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Práctica Nº2 Biología Molecular

Fundamento

El ADN se encuentra libre en el citoplasma de la célula procariota para su aislamiento

se debe tener en cuenta al rompimiento eficiente de las células. También la inhibición

de las enzimas Nucleasa y Proteasas que se liberan durante la disrupción celular. Este

Procedimiento tiene las siguientes etapas.

1. Degradación de la pared celular (compuesta por peptidoglicano)

mediante la actividad de la lisozima.

2. Lisis celular por disrupción de las membranas celulares por el

detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Este también reduce la

actividad de las nucleasas por su capacidad de desnaturalizar

proteínas. Nucleasa va a cortar en ADN y ARN

3. La adición de agentes quelantes como el ácido etilen diamino tetra

acético (EDTA) también inhibe las nucleasas removiendo los

cationes divalentes.

4. Purificación del DNA mediante la mezcla cloroformo-alcohol

isoamílico. Se usa para desnaturalizar y precipitar proteínas.

5. El DNA libre de proteínas se aísla mediante precipitación con etanol.

Objetivo

Observar e identificar el ADN

Materiales

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

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Práctica Nº2 Biología Molecular

Materiales y equipos:

a. Incubadora bacteriológica a 37ºC.

b. Centrífuga.

c. Baño María a 60ºC.

d. Solución Salina Estéril (NaCl, 0.85%).

e. Solución de Lisozima (10 mg/ml).

f. SDS 25% (p/v).

g. Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1).

h. Etanol 95%.

i. Etanol 70%.

j. Frasco de 10 ml.

k. Agua libre de nucleasas.

Procedimientos

1. Inocular 50 ml de medio LB con una alícuota de cepa bacteriana

(Escherichia coli JM109). Incubar por 24 horas a 37ºC.

2. Verter cultivo bacteriano a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000

rpm durante 10 minutos. Eliminar sobrenadante.

3. Lavar las células con solución salina fisiológica-SSF: resuspender con 5

ml de SSF (NaCl 0.85% o NaCl 0.15 M), agitar con vortex por 2 minutos

y centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos, eliminar sobrenadante.

4. Resuspender las células en 2.5 ml de NaCl (0.9%) 0.1M – 0.1 M EDTA,

agitar con vortex por 1 minuto y añadir 0.1 ml de solución de Lisozima

(10 mg/ml). Incubar la suspensión a 37ºC por 30 minutos.

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5. Completar las lisis por adición de 200 ul de SDS al 25% (p/v) y calentar

esta preparación por 10 minutos a 60ºC en Baño María.Añadir Igual

volumen (1.25 ml) de solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y

mezclar suavemente. Luego centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos a

temperatura ambiente.

6. Separar la fase acuosa (superior) cuidadosamente con una pipeta

evitando contaminar con la fase inferior y transferirla a un frasco de 50

ml.

7. Suavemente agite la solución de ácidos nucleicos con una bageta o una

pipeta Pasteur mientras lenta y suavemente se añade dos y medio

volúmenes de etanol al 95%. Evitar la agitación vigorosa que puede

destruir el DNA.

8. El DNA forma una película fibrosa blanca en la interfase agua etanol. Se

continúa agitando suavemente hasta que se mezclen las fases y todo el

DNA haya quedado en la pipeta o bageta.

9. Secar el exceso de líquido presionando la pipeta en las paredes del

frasco.

10. Continuar la precipitación y deshidratación de la muestra por inmersión

del DNA adherido a la pipeta en un tubo de ensayo conteniendo etanol

al 70% (1 ml) y luego al 95% (1 ml).

11. Dejar secar a temperatura ambiente.

12. Para conservar el ADN colocar la pipeta con el ADN adherido en un

tubo Eppendorf con 500 ul de tampón TAE e nucleasas y hacer girar en

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Práctica Nº2 Biología Molecular

sentido inverso al de la precipitación. Conservar a temperatura de

congelación (-20º

1. Inocular 50 ml de medio LB con una alícuota de cepa bacteriana

(Escherichia coli JM 109). Incubar en agitación por 24 horas a 37º C.

2. Verter el cultivo en tubos Falcon de 15ml y centrifugar a 6000 rpm

durante 10 minutos.

CENTRIFUGAR

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Al cabo de 24 horas el medio se turbia por la presencia de bacterias (108 – 109 cel/ml).

El cultivo también se puede realizar en una placa petri.

Fase superior: medio de cultivo usado

Fase inferior: partículas sedimentadas

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Práctica Nº2 Biología Molecular

3. Lavar los tubos con solución salina fisiológica estéril (NaCl 0.85%):

resuspender con 5 ml de solución salina y centrifugar a 6000 rpm

durante 10 minutos, eliminar sobrenadante.

CENT RIFUGAR

4. Resuspender las células en 2.5 ml de solución NaCl 0.85% - EDTA 0.1 M

y añadir 0,1 ml de solución de lisozima (10 mg/ml). Incubar la

suspensión a 37ºC por 30 minutos en agitación.

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NaCl 0.85%

NaCl 0.85% 25 ml.

EDTA 0.1 M

Lisozima 10 mg/ml

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Práctica Nº2 Biología Molecular

5. Completar la lisis por adición de 0,2 ml de SDS al 25% (p/v) y calentar

esta preparación por 10 minutos a 60 ºC en baño maría.

6. Añadir 3.5 ml de solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y mezclar

suavemente.

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

SDS 25% 0,2 ml o 200 ul.

Toda la turbidez de la suspensión se vuelve transparente.

El baño María acelera la capacidad de destrucción de los lípidos por parte de la SDS.

Al colocar el cloroformo-alcohol isoamílico se debe mezclar suavemente y no agitar ya que se pueden romper las moléculas de DNA. Los grumos que se observan son debido a la presencia de proteínas.

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7. Transferir la mezcla a un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 6000 rpm

por 10 minutos a temperatura ambiente.

8. Separar la fase acuosa (superior) cuidadosamente con una pipeta

evitando contaminar con la fase inferior y traspasarla a un frasco de 10

ml.

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

CENTRIFUGAR

Solo se requiere el DNA. Lo demás se considera contaminante.

DNA en solución acuosa

Cloroformo, alcohol Isoamílico y lípidos

Proteínas coaguladas, restos de pared de membrana.

El DNA se encuentra enrollado en la pipeta como una mucosidad, formando una película fibrosa.

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Práctica Nº2 Biología Molecular

9. Agitar suavemente la solución de ácidos nucleicos con una bagueta

mientras se añade lenta y suavemente dos volúmenes de etanol al 95%.

Evitar la agitación vigorosa que puede destruir el DNA.

El DNA forma una película fibrosa en la interfase agua etanol. Se continúa

agitando suavemente hasta que se mezclen las fases y todo el DNA haya

quedado en la bagueta.

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

Etanol 95%

2 volúmenes

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Práctica Nº2 Biología Molecular

10. Secar el exceso de líquido presionando la bagueta en las paredes del

vaso de precipitación.

11. Lavar la muestra por inmersión del DNA adherido a la bagueta en un

tubo de ensayo conteniendo etanol al 70% (1ml) y luego al 95% (1ml).

12. Dejar secar a temperatura ambiente.

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

Etanol 70º Etanol 90º

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Práctica Nº2 Biología Molecular

13. Recuperar el DNA en un tubo de ensayo con agua destilada libre de

nucleasas o buffer TE (tris-EDTA), mediante agitación de la bagueta en

sentido reverso.

Fundamentos: la extracción del ADN requiere una serie de etapas básicas en 1er Tendrá q

ue romperse la pared celular y la membrana plasmática para atender al

núcleo de la célula. A continuación debe romperse la membrana nuclear para

dejar libre e ADN, por ultimo Hay que proteger el ADN de la acción enzimática

y finalmente para aisar el ADN este debe presipitar el alcohol.

Objetivos

Durante la presente practica el estudiante:

1. Analiza el proceso de extracción de DNA

2. Describe las etapas de extracción de DNA bacteriano

Materiales

1. Una porción de hojas de espinaca

2. Detergente liquido

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Se conserva en un tubo Eppendorf. Se agita en sentido contrario para que el DNA se libere de la pipeta. Queda disuelto en agua ultra pura o Buffer

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3. Sal

4. Agua destilada

5. Zumo de piña o de papaya

6. Alcohol al 96º

7. 1 baso de precipitado

8. Tubos de

1) Explique la función que cumple el detergente en la prueba de extracción de célula vegetal también la sal?

.El detergente cumple la función de destruir las membranas celulares la sal encargada de dar el medio hipertónico que se necesita.

2) Explique el mecanismo y la función que cumple el jugo de papaya

Las papayas son ricas en su componente llamado PAPAINA o PAPAYOTINA ,es una enzima con propiedades parecidas a la pepsina o la tripsina, para romper los enlaces peptídicos.

3) Explique la función que cumple el alcohol en la siguiente practica

Sirve para formar 2 fases y es en la interfase que hará su aparición posteriormente al ADN

4) El material Obtenido en la práctica es una mezcla de ADN? Abra presencia de ARN en dicho material?

Dr. Mag. Rafael Prado Prado

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Práctica Nº2 Biología Molecular

Si hay ARN por que después de obtener en interfase las moléculas de ADN no purificado como es un experimento purificado por electroforesis teniendo como agregados dentro la molécula de ARN

Dr. Mag. Rafael Prado Prado