UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

Universidad Nacional de CajamarcaEscuela de Ingeniera en Industrias Alimentarias

IDENTIFICACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN EL AGUA MEDIANTE LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLEI. INTRODUCCIN. El "agua " es uno de los compuestos ms importantes para la vida del planeta y del universo, el cual, podemos encontrar en diferentes estados como lquido, slido y gaseoso. Este compuesto es una sustancia lquida formada por la combinacin de dos volmenes de hidrgeno y un volumen de oxgeno, que constituye el componente ms abundante en la superficie terrestre. Este compuesto es uno de los ms abundantes en nuestro planeta, el cual cubre el 71% de la superficie de la terrestre formando los ocanos, lagos, lagunas, glaciares, ros, napas subterrneas, riachuelos, canales Este fundamental compuesto, permite la existencia de vida en la tierra ya que los seres vivos estn constituidos por el porcentaje importante de agua. El agua es un elemento vital para la existencia humana, de su uso adecuado depende nuestra salud, alimentacin y produccin agrcola. El utilizar agua contaminada en la preparacin de alimentos u otras actividades nos podra producir un gran nmero de casos de infeccin. La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la determinacin de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la salud pblica, al estar en contacto con el ser humano entre ellos tenemos a los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo Gram negativos, inmviles o mviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman cido o cido y gas a partir de glucosa. Su composicin antignica es un mosaico que interrelaciona serolgicamente varios gneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parsitos de animales y otros patgenos. Para ver la calidad de las aguas se recorre a parmetro fsico qumico y biolgico. Los parmetros bacteriolgicos tienen mayor importancia para dictmenes higinicos; es preciso hallar el nmero de grmenes saprfilos o de coli y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminacin. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con produccin de gas y cido. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliformes que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicacin. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros tambin pueden emplearse para estimar el grado de contaminacin fecal. En el presente informe podremos apreciar el mtodo de nmero ms probable el cual en este caso lo utilizaremos para analizar una muestra de agua para el indicador de Coliformes fecales y totales.

II. OBJETIVOS. Investigar la presencia de bacterias del grupo coliformes totales y fecales en la muestra de agua mediante la tcnica del nmero ms probable (NPM). Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP. Detectar si la muestra (agua) trada es apta para el consumo humano.

III. MARCO TERICO. 1. Agua. El agua es un componente de nuestra naturaleza que ha estado presente en la Tierra desde hace ms de 3.000 millones de aos, ocupando tres cuartas partes de la superficie del planeta. Su naturaleza se compone de tres tomos, dos de oxgeno que unidos entre s forman una molcula de agua, H2O, la unidad mnima en que sta se puede encontrar. La forma en que estas molculas se unen entre s determinar la forma en que encontramos el agua en nuestro entorno; como lquidos, en lluvias, ros, ocanos, camanchaca, etc., como slidos en tmpanos y nieves o como gas en las nubes. Gran parte del agua de nuestro planeta, alrededor del 98%, corresponde a agua salada que se encuentra en mares y ocanos, el agua dulce que poseemos en un 69% corresponde a agua atrapada en glaciares y nieves eternas, un 30% est constituido por aguas subterrneas y una cantidad no superior al 0,7% se encuentra en forma de ros y lagos. La composicin del agua la podemos comprobar efectuando la electrlisis de dicha sustancia. Electrlisis. Es un conjunto de fenmenos fsicos y qumicos que ocurre cuando pasa la corriente elctrica a travs de un electrolito. Electrlisis del agua. Se efecta diluyendo en el agua, una gota de cido sulfrico o hidrgeno de sodio, descomponindose al paso de la corriente elctrica depositndose oxgeno en el nodo e hidrgeno en el ctalo. La contaminacin de las aguas: Se produce al incorporar a ese medio elementos extraos, tales como petrleos, sustancias radiactivas, minerales inorgnicos, residuos industriales, productos qumicos o aguas residuales, entre otros, que deterioran su calidad. La salud humana puede quedar seriamente afectada por efecto de la contaminacin de las aguas. Existen ciertos elementos qumicos muy peligrosos para los seres vivos por ingestin, como el arsnico, mercurio o plomo, que pueden llegar a la cadena alimentaria al ser absorbido por los vegetales por medio de los acuferos subterrneos o las aguas de riego, tambin puede estar contaminada por microorganismos y puede producir enfermedades como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Clera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen entrico. Se sabe que los microorganismos patgenos que llegan a los depsitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Adems, ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcusfaecalis) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre estn en las materias fecales.

2. Bacterias Coliformes. La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo alemn Theodor von Escherichen 1860. Von Escherich la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego , kolon, "intestino"). Con posterioridad microbiolgica sistemtica nombrara el gnero Escherichia en honor a su descubridor. Las bacterias coliformes pueden concentrarse en cualquier parte en el medio ambiente: tierra, plantas y animales. Su presencia en el agua, mayormente en el agua potable indica que la reserva no est adecuadamente tratada contra los contaminantes. El agua puede haber tomado la bacteria cuando corra sobre el suelo y las plantas, o puede haber cado suciedad dentro de un pozo. La bacteria coliforme es inocua por s misma, pero su presencia es un alerta de que la reserva de agua debe ser controlada para detectar otro tipo de contaminacin. a. Caracteres bioqumicos. El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioqumicas: Son aerobias o anaerobias facultativas. Son bacilos Gram negativos; no son esporgenas fermentar la lactosa a 37 C en 48 horas, produciendo cido lctico y gas. b. Habitad del grupo coliforme. Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

c. Los coliformes como indicadores. Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura. Asimismo, su nmero en el agua es proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms coliformes se aslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces. 3. Bacterias coliformes totales. Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliforme forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cascara de huevo, etc. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. 4. Bacterias coliformes fecales. Las bacterias coliformes fecales son un subgrupo de las bacterias coliformes, que generalmente son inocuas. No obstante, las bacterias coliformes fecales viven por lo general en los intestinos y heces de los animales de sangre caliente, incluyendo los humanos y los animales cuyo estircol es utilizado como fertilizante. Cuando se detectan bacterias coliformes fecales en el agua potable, el riesgo de salud es mucho ms alto que cuando hay bacterias coliformes comunes. Las bacterias coliformes fecales indican que aguas residuales o corrientes de tierras de labranza cubiertas con estircol estn penetrando en la reserva de agua y no estn siendo correctamente eliminadas. Esto significa que puede haber bacterias peligrosas y parsitos en el agua. El agua corriente y estancada del medio ambiente, como riachuelos, ros, estanques y lagos, tambin son una posible fuente de bacterias coliformes fecales, en especial si estn cerca de tierras cultivables o fuentes de aguas residuales humanas. 5. E. coli E. coli es una clase de bacteria coliforme fecal que predomina en los intestinos y las heces de las personas y animales de sangre caliente. Su presencia en el agua potable por los general significa que la reserva de agua fue recientemente contaminada por aguas residuales o corrientes de tierras de labranza fertilizadas. Algunas variedades de E. coli causan enfermedades en las personas. Cuando aparece en una reserva de agua, se considera un riesgo de salud pblica. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. 6. Agar para Coliformes. MacConkey. Es un medio de cultivo especfico para bacterias Gram negativas y cepas que fermenten la lactosa. Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo as las bacterias gram negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-). Lac+ Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el PH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparicin de colonias de color rosadas o rojas. Lac- Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras. EMB agar. El Agar Levine o Agar EMB Levine es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciacin de E.coli, tiene un aspecto purpreo, aunque naranja tras su esterilizacin, es semislido, y est destinado al cultivo en placa. Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciacin de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metlico, las fermentadoras. La prueba del indol. es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa. Si esta prueba sale positiva se va a formar un anillo de color rojo sobre el caldo.

Rojo de metilo

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Frmula: C15H15N3O2). Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin de cidos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 1500 ml de metanol. Una reaccin positiva (ms o menos) indica que el microorganismo realiza una fermentacin acidolctica de la glucosa por la va cido-mixta. Si la prueba es positiva aparece un color rojo violceo, si es negativa no aparece coloracin alguna. Agar TSI. El Agar-hierro-triple azcar es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los medios de cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn: Fermenten o no glucosa. Fermenten o no lactosa o sacarosa. Produzcan o no cido sulfhdrico. Produzcan o no gas. Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son: Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificar el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecer de color rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volvindolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo. Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento del tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. Agar Simmus citrato. En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. IV. MATERIALES Y MTODOS.1. Materiales:

Agua peptonada. Tubos de ensayo tapa rosca. Campanas Durham. Pipetas de 1ml. Probetas. Incubadora. Gradilla. Mecheros. Placas Petri Agua Aza de siembra Alcohol

2. Metodologa.

a. Nmero ms probable. Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia decontaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

Prueba presuntiva Primero medimos en una probeta 225 ml del diluyente.(agua peptonada)

De los 225ml del diluyente sacamos 9ml a dos tubos de ensayo.

Medimos en una probeta 25ml de la muestra (agua) y lo aadimos al diluyente esta mescla vendra a ser la disolucin que sera (, luego de la disolucin ( sacamos con una pipeta 1ml para pasarlo al tubo ( de la disolucin con una pipeta sacamos 1ml para pasarlo al tubo , luego de cada uno sacamos 1ml de a cada tubo por triplicado.

Despus de esto de cada disolucin (, ( .sacamos con una pipeta 1 ml para colocarlo en los tubos de ensayo que contenan caldo lactosado con una campana de durgan esto confirma la presencia de e.coli total.

Luego de esto llevamos a incubara a bao mara a 44C por un tiempo de 24 a 48 horas. y observamos los resultados.

Prueba confirmativa.

De los tubos que salen positivos sacamos una peliculita y lo sembramos en los tubos que contiene caldo lauril sulfato o verde brillante, luego nuevamente llevamos a incubar a bao mara a 44C por 48 horas. el caldo lauril sulfato confirma la presencia de e.coli fecal.

Luego sembramos en medios especficos (agar Mac conkey (MC) y eosina azul de metileno (EMB)) incubamos a una temperatura de 37C por 24 horas. Luego observamos los resultados.

Diluyente muestra Medimos en una probeta 250ml Medimos en una probeta 250ml del diluyente.50ml del diluyente.

Medimos 25 ml de muestra en la probeta mesclamos

9 ml

9 ml

Incubamos a bao mara por 48 horas a 44C sacamos y vemos los resultados que 2 tubos salieron positivos (10-1, 10-2).Presencia de gas y turbidez presencia de coliformes totales.

Sacamos una peliculita y sembramos en caldo lauril sulfato en ambos casos presencia de coliformes fecales

Incubamos a bao mara por 48 horas a 44C

Luego para para realizar la prueba confirmativa sembramos las muestras en MC y EMB

V. RESULTADOS.

De los tubos sembrados en el caldo lactosado (prueba presuntiva) se obtuvo los siguientes resultados (a las 48 horas) para coliformes totales.

TUBOSDILUCIONESTOTAL

10-11017 UFC/MLCT

10-21004 UFC/MLCT

Las muestras (, ( salieron positivas con presencia de gas y un poco de turbidez por lo tanto hay presencia de e.coli total.

De los tubos que salieron positivos sembramos una peliculita en tubos que contengan caldo lauril sulfato, este medio nos determinara si hay la presencia de e. Coli fecal en la muestra trabajada. Despus de ser incubada por 48 horas a 44C sali positiva (presencia de e. Coli fecal).

De los tubos positivos para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MAC CONKEY y AGAR EMB, luego de las incubaciones por 24 horas se obtuvo que todas las siembras realizadas salieron positivas por lo tanto se puede decir que hay presencia de e. coli fecal

VI. CONCLUSIONES.

Hemos podido observar la presencia de bacterias del grupo coliformes totales y fecales en la muestra de agua mediante la tcnica del nmero ms probable.

Los resultados del presente estudio dan una idea del alto riesgo para los consumidores del consumo de agua de donde fue obtenida la muestra , debido a la contaminacin fecal, la cual puede ser la causa de las diferentes enfermedades.

Aprendimos a realizar pruebas con mtodo de recuento de nmero ms probable y que aspectos nos indican que hay presencia de coliformes fecales y totales.

Es importante realizar este mtodo de nmero ms probable para tener bases para aplicarlo, saber su fundamento y su respectivo procedimiento, adems nos permite realizar otro tipo diferente de anlisis. Adems nos permite aprender las caractersticas biolgicas de los microorganismos ya que en esta prctica realizada nos ha indicado la presencia de coliformes totales y fecales que se da por la produccin de gases.

VII. DISCUSIONES.

Pudimos observar que la muestra en este caso agua potable presento tipos de coliformes (fecales y totales) lo cual nos indica que dicha agua no es apta para el consumo humano.

Se utiliz la tcnica de tubos de fermentacin mltiple (dilucin en tubo) del nmero ms probable (NMP), el cual proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubada a 35 C (coliformes totales) 44.5 C (coliformes fecales) durante 24 a 48 h, resultando en la produccin de cidos y gas, el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin. en nuestra practica tanto para las coliformes totales como fecales se ha incubado a una temperatura de 44C.

VIII. BIBLIOGRAFA

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ttps://www.google.com.pe/search?q=numero+mas+probable+para+coliformes&es_sm=93&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=pJJ7U_iEEIHq8QGX5YH4AQ&ved=0CAgQ_AUoAQ&biw=1600&bih=799#facrc=_&imgdi

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