Práctica Nº 1 Genetica Med 2015-i

MANUAL DE PROTOCOLOS DE GENTICA MDICA 2015-I Escuela de Medicina V Ciclo

Profesores MSc. Blgo. JOS LLONTOP NUEZ/MSc. Blgo. CSAR IQUE CARBAJAL

PRCTICA N 1

EXTRACCIN, PURIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE ADN GENMICO HUMANO

PROFESOR MSC. BLGO. JOS LLONTOP NUEZ

I. COMPETENCIAS.

1. Explica y comprende los pasos de extraccin y purificacin de ADN

genmico humano usando un kit comercial.

2. Realiza la cuantificacin de ADN genmico humano por mtodos

espectrofotomtricos.

3. Comprende la importancia de la aplicacin de la tcnica de extraccin,

purificacin y cuantificacin de ADN genmico humano en Gentica

Mdica.

II. INTRODUCCIN

El aislamiento del ADN es un paso esencial en el laboratorio, aunque existen muchos

mtodos para realizar la extraccin, el procedimiento debe ser diseado para el

organismo del cual se va a obtener el ADN, debido a que la estructura y composicin

de los organismos varan. La caracterstica comn de los mtodos de extraccin es

que primero se debe destruir la clula y luego el ADN es separado de los otros

componentes tales como protenas, lpidos y carbohidratos. La mayora de los

protocolos tambin incluyen una digestin con RNAasa para degradar el ARN. El

mtodo ms simple para liberar los cidos nucleicos exige solamente un paso de lisis.

Hay una variedad de mtodos para la liberacin de los cidos nucleicos, por ejemplo,

en el caso de microorganismos, hervir con agua o buffer PCR, uso de detergentes con

o sin calor, ciclos de calentamiento y enfriamiento, SDS-proteinasa K, usos de

enzimas, sonicacin y calor2.

Despus de liberar el ADN con cualquier mtodo, es esencial que se remueva

cualquier sustancia que pueda causar la inhibicin de la amplificacin por PCR

usando un procedimiento de purificacin confiable, reproducible y sensible. El

mtodo ms convencional es la extraccin de las protenas con fenol-cloroformo,

precipitacin del ADN con etanol, y concentracin del ADN con isopropanol o



butanol. Alternativamente a estos mtodos se han desarrollado estrategias con

mtodos de fase slida en columna (matriz de silica, partculas de vidrio); resinas de

intercambio inico o partculas magnticas, como un nuevo protocolo para la

purificacin del ADN2.

Debido a la necesidad del paso de extraccin de los cidos nucleicos a partir de

muestras de los pacientes para el diagnostico microbiolgico y gentico, actualmente

se encuentran en el mercado disponibles una gran variedad de kits comerciales que

estn diseados para la extraccin de los cidos nucleicos sin complicaciones ni

protocolos laboriosos. Algunos de ellos son AxyPrep Blood genomic DNA Miniprep

Kit (Axygen Biosciences, Inc, CA), Puregene DNA Isolation Kit (PG) (Gentra

Systems, Inc, Minneapolis, MN USA) Generation Capture Columm kit (GCC) (Gentra

Systems, Inc), Masterpure DNA purification kit (MP) (Epicentre Technologies,

Madison, WI, USA), Isoquick nucleic acid extraction kit (IQ) (Microprobe Corp.,

Bothell, WA, USA), PureLink Genomic DNA Kit de Invitrogen; entre otros. Los ms

utilizados son los que tienen membranas tipo gel basados en slica, columnas con

filtro de fibra de vidrio o partculas magnticas, los cuales se unen en forma

especfica al ADN, mientras que las sustancias contaminantes o los inhibidores del

PCR son removidos en forma efectiva mediante sucesivos lavados. Recientemente,

conjuntamente con estos kits de extraccin se han diseado nuevos sistemas

robticos automatizados con caractersticas inteligentes; la mayora de la tecnologa

se basa en el uso de partculas magnticas en combinacin con vidrio o slica. Con

estos equipos, los cidos nucleicos se pueden aislar eficientemente, a partir de un

amplio rango de tipos de muestras que incluyen plasma, suero, sangre total, lquido

cefalorraqudeo, heces, muestras respiratorias3.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS.

3.1. Materiales y equipos 3.1.1. Materiales:

A. Biolgico:

Sangre fresca humana con anticoagulante EDTA.

B. Reactivos:

Kit Comercial de Extraccin de ADN Pure Link Genomic DNA

Kits de Invitrogen.

Etanol puro.



3.1.2. Equipos, instrumentos y otros

Bao Mara 55C.

Microcentrfuga 10000g.

Centrfuga universal.

Tubos de microcentrfuga estril.

Vrtex.

Fluormetro Qubit 2.0 UV microvolmenes.

1 Marcador indeleble.

Guantes descartables de vinilo.

Gorras de bioseguridad.

Papel absorbente.

Micropipetas de 100-1000 ul y de 2-20 ul.

Tips amarillos y azules con racks.

3.2. Procedimientos.

3.2.1. Extraccin de la muestra de sangre.

Obtener la muestra de sangre con el sistema Vacutainer

supervisado por el profesor de mesa: 1) Retirar la aguja

Vacutainer rompiendo la cinta de seguridad y colocarlo en el

capuchn; 2) Colocar el torniquete a 4 dedos de la zona de

puncin 3) Ubicar bien la vena para puncin; 4) Desinfectar

la zona de puncin; 5) Insertar, en la vena, la guja con el bisel

hacia abajo y 6) Colocar el tubo Vacutainer para obtener la

muestra.

NOTA: Deben ser seleccionados 4 alumnos como mnimo (2

por mesa). El resto de alumnos voluntarios firmarn un

documento de Consentimiento Informado.

3.2.2. Extraccin de ADN con el Mtodo INVITROGEN1

Lisis Celular

1) Colocar el Bao mara a 55C.

2) Aadir, a un tubo de microcentrfuga estril, 200 l de

muestra de sangre fresca o congelada (si el volumen de

muestra es menos de 200 l ajustar el volumen de

muestra a 200 l usando PBS 1X).



3) Aadir 20 l Proteinasa K a la muestra.

4) Aadir 20 l RNasa A a la mezcla anterior, mezclar bien

con vortex e incubar a temperatura ambiente por 2

minutos.

5) Aadir 200 l de buffer de lisis/binding y mezclar bien

con vortex hasta obtener una solucin homognea.

6) Incubar a 55C por 10 minutos para promover la digestin

de la protena.

7) Aadir 200 l de etanol 96-100% al lisado. Mezclar bien

con vortex por 5 segundos para producir una solucin

homognea.

Binding DNA

1) Remover una columna Spin PureLink del paquete del kit.

2) Aadir el lisado (~ 640 l) obtenido a la columna Spin.

3) Centrifugar la columna a 10000xg por 1 minuto a

temperatura ambiente.

4) Descartar el tubo de coleccin y colocar la columna Spin

en un tubo de coleccin PureLink disponible en el kit.

Washing DNA

1) Aadir 500 l de buffer wash 1 preparado a la columna.

2) Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10000xg

por 1 minuto.

3) Descartar el precipitado lquido del tubo de coleccin y

colocarlo a la columna Spin.

4) Aadir 500 l de buffer wash 2 preparado a la columna.

5) Centrifugar la columna a velocidad mxima (12000xg) por

3 minutos a temperatura ambiente. Descartar el tubo de

coleccin.

Eluting DNA

1) Colocar la columna en un tubo de microcentrfuga de 1.5

ml.

2) Aadir 100 l de buffer de elucin PureLink a la columna.

3) Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar

la columna a mxima velocidad por 1 minuto a



temperatura ambiente.

4) Recuperar ms ADN siguiendo un segundo paso de

elucin.

5) Centrifugar la columna a mxima velocidad por 1.5

minutos a temperatura ambiente.

6) Remover y descartar la columna.

El tubo contiene ADN purificado.

Storing DNA

1) Almacenar el ADN purificado a 20C o usar el ADN para

la aplicacin inmediata deseada.

2) Para almacenajes ms largos se debe almacenar en buffer

de elucin a -20C pero no en agua debido a que el ADN

estara sometida a hidrlisis cida.

3) Si el ADN es almacenado a 4C se debe usar

inmediatamente en alcuotas para evitar daos por

congelamiento y descongelacin. En lugar de ello

distribuir la solucin de ADN en alcuotas las cuales

debern ser almacenadas a -20C por mucho tiempo.

3.2.2 Cuantificacin de ADN

Mtodo del Kit Qubit dsDNA HS de Invitrogen

Introduccin

El kit provee reactivos concentrados para los ensayos, bufferes de

dilucin y estndares de ADN prediludos. Simplemente diluyes el

reactivo usando el buffer del kit, aades tu muestra y lees la

concentracin usando el fluormetro Qubit 2.0. El ensayo es

altamente selectivo para DNAs de doble cadena dsDNA) y es preciso

para muestras con concentraciones iniciales de 10 pg/l a 100 pg/l.

El ensayo es ejecutado a Temperatura ambiente y la seal es estable

por 3 horas. Los contaminanes comunes, nucletidos libres,

solventes, detergentes o protenas son bien tolerados en el ensayo.

Protocolo experimental

Debemos preparar estndares para calibrar el fluormetro Qubit 2.0.



Si planeas usar la ltima calibracin ejecutada en el instrumento

necesitars pocos tubos y menos solucin de trabajo.

1) Colocar y marcar tubos PCR de 0.5 ml necesarios para los

estndares y las muestras. El ensayo Qubit dsDNA HS

requiere 2 estndares.

Nota: Usar slo tubos PCR de 0.5 ml de pared delgadas y claros.

2) Marcar las tapas de los tubos.

3) Preparar la solucin de trabajo diluyendo el reactivo Qubit

dsDNA HS al 1:200 en buffer Qubit dsDNA HS. Usar un

tubo plstico limpio cada vez que prepares la solucin de

trabajo Qubit. No mezclar la solucin de trabajo en

contenedores de vidrio.

Ejemplo: Para 8 muestras preparar suficiente solucin de trabajo

para las muestras y los 2 estndares: ~ 200 l por tubo en

10 tubos preparar 2 ml de solucin de trabajo (10 l de

reactivo Qubit + 1990 l de buffer Qubit).

4) Cargar 190 l de solucin de trabajo Qubit en cada uno de los

tubos usados para los estndares.

5) Aadir 10 l de cada estndar al tubo apropiado y mezclar

con vortex 2-3 seg evitando formar burbujas.

Nota: Pipetear con cuidado. Esto es crtico para asegurar que

exactamente 10 l de cada estndar Qubit dsDNA HS

sean aadidos a 190 l de solucin de trabajo Qubit.

Tambin es importante marcar la tapa de cada tubo

estndar correctamente para que sean introducidos en

forma ordenada al instrumento.

6) Cargar la solucin de trabajo Qubit en tubos de ensayo

individuales para que el volumen final en cada tubo despus

de aadir la muestra sea de 200 l.

Nota: Las concentraciones de las muestras pueden estar entre

1-20 l y de acuerdo a esto se deben cargar cada muestra en



un tubo de ensayo con un volumen de solucin de trabajo

Qubit entre 180 y 199 l.

7) Aadir las muestras a cada tubo que contiene el volumen

correcto de solucin de trabajo Qubit y mezclar por vortex de

2-3 seg. El volumen final en cada tubo debe ser 200 l.

8) Incubar todos los tubos a temperatura ambiente por 2 minutos.

9) Sobre el botn HOME del fluormetro Qubit 2.0, presionar

DNA y luego selecciona dsDNA como tipo de ensayo. El

screen estndar es automticamente visualizado.

10) Sobre el sreen estndar presionar YES para requerir una

nueva calibracin o presionar NO para usar la ltima

calibracin.

Si presionamos SI (Nueva calibracin)

- Correr una nueva calibracin.

- Insertar el tubo que contiene el stndar N 1 del fluormetro,

cerrar la tapa y poner READ. La lectura tardar

aproximadamente 20 seg.

- Remover el estndar N 1.

- Insertar el tubo que contiene el estndar N 2 en el

fluormetro, cerrar la tapa y poner READ.

- Remover estndar N 2.

Si presionamos NO (ltima calibracin)

- El screen de la muestra ser automticamente visualizado.

- Insertar el tubo de la muestra en el fluormetro, cerrar la

tapa y presionar READ.

11) El resultado se visualizar en la pantalla.

12) Para leer la prxima muestra, remover la muestra del

fluormetro Quit 2.0, insertar la siguiente muestra y presionar

READ NEXT SAMPLE.



Clculo de la Concentracin de ADN de la muestra

El fluormetro Qubit 2.0 da valores para el ensayo Qubit dsDNA HS

en ng/ml. Este valor corresponde a la concentracin despus que tu

muestra fue diluda en el tubo de ensayo. Para calcular la

concentracin de tu muestra en g/ml usar la siguiente ecuacin:

[Muestra]= Valor QF x (200/X)

donde: Valor QF= El valor dado por el fluormetro Qubit 2.0

X= N de microlitros de muestra aadidos al tubo de ensayo.

3.2.3 Manejo de Residuos

Los residuos slidos deben juntarse y envolverse en un papel,

luego depositarlos en una bolsa que se cerrar hermticamente

y se dispondr en el recipiente asignado para ello en el

laboratorio.

Los residuos lquidos debern mezclarse con agua antes de su

eliminacin a excepcin de los residuos peligrosos como la

sangre, que deben neutralizarse con hipoclorito de sodio (leja)

30 minutos antes de su descarte por el alcantarillado.

3.2.4 Referencias Bibliogrficas

1. Life Technology Corporation User Guide PureLink Genomic

DNA Kits, USA, 2012. Disponible en:

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/pur

elink_genomic_man.pdf.

2. Luque, J. y A. Herrez. Texto Ilustrado de Biologa Molecular

e Ingeniera Gentica: Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones

en Ciencias de la Salud. Edit. Elsevier Science, Universidad

de Alcal, Madrid- Espaa, 2002.

3. Buckingham, L. and M. Flaws. Molecular Diagnostic:

Fundamentals, Methods and Clinical Applications. Edit.

F.A. Davis Company, USA. 2007.



FUNDAMENTACIN

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora

de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN.

Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos

existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios

siguientes:

cido nucleico diana;

Organismo fuente;

Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);

Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);

Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc.).

FUENTES DE ADN

Cualquier clula nucleada del humano puede ser fuente para aislar el ADN genmico. La

mayora de las veces se recurre a muestras de sangre perifrica obtenidas por venopuncin.

La sangre perifrica es un tejido de fcil acceso; sin embargo, la persona puede desarrollar

un hematoma en el rea de la toma de muestra.

En adultos mayores, inmunosuprimidos, canalizados, o en estado caquxico es muy difcil

obtener una muestra de sangre perifrica de calidad. De igual forma, los pacientes

peditricos pueden presentar fobia a las agujas, no cooperar para la toma de muestra y en

conjunto, dificultar el proceso. Por otro lado, en los trabajos de campo o cuando la muestra

debe ser enviada para su anlisis a un lugar distante, las muestras de sangre requieren de

condiciones especiales de conservacin y de transporte. Dependiendo el tipo de estudio; a

veces es necesaria la adicin de un anticoagulante o aditivo para preservar los

componentes celulares. Generalmente si el transporte es en menos de 24 horas para llegar

a su destino, puede hacerse a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando el trayecto toma

ms de ese tiempo, es aconsejable que la muestra se transporte en refrigeracin (4C).

Anteriormente, solo existan tubos de vidrio para muestras sanguneas y en ocasiones las

muestras llegaban contaminadas en sus contenedores rotos. Actualmente se prefieren los

contenedores de plstico para evitar estos accidentes.

El ADN que se obtiene de este tejido se encuentra en los glbulos blancos. Uno de los

principales contaminantes en la sangre, es el hierro de la hemoglobina proveniente de los

glbulos rojos. El hierro es un potente inhibidor de la actividad de varias enzimas,



incluyendo la ADN polimerasa que participa en la reaccin de la cadena de la polimerasa

(PCR). Si el hierro no logra eliminarse por completo, ste puede interferir con procesos

posteriores del anlisis del ADN.

Otros tipos de muestras que suelen utilizarse para el aislamiento del ADN genmico son:

bulbo piloso de cabello, clulas epiteliales de enjuague bucal, raspado con hisopo bucal,

biopsia o punch de piel, biopsia de tejido fresco o parafinado obtenido por proceso

quirrgico o ambulatorio. La obtencin de algunas de estas muestras requiere mayor

cantidad de material o procesos invasivos y dolorosos. De igual forma, el proceso de

aislamiento de ADN a partir de estas otras muestras requiere tratamientos de duracin

ms larga (por ejemplo, tratamiento con la enzima proteinasa para eliminar exceso de

protenas).

METODOS DE EXTRACCIN

Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis

celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de

clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de

ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por

ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los

procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:

Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);

Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.);

Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo

tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las

membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares.

Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan

fcilmente por filtracin o precipitacin.



METODOS DE PURIFICACIN

Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser

combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:

Extraccin/precipitacin.

Cromatografa;

Centrifugacin;

Separacin por afinidad.

A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de

los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo

con objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse

una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es

escasa, puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer

la precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones

salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante

cambios del pH.

Fig.1 Esquema General del Aislamiento Orgnico de ADN

Fig.2 Aislamiento Inorgnico de ADN



Fig.3 Aislamiento de ADN en Medio Slido



CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE EL MTODO ESPECTROFOTOMETRCO (FLUORMETRO QUBIT)

El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse

directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia

A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo

visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de

contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin espectrofotomtrica de la

irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este mtodo, los

tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan

idneos. La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y

comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse

calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el

cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes

respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a

230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos,

fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras

puras es de 2,2 aproximadamente.

Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el mtodo

de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de cidos

nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio

irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de concentracin.

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