INSTITUTO POLITCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Bioqumica Microbiana

Integrantes:

Durn Vera Ana RosaFras Navarro Csar FaridPrez Snchez Adriana

Grupo: 5IM1 Equipo: 1 Seccin: 1

Nombre de la prctica: Determinacin de actividad de Succinato Deshidrogenasa de Escherichia coli

ASPECTOSVALORCALIFICACIN

Hiptesis y diseo experimental6%

Objetivos1%

Registro de datos3%

Manejo de datos5%

Discusin de resultados6%

Conclusiones3%

Bibliografa1%

Hiptesis

Si la bacteria Escherichia coli se inocula en glucosa y en succinato y se le adiciona una fuente de carbono igual a la del medio de cultivo, entonces la bacteria presentar un mayor crecimiento que si se le pusieran sustratos contrarios. A mayor concentracin de glucosa, ya sea en el medio de inoculacin o adicionada posteriormente, menor actividad enzimtica presentar la Succinato Deshidrogenasa.

Fundamento

La succinato deshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin esteroespecfica de succinato a fumarato. Esta enzima es inhibida fuertemente por malonato, un anlogo estructural del succinato y un ejemplo clsico de un inhibidor competitivo. La succinato deshidrogenasa contiene un grupo prottico FAD que se une en forma covalente a la enzima por medio de un residuo His (en la mayora de otras enzimas que contienen FAD, el FAD se sostiene fuertemente pero no en forma covalente). En general el FAD funciona para oxidar bioqumicamente alcanos (como succinato) a alquenos (como fumarato), mientras que NAD+ participa en la oxidacin ms exergnica de alcoholes a aldehdos o cetonas. La deshidrogenacin de succinato produce FADH2, que debe reoxidarse antes que la succinato deshidrogenasa pueda emprender otro ciclo cataltio. La reoxidacin de FADH2 se produce cuando sus electrones se pasan a la cadena transportadora de electrones mitocrondrial.

Mtodo de Ells

Es un mtodo espectrofotomtrico aerbico aplicado para la determinacin de Succinato Deshidrogenasa soluble. Basado en que el Metosulfato de fenazina se acoplar a la cadena transportadora de electrones entre la reduccin de nucletidos de piridina y 2,6-diclorofenol indofenol. La adicin de metosulfato de fenazina a un sistema que contiene succinato, DCFIF y SDH soluble, causa una rpida reduccin del CDFIF (incoloro). La taza de reduccin es proporcional a la cantidad de enzima aadida.

Objetivos

Determinar la actividad enzimtica de succinato deshidrogenasa en Escherichia coli, a partir de diferentes cultivos con condiciones diferentes. Analizar y discutir cmo es que se comporta Escherichia coli en cada uno de los cultivos empleados.

Registro y Manejo de datos

1. Efecto de la fuente de Carbono:

Para observar el efecto que ocasiona al inocular al medio de cultivo Succinato y Glucosa, con fuentes de Carbono de Succinato y Glucosa, se elaboraron los medios y se midieron absorbancias a 600 nm al inicio y despus de incubarlos 5h a 37C, obteniendo los siguientes datos, que mediante una grfica denotamos dicho efecto:

Tabla 1. Valores de absorbancias a 600nm del efecto del crecimiento de Escherichia coli.Cultivos y fuentes de carbonoA a 600 nm

InicialFinalA

S/S0.7121.0050.293

S/G0.721.2060.486

G/S0.8941.1050.211

G/G0.8891.2110.322

Figura 1. Efecto del crecimiento de Escherichia coli en medios de cultivo con caractersticas diferentes.

2. Efecto de la fuente de carbono en la actividad de la SDH:

Pusimos en evidencia el efecto de la fuente de Carbono sobre la actividad de la Succinato deshidrogenasa nicamente adicionando DCFIF, MSF, KCN, Regulador de fosfatos, Succinato de Na y suspensin celular, se leyeron %T a 600 nm de las 4 celdas cada una con un inculo de clulas y una fuente de carbono adicionada, y se obtuvieron las siguientes lecturas:

Tabla 2. Valores de transmitancias de las diferentes fuentes de carbono en la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa.

Tiempo (s)%T a 600 nm de suspensiones celulares crecidas en las fuentes de Carbono

S/SS/GG/SG/G

011.54.57.38.2

3013.94.98.28.4

6016.35.29.48.8

9018.45.610.89

12020.5612.29.3

15022.76.313.79.6

18024.76.615.29.8

21026.9716.710

24029.57.318.210.2

27032.17.519.810.5

30034.77.921.410.6

Para observar el efecto que generan las fuentes de carbono utilizadas, realizamos una grfica comparando las fuentes de carbono con respecto del tiempo, para ello es necesario restarle el %T inicial de cada tubo ya que este no corresponde a nuestros resultados:

De igual forma lo hacemos para cada uno de los tiempos, teniendo los valores de la siguiente tabla, y con ello se construye una grfica de %T vs t:

Tabla 3. Diferencias del %T de los medios de cultivo con diferentes fuente de carbono.Tiempo (s)%T de suspensiones celulares crecidas en diferentes fuentes de Carbono

S/SS/GG/SG/G

00000

302.40.40.90.2

604.80.72.10.6

906.91.13.50.8

12091.54.91.1

15011.21.86.41.4

18013.22.17.91.6

21015.42.59.41.8

240182.810.92

27020.6312.52.3

30023.23.414.12.4

Figura 2. Efecto de la fuente de Carbono en la actividad enzimtica.

Discusin de resultados

La bacteria Escherichia coli es una enterobacteria que puede llevar a cabo tanto respiracin aerobia como fermentacin, esto ayuda a que se adapte casi a cualquier medio en el que se cultive, siendo estos los determinantes para que exista un mayor o menor crecimiento de la misma. Esta bacteria lleva a cabo la gliclisis, proporcionando de esta manera coenzimas que se reducirn en el Ciclo de Krebs quien a su vez proporcionar los electrones a travs del FADH2 para que lleve a cabo la cadena transportadora de electrones y as poder vivir. Sin embargo en el experimento realizamos pruebas con dos fuentes de carbono como medio de cultivo: glucosa y succinato, combinando tambin la fuente de carbono que se le adicionaba una vez cultivada. En las grficas podemos observar que la bacteria no tiene un crecimiento grande en el medio de Glucosa/Glucosa (dnde el primero indica el sustrato adicionado y el segundo el medio de cultivo) pero sabemos que esto es falso, ya que como ya se mencion anteriormente, al llevar a cabo gliclisis, la fuente de carbono principal es la glucosa. Despus le seguiran el medio Succinato/Glucosa, a continuacin el Glucosa/Succinato y por ltimo Succinato/Succinato. Aunque el succinato tambin forma parte de una de las vas que esta bacteria lleva a cabo, claramente no es la principal y es por ello que el crecimiento no es tan grande que como si lo hiciera con glucosa. La otra variable que tenemos adems del medio de cultivo es precisamente el sustrato que le adicionamos despus, nuevamente tendr un mayor crecimiento con glucosa que con succinato y esto es otro determinante, ya que si se adiciona succinato en el medio de glucosa, el primero inhibir el crecimiento aunque no tanto por tener a la glucosa como otra fuente de donde puede obtener carbono.

Conclusiones

Succinato Deshidrogenasa presenta mayor actividad enzimtica en presencia de Succinato que con Glucosa. La importancia de la Succinato Deshidrogenasa reside en que si se le agregara algn inhibidor al complejo I, los electrones pueden llegar a la cadena respiratoria mediante ella directamente en el complejo II. La enzima necesita un acarreador para poder llevar a cabo su actividad cataltica en un medio con glucosa. Escherichia coli crece mejor en un medio donde exista 100% glucosa, sin embargo, puede crecer en los diferentes medios que se utilizaron aunque en menor proporcin.

Bibliografa

Voet Voet. Fundamentos de Bioqumica: La vida a nivel molecular. Editorial Mdica Panamericana, 2 edicin, Madrid Espaa, 2009. Pg. 530