PRACTICA1-BIOQUIMICA MICROBIANA

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PRÁCTICA NUMERO I: “REPRESIÓN CATABÓLICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE EQUIPO NO. 3: Banda Soriano Yeny Ruth Espinoza Flores Alejandra Morales Santamaría Norma Angélica Romo Albino Salvador Iván UEA: BIOQUIMICA MICROBIANA PROFESOR: ARMANDO MEJIA ALVARES GRUPO: BG08 FECHA DE ENTREGA: 12 - JUNIO - 2012 1

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PRÁCTICA NUMERO I:

“REPRESIÓN CATABÓLICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE ”

EQUIPO NO. 3:

Banda Soriano Yeny Ruth

Espinoza Flores Alejandra

Morales Santamaría Norma Angélica

Romo Albino Salvador Iván

UEA:

BIOQUIMICA MICROBIANA

PROFESOR:

ARMANDO MEJIA ALVARES

GRUPO:

BG08

FECHA DE ENTREGA:

12 - JUNIO - 2012

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INTRODUCCION

La capacidad de la glucosa en el control de la expresión de un número de diferentes operones inducibles se le llama represión catabólica [1]. La represión catabólica se genera a nivel de promotor de hecho algunas mutaciones que afectan al promotor hacen a la célula sea insensible a la represión catabólica. [4]

Dado que la glucosa es la fuente preferida de C para las bacterias, la capacidad de la glucosa para regular la expresión de otros operones, asegura que las bacterias utilizarán glucosa antes que cualquier otra fuente de carbono como fuente de energía. [1] Cantidades adecuadas de glucosa previenen la expresión de genes que expresan proteínas necesarias para la fermentación de otros numerosos catabolitos como la lactosa, arabinosa y galactosa, aún cuando están en concentraciones elevadas. De este modo el microorganismo previene el gasto de energía en sistemas enzimáticos que no se utilizan. Este sistema se revierte, es decir, permite la activación de los genes mencionados anteriormente, cuando la glucosa no está presente en el medio extracelular del microorganismo, a través de un mecanismo dependiente de AMPc.[2]

Cuando los niveles de glucosa son bajos, los niveles de AMPc son altos y viceversa. Esta interrelación existe porque el transporte de glucosa al interior de la célula inhibe a la enzima adenilato ciclasa que es la que produce el AMPc. En las bacterias el AMPc se une a una proteína de unión con AMPc llamada CAP o CRP. El complejo AMPc-CAP y no la proteína CAP por sí sola, es capaz de unirse a un sitio en los promotores de los operones sensibles a la represión catabólica. La unión con el complejo hace al promotor más eficiente, por lo tanto se llevarán a cabo más procesos de iniciación de la transcripción de ese promotor. Debido a que el papel del complejo CAP-AMPc es encender la transcripción, este tipo de control se considera como CONTROL POSITIVO. Las consecuencias de este tipo de control son que, para que se logre la expresión máxima de un operón sensible a represión catabólica, la glucosa necesariamente debe estar ausente en el medio ambiente bacteriano y el inductor del operón deberá estar presente. Si ambos están presentes el operón no se expresará a su nivel máximo hasta que la glucosa sea metabolizada completamente. Obviamente, no hay expresión del operón, es decir esta no ocurre a menos que el inductor se encuentre presente. [1]

La expresión de gran cantidad de genes de la célula de una levadura está sujeta a la represión por glucosa. No obstante, el grado de represión por glucosa varía de un gen a otro. Por ejemplo: la expresión de genes involucrados en la utilización de la galactosa, genes galactosa (GAL), es reprimida al menos 1000 veces por la glucosa. La expresión de genes involucrados en el metabolismo de la maltosa, genes maltosa, es reprimida aproximadamente 15 veces como describen M. Johnston et al. en The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces (1992), 226. [3]

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Medio enriquecido con Glucosa:

En un medio enriquecido con glucosa y con bajos niveles de oxígeno o en un medio con glucosa en exceso se produce una fermentación alcohólica, por acción de la enzima Alcohol deshidrogenasa (presente en Saccharomyces cerevisiae), hasta el agotamiento del sustrato. El producto de dicha fermentación, o etanol, es un sustrato de reserva energética para los organismos fermentadores. Una vez agotada la glucosa en el medio, la levadura utiliza el etanol como sustrato, incorporándolo al ciclo de Krebs en forma de acetaldehído mediante la reducción de etanol y la oxidación de una molécula de NADH + H+ por acción de la catalasa presente en la mitocondria de Saccharomyces cerevisiae [5] o por acción de la misma alcohol deshidrogenasa.

Medio enriquecido con Etanol:

En un medio enriquecido con etanol, la levadura cierra sus vías del ciclo de krebs, y empieza a reducir el etanol por acción de deshidrogenasas, y asa usando enzimas gluconeogenicas produce ATP y coenzimas oxidadas en la vía EMP para así lograr un buen crecimiento de la levadura.

OBJETIVO

Demostrar que la fermentación del microorganismo Saccharomyces cerevisiae es regulado por represión catabólica.

MATERIAL

2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL

2 Probetas de 250 mL

1 Agitador magnético

1 Asa

1 Piceta con alcohol

1 Piceta con agua

2 Mecheros Fisher

1 Parrilla

2 Espátulas

10 Cajas Petri

Medios

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METODOLOGIA

Preparación de medios utilizados para demostrar la represión catabólica

Medios

Sustancia MEDIO 1 (5 cajas Petri)

MEDIO 2 (5 cajas Petri)

MEDIO 3 (1 caja Petrí)

Equipo que peso para medio 3

Glucosa 0.5%Etanol 3% 3% 12-DG 0.2% 2(NH4)2SO4 0.1% 0.1% 0.1% 3

KH2PO4 0.05 0.05 0.05 4Ext. de levadura 0.2 0.2 0.2 5AGAR 2 2 2 6pH 7 7 7 7Los valores mostrados en la tabla están representados en g /100 ml

1. Los medios 1 y 2 (el medio 3 se hizo entre todo el grupo) se prepararon para 180 mL de H2O cada uno con lo cual se hicieron los cálculos correspondientes

2. Pesar los reactivos a utilizar en sus debidas cantidades (cálculos hechos para 180 mL) y lo que nos toco para el medio 3.

3. En cada matraz Erlenmeyer (2 matraces) se colocó 180 mL de H2O para la elaboración de los medios.

4. Después de elaborar los medios 1 y 2 ajustar el pH con el potenciómetro a 7.

5. Tapar los medios para evitar contaminación y llevarlos a la autoclave y esperar.

6. Vaciar los medios a las cajas Petri con mucho cuidado para evitar la contaminación y esperar a que solidifiquen.

7. Inocular las cajas de los medios (1 2 y 3) con el microorganismo Saccharomyces cerevisiae con la técnica de inoculación de estría simple con mucho cuidado para evitar la contaminación.

8. Inoculación de S. cerevisiae por estría simple

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9. Esperar dos días y observar resultados.

RESULTADOS

Tabla 1.1 Medio 1

Alumno Creció Creció ContaminaciónYeny R. Banda

Si Moderado uniformemente No

Alejandra Espinoza

Si Moderado uniformemente No

Salvador I. Romo

Si Moderado uniformemente No

Tabla 1.1 Nos muestra tanto el crecimiento como el aspecto de Saccharomyces cerevisiae en el medio 1 el cual el cual solo contenía glucosa como fuente de carbono

Fig. 1.1.- En esta imagen se puede observar nuestros resultados después de la inoculación en el medio 1 en la cual se observan cepas con un buen grosor, ya que al tener de sustrato glucosa se dedico a formar

biomasa y las colonias se ven de color beige y brilloso.

Tabla 1.2 Medio 2

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Alumno Creció Como creció ContaminaciónNorma A.

Santamaría Si Moderado uniformemente No

Alejandra Espinoza

Si Moderado uniformemente No

Salvador I. Romo

Si Moderado uniformemente No

Fig. 1.2.- En esta imagen se puede observar nuestros resultados después de la inoculación en el medio 2 obteniendo cepas con aspecto cremoso y color beige, como se puede observar, las colonias de las cepas

se ven delgadas, ya que al cambiar el sustrato la producción de biomasa es menor.

Tabla 1. 3 Medio 3

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Alumnos Creció Como creció ContaminaciónTodos No No

Fig. 1.3.- En esta imagen se puede observar nuestros resultados después de la inoculación en el medio 3 en la cual no se observo crecimiento debido al engaño que recibió S. cerevisiae al utilizar 2-DG en lugar

de glucosa.

DISCUSION

En esta práctica se elaboraron medios de cultivo con condiciones optimas para el buen desarrollo de Saccharomyces cerevisiae, es decir inoculamos el microorganismo en 3 diferentes cultivos que incluían los requerimientos para el buen crecimiento, un pH optimo para que la levadura creciera bien, lo que variaba de los medios era la fuente de carbono ya que el medio 1 contenía Glucosa, en el medio 2 Etanol y en el medio 3 2-DG.

Cuando la concentración de glucosa es el factor limitante del crecimiento se obtiene mayor cantidad en biomasa durante la vía aerobia, en este caso nuestro medio 1 contenía como fuente de carbono la glucosa dando inicio en la vía EMP para terminando en la cadena respiratoria; observando así una gran cantidad de biomasa; sin embargo al tener gran cantidad de carbohidratos tomara la opción de irse por la vía fermentativa de este modo al medio 2 se decidió colocar como fuente de carbono etanol obteniendo como resultado menor cantidad de biomasa con respecto al medio 1 debido a que la glucosa al llegar a piruvato y tener como fuente de carbono el etanol se impide el paso hacia ciclo de krebbs y de este modo no llegara a cadena respiratoria, por último se logro engañar al microorganismo adicionándole un sustrato similar de glucosa (2-DG) al medio 3 la cual cerrara la vía aerobia y así no utilizará el etanol como fuente de carbono, es decir no pudo llevar a cabo ninguna de las vías posibles observándose macroscópicamente que no hubo crecimiento. Arrojando así los resultados esperados de acuerdo a la bibliografía.

CONCLUSION

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Como se observo en la práctica, con el fin de evitar un gasto energético, la levadura hace una represión catabólica para que ella decida de cual manera puede desarrollarse mejor. Las diferentes fuentes de C que se le pusieron en los medios a la levadura, ella los reconoce y sabe cómo aprovecharlos. Se logro la inoculación de Saccharomyces cerevisiae en los tres medios de cultivo con distintas fuentes de carbono y se observo la represión catabólica que sucede en uno de los medios, comprendiendo a su vez la vía que usa dicho microorganismo según sea las condiciones que le adicionemos al medio.

BIBLIOGRAFIA

[1] Dr. Edgar Vázquez-Contreras. Instituto de Química (UNAM). Represión catabólica.

http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/regulacion%20expresion%20genes2.html

[2] Dr. Gene Mayer. Microbiología e Inmunología On-line. Mecanismos de regulación génica.

http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter9.htm

[3] Domínguez, David J. Cepas de levaduras limitadas por un sustrato, sin represión catabólica. Oficina Española de Patentes y Marcas. Titulares: The Pillsbury Company.

[4] Giorgio Mangiarotti, 1987 “Del origen al organismo biología general” Editorial PICCIN pp. 195 y 196.

[5] Ignasio López Carlos- Goñi Ramos Díaz, 2005 “Manual práctico de microbiología” Editorial Elsevier España p.p (61)

[5] Spevak, Walter. Fessl, Friederike. Rytka, Joanna. Traczyk, Aleksandra. Skoneczny, Marek. Ruis, Helmut. Isolation of the Catalase T Structural Gene of Saccharomyces cerevisiae by Functional Complementation. Institut f¨r Allgemeine Biochemie der Universität Wien and Ludwig Boltzmann-Forschungsstelle für Biochemie, 1983.

Medina, Jose Maria. Et al. Bioquímica. Segunda edición. Editorial SINTESIS, España, 2003. p. p. 145-151.

Bamforth, Charles W. Food Fermentation and Micro-organisms. Primera edición. Editorial Blackwell Publishing. USA, 2005. p. p. 31-33.

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