromotor de un modo dependiente de 17-β-estradiol.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han razonado que los sistemas inducibles pueden permitir el desarrollo de protocolos usando elgen ipt como marcador de transformación sin los inconvenientes de la expresión constitutiva. En condiciones deinducción, las células transformadas con el gen ipt deberían tener niveles elevados de citoquinina y, por tanto, elpotencial para regenerar brotes a partir de callos o explantes. En este contexto, la sobreexpresión del gen ipt puedeservir como sistema marcador sin antibiótico que selecciona de forma específica células transformadas. Como handescrito Aoyama y Chua (1997), el sistema inducible por dexametasona permite la expresión estrechamente reguladade genes diana en las plantas transgénicas. Este sistema consiste en un factor de transcripción híbrido que media enla transcripción cuando se activa por acción de la DEX y un gen regulado bajo el control de elementos cis que sóloresponde a este factor de transcripción. Por tanto, los inventores usaron un casete de transformación que contenía el genipt bajo el control del sistema inducible con DEX que actúa como marcador sin antibiótico para la cotransformación deotros dos genes constitutivamente expresados (higromicina fosfotransferasa (hpt) (Waldron y col., 1985) y luciferasade luciérnaga (luc) (Millar y col., 1992). Este nuevo sistema de transformación se estableció tanto para el tabaco comopara la lechuga usando transformación mediada por Agrobacterium.

La presente invención se refiere, en una forma de realización, a plantas transgénicas que se han transformado conun vector que incluye un marcador seleccionable que está bajo el control de un promotor inducible. En una formade realización preferida de la invención, la planta transgénica es una planta de tabaco. En una forma de realizaciónalternativa preferida de la invención, la planta transgénica es una planta de lechuga.

En una forma de realización de la invención, el vector que se usa para formar las plantas transgénicas incluyeun promotor químicamente inducible que activa el marcador seleccionable. Si se desea, también se puede poner bajoel control del promotor inducible cualquier otro gen de interés, de forma que el gen se pueda activar cuando sedesee. Dicho gen no tiene que ser un marcador. Ejemplos de tales vectores se presentan en los siguientes Ejemplos,que no sólo describen los vectores, sino también los procedimientos usados para preparar y seleccionar las plantastransgénicas que contengan tales vectores.

En una forma de realización de la invención, el promotor se puede inducir con el fin de seleccionar células o plantasque se han convertido en transgénicas, pero no se inducirá en condiciones naturales de crecimiento. De este modo,el gen marcador seleccionable, aunque presente en las plantas transgénicas, estará completamente silente durante elcrecimiento normal de las plantas y no interferirá con el crecimiento de las plantas. Tal gen marcador silente serámejor a nivel ambiental que, por ejemplo, tener un marcador genético de resistencia a antibiótico en el que dicho gende resistencia se expresa durante el crecimiento normal de la planta. El uso de este último tipo de marcador es deinterés ya que puede conducir al desarrollo de organismos resistentes al antibiótico.

En una forma de realización de la invención, el promotor inducible es el receptor de glucocorticoide, se ha pen-sado que este es un buen sistema de inducción para plantas porque el propio glucocorticoide no causa ningún efectopleiotrópico en plantas. En una forma preferida de realización de la invención, el factor de transcripción que se uneal receptor de glucocorticoide es un factor de transcripción quimérico en el que la región reguladora del GR de ratase añade al dominio de unión al ADN del factor de transcripción de levaduras GAL4 y el dominio de transactivaciónde la proteína del herpes viral VP16. El factor de transcripción híbrido resultante se denomina “GVG” porque estácompuesto por un dominio de cada GAL4, VP16 y GR. El gen GVG se introdujo en el tabaco junto con un gen indi-cador de luciferasa (Luc) transcrito de un promotor que contiene seis copias de la secuencia de activación en dirección5’ de GAL4 (GAL4 UAS). Tras el tratamiento con glucocorticoide se observó una buena inducción de la actividadluciferasa y los niveles de ARNm de luc.

Una ventaja principal del sistema de GVG en plantas es el hecho de que GR y glucocorticoide, al menos a lasconcentraciones usadas, son inocuos y no ejercen efectos fisiológicos adversos observables sobre las plantas, lo quepermite la inducción de genes diana sin efectos pleiotrópicos. Para conservar esta ventaja, los demás componentes delsistema GVG también se obtuvieron de fuentes de origen no vegetal.

Otra ventaja del sistema es que el glucocorticoide posee características que lo hacen adecuado como producto

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químico inductor. Dado que el glucocorticoide puede pasar con facilidad a las células vegetales, se puede realizar lainducción génica rápida usando varios procedimientos. Una inducción local de la expresión génica se puede obtenersimplemente rociando con una solución de glucocorticoides. Está claro que los productos químicos inductores sepueden acumular en las hojas a una concentración elevada cuando las plantas enteras se tratan en condiciones deaire abierto. Incluso en tales condiciones, el glucocorticoide acumulado no causa ningún daño visible a las hojas. Lenivel de inducción se puede regular usando diferentes concentraciones o diferentes derivados de glucocorticoide. Estacaracterística puede ser útil para analizar los efectos dependientes de la dosis de los productos génicos inducidos. Elglucocorticoide es uno de los compuestos biológicos mejor estudiados y en la actualidad comercialmente existen másde 100 tipos diferentes de derivados de glucocorticoides. Algunos de los derivados de glucocorticoides serían útilespara la inducción estable y transitoria, respectivamente. Además, algunos antagonistas de glucocorticoides podríanusarse para la regulación por disminución de la inducción.

Aunque más adelante se describe constructos específicos, los expertos en la técnica pueden imaginarse con facili-dad y producir otros. El sistema GVG desarrollado en la presente es muy flexible en su composición. Por ejemplo, lainducción de la transcripción se puede limitar a un tejido específico sustituyente el promotor de 35S para el gen GVGcon un promotor específico de tejido. Cada dominio funcional en la proteína de fusión GVG también se puede inter-cambiar. Con un dominio de unión al ADN diferente y la región reguladora de otro receptor de hormona esteroidea,es posible desarrollar otro sistema de inducción esteroidea en combinación con el sistema GVG.

También se ha desarrollado otro constructo que posee ventajas sobre o junto con el sistema GVG. Este constructose denomina XVE. Es similar al sistema GVG pero contiene el dominio de unión al ADN del represor bacteriano LexAy la región reguladora del receptor de estrógeno humano. El constructo XVE se puede usar en lugar del constructoGVG ya que el constructo GVG se describe en la presente descripción siempre y cuando el inductor adecuado seusa para el constructo que se está usando. El constructo XVR se puede usar junto con el constructo GVG y se puedecontrolar por separado del constructo GVG.

En una forma preferida de realización de la invención, el marcador seleccionable usado es el gen ipt. Cuando estegen se induce, tiene como resultado el fenotipo en brote extremo, en el que las células de las plantas crecen en muchosbrotes más que raíces. Este fenotipo se puede seleccionar con facilidad mediante inspección visual. Una vez eliminadoel agente de inducción, el gen ipt se convierte en silente y las células pueden crecer con normalidad. En otras formasde realización de la invención, otros marcadores seleccionables, por ejemplo el gen CKI1, se pueden usar de formasimilar. De nuevo, cualquiera que sea el marcador que se use estará sólo activo cuando está inducido u será silente unavez que se haya eliminado el inductor químico.

Se pueden preparar varios constructos de ADN que incorporen el principio de usar un marcador químico inducible.La teoría que se encuentra detrás del diseño de los plásmidos, que se describen con detalle más adelante, consistía enensamblar las regiones dentro de un plásmido que se podía controlar bien.

Otra forma de realización de la invención se refiere a un procedimiento para seleccionar plantas transgénicas usan-do un marcador seleccionable que está bajo el control de un promotor inducible químicamente. En una forma preferidade realización de la invención, el gen ipt de se coloca bajo el control de un promotor inducible por glucocorticoidedentro de un plásmido. En una forma alternativa preferida de realización de la invención, el gen CKI1 o uno de los ge-nes de la familia knotted se coloca bajo el control de un promotor inducible por glucocorticoide dentro de un plásmido.El sistema inducible por dexametasona consiste en un factor de transcripción híbrido que media en la transcripcióndel receptor de glucocorticoide en presencia de DEX. Este sistema permite la regulación estrecha de la expresión deipt en plantas transgénicas. Las células vegetales se transforman con este plásmido y las células se cultivan en medioMS sin hormonas vegetales pero en presencia o ausencia de dexametasona, un análogo sintético de glucocorticoides.En condiciones de inducción, las células transformadas con el gen ipt presentan niveles elevados de citoquinina yregenerarán los brotes a partir de callos o explantes. Dado que las células se cultivan en ausencia de hormonas ve-getales, los brotes se desarrollarán únicamente en las células que estén transformadas y sobreproduzcan citoquininasen presencia de dexametasona. Las células no transformadas no producirán brotes y las células cultivadas en ausenciade dexametasona no producirán brotes. Por tanto, la sobreexpresión del gen ipt puede servir como sistema marcadorsin antibióticos que selecciona de forma específicas células transformadas. Este sistema también podría servir comosegundo marcador para introducir genes adicionales en plantas que ya son resistentes a antibióticos. Los brotes deteratoma deberían aparecer en 2-3 semanas sobre las células transformadas cultivadas en presencia de dexametasona.Estos brotes se pueden escindir y colocar en medio MS que contenga ácido indol acético pero sin dexametasona. Enesta condición, el gen ipt, CKI1 o de la familia knotted no debería seguir activado y las plantas transgénicas debe-rían aparecer normales y fértiles, y serán capaces de liberar semillas. En principio, este procedimiento es aplicable acualquier gen vegetal que, bajo el control de cualquier sistema de expresión inducible adecuado, puede estimular laregeneración y el desarrollo de brotes.

Debe observarse que aunque algunas plantas se comportan como se ha descrito anteriormente (los únicos brotesproducidos son lo procedentes de las plantas transformadas). En algunas plantas pueden crecer brotes en medio sinhormonas aunque no estén transformadas. Con dichas plantas se puede usar una variedad de técnicas para proporcionarrendimientos satisfactorios de la selección de plantas transformadas. Uno de tales procedimientos es que, aunque losbrotes pueden estar producidos por plantas no transformadas, tales brotes parecen normales (de tipo salvaje), mientrasque las plantas transformadas poseen el fenotipo en brote. Por tanto, se puede usar el fenotipo para distinguir brotestransformados de brotes no transformados. Un procedimiento alternativo consiste en añadir una hormona, como la

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auxina, al medio de crecimiento para suprimir la formación de brotes por parte de los explantes no transformados.Esto disminuirá el nivel de ruido de fondo de los brotes no transformados que aparezcan. La cantidad de auxina quese debe añadir puede determinarse mediante titulación, es decir usando diferentes concentraciones de auxina, con elfin de determinar el nivel que suprime el crecimiento de brotes en los explantes no transformados pero que permite elcrecimiento de los brotes en los explantes transformados.

En una forma de realización de la invención, para la cotransformación de otros dos genes expresados de formaconstitutiva (higromicina fosfotransferasa (hpt) y luciferasa de luciérnaga (luc)) se usó un casete de transformación(Figura 12) que contiene el gen ipt bajo el control del sistema inducible por glucocorticoide GVG (Aoyama y Chua,1997) actuando como marcador sin antibiótico. Cuando se indujo con DEX se expresó isopentenil transferasa desde elgen ipt, lo que condujo a la presencia de niveles elevados de citoquinina. En condiciones de inducción de la expresiónde ipt, los niveles elevados de citoquinina produjeron suficiente regeneración de brotes transgénicos de los explantesde tabaco y de lechuga (Figura 8). La determinación de los niveles de transcritos de ipt en los regenerantes reveló quela regeneración estaba estrechamente acoplada a la expresión de ipt (Figuras 10A-D). Incluso en condiciones de noinducción, donde sólo algunos brotes se regeneraban a partir de los explantes, al menos un 50% de los regenerantescontenían el transen. Los análisis de tipo Southern y de segregación de los brotes y plantas transgénicos revelaron quela mayoría de los regenerantes contenía únicamente una copia sencilla del gen ipt (Figuras 11A-C). Los experimentosde evolución en el tiempo demostraron que la regeneración era rápida y la especificidad del procedimiento se manteníadurante un periodo de tiempo de al menos 20 años. Por tanto, los efectos de las citoquininas fueron locales y lashormonas no difundían ni desencadenaban la regeneración de las células no transformadas. Este hallazgo está deacuerdo con la observación de que incluso concentraciones elevadas de citoquinina aplicadas de forma exógena causanmás o menos reacciones locales. La eficacia de la cotransformación de los genes hpt y luc se determinó midiendo laactividad Luc (Figuras 9A-F) y analizando los regenerantes para determinar la existencia de resistencia a higromicina.También se realizó un análisis de tipo Northern para determinar los niveles de los transcritos hpt y luc (Figuras 10A-D). En alrededor del 80% de los brotes, los genes luc y hpt fueron cotransformados con éxito con el sistema inducibleipt. Después de que los regenerantes se transfirieron a condiciones no inductivas, la morfología de las plantas de tabacoy de lechuga era completamente normal. Más del 40% de los regenerantes de tabaco desarrollaron fuertes sistemasradiculares en 20 días y pudieron transferirse al suelo con facilidad. Las plantas resultantes no mostraron anomalíasmorfológicas ni del desarrollo y los transgenes se transmitieron a la progenie. Estos resultados demuestran las ventajasque la expresión inducible de ipt posee sobre la expresión constitutiva de ipt.

En otra forma de realización de la invención, se colocan genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas bajoel control de un promotor inducible por receptor de glucocorticoide. El promotor puede inducirse para permitir laexpresión de los genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas con el fin de seleccionar las células vegetalestransformadas. Una vez que se han seleccionado las células vegetales transformadas, se puede reprimir la expresiónde los genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas. Este sistema afecta más al ambiente que un sistema en el quelas plantas transformadas expresan de forma constitutiva los genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas.

El sistema inducible químicamente se puede usar de un modo más general y, por supuesto, su uso no está limitadoal uso para inducir el gen ipt, CKI1 o knotted ni otro marcador seleccionable. Se puede usar para inducir químicamentecualquier gen de interés. Se puede usar para inducir un marcador detectable, tal como la luciferasa u otro marcadordetectable deseado.

El desarrollo del sistema usado tuvo lugar en una serie de etapas para analizar los aspectos individuales del cons-tructo final. Estas etapas se exponen en los Ejemplos siguientes. En primer lugar se expone aquí una breve introducciónexplicando la progresión de los experimentos. El sistema GVG se usó primero para mostrar que se podía preparar unconstructo que incluya un gen inducible por DEX o un análogo a glucocorticoides. Para este fin se usó el plásmidopMON721, colocándose el luc bajo el control de UAS. Esto se usó para hacer plantas de tabaco transgénicas que seseleccionaron en medio con kanamicina. Estos experimentos mostraron que tal sistema funcionaría (Aoyama y Chua,1997). A continuación, con el deseo de evitar la resistencia a antibióticos como marcador, se diseñaron nuevos cons-tructos para usar el gen ipt como marcador. Los constructos se fabricaron con los vectores pTA7001 o pTA7002 consitios de multiclonación en dirección 3’ de los 6 UAS. Estos constructos incluyeron el sistema de transcripción quimé-rico GVG bajo un promotor 35S y también incluyeron un gen de resistencia a higromicina regulado por el promotorNOS. El gen ipt se colocó en dirección 3’ de los 6 UAS. El uso de este constructo demostró que el fenotipo “en brote”resultante de la sobreexpresión de ipt podía usarse como marcador. A continuación se fabricaron diferentes constructospara ampliar los resultados a otras plantas distintas de la del tabaco. El constructo pTA7002/ipt se modificó de formaque el promotor 35S, que se usa para expresar la secuencia codificadora de GVG, fuera reemplazado con un promotorsintético denominado G10-90, que actúa como un promotor más fuerte que el promotor 35S. Este consiste en 4 copiasde la caja G fusionadas con el promotor 35S-90. Además, se añadió un gen adicional, 35S-luc. Este constructo seusó en las plantas de tabaco y de lechuga. A continuación se analizaron los brotes seleccionados para determinar laexpresión de luciferasa y la resistencia a higromicina. Los resultados indican que un porcentaje muy elevado de losregenerantes en brote mostraban expresión de luciferasa y resistencia a higromicina. Esto prueba que el uso del sistemaGVG y el gen ipt permite el uso del fenotipo en brote como marcador en plantas diferentes.

Otra forma de realización de la invención es el marcaje de activación a través del sistema de pérdida-ganancia defunción (GLF). El principio del sistema GLF es reemplazar el promotor nativo de un gen de interés en el genoma dela planta con un promotor inducible. Por tanto, el reemplazo causará la mutación de pérdida de función debido a laausencia del promotor del gen diana. Por otro lado, la expresión del gen diana se controlará mediante un inductor y la

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sobreexpresión ectópica inducida del gen diana conducirá a los fenotipos de ganancia de función. Además, dado queambos tipos de mutaciones son condicionales, la mutación de pérdida de función se puede complementar mediantela expresión inducible del gen diana en condiciones adecuadas, La expresión del gen bajo el control del promotorinducible transgénico se puede controlar mediante la concentración del inductor que esté presente. En ausencia deinductor o a niveles muy bajos del inductor, el promotor estará inactivo o mínimo y no se producirá expresión. Aniveles elevados de inductor, el promotor puede sobreexpresar el gen. A un nivel intermedio de inductor, la expresióndel gen puede ser equivalente a la expresión de tipo salvaje y la planta, célula u organismo pueden parecer de tiposalvaje.

En la práctica, el sistema GLF parece requerir un promotor inducible estrechamente regulado y altamente eficaz,y un reemplazo relativamente preciso de la secuencia del promotor diana en el genoma del huésped. El sistema XVEdescrito en la presente memoria descriptiva satisface plenamente los requerimientos del sistema GFL. Además delcontrol estrecho, el sistema XVE puede multiplicar por 8 la expresión del gen diana del promotor 35S. lo que loconvierte en un sistema ideal para los estudios de sobreexpresión ectópica. Aunque en la actualidad es difícil larecombinación homóloga a una frecuencia elevada en las plantas superiores por razones desconocidas, es posiblegenerar una gran mezcla de mutantes y, posteriormente, seleccionar las mutaciones de interés de ganancia y/o pérdidade la función. De hecho, los inventores han identificado varios mutantes, de los cuales los promotores de los genesdiana se reemplazaron con el promotor inducible, generando de este modo mutaciones tanto de ganancia como depérdida de función en un único locus. Como se ha indicado anteriormente, el sistema es muy útil para las mutacionesespecíficas de gen en mamíferos y levaduras, donde la recombinación homóloga es prácticamente posible.

El vector GFL (Figura 17) se construyó sobre la base del vector XVE descrito en la presente memoria descriptivay que también se describe en Zuo y col. (2000), que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia.Tras insertar el genoma del huésped, el promotor OLexA-46 puede activar un gen fusionado en dirección 3’ de un mododependiente de 17-β-estradiol, o la secuencia operador LexA (OLexA) también puede servir como un fuerte potenciadordependiente de 17-β-estradiol para activar los genes cerca de la inserción en el ADN-T.

La presente invención se describe en referencia a los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración ycon los que no se pretende limitar la invención en modo alguno. Se utilizaron técnicas estándar bien conocidas en lamateria o las técnicas que se describen específicamente a continuación.

Ejemplo 1

Constructos de ADN

A) Constructo pTA7002

El plásmido pTA7002 es similar al pBI101 (Clontech) a excepción de que la secuencia entre el borde derecho yel borde izquierdo se reemplaza por tres unidades de transcripción. El inserto entre los bordes derecho e izquierdo depTA7002 se ilustra en la Figura 1 y comprende un plásmido que incluye los elementos siguientes: un promotor 35S,un dominio de unión al ADN de GAL4, un dominio de transactivación de VP16, dominios reguladores del receptorde glucocorticoides y una secuencia de adición de poli(A) de la subunidad pequeña rbcS-E9 de la ribulosa bifosfatocarboxilasa de guisante, todo como parte de una primera unidad de transcripción (35S-GVG-E9); un promotor de lanopalina sintasa (NOS), una secuencia de codificación de la higromicina fosfotransferasa, y el terminador NOS comoparte de una segunda unidad de transcripción (NOS-HPT-NOS); y 6 copias en tándem de una secuencia de activaciónen dirección 5’ (UAS) de GAL4 colocadas en dirección 5’ de un promotor 35S mínimo (-46 a +8), que incluye la cajaTATA como parte de una tercera unidad de transcripción (6x UAS-(-46/35S)-3A). Esta tercera unidad de transcripcióntambién incluye sitios de restricción (XhoI y SpeI) para la inserción de cualquier secuencia de codificación deseaday la subunidad pequeña rbcS-3A de la ribulosa bifosfato carboxilasa de guisante (Fluhr y col., 1986). Una regióncodificadora que se inserta en el sitio XhoI-SpeI debería contener los codones tanto de iniciación como de termina-ción.

Con más detalle, la unidad de transcripción 35S-GVG-E9 incluye las bases -343 a +9 del promotor 35S del CaMV(Odell y col., 1985). El dominio de unión al ADN GAL 4 comprende los aminoácidos 1-74 (Laughon y Gesteland,1984). El dominio ácido de VP16 comprende los aminoácidos 413-490 (Dalrymple y col., 1985). El dominio delreceptor de GR comprende los aminoácidos 519-795 (Miesfeld y col., 1986). El extremo 3’ de esta unidad de trans-cripción es la secuencia de adición de poli(A) de la subunidad pequeña rbcS-E9 de la ribulosa bifosfato carboxilasade guisante (Coruzzi y col., 1984). El promotor 35S que dirige el gen GVG se puede cambiar por un fragmento pro-motor de elección usando los sitios de enzimas de restricción Sse8387I y PmeI. Al hacer esto, se puede insertar unpromotor que puede inducir el gen insertado en un tejido específico o durante un periodo específico, en función de lascaracterísticas del promotor.

B) pTA7001

Este plásmido es idéntico al pTA7002, a excepción de la orientación del fragmento que contiene 6x GAL4 UAS-TATA-sitios de clonación-terminador 3A. Por tanto, también contiene los elementos cis y trans en la región ADN-Tdel plásmido. El elemento trans es la región GVG compuesta por el dominio de unión al ADN GAL4, el dominio detransactivación de VP16 y el dominio del receptor de GR dirigido por el promotor 35S. El elemento cis está compuesto

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por 6x GAL4 UAS y la caja TATA del promotor 35S. De nuevo, este plásmido se basa en el pBIi101 (Clontech) dondese ha reemplazado la región entre el RB y el LB. En el pTA7001, esta región se ha convertido:

1-39: pTiPOST37 de pBI101 (RB= 1-25)

47-858: promotor 35S de pBI221 (TATA= 813-816)

867-1097: GAL4 (aa 1-77)

1117-1340: VP16 (AA 413-490)

1347-2180: GR de rata (aa 519-795)

2207-2764: terminador rbcs-E9 de guisante

2780-3112: promotor NOS de pBI101

3120-4145: higromicina fosfotransferasa

4147-4399: terminador NOS de pBI101

4893-4423: terminador rbcs-3A de guisante

4941-4894: sitios de clonación XhoI, SpeI

4995-4942: promotor 35S caja TATA (TATA= 4980-4977)

5197-4996: 6x GAL4 UAS

5198-5357: fragmento M13mmp19 EcoRI-HaeII de pBI101

5358-5862: pTiPOST37 de pBI101 (LB= 5838-5862).

C) pTA7002/ipt

Este plásmido se preparó insertando un fragmento de restricción (XhoI, SpeI) que contiene el gen de la isopente-niltransferasa (ipt) del plásmido pTIT37 (Goldberg y col., 1984) en dirección 3’ del promotor 6XUAS en el plásmidopTA7002.

D) pMON721/Luc

Este plásmido tiene un diseño similar al plásmido pTA7002 en cuanto a que incorpora el mismo sistema GVG. Sinembargo, esto se basa en el vector pMON721 (Monsanto corp., San Louis, MO) en lugar de en el plásmido pTA7002.El gen GVG, que se transcribe desde la región -343 a +1 del promotor 35S del CaMV (Odell y col., 1985), estabaflanqueado en el extremo 3’ por la secuencia de adición de poli(A) de la subunidad pequeña rbcS-E9 de la ribulosabifosfato carboxilasa de guisante (Coruzzi y col., 1984). Los fragmentos de ADN que codifican dominios específicosse produjeron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de secuencias adecuadas para laclonación dentro del marco. El dominio de unión al ADN GAL4 comprende los aminoácidos 413-490 (Dalrymple ycol., 1985) y el dominio del receptor de GR comprende los aminoácidos 519-795 (Miesfeld y col., 1986). El ADN UASde GAL4 (5’-CGGGTGACAGCCCTCCG-3’ ID SEC Nº 1) se sintetizó químicamente y la secuencia de codificaciónpara el gen luc (de Wet y col., 1987) se escindió de pGEM-luc (Promega Co.). La secuencia de codificación Luc setranscribió a partir de seis copias de GAL4 UAS colocada en dirección 5’ de la región -46 a +1 del promotor 35S yflanqueada en el extremo 3’ por la secuencia de adición poli(A) de la rbcS-3A de guisante (Fluhr y col., 1986). Lafigura 2 ilustra los puntos de inserción en pMON721 de los constructos de ácido nucleico de GVG y luc.

E) pTA7002G/ipt/luc (pYS4)

Este plásmido es similar al pTA7002ipt, aunque con dos diferencias. El promotor 35S del vector pA7002/ipt sereemplazó con un promotor sintético denominado G10-90. Este último promotor consiste en 4 copias de una caja G(GCCACGTGCC ID SEC Nº 2) fusionadas en el promotor 35S -90.

Asimismo, se incluyó un gen 35S-luc para facilitar el reconocimiento visual de los transformantes usando unsistema de imagen sensible. Este vector se muestra en la Figura 12. Véase Kunkel y col., 1999.

F) Vectores XVE

Los vectores XVE (véase la Figura 13, se han descrito en Zuo y col., (2000). XVE: un factor de transcripciónquimérico que contiene el dominio de unión a ADN de LexA (residuos 1-87), el dominio de transactivación de VP16

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(413-490) y la región reguladora del receptor de estrógenos humano (272-595). El segundo casete de expresión, quecontrola el gen de interés, se realizó fusionando 8 copias de los sitios de unión LExA a -46 del promotor mínimo35S.

pER8-CKI1 (XVE-CKI1): un fragmento de ADN XhoI/SpeI que contiene la región codificadora así como partede la región sin traducir 5’ y 3’ del ADNc de CKI1 se insertó en los mismos sitios del vector pER8 en dirección 3’del promotor 8XLexA-46. En este constructo, el gen CKI1 se colocó bajo el control del sistema inducible XVE y sutranscripción sólo puede activarse con 17-β-estradiol o 4-hidroxilo tamoxifeno.

pER8-LEx1 (XVE-Lec1): un fragmento de ADN XhoI/SpeI que contiene la región codificadora así como partede la región sin traducir 5’ y 3’ del ADNc de Lec1 se insertó en los mismos sitios del vector pER8 en dirección 3’del promotor 8XLexA-46. En este constructo, el gen Lec1 se colocó bajo el control del sistema inducible XVE y sutranscripción sólo puede activarse con 17-β-estradiol o 4-hidroxilo tamoxifeno.

pER8-SERK (XVE-SERK): un fragmento de ADN genómico que contiene el gen SERK de Arabidopsis (sin elpromotor SERK y las secuencias de terminación de la transcripción) se insertó en los mismos sitios del vector pER8 endirección 3’ del promotor 8XLexA-46. En este constructo, el gen SERK se colocó bajo el control del sistema inducibleXVE y su transcripción sólo puede activarse con 17-β-estradiol o 4-hidroxilo tamoxifeno.

Ejemplo 2

Plantas transformadas con vectores basados en pMON721

El vector pMON721 se puede usar en combinación con la cepa ABI de A. tumefaciens pero no se usa con la cepaLB4404 de A. tumefaciens. La cepa ABI sola puede inducir brotes en discos de hoja de tabaco cultivados en medio MSsin hormona y, por tanto, no se puede usar para experimentos en los que el marcador es el crecimiento de los brotes. Lacombinación pMON721-cepa ABI de A. tumefaciens es útil para los experimentos en los que se están seleccionandootros marcadores, por ejemplo cuando se está seleccionando la resistencia a antibióticos. En estos experimentos lascélulas se cultivan en medio con hormonas y la selección se realiza mediante resistencia a kanamicina, y se cultivantanto en presencia como en ausencia del inductor, por ejemplo dexametasona.

A) Trasformación del plásmido en la bacteria

Los plásmidos se introdujeron en Agrobacterium tumefaciens. Los plásmidos derivados de pMON721 se colocaronen la cepa ABI (Monsanto Corp., San Louis, MO) mediante procedimientos bien conocidos para los expertos enla técnica. Por ejemplo, para pMON721/Luc, se seleccionó una única colonia de la cepa ABI de Agrobacteriumtumefaciens (Monsanto Corp., San Louis, MO) que contenía pMON721/Luc de las placas YEB que contenían 50 mg/lde kanamicina, 25 mg/l de cloranfenicol, 100 mg/l de espectinomicina y 100 mg/l de estreptomicina. Las células deAgrobacterium se transfirieron a un tubo estéril de tapa enroscable de 50 ml que contenía 10 ml de medio líquido YEBcon 50 mg/l de kanamicina, 25 mg/l de cloranfenicol, 100 mg/l de espectinomicina y 100 mg/l de estreptomicina. Elcultivo creció a 28ºC durante 24 horas. Las células de Agrobacterium en cultivo se recogieron mediante centrifugacióna 3000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. El sedimento celular se lavó una vez en 10 ml de medio YEB con antibióticosy después se resuspendió en 30 ml de medio B5, que se usó para la inoculación de los explantes. El medio YEB seprepara llevando hasta 1,0 litros los siguientes: 5,0 gramos de sacarosa, 5,0 gramos de peptona, 5,0 gramos de extractode carne, 1,0 gramos de extracto de levadura y 0,04 gramos de MgSO47H2O.

B) Co-cultivo con Agrobacteria

Discos de hojas de Nicotiana tabacum cv SR1 se transformaron y regeneraron como describen Horsch y col. (1988)y se realizó la transformación de Arabidopsis de acuerdo con el procedimiento de Valvekens y col. (1988).

C) Plantas transgénicas que contienen luciferasa

Se dejó autofertilizar las plantas transgénicas primarias y se recogieron las semillas. LA progenie transgénicagerminó en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con 3% de sacarosa, 0,8% de agar y 100 µg/mlde kanamicina para la selección. Las plantas T3 homocigotas cultivadas en el mismo medio agar durante 14 días trasla germinación se usaron en experimentos de inducción. En algunos experimentos, las plantas se transfirieron a unmedio de cultivo hidropónico que contenía una concentración 1/100 de sales de MS y se adaptaron a las condicionesde crecimiento durante 3 días antes de usar. En todos los casos, las plantas se expusieron a luz continua y a unatemperatura de 27ºC (tabaco) o 22ºC (Arabidopsis).

Plantas transformadas con vectores basados en PTA7002 o PTA7001

Los vectores PTA7002 y PTA7001 se pueden usar con la cepa LB4404 de Agrobacterium tumefaciens. Al contrarioque la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens, la cepa LB4404 no induce brotes y esta combinación de vector y cepabacteriana se puede usar en los experimentos en los que el crecimiento de brotes es el marcador. Los experimentosdescritos en la presente usaron PTA7002/IPT. No obstante, el vector usado puede incluir otros genes de interés que nose encuentren bajo el control del sistema GVG, otros genes que se desea transformar en plantas. En estos experimentos,

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las plantas se seleccionan en medio sin hormonas y sin antibióticos, pero en presencia y ausencia de inductor (p. ej.,dexametasona). Sólo las células cultivadas en presencia del inductor deberían generar brotes. Estos brotes se cortan,se colocan en medio con auxinas pero sin el inductor. La ausencia de inductor detiene la transcripción del gen ipt y laauxina del medio estimula la regeneración de la raíz. Esto se puede analizar mediante análisis de tipo Northern o paradetectar resistencia a higromicina para determinar qué plantas regeneradas se transforman de verdad.

A) Transformación de plásmido en bacterias

Los plásmidos se introdujeron en Agrobacterium tumefaciens. Los plásmidos derivados de pTA7002 y pTA7001se colocaron en la cepa LB4404 (Clontech Laboratories, Inc.) mediante procedimientos bien conocidos por los ex-pertos en la técnica. Por ejemplo, para pTA7002/ipt, se seleccionó una única colonia de la cepa LB4404 que conteníapTA7002/ipt de las placas YEB que contenían 50 mg/l de kanamicina y 100 mg/l de estreptomicina. Las células deAgrobacterium se transfirieron a un tubo estéril de tapa enroscable de 50 ml que contenía 10 ml de medio líquido YEBcon 50 mg/l de kanamicina y 100 mg/l de estreptomicina. El cultivo creció a 28ºC durante 24 horas. Las células deAgrobacterium en cultivo se recogieron mediante centrifugación a 3000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. El sedimentocelular se lavó una vez en 10 ml de medio YEB con antibióticos y después se resuspendió en 30 ml de medio B5, quese usó para la inoculación de los explantes.

B) Co-cultivo con Agrobacteria

Hojas de tabaco se cortaron en secciones de 4 mm x 4 mm en un papel de filtro estéril húmedo y después setransfirieron a agua desionizada estéril. Las secciones de las hojas se sumergieron durante varios minutos en la soluciónde Agrobacteria (en medio B5) en una placa petri. Las secciones se transfirieron secas a una pieza de papel de filtroestéril y después se colocaron en placas con MBDK. La composición del medio MBDK es: sales MS 4,3 g/l; vitaminasB5- 112 mg/l; 2-4-D-0,5 mg/l; kinetina-0,1 mg/l; sacarosa-20 g/l; fitagel-2 g/l; pH 5,7.

(C) Regeneración de brotes

Tras 3 días de cocultivo de las hojas de tabaco con Agrobacteria, los explantes se lavaron 3 veces mediante in-mersiones en 30 ml de agua estéril que contiene 200 mg/l de carbenicilina en una placa petri. Después de haberlotransferido en seco a toallas de papel estéril, los explantes se colocaron en medio MBC con o sin dexametasona (DEX,30 µM). La composición del medio MBC es: sales MS 4,3 g/l; vitaminas B5-112 mg/l; sacarosa-20,0 g/l; carbeni-cilina-200 mg/l; fitagel-2,0 g/l; pH 5,7. Las placas se incubaron en una cuarto de cultivo tisular a 25ºC y 16 horasde luz/8 horas de oscuridad. Tras dos semanas, Aparecieron yemas de brotes verdes en los puntos de las heridas delos explantes únicamente en el medio que contenía DEX (30 µM). Los brotes se escindieron y transfirieron a placascon MBCI. El medio MBCI ES: sales MS 4,3 g/l; vitaminas B5- 112 mg/l; sacarosa-20,0 g/l; carbenicilina-200 mg/l;fitagel-2,0 g/l; pH 5,7, ácido indol acético (AIA)- 0,15 mg/l.

(D) Selección de plantas transgénicas

Tras diez días de cultivo en placas con MBCI aparecen muchos brotes esporádicos. Estos se cortan y transfierena nuevas placas con MBCI. Estos brotes presentan un aspecto normal tras 10 días de cultivo. Regeneran las raíces ycrecen hasta plántulas de 4-6 hojas tras 2-3 semanas. En esta etapa. están listas para analizarse y verificar si de verdadse han transformado. Dado que el plásmido pTA7001 o pTA7002 contiene el gen NOS-hpt, los brotes transformadosdeberían ser resistentes a higromicina. Por tanto, se escinde muestras de hojas que contienen peciolos y se transfierena medio MBCI con 40 mg/l de higromicina para la inducción de la raíz. Sólo ∼10% de los brotes recogidos en realidadse han transformado. Las células no transgénicas pueden formar brotes como resultado de la absorción de citoquininasproducidas por las células adyacentes, que se han transformado y están produciendo citoquininas. El crecimiento de losbrotes seleccionados en presencia de higromicina se puede usar para seleccionar los brotes transformados. El análisisde tipo Northern o Southern es otro medio de analizar la transformación. Estos últimos procedimientos son útiles enlos experimentos en los que el gen NOS-hpt se ha delecionado del plásmido pTA7001 o pTA7002 y en su lugar se hainsertado un gen de interés. Los brotes con raíz se transfieren a macetas y se cultivan hasta su madurez en invernadero.Las plantas transgénicas parecen normales y son fértiles y liberan semillas.

Ejemplo 4

Inducción con glucocorticoides

Todos los derivados glucocorticoides, dexametasona (DEX),acetonido de triamcinolona, betametasona e hidrocor-tisona se adquirieron en Wako Pure Chemical Industries. Los productos químicos se disolvieron en etanol a 30 mMantes de usar y se diluyeron en el medio de crecimiento o en la solución de rociado. Al medio o solución de controlnegativo se añadió el mismo volumen de etanol. En el caso de los experimentos de cultivos tisulares (como en elEjemplo 3) en el medio de cultivo tisular con fitagel se incluyó DEX. En el caso de tratamiento de toda la planta, lasplantas se cultivaron en un medio de agar con glucocorticoide o sus raíces se sumergieron en un medio de crecimientohidropónico que contenía glucocorticoide a 0,01 mM. Para el procedimiento de rociado, la solución contenía DEX30 µM y 0,01% (p/v) de Tween-20; este último se añadió en forma de agente humectante. En los experimentos queimplican rociado de la mitad de una hoja, la otra mitad y las demás partes de la planta se cubrieron con una películade plástico. Debe observarse que aunque la DEX no es un producto químico especialmente tóxico, podría tener algún

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efecto fisiológico sobre los seres humanos y se deben tomar precauciones, en especial el uso de protección cuando seestá rociando el compuesto.

Ejemplo 5

Ensayos con luciferasa

La extracción de luciferasa y los ensayos para determinar las actividades relativas de la luciferasa se llevaron acabo como han descrito Millar y col., (1992). Para obtener imágenes de la luminiscencia de la luciferasa, las raícesde las plantas tratadas con DEX se sumergieron en una solución que contenía luciferina de potasio 0,5 mM (Sigma)durante 1 hora o se sumergió el peciolo de una hoja rociada en una solución de luciferina de potasio 0,5 mM durante30 minutos. La luminiscencia de la luciferasa emitida por las plantas se visualizó usando una cámara con intensifica-ción de imágenes (VIM) y procesadores de imagen con recuento de fotones (ARGUS-50) adquiridos en HamamatsuPhotonic Systems. El tiempo de exposición fue de 10 minutos. Para hacer una foto de la luminiscencia de la luciferasaprocedente de la hoja rociada, la hoja y una película de color instantánea (LP100, Fuji Photo Films co.) se pusieron encontacto uno con otro, con una fina película de plástico entre ellos, durante 5 horas.

Ejemplo 6

Análisis de ARN

El aislamiento del ARN total y la hibridación de tipo Northern se realizaron como describen Nagy y col. (1988).Tras la hibridación, se obtuvieron imágenes de las señales con el sistema BAS-2000 (Fuji Photo Films Co.)

Ejemplo 7

Selección de las mejores líneas transgénicas

Deberían obtenerse ya analizarse varias líneas transgénicas independientes. Se debe seleccionar la mejor líneacomo la que posee un nivel basal bajo y un nivel de inducción elevado. A menudo se insertan múltiples copias delfragmento de ADN-T en un locus. En tal caso, podría ser que el promotor 35S cerca del RB se aproximara al pro-motor inducible y modificara el promotor inducible a un promotor constitutivamente activo. En otro de tales casos,una secuencia cromosómica cercana al promotor inducible también podría afectar a la actividad. Por tanto, es mejoranalizar las líneas transgénicas obtenidas para encontrar una que posea una actividad basal baja y un nivel de inducciónelevado.

Ejemplo 8

Inducción de actividad luciferasa en plantas transgénicas

Se midieron los niveles de inducción en equilibrio de la actividad de luciferasa como respuesta a diferentes concen-traciones de un glucocorticoide. Plantas transgénicas jóvenes (preparadas usando el vector pMON721/luc) cultivadasen medio agar se transfirieron a un medio de agar recién preparado que contenía diferentes concentraciones de DEX.Tras dos días en el medio de inducción, se preparó el hidrolizado celular completo a partir de 10 plantas y se analizópara determinar la actividad de luciferasa. La Figura 3B muestra una imagen de la luminiscencia de la luciferasa deplantas usando un sistema de cámara de alta sensibilidad. La escala de color para la Figura 3B se muestra en la Figura3A. La Figura 3C muestra la actividad relativa de luciferasa inducida por diferentes concentraciones de DEX. La ac-tividad de luciferasa detectada en ausencia de DEX fue muy baja y comparable a la obtenida de plantas transgénicasque portaban un gen de luciferasa precedido únicamente por la caja TATA (datos no mostrados). Este resultado indicaque el GAL 4 UAS era quiescente en plantas y no es reconocido por ningún factor de transcripción vegetal endógeno.La inducción fue detectable a una concentración de DEX 0,1 µM o superior, y se obtuvo una buena correlación entrelas concentraciones de DEX y los niveles de inducción, en el intervalo de concentraciones de 0,1 a 10 µM. El nivel deinducción máximo fue 100 veces el nivel basal.

En este experimento, las plantas se trataron con DEX durante un periodo lo suficientemente largo para garantizarque la actividad luciferasa había alcanzado un nivel estable para cada concentración de DEX. La inducción fue muylenta en utensilios de plástico, como se observa en este experimento, probablemente porque, en condiciones cerradasel flujo de agua de transpiración en plantas y, por tanto, la captación de glucocorticoides a través de la raíz, era lenta encomparación con las condiciones no cerradas al aire libre. Por otro lado, en estas últimas condiciones, es muy difícilcontrolar con exactitud la concentración de glucocorticoide en plantas porque la hormona se acumula con rapidez enlas hojas, como resultado de la transpiración.

Se han empleado varias especies de plantas para los estudios con aspectos básicos y aplicados de las cienciasvegetales y, entre ellas, Arabidopsis ha emergido como planta modelo para las exploraciones básicas de la biologíavegetal. Sin embargo, hasta ahora no se han desarrollado buenos sistemas de inducción para esta planta modelo. Lossistemas de inducción usando promotores de plantas, por ejemplo promotores del shock térmico, no son adecuadosporque provocan efectos pleiotrópicos. Aunque el sistema de expresión dependiente de tetraciclina se ha usado conéxito en el tabaco, no parece funcionar en Arabidopsis (Gatz, 1996). Por otro lado, en la presente se ha observado que

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el sistema GVG puede también funcionar en Arabidopsis. Las Figuras 4A-C muestran que la DEX indujo con eficaciaactividad de luciferasa en Arabidopsis transgénica. El sistema GVG debería ser ampliamente aplicable a muchos genesy en diferentes especies de plantas transgénicas.

Ejemplo 9

Cinética de la inducción transcripcional por DEX

Aunque la actividad luciferasa es fácil de medir, no es adecuada para un estudio de cinética en una escala de tiempocorto, ya que se ha estimado que la semivida de la actividad luciferasa es de aproximadamente 3 horas (Thompson ycol., 1991). Para obtener información más directa sobre la cinética de inducción, se preparó ARN total y se sometióa análisis de tipo Northern. En estos experimentos, las plantas se colocaron al aire libre para garantizar la rápidacaptación de DEX. Las plantas transgénicas se adaptaron a las condiciones de crecimiento hidropónico al aire libre yal medio líquido se añadió DEX a una concentración final de 10 µM. Se preparó el ARN total de 20 plantas a cadapunto de tiempo y se sometió a análisis de tipo Northern. Los resultados de las plantas sometidas a transfección conpMON721/luc se muestran en las Figuras 4A y 5A. La figura 4A muestra que el ARNm de luc se detectó por primeravez 1 hora después de la adición de DEX y la cantidad aumentó hasta un nivel en equilibrio en las siguientes 3 horas.Para analizar la sostenibilidad de la inducción, se retiró la DEX del medio y se analizó el ARN total preparado a partirde las plantas. La figura 5A muestra que el ARNm de luc se podía detectar incluso 4 días después de la eliminaciónde la DEX.

Mediante la monitorización de la actividad de luciferasa se obtuvo un resultado similar. Debido a la elevada sen-sibilidad de la detección, la actividad de luciferasa inducida pudo medirse 30 minutos después de la adición de DEXy durante 8 días después de la eliminación de la hormona (datos no mostrados). De estos resultados se puede concluirque la inducción de la transcripción por la DEX es rápida y se puede mantener durante un periodo prolongado.

Ejemplo 10

Respuestas a varios glucocorticoides

Para determinar la intensidad y la duración de la inducción se analizaron diversos derivados de glucocorticoides.Plantas transgénicas jóvenes (sometidas a transfección con pMON721/luc) cultivadas en un medio agar se transfec-cionaron a un medio agar recién preparado que contenía 30 µM de diferentes glucocorticoides y se cultivaron durante2 días adicionales. Tras la inducción, las plantas de devolvieron al medio agar sin glucocorticoide. En cada punto detiempo indicado en la Figura 6 se recolectaron 10 plantas y se analizaron sus actividades luciferasa. La Figura 6 mues-tra que los niveles de inducción y sus duraciones eran diferentes con diferentes derivados de glucocorticoides. Losniveles de inducción más elevados se obtuvieron con DEX o con acetonido de triamcinolona. En contraste con ello,sólo se detectaron niveles de inducción bajos o moderados con betametasona o hidrocorticoides, respectivamente. Enestos experimentos, se supuso que el nivel de inducción obtenido con cada glucocorticoide había alcanzado un nivelde equilibrio porque periodos de inducción más prolongados no incrementaron de forma significativa la actividad deluciferasa (datos no mostrados). La inducción por DEX se mantuvo durante un periodo más prolongado en compara-ción con la producida por la acetonido de triamcinolona, mientras que ambos glucocorticoides otorgan el mismo nivelde inducción al comienzo del tratamiento. Aunque la estabilidad de estos glucocorticoides en plantas no se conoce enestos experimentos, las características de inducción de diferentes corticoides podrían usarse para regular la intensidady la duración de la inducción.

Ejemplo 11

Inducción local de la expresión de luciferasa mediante rociado de glucocorticoide

Las mitades derecha e izquierda de una hoja (de aproximadamente 10 cm de longitud) en una planta maduraportadora de los genes GVG y Luc (la planta era transgénica para el vector pMON721/luc) se rociaron con una soluciónque contenía 30 µM de DEX y 0,01% (p/v) de Tween-20 y una solución control, respectivamente. Veinticuatro horasdespués del rociado, la hoja se escindió y se dejó que pasara luciferina a través del peciolo. La Figura 7 muestra lafluorescencia desde la porción de la hoja que había sido tratada con DEX, mientras que no se observa fluorescencia enla porción de la hoja tratada con una solución control sin DEX. La figura 7 se realizó tomando una película de colorinstantánea (Fuji Photo Films Co. LP100) en la hoja, con una película de plástico entre ellos, durante 5 horas.

Ejemplo 12

El sistema de expresión inducible XVE

Sería una gran ventaja en las ciencias básicas y aplicadas controlar de forma independiente e inducible la expresiónde múltiples genes. Como primera etapa hacia la consecución de este objetivo, los inventores han desarrollado un nuevosistema de expresión inducible, designado XVE (Véase la Figura 13). Principalmente, el sistema XVE es similar aldel GVG, en el que la región reguladora de un receptor nuclear confiere la inducibilidad hormonal al DBD heterólogofusionado con la secuencia anterior. La quimera XVE contiene el DBD del represor bacteriano LExA(X) (Horii ycol., 1981; Miki y col., 1981) y la región reguladora del receptor estrógeno humano (E) (Greene y col., 1986). Estas

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características estructurales permiten que el XVE tenga diferente especificidad de unión al ADN y que sea activadopor diferentes estímulos en comparación con el GVG. En consecuencia, se fusionaron ocho copias de sitios de uniónal LExA con el promotor mínimo 35S en -46 para dirigir los genes efectores.

Para analizar el sistema XVE, los inventores insertaron un ADNc que codifica la proteína para la fluorescenciaverde (GFP) en el casete efector de un vector XVE (pER8; véase la Figura 13 para obtener los detalles). El vectorpER8-GFP se transformó en Arabidopsis y tabaco, y se evaluó la expresión del gen GFP. Se obtuvieron resultadossimilares para ambas especies. En la presente, los inventores presentan datos obtenidos de un análisis detallado delas líneas transgénicas de Arabidopsis con pER8-GFP. Inicialmente, los inventores seleccionaron 22 líneas transgé-nicas independientes mediante inspección visual de plantas germinadas en ausencia (control) o presencia (inducido)de inductores (una mezcla de 17-β-estradiol y 4-hidroxilo tamoxifeno 1 µM) con microscopio de fluorescencia con-vencional. EL resultado de esta selección se resume en la Tabla 1. En más de la mitad de las líneas se observó unelevado nivel de inducción, y en la Figura 14 se proporciona un ejemplo representativo. Entre las líneas restantes, elgen de GFP expresado en un nivel más bajo (23%) o, en algunos casos, no presentó una expresión detectable (9%).Una pequeña fracción de estas líneas expresó el gen de GFP en un patrón parcheado (14%). Estos datos indicaron queel XVE es un sistema de expresión muy eficaz. En todas las líneas examinadas, no se detectó expresión de fondo (enausencia de inductores, lo que sugiere que el sistema está estrechamente controlado.

TABLA 1

Resumen de las líneas de Arabidopsis transgénicas con pER8-GFP

Señal de GFP Nº de líneas %

Fuerte 12 54,5Débil 5 22,7

No hay señal 2 9,2Parcheada 3 13,6

Total 22 100,0

Ejemplo 13

Caracterización del sistema de expresión inducible XVE

En la selección original se usó una mezcla de 17-β-estradiol y 4-hidroxilo tamoxifeno, los dos inductores más usa-dos de receptores de estrógeno. Para distinguir qué compuesto es la forma activa para la respuesta, estos dos productosquímicos se analizaron por separado para determinar su capacidad de inducción. Aunque ambos productos químicosfueron capaces de inducir la expresión del gen indicador, parece que el 4-hidroxilo tamoxifeno era ligeramente menosactivo que el 17-β-estradiol. Este último inductor se usó en los experimentos posteriores.

Para examinar la dependencia de la dosis del sistema, plántulas de tres semanas de edad germinadas en ausenciadel inductor se transfirieron a medio que contenía varias concentraciones de 17-β-estradiol y se incubaron durante 16horas. Los ARN se prepararon a partir de las plántulas sin tratar (control) o tratadas, y se analizaron mediante análisistipo Northern usando el ADNc de la GFP como sonda. Como se muestra en la figura 15, el transcrito de GFP pudodetectarse con tratamiento de 17-β-estradiol 0,0004 µM (0,4 nM) y la inducción se saturó a una concentración deaproximadamente 5 µM.

En los experimentos de evolución en el tiempo, las plántulas de tres semanas de edad se transfirieron a medio quecontenía 17-β-estradiol 2 µM y se incubaron durante varias duraciones de tiempo. Los ARN se prepararon y analizaroncomo se ha descrito anteriormente. El transcrito de GFP se pudo detectar tras una incubación de 30 minutos y laexpresión alcanzó el nivel máximo tras una inducción de 24 horas (Figura 16). En experimentos aparte, la fluorescenciaGFP apareció inalterada tras una incubación de cinco semanas en el medio de inducción, lo que sugiere que el sistemapermanecía constantemente activo.

En los experimentos que se muestran en las Figuras 15 y 16 se analizaron tres líneas transgénicas independientes yse obtuvieron resultados similares. En ambos casos se alcanzó de forma rutinaria una inducción multiplicada por 100-200 de los transcritos. Es más importante el hecho de que en ninguna de las líneas analizadas se observaron efectostóxicos ni alteraciones fisiológicas evidentes. Los análisis anteriores indican que el XVE es un sistema inducible eficazy fiable.

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Ejemplo 14

Transfección de discos de hojas de tabaco y células de raíz con XVE-CKI1

Además del GVG-ipt se ha usado pER8-CKI1 (XVE-CKI1) para la transfección de discos de hojas de tabaco. Trasla inducción con 17-β-estradiol, los brotes se regeneraron sin usar ninguna hormona vegetal aplicada externamente.Los brotes iniciaron 25-35 días después de la inducción. La adición de AIA (0,5 mg/l) no incrementó la eficacia, sinoque tuvo efectos adversos sobre la formación de los brotes. La eficacia de la regeneración era dependiente de la dosissobre 17-β-estradiol en el medio (analizado a concentraciones de 1, 5, 10, 20 y 30 µM, con la saturación a 10 µM).

El vector XVE-CKI1 también se usó para transformar células de raíz de tabaco. Usando las células de raíz, losbrotes se regeneraron tras la inducción con 17-β-estradiol sin usar ninguna hormona vegetal aplicada externamente. Ala hora de cocultivar raíces con Agrobacteria (2-3 días a 22ºC) se incluyeron 2,4-D (0,5 mg/l) y kinetina (0,1 mg/l).Las raíces infectadas se colocaron en medio MBC con o sin 17-β-estradiol (5 µM). Los explantes se transfirierona medio MBC recién preparado (con o sin el inductor) cada dos semanas. Los explantes cultivados en ausencia delinductor produjeron callos de color blanco o amarillo oscuro tras cultivar durante 20-30 días, pero estos no formaríanbrotes. Los explantes cultivados en presencia de inductor formaron callos verdes. Los brotes iniciaron 40-50 díasdespués de la inducción. En medio MBC, 0 de 49 callos blancos/marrones se convirtieron en verdes y produjeronbrotes, mientras que en medio MBC complementado con 17-β-estradiol 5 µM, 13 de 65 callos blancos/marronesse convirtieron en verdes y produjeron brotes. Este experimento usó el mismo número de explantes radiculares coninductor y sin inductor. Dado que 65 callos se formaron con inductor y sólo 49 sin inductor, la sobreexpresión de CKI1también puede incrementar la eficacia de la formación del callo.

Ejemplo 15

Transfección de raíces de Arabidopsis con XVE-CKI1

A) Preparación del material radicular

Semillas recién recolectadas se almacenan en seco a 4ºC durante dos semanas antes de usar. Las semillas seesterilizan colocándolas en un tubo Eppendorf de 1,5 ml (o en otro envase conveniente) con aproximadamente 1 mlde solución de esterilización (50% de Clorox + 0,01% Triton X-100) y en agitación regular durante 10 minutos. Esmejor no usar demasiadas semillas (> 1000 o aproximadamente 50 µl) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, ya que usar unnúmero demasiado elevado de semillas tiene como resultado una esterilización ineficaz. La solución de esterilizaciónse elimina con una pipeta estéril y las semillas se lavan tres veces en agua destilada estéril usando 1,0-1,5 ml para cadalavado.

Las semillas esterilizadas se suspenden en aproximadamente 0,5 ml de un agar estéril al 0,15% en solución deagua y después se extienden sobre la superficie de placas A (sales MS + 30 g/l de sacarosa + 0,8 g/l de agar, pH5,7). Las semillas se vernalizan a 4ºC durante dos días para mejorar la frecuencia de germinación de las semillas. Acontinuación, las semillas se incuban en un cuarto de cultivo y germinan en tres días. Para el cultivo de raíces se usanplántulas de una semana.

De diez a 15 plántulas se transfieren a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de medio B5 (sales B5+ 30 g/l de sacarosa + 0,5 g/l de MES (ácido 2-[N-morfolino]atanosulfónico), pH 5,7). El matraz se sella sin apretarcon dos capas de papel de aluminio y se coloca en un agitador a 125 rpm. Los cultivos se iluminan con luz tenue a22ºC. Tras 10-15 días en cultivo en medio B5, las raíces se usan para la transformación. Las raíces blancas deberánseleccionarse para la transformación. Las raíces de color amarillo o ligeramente marronáceas no se pueden transformarbien.

B) Pretratamiento de los explantes de raíz

Las siguientes etapas deben llevarse a cabo en una campana estéril. Las raíces preparadas como se indica en laetapa (A) se transfieren a una placa Petri estéril. Para cortar el sistema de raíz de las plántulas se usa un escalpeloestéril. Las raíces se cortan en segmentos de aproximadamente 1 cm y se colocan sobre una toalla de papel estérilpara eliminar el exceso de medio. A continuación, los segmentos de raíz se transfieren a placas F1 (sales B5 + 20 g/lde glucosa + 0,5 g/l de MES + 0,5 mg/l de 2,4-D + 0,05 mg/l de kinetina + 2 g/l de fitagel, pH 5,7) usando pinzasestériles. Las raíces se extienden de forma que todas se encuentren en contacto con el medio. Las placas se sellan conuna tapa permeable a gas y se incuban en un cuarto de cultivo tisular durante 2-3 días.

C) Crecimiento de Agrobacterium

Agrobacterias (cepa LBA4404; Clontech) se transformaron con constructos pER8-CKI1 (XVE-CKI1) y los trans-formantes resultantes se cultivaron en medio YEB (5 g/l de sacarosa, 5 g/l de peptona, 5 g/l de extractos de carne y 1g/l de extractos de levadura, 0,04 g/l de MgSO47H2O, pH 7,0) complementado con 100 mg/ml de espectinomicina y100 mg/l de estreptomicina durante la noche a 28ºC. A continuación, las agrobacterias se sedimentaron y lavaron dosveces con medio YEB sin antibióticos y, por último, se suspendieron en 2,0-2,5 ml de YEB para la infección de losexplantes de raíz de Agrobacterium.

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D) Inoculación de explantes de raíz con Agrobacterium y cocultivo

Los explantes de raíz preparados como se indica en la parte B anteriormente se transfirieron a una placa Petri estérily se cortaron en segmentos de 0,5 cm. Los explantes de raíz se transfirieron a una cesta estéril (por ejemplo, un tubode vidrio con una cubierta de malla en un extremo), que se coloca en una placa Petri que contiene 20 ml de medioB5. 2 ml de la solución de Agrobacterium de la etapa C se colocan en el medio B5. La cesta se agita suavementedurante alrededor de 2 minutos para estar seguros de que se inocula Agrobacterium en los explantes de raíz. Tras lainoculación, la cesta que contiene los explantes de raíz se coloca en 4 capas de toallas de papel estéril para eliminarel exceso de líquido. Tras algún tiempo se eliminan de la cesta los grupos de segmentos de raíz usando pinzas y secolocan en placas F2 (placas F1 + 20 mg/l de acetosiringona) en grupos de 5-10 segmentos de raíz. Los segmentos deraíz se cocultivan con agrobacterias durante 2-3 días a 22ºC.

E) Selección y regeneración de transformantes

Tras el cocultivo de segmentos de raíz con agrobacterias, las agrobacterias se lavan de los explantes de raíz me-diante agua destilada estéril que contiene 200 mg/l de carbenicilina. Los explantes de raíz se recopilan en una cestaque a su vez se coloca en toallas de papel estéril para eliminar el exceso de líquido. Los segmentos de raíz se trans-fieren a medio MIC (sales MS + 10 g/l de sacarosa + 0,5 g/l de MES + 0,15 mg/l de ácido indol acético (AIA) + 200mg/l de carbenicilina + 2,0 g/l de fitagel, pH 5,7) con o sin un inductor químico (17-β-estradiol 5 µM) y se cultivana 22ºC durante un ciclo de 16 horas de luz blanca y 8 horas de oscuridad. El medio MIC contiene sales MS, AIA ycarbenicilina, pero no contiene los antibióticos para la selección de transformantes. Se observa que la presencia deAIA no es crítica, pero sí aumenta la eficacia de la regeneración cuando se usa con Arabidopsis. El AIA posee unefecto negativo cuando se usa con tabaco.

Lo anterior se subcultiva en el mismo medio tras la primera semana y después se subcultiva cada dos semanas.Después de aproximadamente 10 días de cultivo aparece un pequeño callo de color verde oscuro sobre los explantesque se cultivan en medio con el inductor químico, pero no aparecen callos verdes sobre la placas sin el inductorquímico. Una vez que los brotes han formado pequeñas rosetas (3-4 hojas), se transfieren a medio MIC sin el inductorquímico para estimular la regeneración de la raíz. Tras la regeneración de la raíz, las plántulas se transfieren al sueloy se cultivan hasta la madurez. Cuando las plántulas se transfieren al suelo, el medio agar se debe eliminar de lasplántulas claramente mediante lavado. Durante los primeros dos días en el suelo, las plántulas deberán cubrirse conuna envoltura de plástico para mantener una humedad elevada.

F) Maduración de las plantas transgénicas

Tras aproximadamente 5-6 semanas, la mayoría de las silicuas se convierten en amarillas y se secan. Las semillasse recogen de forma individual y se almacenan a 4ºC.

Ejemplo 16

Transfección de Arabidopsis con XVE-Lec1

La sobreexpresión de LEc1 bajo el control del sistema inducible XVE (pER8-LEc1) conduce a la formación deembriones somáticos o estructuras de tipo embrión en los cotiledones en plántulas transgénicas de Arabidopsis. Es-te sistema se puede usar para producir embriones somáticos en condiciones sin hormonas vegetales en ausencia dehormonas vegetales. Esto difiere de todos los procedimientos actuales de cultivo tisular en los que la formación deembriones somáticos depende de 2,4-D. Tras la transferencia al medio sin el inductor, los embriones somáticos germi-narán en plántulas, produciendo de este modo transformantes que no expresan un marcador antibiótico seleccionable.La sobreexpresión condicional de Lec1 también puede incrementar las eficacias de la transformación y regeneraciónde monocotiledóneas y gimnospermas. Usando las técnicas de la materia anterior, ha sido muy difícil obtener regene-rantes y/o transformantes para las especies más económicamente importantes. Este procedimiento es particularmenteimportante para las monocotiledóneas y gimnospermas, cuya regeneración se produce principalmente a través de lavía de la embriogénesis somática.

Ejemplo 17

Transfección con XVE-SERK

El gen SERK de Arabidopsis se clonó mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). El gen SERK secolocó bajo el control del sistema XVE. El constructo XVE-SERK se usó para transfeccionar tabaco y Arabidopsis.Tras la inducción, los embriones somáticos se formarán en condiciones sin hormonas vegetales en ausencia de todashormonas vegetales añadidas. Las técnicas de la materia anterior requerían la presencia de 2,4-D para la formación deembriones somáticos. Tras la transferencia al medio sin inductor, los embriones somáticos germinarán en plántulas,produciendo de ese modo transformantes que no expresan un marcador antibiótico seleccionable. La sobreexpresióncondicional de SERK también incrementará las eficacias de la transformación y regeneración de monocotiledóneas ygimnospermas, que previamente ha sido muy difícil regenerar y/o transformar. Este procedimiento es particularmenteimportante para las monocotiledóneas y gimnospermas, cuya regeneración se produce principalmente a través de lavía de la embriogénesis somática.

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Ejemplo 18

Sistemas inducibles dobles

Un objetivo principal es desarrollar un sistema de expresión inducible doble en el que múltiples genes se puedenregular de forma independiente e inducible. Las plantas transgénicas de Arabidopsis portadoras de a) XVE y b) GVGpueden generarse mediante cotransformación o cruces entre líneas individuales. Cada componente del sistema indu-cible doble funcionará de forma independiente y no interferirá en otra y mantendrán su capacidad de inducción bajocontrol estrecho. Los genes bajo el control de cada promotor se pueden inducir en orden o simultáneamente medianteel uso y en el momento adecuados del inductor.

Ejemplo 19

Uso de un gen KNOTTED para inducir la formación de brotes

La expresión del gen knotted1 y los miembros de su familia, por ejemplo los genes homólogos al knotted1 KNAT1y KNAT2, es muy elevada en brotes (Lincoln y col., 1994; Chuck y col., 1996). Las plantas transgénicas que se hantransformado con, por ejemplo, el gen KNAT1 bajo el control de un promotor 35S de CaMV presentan alteracionesgraves, incluida la formación de brotes ectópicos (Lincoln y col., 1994). Sin embargo, tales brotes son incapaces dedesarrollarse con normalidad a causa de la expresión no controlada del gen knotted. Un sistema en el que las plantasse transforman con los genes knotted que se puedan regular permitirá producir plantas que producirán brotes, y, acontinuación, usar los brotes para regenerar las plantas normales cerrando la expresión del gen en los brotes. Lapresente invención es un procedimiento para conseguir tal resultado. Un gen knotted, por ejemplo kn1 del maíz, seintroduce en un vector de forma que se encuentre bajo el control del sistema GVG descrito anteriormente. Las plantasque se han transformado con este vector crecerán con normalidad en ausencia de un inductor del sistema GVG o XVE.Explantes, por ejemplo discos de hojas, de estas plantas transgénicas se pueden tratar con un inductor (por ejemplo,dexametasona o 17-β-estradiol) para estimular el desarrollo de brotes esporádicos. Los brotes desarrollados se puedenescindir y transferir a un medio sin el inductor. A continuación, estos brotes se desarrollarán con normalidad paradar plantas transgénicas. Los vectores usados pueden incluir otros genes de interés, que no están bajo el control delsistema GVG o XVE, que se desea para transformar las plantas. Las plantas seleccionadas incluirán el gen de interés yse habrán seleccionado sin el requerimiento de usar un marcador antibiótico seleccionable. Obsérvese que la selecciónde brotes transformados debería realizarse como en el Ejemplo 3, es decir en medio sin hormonas (MBC) pero concarbenicilina para matar las Agrobacterias. Para el mismo fin se pueden usar homólogos del gen knotted de maíz deotras plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.

Ejemplo 20

Uso de un gen CKI1 para inducir la formación de brotes

Recientemente se ha identificado el gen CKI1 (Kakimoto, 1996). La sobreproducción de este gen en plantas tienecomo resultado plantas que exhiben respuestas de citoquinina típicas, incluida una rápida división celular y la forma-ción de brotes en cultivo tisular en ausencia de citoquinina exógena (Kakimoto, 1996). El gen CKI1 se puede usarcomo un marcador seleccionable de un modo similar al ipt. Un sistema en el que las plantas se transforman con CKI1que se pueda regular permitirá producir plantas que producirán brotes, y, a continuación, usar los brotes para regenerarlas plantas normales cerrando la expresión del gen en los brotes. La presente invención es un procedimiento para con-seguir tal resultado. Un gen CKI1 se introduce en un vector de forma que se encuentre bajo el control del sistema GVGdescrito anteriormente. Las plantas que se han transformado con este vector crecerán con normalidad en ausencia deun inductor del sistema GVG. Explantes, por ejemplo discos de hojas, de estas plantas transgénicas se pueden tratarcon un inductor (por ejemplo, dexametasona) para estimular el desarrollo de brotes esporádicos. Los brotes desarro-llados se pueden escindir y transferir a un medio sin el inductor. A continuación, estos brotes se desarrollarán connormalidad para dar plantas transgénicas. Los vectores usados pueden incluir otros genes de interés, que no están bajoel control del sistema GVG, que se desean para transformar las plantas. Las plantas seleccionadas incluirán el gende interés y se habrán seleccionado sin el requerimiento de usar un marcador antibiótico seleccionable. Como en losejemplos 3 y 19, la selección se realiza en placas con MBC para los brotes, que después se transfieren a MBCI paraenraizar.

Ejemplo 21

Vectores con genes de resistencia a antibióticos o de resistencia a herbicidas bajo el control de GVG o XVE

Los genes causantes de resistencia a antibióticos se han usado ampliamente en vectores como marcadores se-leccionables. Un problema con tales sistemas es que los genes tienden a ser constitutivamente activos y las plantastransformadas que se obtienen continuarán expresando estos genes. La inserción de tales genes de expresión consti-tutiva en plantas que se cultivan fuera de un contexto de laboratorio ha supuesto un problema ambiental y sanitario(Bryant y Leather, 1992; Gressel, 1992; Flavell y col., 1992). La introducción de tales genes bajo el control del sistemaGVG o XVE supera estos inconvenientes. Los genes de resistencia a antibióticos únicamente se expresarán duranteel procedimiento de selección en el momento en el que haya presente un glucocorticoide en el medio de crecimien-to, pero los genes no se activarán cuando se cultiven fuera del laboratorio en ausencia de glucocorticoide. Se puede

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utilizar cualquier resistencia a antibiótico deseada. Para este fin se pueden usar los vectores pTA7001 y pTA7002 ade-cuadamente modificados. El gen del antibiótico de interés se clona en, por ejemplo, el sitio de clonación XhoI-SpeI.Los vectores pTA7001 o pTA7002 se modificarán de tal manera que el gen hpt se inactiva o elimina. Se pueden usarestos vectores modificados. Vectores adecuados se pueden preparar comenzando con, por ejemplo, el vector pBI101(Clontech). La región entre los bordes izquierdo y derecho del vector se elimina y reemplaza con el sistema GVG oXVE descrito anteriormente, que incluye, brevemente, el promotor 35S, el dominio de unión al ADN de GAL4, undominio de transactivación de VP16, y el dominio regulador del receptor de glucocorticoides más la región 6xGAL4UAS, seguida por un sitio de clonación. Tales vectores no incluyen un gen de resistencia a antibiótico. Cualquier gende resistencia a antibiótico se puede insertar en el sitio de clonación cerca de la región 6xGAL4 UAS y se encontrarábajo el control del glucocorticoide. El gen de la higromicina fosfotransferasa y el gen de la neomicina fosfotransferasa(npt) son dos ejemplos de genes de antibióticos que pueden utilizarse. Para transformar los explantes de las especiesdeseadas se pueden usar vectores Ti que incluyan un gen npt o hpt regulable con DEX. Durante la fase de cultivotisular, los brotes regenerados se seleccionarán en presencia de DEX (que activa el gen de resistencia al antibióticoadecuado) y en presencia del antibiótico adecuado (kanamicina o higromicina). Una vez verificado, los brotes trans-génicos se pueden transferir a continuación en medio de cultivo tisular con el antibiótico, pero sin el inductor químico(DEX). Las plantas resultantes contendrán los genes de resistencia a antibióticos, pero estos genes no serán activos enausencia de un inductor químico.

Los genes de resistencia a herbicidas se pueden colocar de forma similar bajo el control del sistema GVG o XVEy usarse para la selección de plantas transformadas durante la fase de cultivo tisular. Tales plantas no expresarían losgenes de resistencia a herbicidas en el campo. Ejemplos de genes de resistencia a herbicidas son PAT (fosfinotricinaacetiltransferasa) que confiere resistencia al herbicida BASTA (principio activo fosfinotricina) (Rathore y col., 1993;Becker y col., 1992) y una forma mutante de acetolactato sintasa, que es resistente al herbicida sulfonilurea de Du-Pont (véase, por ejemplo, Wiersma y col., 1989; Harms y col., 1992; Hattori y col., 1992; Hattori y col., 1995). Enteoría, estos genes podrían usarse no sólo como marcadores seleccionables en cultivo tisular, sino también podríanexpresarse en el campo. Dados los posibles peligros de rociar DEX o 17-β-estradiol, no se debe rociar DEX sobre lasplantas en el campo, pero este procedimiento podría usarse si como inductor se usa un compuesto más seguro que laDEX.

Ejemplo 22

Crecimiento y transformación de plantas

Semillas SR1 de Nicotiana tabacum se esterilizaron en superficie en 30% de lejía comercial que contenía 0,02%de Tween 20 durante 20 minutos y se lavaron cinco veces con agua estéril. Las plantas se cultivaron en un cuartode cultivo tisular a 22ºC a ciclos de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. La transformación del tabaco se realizóesencialmente como describen Horsch y col., (1985) y Klee y col., (1987). Se prepararon discos de hojas a partir dehojas jóvenes de plantas de cuatro semanas y los explantes se cultivaron durante dos días en medio MB (sales MS,vitaminas B5, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de acetosiringona, 0,2% de fitagel, pH 5,7). Tras un co-cultivo de tres días conAgrobacterium tumefaciens, los discos de hojas se transfirieron a medio MS que contenía diferentes concentracionesde DEX. Tras de 20 a 40 días de cultivo, los brotes regenerados se escindieron de las plantas y se cultivaron en medioMS que contenía AIA para inducir la regeneración de la raíz.

Se germinaron hojas de lechuga esterilizadas (Lactuca sativa var. Great Lake nº 118) y las plántulas se cultivaroncomo se ha descrito para el tabaco, La transformación de los discos de hojas de lechuga se realizó como describieronCurtis y col., (1996) con la excepción de que no se añadió citoquinina al medio de cultivo.

Ejemplo 23

Optimización de las condiciones para la inducción del gen ipt en células transformadas

Los discos de hojas de tabaco y los discos de hojas de lechuga, obtenidos de la transfección con pTA7002G/ipt/luc,Se introdujeron en medio con carbenicilina y diferentes concentraciones de dexametasona (DEX). Los explantes setransfirieron a medio reciente cada dos semanas para mantener condiciones de cultivo constantes. El número de brotesque se regeneraron a partir de un número de discos de hojas incrementó de forma espectacular a medida que se incre-mentaba la concentración de DEX (Tabla 2). Ciento setenta brotes de tabaco y 198 brotes de lechuga se regeneraronde 28 explantes a una concentración de 10 µM de DEX. En ausencia de DEX, sólo se regeneraron 7 brotes en tabacoy se regeneraron 30 brotes en lechuga de 28 explantes cada uno (Figura 8).

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TABLA 2

Tabaco Lechuga

DEX (µm) 0 0,1 1 10 0 10

Número total de regenerantes por 28 explantes 7 139 129 170 30 198

Número de regenerantes examinados 7 72 72 72 28 28

Porcentaje de regenerantes LUC+ 42 29 44 49 12 46

Ejemplo 24

Medición de la actividad Luc en regenerantes de tabaco y de lechuga

El casete de transformación pTA7002G/ipt/luc (Figura 12) contenido en el gen luc bajo el control del promotor35S del CaMV (Millar y col., 1992; Benfey y Chua, 1990). Se midió la actividad luc con el fin de estimar el númerode brotes transgénicos usando el sistema de imágenes de vídeo descrito por Michelet y Chua (1996). Las medicionesse integraron en 5 minutos y se sustrajo el fondo correspondiente de las imágenes (Figuras 9A-F).

Aproximadamente el 50% de los regenerantes expresaron el gen luc (Tabla 2). En condiciones de no inducción(DEX 0 µM), el 42% de los regenerantes del tabaco y el 12% de los regenerantes de la lechuga mostraron actividadLuc detectable (Tabla 2). Esto indica que un pequeño porcentaje de las células transformadas eran muy sensibles ala citoquinina, cuyos niveles podrían elevarse ligeramente debido a la expresión poco a poco de ipt. Dado el elevadorendimiento de los regenerantes, los experimentos descritos a continuación se realizaron usando brotes de explantesque se habían tratado con DEX 10 µM.

Ejemplo 25

Medición del efecto de la inducción de ipt con DEX en el tiempo

Para caracterizar más el sistema de transformación, los inventores analizaron los efectos de la duración de la in-ducción así como los efectos de fitohormonas aplicadas de forma exógena. Se realizaron experimentos de evoluciónen el tiempo para determinar si la especificidad de la inducción del gen ipt disminuye con el tiempo debido a lasobreproducción y difusión de la citoquinina, lo que podría desencadenar acontecimientos de regeneración en las cé-lulas vecinas no transformadas. La actividad Luc en 54 regenerantes de tabaco (obtenidos de una transfección conPta7002G/ipt/luc) se midió tras 20, 30 y 40 días de inducción con DEX 10 µM para estimar la frecuencia de trans-formación. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de regenerantes con actividad Luc detectableen el tiempo. Tras 20 días, el 46% de los regenerantes poseía actividad Luc detectable, y tras 30 y 40 días, el 53%de regenerantes poseía actividad Luc detectable. Además, no se produjeron cambios detectables en la eficacia de latransformación (determinados como actividad Luc) cuando se indujo directamente la expresión del gen ipt durante elperiodo de cocultivo con Agrobacterium. Se han obtenido resultados similares con la lechuga.

Ejemplo 26

Influencia de auxina aplicada de forma exógena durante la inducción

La actividad luciferasa se midió en brotes de explantes de tabaco (obtenidos de una transfección con pTA7002G/ipt/luc) cultivados durante 40 días en medio con 1,0, 1,5 y 2,0 mg/l de auxina y DEX 10 µM. los niveles elevados de auxinay citoquinina favorecieron la regeneración de la raíz y produjeron un efecto de supresión sobre la regeneración de bro-tes y, por tanto, podrían reducir el número de regenerantes no transgénicos. No se produjeron diferencias significativasen la actividad luciferasa a diferentes concentraciones de auxina, A 1,0 mg/ml de auxina, el 45% de los regenerantesposeía actividad Luc detectable, a 1,5 mg/l de auxina, el 58% de los regenerantes poseía actividad Luc detectable y a2,0 mg/l de auxina, el 47% de los regenerantes poseía actividad Luc detectable.

Ejemplo 27

Determinación de los niveles de transcrito de ipt en los brotes usando análisis de tipo Northern

El nivel de los transcritos de ipt se determinó en regenerantes de tabaco y de lechuga de 30 días (procedentes deuna transfección con pTA7002G/ipt/luc) con y sin actividad luciferasa detectable. Los regenerantes se cultivaron endexametasona 10 µM.

Se extrajo ARN de 0,1 g de material vegetal usando kits de extracción de ARN de Qiagen y sus protocolos. El ARNtotal se separó en geles de agarosa al 1% que contenían formaldehído 0,8 M. El ARN se transfirió a membranas de

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Duralon UV de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene). Tras la transferencia, el ARN se sobrecruzócovalentemente con la membrana mediante irradiación UV. Las membranas se bloquearon y se realizó la hibridaciónusando solución de Stratagene QuikHyb® a 68ºC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la hibridaciónse lavaron las membranas tres veces durante 15 minutos con 2X SCC + 0,1% de SDS a 65ºC y una vez con 0,1X SCC+ 0,1% de SDS a 60ºC durante 15 minutos.

Los resultados del análisis de tipo Northern revelaron que con sólo una excepción (Figura 10C, muestra f), todoslos regenerantes de tabaco y de lechuga analizados expresaron transcritos de ipt (Tabla 3). La cantidad de transcritoipt fue superior en los regenerantes de tabaco que en los de lechuga y varió entre diferentes brotes. Los niveles detranscritos para ipt fueron superiores en los brotes LUC+ que en los regenerantes sin actividad luciferasa detectable(LUC-). Esto indica que la regeneración estaba casi completamente acoplada a la expresión del gen ipt lo que conducea niveles elevados de citoquinina.

TABLA 3

Número de regenerantes Actividad luciferasa Trascrito ipt Trascrito luc luc (número de copias)del tabaco

9 + + + 1

1 + + + >1

3 - + Más corto 1

1 - + Más corto >1

3 - + - 0

1 - - - 0

Ejemplo 28

Determinación de la presencia del gen luc y el nivel de su transcrito en brotes usando análisis de tipo Southern yNorthern

Para analizar la presencia del gen luc se realizó un análisis de tipo Southern usando ADN de regenerantes de tabacoLUC+ y LUC- (obtenidos de una transfección con pTA7002G/ipt/luc). Se extrajo ADN de 0,1 g de material de plantade tabaco usando kits de extracción de ADN Nucleon y sus protocolos. El ADN se separó en geles de agarosa al 0,8%.El ADN se transfirió a membranas de Duralon UV de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene). Trasla transferencia, el ADN se sobrecruzó covalentemente con la membrana mediante irradiación UV. Las membranasse bloquearon e hibridaron usando solución de Stratagene QuikHyb® a 68ºC de acuerdo con las instrucciones delfabricante. Tras la hibridación se lavaron las membranas tres veces durante 15 minutos con 2X SCC + 0,1% de SDSa 65ºC y una vez con 0,1X SCC + 0,1% de SDS a 60ºC durante 15 minutos. El gen luc se encontró en todos losregenerantes LUC+ y en el 50% de los brotes LUC-.

El análisis de tipo Northern se realizó de acuerdo con el Ejemplo 27 con el fin de analizar la presencia de transcritosluc en regenerantes de tabaco LUC+ y LUC-. Los regenerantes LUC- poseían transcritos luc más pequeños y menosabundantes en comparación con los transcritos luc de los regenerantes LUC+, que eran más grandes y más abundantes(Tabla 3).

Ejemplo 29

Análisis de la resistencia a higromicina

La expresión del gen hpt confiere resistencia a higromicina. Para analizar la presencia del gen hpt en los rege-nerantes de tabaco LUC+ y LUC- (obtenidos mediante transfección con pTA7002G/ipt/luc), se analizó la resistenciaa higromicina como se ha expuesto en el Ejemplo 3. Briznas de hoja joven con peciolo se colocaron en medio agarcon higromicina y se clasificaron según la formación de raíz. La resistencia a higromicina se analizó en placas conmedio no inductor que contenía 20 mg/l de higromicina. El noventa y cinco por ciento de todos los regenerantes detabaco LUC+ analizados eran resistentes a higromicina y más del 60% de los brotes LUC- analizados eran resistentesa higromicina.

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Ejemplo 30

Regeneración de la raíz, morfología de la planta y número de copias en tabaco

Los brotes de tabaco (obtenidos de una transfección con pTA7002G/ipt/luc) se transfirieron a un medio inductorde la raíz (1 x sales MS, vitaminas B5, 0,15 mg/l de AIA, 20 g/l de sacarosa, 0,2% de fitagel, pH 5,7) que no conteníaDEX. Aproximadamente el 40% de los brotes de tabaco transgénicos desarrolló un sistema radicular fuerte en un plazomáximo de 29 días tras la transferencia. Con muy pocas excepciones (menos del 2%), la morfología de las plantas detabaco transgénicas parecían normales. Las plantas de tabaco se transfirieron al suelo. Las plantas desarrollaron hojasy flores normales y, aparentemente, no estaba afectada la producción de semillas.

El análisis de segregación para la familia de los genes luc se realizó con 44 plántulas seleccionadas al azar (progenieT1) de una línea de tabaco transgénico (Figuras 11A-B). Las semillas se tomaron de plantas transgénicas que sehabían sometido a autocruzamiento. Se analizó una población de la progenie (plántulas germinadas). En estas semillas,las mediciones de actividad luciferasa mostraron una clara segregación 3:1 del gen luc dominante. Esto mostró unainserción en un locus y que el transgen se transmitió de forma estable a la segunda generación.

El análisis de tipo Southern se realizó con ADN de las plántulas tras la digestión del ADN con enzimas de restric-ción. Se detectaron bandas sencillas de gel (Figura 11C).

Ejemplo 31

Análisis de tipo Southern de los regenerantes de tabaco

El análisis de tipo Southern se realizó con ADN de dieciocho regenerantes de tabaco (obtenidos de una transfeccióncon pTA7002G/ipt/luc) tras la digestión con Bam HI, SacI y XbaI. La mayoría de los brotes contenían únicamenteuna única copia del transgen. Sólo dos de dieciocho regenerantes mostraron la presencia de más de una banda dehibridación (Tabla 3).

Ejemplo 32

Características y aplicaciones del sistema GLF

La Figura 17 es un diagrama esquemático del vector del marcaje de activación de XVE pER16. Sólo se muestra laregión entre el borde derecho (RB) y el borde izquierdo (LB) (no a escala). Dos unidades de transcripción y el promotorOLexA-46 se localizan entre el RB y el LB. En la primera unidad de transcripción, el promotor G10-90 (Ishige y col.,1999) dirige el gen de fusión XVE terminado por la secuencia de adición de poliA rbc E9. La segunda unidad detranscripción consiste en el promotor del gen de la Nopalina sintasa (NOS), la secuencia codificadora del gen de laneomicina transferasa II (NPT II) y la secuencia de poliadenilación NOS. El promotor OLEXA-46 está formado por 8copias de la secuencia operador LexA fusionada con el promotor -46CaMV35S. Tras la integración en el genoma de laplanta, el promotor OLEXA-46 puede activar la transcripción de secuencias fusionadas en sentido en dirección 3’ desdepromotor de un modo dependiente de 17-β-estradiol.

El sistema GLF se puede usar en selecciones genéticas a gran escala para mutantes de interés. Por ejemplo, losinventores pueden genera un gran número de mutantes de Arabidopsis (Betchtold y col., 1993) portadores del vectorGLF para genómica funcional. Un mutante de ganancia de función se puede identificar de inmediato a partir de laprogenie T1 cultivada en el medio de inducción que contenía 17-β-estradiol. La eliminación del inductor permitirá larecuperación del mutante incluso en el caso de que la mutación de ganancia de función sea letal. Obsérvese que estetipo de mutaciones letales no se puede recuperar mediante todos los previos sistemas publicados (Hayashi y col., 1992;Kakimoto, 1996; Weigel y col., 2000). Por otro lado, el fenotipo de pérdida de función se puede caracterizar despuésen la progenie T2. Una ventaja adicional del sistema GLF es que permite la complementación genética condicional deuna mutación de pérdida de función. Esto se puede realizar mediante tratamiento adecuado de un mutante de pérdidade función con el inductor 17-β-estradiol, restableciendo de este modo de forma condicional del fenotipo mutante alfenotipo de tipo salvaje.

Bibliografía

Ainley WM and Key JL (1990). Plant Mol. Biol. 14:949-966.

Akiyoshi DE, Klee H, Amasino RM, Nester EW and Gordon MP (1984). Proc. Natl. Acad. Sci,. USA 81:5994-5998.

Aoyama T and Chua N-H (1997). Plant J. 11:605-612.

Aoyama T, Dong C-H, Wu Y, Carabelli M, Sessa G, Ruberti I, Morelli G and Chua N-H (1995). Plant Cell7:1773-1785.

Barry GF, Rogers SG, Fraley RT and Brand L (1984). Proc. Natl. Acad. Sci,. USA 81:4776-4780.

23

5

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15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 263 502 T3

Beato M (1989). Cell 56:335-344.

Beavan MW and Chilton MD (1982). Annu. Rev. Genet. 16:357-384.

Bechtold N, Ellis J and Pelletier G (1993). C. R. Acad. Sc,. Ser. III Sci. Vie 316:1194-1199.

Becker D, Kemper E, Schell J and Masterson R (1992). Plant Molecular Biology 20:1195-1197.

Benfey PN and Chua N-H (1990). Science 250:956-966.

Braselmann S, Graninger P and Busslinger M (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1657-1661.

Bryant J and Leather S (1992). Trends Biotechnol 10:274-275.

Chaudhury AM, Letham S, Craig S and Dennis ES (1993). Plant J. 4:907-916.

Chuck G, Lincoln C and Hake S (1996). The Plant Cell 8:1277-1289.

Cline MG (1991). Physiol Plant. 90:230-237.

Coenen C and Lomax T (1997). Trends Plant Sc,. 2:351-355.

Coruzzi G, Broglie R, Edwards C and Chua N-H (1984). EMBO J. 3:1671-1679.

Curtis IS, Power JB, Blackball NW, de Laat AMM and Davey MR (1996). J Exp. Bot. 45:1441-1449.

Dalrymple MA, McGeoch DJ, Davison AJ and Preston CM (1985). Nucl. Acids Res. 13: 7865-7879.

Davies PE (ed.) (1995). Plant Hormones and Their Role in Plant Growth and Development, Kluwer AcademicPublisher, Dordrecht.

de Wet JR, Wood KV, DeLuca M, Helinski DR and Subramani S (1987). Mot Cell. Biol. 7:725-737.

Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E and Yamakado M (1997). Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:2117-2121.

Faiss M, Zalubilová Strnad M and Schmülling T (1997). Plant Journal 12:401-415.

Flavell RB, Dart E, Fuchs RL and Fraley RB (1992). Bio Technology 10:141-144.

Fluhr R, Moses P, Morelli G, Coruzzi G and Chua N-H (1986). EMBO J. 5:2063-2071.

Gan S and Amasino RM (1995). Science 270:1986-1988.

Gatz C (1996). Cur. Opin. Biotechnol. 7:168-172.

Gatz C, Frohberg C and Wendenburg R (1992). Plant J. 2:397-404.

Giniger E, Varnum S and Ptashne M (1985). Cell 40:767-774.

Goldberg SB, Flick JS and Rogers SG (1984). Nucl Acids. Res. 12:4665-4677.

Goodrich JA, Hoey T, Thut CJ, Admon A and Tjian R (1993). Cell 75:519-530.

Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y and Shine J (1986). Science 231:1150-1154.

Gressel J (1992). Trends Biotechnol 10:382.

Harms CT, Armour SL, DiMaio JJ, Middlesteadt LA, Murray D, Negrotto DV, Thompson-Taylor H, Wey-mann K, Montoya AL, Shillito RD, et al. (1992). Mol Gen. Genet. 233:427-435.

Hattori J, Rutledge R, Labbe H, Brown D, Sunohara G and Miki B (1992). Mol. Gen. Genet. 232:167-173.

Hattori J, Brown D, Mourad G, Labbe H, Ouellet T, Sunohara G, Rutledge R, King J and Miki B (1995). Mol.Gen. Genet. 246:419-425.

Hayashi H, Czaja I, Lubenow H, Schell J and Walden R (1992). Science 258.1350-1353.

Horii T, Ogawa T and Ogawa H (1981). Cell 23:689-697.

24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 263 502 T3

Horsch RB, Frey JE, Hofman NL, Eichholtz D, Rogers SG and Fraley RJ (1985). Science 227:1229-1231.

Horsch R, Fry J, Hofman N, Neidermeyer J, Rogers S and Fraley R (1988). In Plant Molecular Biology Manual,A5 (Gelvin S and Schilperoort R, eds). Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, pp. 1-23.

Hua J and Meyerowitz EM (1998). Cell 94:261-271.

Ishige F, Takaichi M, Foster R, Chua NH and Oeda K (1999). Plant J. 18:443-448.

Kakitnoto T (1996). Science 274:982-985.

Keegan L, Gill G and Ptashne M (1986). Science 231:699-704.

Klee H, Rorsch R and Rogers S (1987). Ann. Rev. Plant Physiol. 38:467-486.

Kunkel T, Niu W-W, Chan YS and Chua N-H (1999). Nat. Biotechnol. 17:916-919.

Kuraish S and Okumura FS (1956). Bot. Mag. 69:817.

Laughon A and Gesteland R (1984). Mol. Cell. Biol. 4:260-267.

Lin Y-S, Maldonado E, Reinberg D and Green MR (1991). Nature 353:569-571.

Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, Benito MI, Town CD, Fujii CY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M,Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA,Lee J, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, VanAken S, Umayam L, Tallon LJ, Gill JE, Venter JC, .et al. (1999). Nature 402:761-768.

Lincoln C, Long J, Yamaguchi J, Serikawa K and Hake S (1994). The Plant Cell 6:1859-1876.

Lloyd AM, Schena M, Walbot V and Davis RW (1994). Science 266:436-439.

Louvion J-F, Havaux-Copf B and Picard D (1993). Gene 131:129-134.

Matsuoka M, Ichikawa H, Saito A, Tada Y, Fujimura T and Kano-Murakami Y (1993). Plant Cell 5:1039-1048.

Mayer K, Schuller C, Wambutt R, Murphy G, Volckaert G, Pohl T, Dusterhoft A, Stiekema W,Entian KD,Terryn N, Harris B, Ansorge W, Brandt P, Grivell L, Rieger M, Weichselgartner M, de Simone V, ObermaierB, Mache R, Muller M, Kreis M, Delseny M, Puigdomenech P, Watson M, McCombie WR, et al. (1999). Nature402:769-777.

McKenzie MJ, Mett V, Reynolds PHS and Jameson PE (1998). Plant Physiol. 116: 969-977.

Medford JI, Horgan BR, El-Sawi Z and Klee HJ (1989). Plant Cell 1:403-413.

Meinke DW (1985). Theor. Appl. Genet. 12:382-392.

Meinke DW (1995). Ann. Rev. Plant Physicl. Plant. Mot. Biol. 46:369-394.

Mett VL, Lockhead LP and Reynolds PHS (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4567-4571.

Michelet B and Chua N-H (1996). Plant Mol. Biol. Rep. 14:320-329.

Miesfeld R, Rusconi S, Godowski PJ, Maier BA, Okret S, Widstroem A-C, Gustafsson J-A and YamamotoKR (1986) Cell 46:389-399.

Miki T, Ebina Y, Kishi F and Nakazawa A (1981). Nucleic Acids Res. 9:529-543.

Miklashevichs E and Walden R (1997). Physiologia Plant 100:528-533.

Millar AJ, Short SR, Chua N-H and Key SA (1992). Plant Cell 4:1075-1087.

Mok DWS and Mok MC (1994). Cytokinins: Chemistry Activity and Function (Mok DWS and Mok MC, eds.)Boca Raton, Florida: CRC Press.

Murashige T and Skoog F (1962). Physiol Plant. 15:493-497.

25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 263 502 T3

Nagy F, Kay SA and Chua N-H (1988). In Plant Molecular Biology Manual, B4 (Gelvin Sand Schilperoort R,eds). Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, pp. 1-12.

Odell JT, Nagy F and Chua N-H (1985). Nature 313:810-812.

Ooms G, Kaup A and Roberts J (1983). Theor. Appl. Genet. 66:169-172.

Picard D (1993). Trends Cell Biol. 3:278-280.

Picard D, Salser SJ and Yamamoto KR (1988). Cell 54:1073-1080.

Rathore KS, Chowdhury VK and Hodges TK (1993). Plant Molecular Biology 2l:871-884.

Redig P, Schmülling T, and Van Onckelen H (1996). Plant Physiol 112: 141-148.

Rusconi S and Yamamoto KR (1987). EMBOJ. 6:1309-1315.

Sachs T and Thimmann KV (1967). Am. J Bot. 54:136-144.

Sadowski I, Ma J, Triezenberg S and Ptashne M (1988). Nature 335:563-564.

Schena M, Lloyd AM and Davis RW (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425.

Skoog F and Miller CO (1957). Symp. Soc. Expl. Biol. 11:118-131.

Smigocki AC and Owens LD (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5131-5135.

Smigocki AC and Owens LD (1989). Plant Physicl. 91:808-811.

Thompson JF, Hayes LS and Lloyd DB (1991).Gene 103:171-177.

Tran Thanh Van KM (1981). Ann. Rev. Plant Physiol 32:292-311.

Triezenberg SJ, Kingsbury RC and McKnight SL (1988). Genes Devel. 2:718-729.

Valvekens D, Van Montagu M and Van Lijsebettens M (1988). Proc. Natl. Acad. Sc,. USA 85:5536-5540.

Waldron C, Murphy EB, Roberts JL,Gustafson GD, Armour SL and Malcom SK (1985). Plant. Mol. Biol.5:103-108.

Weigel D, Ahn JH, Blazquez MA, Borevitz JO, Christensen SK, Fankhauser C, Ferrandiz C, Kardailsky I,Malancharuvil EJ, Neff MM, Nguyen JT, Sato S, Wang ZY, Xia Y, Dixon RA, Harrison MJ, Lamb CJ, YanofskyMF and Chory J (2000). Plant Physiol 122:1003-1013.

Weinmann P, Gossen M, Hillen W, Bujard H and Gatz C (1994). Plant J. 5:559-569.

Wiersma PA, Schmiemann MG, Condie JA, Crosby WL and Moloney MM (1989). Mot. Gen. Genet. 219:413-420.

Wingler A, von Schaewen A, Leegood RC, Lea PJ and Quick WP (1998). Plant Physicl. 116:329-335.

Yoder JI and Goldsbrough AP (1994). Biol Technology 12:263-267.

Zuo J, Niu Q-W and Chua N-H (2000). Plant J. 24:265-273.

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REIVINDICACIONES

1. Un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un factor de transcripción, que tiene los siguienteselementos en la dirección 5’ a 3’, (i) un promotor, (ii) ADN que codifica un dominio de unión a ADN del represorbacteriano LexA, (iii) ADN que codifica un dominio de transactivación de VP16, (iv) ADN que codifica el dominioregulador de un receptor de estrógenos.

2. El vector de la reivindicación 1, en el que dicho vector además comprende un gen que codifica un marcadorseleccionable o un marcador detectable, cuya expresión está controlada por el factor de transcripción.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que dicho gen es ipt, CKI1, luciferasa, un miembro de la familia knotted,o un gen cuya expresión puede estimular la regeneración y desarrollo de los brotes.

4. El vector de la reivindicación 2, en el que dicho vector además comprende un gen de resistencia a antibióticos.

5. El vector de la reivindicación 2, en el que dicho vector además comprende un gen de resistencia a herbicidas.

6. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho vector además comprende uno o más genesde interés.

7. El vector de la reivindicación 1, en el que dicho promotor es un promotor constitutivo.

8. El vector de la reivindicación 7 en el que dicho promotor constitutivo es G1090.

9. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho promotor es un promotor específico detejido.

10. El vector de la reivindicación 1 ó 2, que además comprende una secuencia del borde derecho adyacente alextremo 5’ del promotor (i) y, en dirección 3’ del ADN que codifica el dominio regulador de un receptor de estrógeno(iv), en la dirección 5’ a 3’, un sitio de unión a OLexA, un promotor mínimo que contiene una caja TATA, y una secuenciadel borde izquierdo.

11. Un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5’ a 3’, (i) un promotor constitutivo, (ii) ADN que codificaun dominio de unión a ADN de represor bacteriano LexA, (iii) ADN que codifica un dominio de transactivación deVP16, (iv) ADN que codifica un dominio regulador de un receptor de estrógeno.

12. Una planta transgénica o célula de planta transgénica que comprende un ácido nucleico de la reivindicación11.

13. La planta transgénica o célula de planta transgénica de la reivindicación 12 comprende además un gen seleccio-nado del grupo constituido por ipt, CKI1, un miembro de la familia knotted, o un gen cuya expresión puede estimularla regeneración y el desarrollo de los brotes.

14. Un procedimiento para preparar una planta transgénica exhibe un diseño fluorescente o una palabra o palabrasen el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

a) preparar una planta transgénica que comprende un gen de luciferasa bajo el control de un promotor química-mente inducible que está controlado por un estrógeno, donde dicho promotor comprende un ácido nucleico según lareivindicación 11; y

b) colocar un producto químico que induzca dicho promotor químicamente inducible en dicha planta transgénicaen el patrón del diseño, palabra o palabras que se deseen; por medio de lo cual dicha planta producirá luciferasa yfluorescerá en el patrón en el que el producto químico se colocó en dicha planta transgénica.

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