1RA PRACTICA BIOLOGIA CELULAR

1RA PRCTICA BIOLOGIA CELULAR

EL MICROSCOPIO El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de dimetro ni consigue resolver dos lneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola lnea).Para observar elementos tan pequeos es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arqumedes, pero la ptica como disciplina se comenz a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon.Anton Van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un pulidor de lentes aficionado, logr fabricar lentes lo suficientemente poderosas como para observar bacterias, hongos y protozoos, a los que llam "animlculos".El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir de ste, los avances tecnolgicos permitieron llegar a los modernos microscopios de nuestro tiempo, los que existen de varios tipos y son usados con diferentes fines.

TIPOS DE MICROSCOPIOSMICROSCOPIOS PTICOSMicroscopio de campo claro: es el microscopio ptico compuesto utilizado en la mayora de los laboratorios. Para formar una imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los aces de luz puedan atravesarla. Tambin se usan mtodos de tincin, segn las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.Microscopio de contraste de fase: posibilita la observacin de muestras sin colorear, por lo que resulta til para estudiar especmenes vivos.Microscopio de interferencia: es una modificacin del anterior que permite la cuantificacin de masa en los tejidos.Microscopio de interferencia diferencial: tambin es una modificacin del microscopio de contraste de fase, que permite estudiar las propiedades de superficie de las clulas.Microscopio de fluorescencia: permite la observacin de estructuras fluorescentes, ya sean naturales o artificiales.Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de sustancias biolgicas. Combina partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un rayo lser. A travs de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen tridimensional.Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran fotogrficamente ya que la luz U.V. no es visible y daa la retina. Se utiliza en la deteccin de cidos nucleicos, que absorben esta luz.Microscopio de luz polarizada: es una modificacin del microscopio de campo claro. Debido al fenmeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y molculas fibrosas.MICROSCOPIOS ELECTRNICOSMicroscopio electrnico de transmisin (MET): utiliza un haz de electrones para producir la imagen. Permite la observacin de detalles a escala macromolecular.

Microscopio electrnico de barrido (MEB): en este caso el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificacin de las imgenes.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO CLAROEs el principal medio que utilizaremos a lo largo de toda la materia para observar la morfologa de los tejidos a estudiar, por lo que debemos conocer en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de ellas.Sistema Mecnico Pie Vastgo o columna Tornillos de ajuste macromtrico Micromtrico Tubo Platina Subplatina Sistema ptico De Observacin Ocular Objetivo De iluminacin condensador Espejo Fuente de luz

SISTEMA MECNICOEste sistema sostiene al sistema ptico y aloja los elementos necesarios para la iluminacin y enfoque del preparado.Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.Vstago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micromtrico.Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque.Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metlico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexin de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm.Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalizacin de los detalles de inters.Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.SISTEMA PTICOSe compone de un sistema ptico de observacin y un sistema ptico de iluminacin; el primero consta de:Objetivo: est formado por un sistema de pequeas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersin (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo ndice de refraccin es muy similar al del vidrio).Ocular: es un tubo cilndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.El sistema ptico de iluminacin consta de:Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de l se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.Fuente de Luz: es una lmpara que est ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lmpara incandescente comn) aproximadamente a 30 cm. del espejo.

CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS: ESCALA DE REPRODUCCIN: relacin lineal que existe entre el tamao del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc. PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imgenes de contornos ntidos. LMITE DE RESOLUCIN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado. PODER DE RESOLUCIN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles ms finos. Est en relacin inversa con el lmite de resolucin. PODER DE PENETRACIN: es la propiedad de permitir la observacin simultnea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproduccin o aumento. DISTANCIA FRONTAL: es la distancia del lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando est enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproduccin del objetivo. AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular tambin tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproduccin es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total ser 40 x 10 = 400.USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO1. Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminacin. Si la misma est incorporada al microscopio, enfocamos con el objetivo de menor aumento, cerramos el diafragma de campo y movemos el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se vea ntido. El diafragma se centra con los tornillos que lo sujetan a la subplatina. Luego se quita el ocular y se verifica que la luz est centrada. A medida que se abre el diafragma su contorno desaparece del campo observado. Si la fuente de luz es externa, se quita el ocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y se mueve el espejo hasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensador debemos usar la cara plana del espejo.2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menor aumento, colocamos el preparado sobre la platina. Utilizando el tornillo el ajuste macromtrico enfocamos lo ms claramente posible.3. El condensador debe estar en la posicin ms alta y el diafragma abierto. Esto si el preparado est coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado.4. Con el tornillo micromtrico se logra el enfoque fino segn nuestra visin.5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad de luz deseada.6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar gradualmente a objetivos de mayor aumento, corrigiendo la apertura del diafragma para cada uno de ellos.7. En caso de utilizar el objetivo de inmersin, se coloca una pequea gota de aceite sinttico sobre el preparado y luego se enfoca con sumo cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia frontal y corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una gasa embebida en xilol o solvente especial para limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo.8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la siguiente manera:- fuente de luz apagada- condensador al tope- diafragma abierto- platina alta- objetivo de menor aumento en posicin- todas las lentes limpias.

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INTRODUCCIN A LAS TCNICAS HISTOLGICASSe define tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio.El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, despus de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro rgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a lminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que sern descriptas ms adelante.OBTENCIN DE LA PIEZAEl material a utilizar puede ser extrado de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observacin se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtencin y crianza puede ser fcilmente efectuada en el laboratorio.Fases en la obtencin de material animal:- Muerte del animal: podemos producirla valindonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicacin a causa de una dosis exagerada de narctico.- Extraccin de los rganos: conociendo la anatoma del animal, debemos dirigirnos directamente a los rganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que ms fcilmente se descomponen, estos son el pncreas y la porcin inferior del tubo digestivo.- Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tamao de las piezas debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.Obtencin de material humano:El hombre no es sujeto de experimentacin, esta verdad indiscutible hace que slo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histolgicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De stas, slo la primera puede darnos material normal; las dos ltimas proporcionarn tejidos patolgicos.- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar.- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.- Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica.FIJACINLa fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima.

Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan para tal fin.Cualidades que debe tener un fijador:1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.).2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.).5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella.6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales.7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.Manera de actuar de los fijadoresVara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula de hidrgeno con su cromforo).Fijadores qumicosSon los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitucin.Dra. Julissa lvarez MuozFIJADORES SIMPLES:a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares.e) Bicromato de potasio al 3-5%.FIJADORES COMPUESTOS:En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.FIJADORES FSICOS:1. Desecacin. 2. Calor seco.3. Calor hmedo.4. Fro.5. Congelacin y desecacin.DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINADeshidratacinLas piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin)Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto cerciorndonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo.Penetracin de la parafinaSe sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.Inclusin definitiva o formacin del bloqueEn moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrtomo.

OBTENCIN DE CORTESEl objeto de la inclusin que hemos descrito anteriormente es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones.Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelacin, y el cristato o critomo.- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

- Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se comunica.- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la disposicin horizontal de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos ms modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra a -60 C gracias a la existencia de una placa de congelacin instantnea. Frente al micrtomo convencional de congelacin, el cristato posee la gran ventaja de permitir la obtencin de cortes mucho ms delgados (por lo general de 4 m y, en manos experimentadas, hasta 2 m).Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta.COLORACINLuego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin.Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solucin colorante.Clasificacin de los colorantes:Segn su origen se clasifican en:COLORANTES NATURALES:- Animales (carmn)- Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn) COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA):- cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos.- Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.- Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro.- Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata). Por otro lado, las coloraciones pueden ser:- Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada.- Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado. Mtodos de coloracin:- Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.- Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para que la coloracin tenga lugar.- Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo.- Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin.- Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (ncleo, fibras elsticas, etc.).- Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y cidos que contrastan por sus colores.- Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa).- Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros que se necesiten. Colorantes ms utilizados en histologa humana:HEMATOXILINA:- Es un colorante vegetal.- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)- Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto. EOSINA:- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo).- Presenta autofluorescencia espontnea.- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.MONTAJELuego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.PROTOCOLO GENERALA continuacin se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra ctedra para la tcnica de Hematoxilina - Eosna para preparados de uso didctico:I. Fijacin En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.II. CorteSe le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratacin1) Alcohol 70, 1h30'.2) Alcohol 96, 1h30'.3) Alcohol 100 (l), 1h30'.4) Alcohol 100 (ll), 1h30'.5) Toluol, entre 1h30' y 3hs. IV. Inclusin1) Secado de la muestra con gasa.2) Parafina 56 (l), 1h30'.3) Parafina 56 (ll), 1h30'.4) Formacin de la barra.5) 30' de frezzer.6) Fractura del taco V. CorteVI. Coloracin1) Secado de los cortes en estufa a 58C, 15'.2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.3) Xilol o toluol (II), 2'.4) Alcohol 100, 30".5) Alcohol 96, 30".6) Alcohol 70, 30".7) Alcohol 50, 30".8) Agua destilada, 30".9) Hematoxilina, 130".10) Agua corriente, 2.11) Alcohol 50, 15".12) Eosina, 30".13) Alcohol 96, 10".14) Alcohol 100, 10".15) Xilol, 1 por lo menos.16) Montaje con Blsamo de Canad sinttico.