Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que...

24
Práctica Enzimas de Restricción

Transcript of Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que...

Page 1: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Práctica Enzimas de Restricción

Page 2: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propioSistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio

ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio

Page 3: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Enzimas de restricción

Se han identificado cientos La mayoría reconocen y cortan

secuencias palindrómicas Muchas dejan “puntas

pegajosas” Se pueden hacer cortes muy

precisos del ADN al escoger la enzima

Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria

Page 4: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Palíndrome

• oso• radar • reconocer• rotor • salas• seres • somos • sometemos • oro• ala • ojo

Page 5: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Secuencia palindrómica en biología

5'- G A A T T C -3'

3'- C T T A A G -5'

• Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras

Page 6: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Algunas enzimas usadas comúnmente

Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG

Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G

Page 7: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Uso de enzimas de restricción

• La actividad depende de condiciones precisas:

pHTemperaturaConcentración de salesIones

• Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas:

3-5 u/ug de ADN genómico1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul

Page 8: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Tipos corte

Page 9: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Utilidad para ADN recombinante

Page 10: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Marcador de peso molecular

• Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel

• A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción

• Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas

• O la escalera de 1kb

Page 11: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Plásmidos en gel

Page 12: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Electroforesis de plásmidos

• Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones

• No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado.

• Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza

Page 13: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Digestión plásmidos

Número bandas= número de sitios de restricción

pG

EM

-T

pG

EM

-T/E

co

RI

pU

WL

201

pU

WL

201

/Ec

oR

I

Page 14: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Digestión ADN genómico

Page 15: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis

Page 16: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Deleción en FQ

Fibrosis quística

Recesiva

Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos

Degradada en RE, no llega a membrana celular

Page 17: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Diagnóstico por sitios de restricción

Page 18: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Mutación: Cys282Tyr

Mutación Hemocromatosis

Page 19: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Mutación: His63Asp

Mutación Hemocromatosis

Page 20: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

• http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html

Page 21: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.
Page 22: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Lambda cortado con EcoRI

5 cortes

Page 23: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Lambda cortado con Eco RI

6 fragmentos

Page 24: Práctica Enzimas de Restricción. Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN.

Práctica

• Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción