PRCTICA # 6RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESFILOS AEROBIOS, COLIFORMES Y ENTEROCOCOSINTRODUCCINPara determinar la cantidad de bacterias en una muestra se pueden utilizar diferentes tcnicas viables, entre las cuales se pueden mencionar: a) Cuenta en placa o Vertimiento en Placa, b) Filtracin por Membrana, c) Nmero Ms Probable (NMP) y d) Mtodo Rpido Idexx.Las tcnicas Cuenta en placa y Filtracin por membrana parten del supuesto que cada bacteria crece y se divide para dar origen a una sola colonia, por tanto el reporte est dado en Unidades Formadores de Colonias (UFC) en lugar de nmero de organismosLas tcnicas NMP y Idexx se basan en la teora de la probabilidad por tanto no es el valor real o verdadero sino una aproximacin al valor real, aunque el resultado es una estimacin su clculo se reporta como Nmero de Bacterias/100 mL o por 100 gr. ObjetivoCuantificar el crecimiento de bacterias en medios slidos y lquidosMATERIALESMedio cuenta en placa fundido (440C)4 Cajas Petri estriles de 100x15 mm1 Pipeta de 10 mL1 Pipeta de 1 mL1 Frasco de dilucin con 90 mL3 Tubos de medio lactosado doble6 Tubos de medio lactosado sencilloTubos con medio VBB2%Tubos con medio EC2 Cajas Petri 60x 12 mm con medio Em12 Filtros de membrana de 45 micras1 Sistema de filtracin Millipore1 Bomba de vaco1 Mechero1 Pinzas1 Incubador a 35oC1 Incubador a 41oC1 Muestra de agua1 Perilla 1Contador de colonias Quebec

PROCEDIMIENTOPreparacin de la muestra y diluciones

1. Agitar la muestra vigorosamente (25 veces de arriba hacia abajo en un arco de 30 cm)2. Tomar 10 mL de la muestra y colocarla en un frasco con 90 mL de agua fosfatada, agitar vigorosamente (dilucin -1)

Mesfilos aerobios (Cuenta en placa)1. Colocar en el fondo de dos cajas Petri 1 mL de la muestra2. Agregar de 12 a 15 mL del agar cuenta en placa fundido3. Mezclar la muestra con el agar con movimientos giratorios (7 a la derecha, 7 a la izquierda 7 hacia arriba y 7 en sentido perpendicular 4. Esperar que solidifique el agar 5. Incubar a 35oC durante 24 horas6. Contar las bacterias en un contador de colonias tipo Quebec7. Realizar el clculo y expresar el crecimiento en unidades formadoras de colonias (UFC) /mL, mediante la ecuacin siguiente:

UFC/mL= No. Colonias en la caja petri x inverso de la dilucin utilizada Coliformes (Numero ms probable)1. Inocular tres tubos de caldo lactosado doble con 10 mL de la muestra 2. Inocular tres tubos de caldo lactosado sencillo con 1 mL de la muestra3. Inocular tres tubos de caldo lacosado sencillo con 1 mL de la dilucin -1 de la muestra4. Incubar los tubos a 35oC durante 24 a 48 horas5. Resembrar los tubos positivos (presencia de cido y gas) en medios Verde Bilis Brillante 2% (VBB) y EC6. Incubar el medio VBB 2% a 35oC durante 48 horas7. Incubar el medio EC a 44.5oC durante 24 horas8. Realizar el clculo del nmero de bacterias con base a las tablas del NMPEnterococos (Filtracin por membrana)1. Con una pinza estril colocar un filtro de membrana sobre el soporte del sistema de filtracin2. Colocar un embudo estril y verter 100 mL de la muestra3. Filtrar la muestra con vaco4. Colocar la membrana con ayuda de una pinza sobre una caja con medio Em15. Realizar un duplicado, procediendo como los pasos 1-4 6. Incubar las dos placas a 41oC durante 24 horas 7. Contar los enterococos (color azul) y calcular las UFC/100mLCUESTIONARIO1. Qu significado tiene el determinar el crecimiento bacteriano en UFC en la tcnica en placa o vertimiento en placa?2. En que se basa el mtodo del NMP con serie de tubos?3. Porque en ocasiones se tienen que realizar diluciones de la muestra4. Cules son las ventajas y desventajas de la tcnica Filtracin por Membrana?