Accin Enzimtica: Actividad de Prueba de Catalizacin (Mtodo 1- O2 Sensor de Gas)

Efecto de la concentracin de enzima en la velocidad de reaccin de la catalasa con H2O2 cuantificado indirectamente a travs de la presin del gas oxgeno (O2) producido.INTRODUCCINLas enzimas son protenas globulares, responsables de la mayora de las acciones qumicas en los seres vivos. Ellas actan como catalizadores, sustancias que aumentan la velocidad de las reacciones qumicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso (Rodrguez, 2000). Las enzimas son extremadamente eficientes y pueden ser usadas una y otra vez, por lo cual, una enzima puede catalizar miles de reacciones cada segundo (cita). Factores como temperatura y pH son extremadamente importantes pues afectan la actividad enzimtica. La mayora de los organismos tienen un rango de temperatura especfica con la cual sobreviven, y sus enzimas funcionan mejor con ese rango de temperatura (cita). Si el ambiente en el que se encuentra la enzima es demasiado cido, o demasiado bsico, la enzima irreversiblemente puede desnaturalizarse, perdiendo as su forma y por lo tanto su funcionamiento.Si bien el H2O2 (perxido de hidrgeno) es txico para la mayora de los seres vivos, muchos de ellos pueden transformarlo enzimticamente antes de que pueda causar daos (cita). Segn (cita) el H2O2 puede ser convertido en oxigeno y agua, de la manera siguiente:

2 H2O2 2 H2O + O2Segn Blackwell et al. (1990), al menos dos diferentes enzimas se conocen que catalizan esta reaccin: catalasa, encontrada en animales y protistas, y peroxidasa, encontrada en las plantas. Por otro lado Beyer y Fridovich (1987) mencionan que el ndice de una reaccin qumica puede ser estudiado de muchas maneras, entre ellas: midiendo la concentracin de un producto (en este caso, el gas O2)

midiendo la cantidad de sustrato presente (en este caso H2O2 )

midiendo la presin de un producto ( en este caso O2 )

Con base en lo anterior, el objetivo de esta investigacin fue evaluar la actividad enzimtica cuando se aplican distintas concentraciones de catalasa a un volumen determinado de H2O2. Esta se determin cuantificando la presencia de O2 (un producto de la reaccin) utilizando un sensor de presin de gas.

PREGUNTA DE INVESTIGACINCmo se modifica la actividad enzimtica cuando se hace reaccionar un volumen fijo de H2O2 (sustrato) con distintas concentraciones de enzima catalasa? Para observar el patrn de actividad enzimtica, se utilizaron 3 concentraciones distintas de catalasa (2, 10 y 20 gotas de solucin enzimtica) y un mismo volumen de H2O2 (3 ml). Una forma indirecta de medir la actividad enzimtica es cuantificando el producto generado. Entonces, esperando que uno de los productos de la reaccin enzimtica fuera el gas O2 se utiliz un sensor de presin de gas para registrar el O2 producido durante 3 minutos. En consecuencia a mayor volumen de sustrato, mayor cantidad de producto producido y por ende tambin mayor presin de gas.HIPTESISLa hiptesis del presente estudio determina que en la reaccin enzimtica catalasa-H2O2, si la concentracin de enzima aumenta, entonces la presin de gas producida por la presencia del oxgeno gaseoso generado, tambin lo har. VARIABLES

En los siguientes cuadros se especifican y describen las variables independiente, dependiente y controladas que se consideraron para la presente investigacin. Variable independienteTratamientos

Concentracin de catalasa ( 1 gota )Se utilizaron 3 volmenes de suspensin enzimtica:

Tratamiento 1: 2 gotas Tratamiento 2: 10 gotas Tratamiento 3: 20 gotasCabe mencionar que se hicieron 5 repeticiones de cada tratamiento.

Variable dependienteCmo se cuantific?

Presin de gas (O2) ( 1PA )El O2 generado como producto de la reaccin enzimtica se determin de forma indirecta midiendo la presin generada por este gas a medida que aumentaba su produccin. La medicin se realiz durante 3 minutos.

Variable controladaPor qu fue necesario controlarla?Cmo se control?

1pHEl pH modifica la actividad enzimtica.Se utiliz papel pH para determinar el pH de la solucin justo antes de cada medicin para asegurarnos que siempre se tuviera el mismo pH ( 7).

2TemperaturaLa temperatura es un factor que modifica la actividad enzimtica. No se control la temperatura en sentido estricto pues el experimento se realiz en el laboratorio escolar a temperatura ambiente, slo se procur mantenerlo cerrado para evitar corrientes de aire durante el mismo. Adems, las mediciones se realizaron siempre a la misma hora de la maana con la finalidad de mantener la misma temperatura durante el experimento (20 - 23C).

3Cantidad de sustratoLa cantidad de sustrato disponible modifica la actividad enzimtica.En todos los tratamientos se utiliz el mismo volumen (3 cm3) de H2O2 (perxido de hidrgeno) con la misma concentracin (2.2 g/100cm3) y se adicionaron 3 cm3 de agua destilada.

4Procedencia de la enzima.La cantidad de catalasa presente en un tejido vegetal o animal puede ser distinta.La suspensin enzimtica se obtuvo de un mismo tipo y cantidad de tejido animal (hgado crudo de res). Para todos los tratamientos se utiliz la misma solucin enzimtica, solo que con distinto volumen.

|5Etc

MATERIALES Y MTODOSEquipo y material Sensor de presin de gas Vernier ( 1 Pa)

Interfase de recopilacin de datos Vernier

Software Logger Pro de Vernier Cronmetro Vernier

Laptop

Bscula digital T-Scale ( 1 g)

Licuadora Oster con mini vaso de 250 cm3

Gradilla de plstico para tubos de ensayo

3 Pipetas volumtricas de 10 cm3 con bulbo 1 Pipeta volumtrica de 100 cm3 con bulbo 15 tubos de ensayo de vidrio con capacidad de 30 cm3 1 Soporte universal

1 Pinza para soporte universal

1 Tabla de plstico para picar 1 Cuchillo 1 Embudo de filtracin

1 Vaso de precipitados de vidrio de 600 cm3 Plstico egapack Papel filtro

Reactivos

100 cm3 de Perxido de hidrgeno H2O2 (agua oxigenada) con concentracin de 10 moles/ cm3 100 cm3 de Agua destilada

Material biolgico 200 g de hgado de res crudo METODOS

I. Procedimiento para preparar la suspensin enzimtica.

1. Se pesaron 30 g de hgado de res crudo con la bscula digital (1 g).

2. Una vez pesado, el hgado se cort en pequeas porciones y se coloc en la licuadora aadiendo 60 cm3 de agua destilada y se licu hasta obtener una mezcla homognea.

3. La mezcla se filtr utilizando un vaso de precipitados de 600 cm3, embudo de vidrio y papel filtro.

4. La solucin obtenida del filtrado (suspensin enzimtica) se mantuvo en el vaso de precipitados y se tap con una cubierta plstica hasta que se requiri anexarla a los tubos de ensayo con H2O2 para llevar a cabo la reaccin cataltica.

5. Para llevar a cabo este procedimiento invertimos aproximadamente 20 minutos.

II. Procedimiento para la medicin de la actividad enzimtica.

1. Se encendi la interfase y se le conect el sensor de presin de gas para que estuviera listo para la medicin.

2. Se rotularon con marcador indeleble tres tubos de ensayo con los nmeros 1, 2 y 3 respectivamente y se colocaron en la gradilla.

3. En cada tubo de ensayo previamente rotulado, se vertieron 3 cm3 de H2O2 utilizando la pipeta volumtrica.

4. Con otra pipeta volumtrica limpia se midieron y agregaron 3 cm3 de agua destilada a cada uno de los tres tubos de ensayo.5. Usando una pipeta limpia, se agregaron 2 gotas de suspensin enzimtica al tubo 1 e inmediatamente despus se comenz a tomar el tiempo con un cronmetro.

6. Se tap la abertura del tubo de ensayo con un dedo y gentilmente se invirti dos veces para mezclarlo.7. Inmediatamente despus se coloc el sensor de presin de gas en la boquilla del tubo de ensayo y se fij con un soporte universal y pinzas tal como se muestra en la Figura 1.

8. Despus de que el cronmetro registrara 30 segundos, se comenzaron a registrar los datos con la interfase durante 3 minutos.

9. Una vez terminado el registro se guardaron los datos para su posterior anlisis y se desacopl el sensor dejndolo listo para la siguiente medicin.10. Se tom el tubo de ensayo rotulado con el nmero 2 y con una pipeta limpia se agregaron 10 gotas de suspensin enzimtica y nuevamente se comenz a registrar el tiempo con un cronmetro.

11. Se repitieron los pasos 6, 7, 8 y 9 de este apartado.

12. Se tom el tubo de ensayo rotulado con el nmero 3 y con una pipeta limpia se agregaron 20 gotas de suspensin enzimtica y nuevamente se comenz a registrar el tiempo con un cronmetro.

13. Se repitieron los pasos 6, 7, 8 y 9 de este apartado.

14. Todo este procedimiento del paso 1 al 13 se repiti 5 veces, pues se determin que se realizaran 5 repeticiones de cada tratamiento.

15. Cabe mencionar que el presente procedimiento para el registro de datos nos tom alrededor de 3.5 horas.

Figura 1. Representacin del montaje de materiales para el registro de datos con el sensor de presin de gas Vernier .III. Procesamiento de datos1. Se descargaron los datos registrados de la interfase Vernier a la computadora, para lo cual se tuvo que instalar previamente el programa Logger Pro de Vernier en la computadora.2. Con los datos obtenidos en cada repeticin se realiz una sola grfica para visualizar el patrn de actividad enzimtica que se tuvo con cada tratamiento.3. Una vez terminado cada registro de datos, se determin la velocidad inicial de reaccin de la enzima realizando una regresin lineal. As, el valor de la pendiente de la lnea, m, se consider la velocidad inicial de reaccin enzimtica.

4. Una vez obtenidos las velocidades iniciales de reaccin de cada una de las 5 repeticiones por tratamiento, se aplic una prueba estadstica t de student con una P0.05 utilizando el paquete estadstico Excel para corroborar si efectivamente hubo una diferencia significativa entre los distintos tratamientos. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOSRespecto a los datos en bruto, en las Tablas 1, 2 y 3 se muestran los valores de presin de gas registrados (en cinco repeticiones) debido a la presencia de oxgeno, el cual al ser un producto de la reaccin enzimtica se utiliz para calcular indirectamente la velocidad inicial de la reaccin enzimtica y de ese modo determinar el efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica. Tratamiento 1: 2 gotas de solucin enzimtica (catalasa), 3cm3 de H2O2 y 3cm3 de H2O

Tiempo de la reaccin enzimtica en segundos( 1 seg.)Presin de gas O2 ( 1Pa)

Primera repeticinSegunda repeticinTercera repeticinCuarta repeticinQuinta repeticinPromedio

X

1223212

10545534

20889878

30111112111011

40141415141314

50 17

6021

7026

8030

9035

10041

11047

12051

13054

14058

15062

16065

17067

18070

Tabla 1. Presin de gas oxgeno generado por la reaccin de la catalasa de origen animal y el perxido de oxgeno con el tratamiento 1, durante cinco repeticiones.Tabla 2. Tabla 3. .. etcA simple vista en las Tablas 1, 2 y 3 se observa que a medida que trascurre el tiempo hay una tendencia a aumentar la presin de gas, sin embargo para visualizar de forma ms clara y confiable los datos se calcul la media y la desviacin estndar de los valores de presin de gas registrados por unidad de tiempo para los tres tratamientos. Los datos obtenidos tal como se muestran en la Tabla 4 hacen evidente la poca variabilidad que existe entre los datos registrados en cada uno de los 19 tiempos de registro por cada tratamiento.

Tiempo de la reaccin enzimtica en segundos

( 1 seg.)Tratamento 1:

2 gotas de solucin enzimtica)

Promedio ( DS)Tratamento 2: 10gotas de solucin enzimtica.

Promedio ( DS)Tratamento 3:

20 gotas de solucin enzimtica.

Promedio ( DS)

12151101

1041101151

2081131191

30111181251

40141241301

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

Tabla 4. Valor promedio ( DE) de la presin del gas oxgeno generada a lo largo de tres minutos durante la reaccin cataltica catalasa - H2O2 al utilizar tres concentraciones distintas de enzima. La poca variabilidad de datos en torno a la media en cada uno de los tiempos de registro se ve reflejada tambin en las Grficas 1, 2 y 3 de los tres tratamientos respectivamente.

Tiempo (segundos (1seg)Grfica 5. Variaciones en la presin de gas (1Pa), debido al O2 producido por la actividad enzimtica de la catalasa durante el tratamiento 1 (1 gota de solucin enzimtica) a lo largo de 3minutos con registro de datos en intervalos de 10 segundos.Este comportamiento de los datos registrados, es decir, que la concentracin de la enzima incrementa la tasa de actividad enzimtica, coincide con lo reportado por Rodrguez (2000) quin cuantific la concentracin de O2 como producto de la reaccin cataltica de la catalasa y H2O2. Cabe mencionar que este mismo patrn de actividad enzimtica no es exclusivo de la catalasa, tambin ha sido descrito por Blackwell et al. (1990) para otras enzimas como .Por otro lado, con los promedios obtenidos en cada repeticin se realiz una sola grfica para contrastar el patrn de actividad enzimtica que se tuvo con cada tratamiento (Ver Grfica 4.) En sta se observa claramente que a medida que se incrementa la concentracin de la enzima tambin lo hace la presin de gas. Sin embargo, aqu se hizo evidente otro factor, la pendiente de cada curva es distinta entonces se decidi calcular cada una de ellas pues de esa forma se estara determinando la velocidad inicial de reaccin cuando se modifica la concentracin de enzima. As a mayor concentracin, mayor tambin la velocidad inicial de reaccin.

Grfica 4..Las pendientes de las curvas se calcularon segn el procedimiento sugerido en el manual de prcticas de Vernier de Biologa Avanzada, 2014. Con base en lo anterior, se obtuvieron los resultados de la Tabla 5. Cantidad de solucin enzimtica ( 1 gota)Pendiente , o velocidad inicial de reaccin (%/s)

1. Rep.2. Rep.3. Rep.4. Rep.5. Rep.

2 gotas

10 gotas

20 gotas

Tabla 5. Velocidades iniciales de reaccin de la catalasa obtenidas al modificar la concentracin de la enzima para la catlisis con H2O2.Con base en lo anterior, para determinar si exista diferencia significativa entre las velocidades iniciales de reaccin de la catalasa al interactuar con el sustrato H2O2, al modificarse la concentracin de la misma, se realiz una prueba estadstica t de student con una P0.05 utilizando el paquete estadstico Excel. Asimismo y en concordancia con la hiptesis del presente estudio, las hiptesis estadsticas son las siguientes:

Ha: Si hay diferencia significativa entre las velocidades iniciales de reaccin de la catalasa cuando se modifica la concentracin de esta enzima al interactuar con el H2O2.

Ho: No hay diferencia significativa entre las velocidades iniciales de reaccin de la catalasa cuando se modifica la concentracin de esta enzima al interactuar con el H2O2.

La frmula utilizada fue la siguiente:

donde: x1: es la media del primer conjunto de datosx2: es la media del primer conjunto de datosS12:es la desviacin estndar del primer conjunto de datosS22:es la desviacin estndar del primer conjunto de datosN1:es el nmero de elementos en el primer conjunto de datosN2:es el nmero de elementos en el primer conjunto de datosDado que tenemos tres conjuntos de datos se harn dos pruebas de t, una incluyendo la dosis de solucin enzimtica ms pequea (2 gotas) y la mayor (20 gotas) y otra inluyendo la dosis ms pequea ( 2 gotas) y la intermedia (10 gotas).Resultados de la t de student y comparar t calculada con la de tablas para aceptar o rechazar hiptesis nula. CONCLUSIONES:Los resultados de esta investigacin aportan..Enfatizar si se obtuvo lo que esperabaEVALUACIN : Modificaciones que se pueden realizar para mejorar la investigacin.REFERENCIAS:Formato APA

Enestadsticalaregresin linealoajuste lineales unmtodomatemticoquemodelala relacin entre una variable dependienteY, lasvariables independientesXi

30.

20

10

1

Presin del gas O2 (Pa)