AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS E

IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM

Ms.C. Juan Giles SaavedraMs.C. Carlos Abanto DíazBlgo. Max Siadén Ortega

AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

CLASIFICACION DE BACTERIAS POR SU REQUERIMIENTO DE OXIGENO

Aerobias estrictasAceptor final de electrones es el O2Staphylococcus sp.

Anaerobias estrictas aceptor final es unamolécula inorgánica, como SO4 o NO3.FusobacteriumPrevotella

Anaerobias AerotolerantesPueden vivir con O2 y sin O2ActinomycesPropionibacterium

Dependen del aceptor final de electrones los cuales producen compuestos tóxicos como: Peróxidos: O2 - + e- + 2 H+ → H2 O2, Superóxidos: O2 + e- → O2 - Radicales hidroxilo: H2 O2 + e- + H+ → H2 O + OH

Los neutrófilos y macrófagos utilizan estos productos tóxicos del O2 para destruir los patógenos invasores.

Muchos microorganismos poseen enzimas que los protegen de estos productos tóxicos del oxígeno.

Las bacterias aerobias y las facultativas poseen las enzimas como:

2O2 - + 2H+ superóxido dismutasa O2 + H2 O2

2H2 O2 catalasa 2H2 O + O2

Radical superóxidoO2 + e- → O2 -

Peróxido de hidrógeno O2 - + e- + 2 H+ → H2 O2

Radical hidroxiloH2 O2 + e- + H+ → H2 O + OH

Estos productos son extremadamente tóxicos porque son agentes oxidantes poderosos y provocan destrucción de constituyentes celulares rápidamente

• Aerobio estricto: Utiliza el oxígeno como aceptor final de electrones. Puede tolerar el oxígeno del aire ( 21%) o aún más.

• Anaerobio facultativo: Puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en O2 al 21% (atmosf.)

• Microaerófilo: Oxígeno dependiente siempre que sea menor que el de una 1 atmósfera.

• Anaerobio estricto: No pueden crecer en presencia de oxígeno

Relación de las bacterias con el oxígeno

Áreas más frecuentes afectadas por anaerobios

RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLÍNICAS

Consideraciones a tomar en cuenta:

1. Tomar la muestra del sitio infectado, usando procedimientos que garanticen la anaerobiosis y eviten la contaminación con flora endógena. Procedimiento adecuado: Aspiración con aguja del material virulento o biopsia

2. Deben ser procesadas en el laboratorio lo más pronto posible manteniendo el estado de anaerobiosis. No refrigerar

3. La aspiración directa con aguja es el mejor método de obtener una muestra representativa para cultivo. Las muestras obtenidas de líquidos estériles (sangre, LCR o peritoneal), se recogen después de la descontaminación cuidadosa de la piel.

Hisopos con atmósfera anaerobia

4. Las muestras se deben colocar en un transportador anaerobio cuanto antes. Las cuales se inoculan en un frasco anaerobio del transporte o una jeringuilla con aguja.

5. Realizar un frotis con tinción Gram de la muestra para obtener información preliminar con respecto al tipo de organismos presentes

Finegoldia magna. son cocos gram-positivos anaerobios estrictos, cuyas células se disponen en pares, tétradas y acúmulos. Forman parte de la flora normal de la piel, tractos gastrointestinal y genitourinario femeninos, y cavidad oral. Por lo general se la aísla a partir de abscesos y otras infecciones de piel y partes blandas, huesos y articulaciones.

El análisis macroscópico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobiosDatos orientadores: • Olor fétido • Aspecto purulento de muestras líquidas• Hallazgo de tejido necrótico• Presencia de gas.

En la tinción Gram (fijar la muestra con metanol) .Observar: forma, tamaño, disposición de las bacterias y registrar el número de microorganismos presentes.Observar características morfológicas distintivas como: presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpúsculos esféricos, formas granulares. La tinción de Gram permite determinar características celulares.

Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido articular y exudados.

EXAMEN DIRECTO DE LOS MATERIALES CLÍNICOS

• Los anaeróbicos pueden crecer en las placas de agar, en una atmósfera sin O2, generalmente N2 al 80%, CO2 al 10% e H2 al 10%. El CO2 estimula en crecimiento y el H2 combinado con el O2, que puede estar presente, sirven para mantener las condiciones anaeróbicas.

• De los sistemas para cultivo de anaeróbicos, el mas común utilliza la técnica de la Jarra Gas Pak. Otros sistemas emplean Cámaras de anaerobios y Medios Pre- reducidos.

SISTEMA PARA EL CULTIVO DE ANAEROBIOS

• Se basa en la remoción del oxígeno presente en la cámara, que ocurre por la reacción con el hidrógeno producido, en presencia de un catalizador: 2 H2 +O2= H2O

• El catalizador está compuesto de un pellet de aluminio revestido de 0.5% de paladio. Debe ser reemplazado cada vez que se va a cerrar la jarra, pues puede ser inactivado por el SH2 bacteriano u otras sust. volátiles. Se reactiva calentándolo a 160° C por 2 horas.

TECNICA DE JARRA ANAEROBICA (GASPAC)

• Contiene un papel filtro, una tableta de borohidruro de sodio, una tableta de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. El sobre es activado al añadir 10 ml. de agua y el ambiente se obtiene en aproximadamente 30 minutos (condensación de agua en la jarra).

• Se monitorea colocando una tira de papel filtro con azul de metileno (indicador). El color azul va desapareciendo.

SOBRE GENERADOR DE GASPAC

Las muestras pueden procesarse en la mesa de trabajo común y se incuban en:

1. Jarras para anaerobiosis : Consiste en una jarra de plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. Creando una atmósfera anaerobia.

La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

JARRAS PARA ANAEROBIOSIS :

azul de metilenoColor azul en presencia de O2 Incoloro en su ausencia de O2

La resazurina actúa como un indicador de la óxido- reducción, que es de color rosado fucsia en presencia de oxígeno

Indicador de anaerobiosis

2. Bolsas plásticas anaerobias : Es una bolsa de plástico transparente , de varios tamaños, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua, partículas de catalizador de paladio frío y resazurina o azul de metileno como indicador de anaerobiosis. La bolsa se sella con calor luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias

Temperatura de 35 a 37°C, para el aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clínicas.

Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes.

Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada de las placas recién inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clínicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el aire ambiental.

INCUBACION

IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE Mycobacterium.

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa producida por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis

Características: Las micobacterias son de forma bacilar, se caracterizan por contener un elevado porcentaje de lípidos, por lo que para su coloración se emplea la tinción de Ziehl-Neelsen (coloración ácido resistente).

Las muestras son muy variadas: pueden ser esputos, aspirados bronquiales, orinas, LCR, biopsias, contenido gástrico, heces etc. Si no se puede procesar el mismo día será necesario guardarlas a 4º C de temperatura (refrigeradora). Para manipular las muestras y sobretodo los pasajes a otros medios de cultivos, es importante hacerlos en la cabina de bioseguridad.

COLECCIÓN DE MUESTRAS

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSENBACILOSCOPIA1. Realizar un extendido del esputo en una lámina portaobjeto limpia y sin

ralladuras.2. Dejar secar a temperatura ambiente antes de la tinción.3. Cubrir con solución de fucsina de Ziehl y calentar hasta la emisión de vapores

durante 3 minutos, cuidando que el colorante no hierva ni se seque.4. Dejar enfriar, decolorar con la mezcla de alcohol- ácido, hasta que no escurra

colorante; lavar con agua corriente.5. Cubrir con azul de metileno durante 3 minutos; lavar con agua corriente y dejar

secar.6. Agregar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el lente

de mayor aumento

LECTURA

Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura. Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa.

RESULTADO INTERPRETACIÓN

 (-)

No se encuentran BAAR en 100 campos microscópicos observado

 (+)

Menos de un BAAR por campo en 100 campos observados (de 10-99 BAAR)

 (++)

 Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos

observados 

(+++) 

Mas de 10 BAAR por campo en 20 campos observados

Cultivo: Desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente nutritivos, el más conocidos tenemos el de Lowenstein-Jensen.

Temperatura óptima de crecimiento es de 37° C. Se revisaran diariamente hasta un total de 60 días, pasados los cuales si no hay crecimiento se consideran negativos.

AISLAMIENTO

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en medio Lowenstein-Jensen.

GRACIAS POR SU ATENCION