Practicas de laboratorio-_primera_parte_2011-05-26-431

Práctica de Laboratorio

Actividad

Página1Microbiología Enológica

▐Prácticas de Laboratorio

Primera parte

Normas generales para la práctica en un laboratorio de microbiologia

Objetivos:-Reconocer el material de laboratorio y los elementos de limpieza empleados.-Desempeñarse con higiene y precaución en el ámbito del laboratorio.-Conocer los métodos de esterilización más usados en un laboratorio de microbiología.-Comprender los fundamentos físicos y químicos de los métodos de esterilización.-Conocer la forma de preparación de medios de cultivo.

Limpieza y esterilización del material empleadoEn las prácticas microbiológicas es fundamental que todos los objetos sucios se recojan en recipientes para proceder a la limpieza y esterilización.Las pipetas se separan del resto del material, recogiéndolas en recipientes con solución desinfectante en los que permanecerá hasta el lavado. Previo al lavado, se les saca, valiéndose de un alambre, el trozo de algodón que ha actuado como filtro en el extremo superior. Las cajas de Petri y los tubos de ensayo se destapan y se los coloca boca abajo y se los hierve en agua jabonosa a fin de que escurran todo el medio de cultivo que contienen.Todo el material debe tratarse con precaución para evitar roturas.El material que tiene colorantes se los separa del resto y se lo trata con soluciones especiales, ya sea con HCl, HNO3 o mezcla sulfocrómica.Si bien en Microbiología Enológica no se trata con microbios patógenos todo material sucio debe tratarse con precaución y en los casos realmente serios se debe esterilizar en autoclave antes de lavar.

Preparación del material para ser esterilizadoUna vez limpio el material debe prepararse convenientemente para que una vez esterilizado conserve estas condiciones.Las cajas de Petri se las envuelve en papel de diario, madera o de seda y se esterilizan en horno a 170ºC.A las pipetas se les coloca un trozo de algodón que actúa como filtro. Se las envuelve en papel o se las coloca en estuches metálicos y se esterilizan en horno a 170ºC.Los tubos de ensayo, erlenmeyers o frascos se los esteriliza previamente acondicionados en horno a 170 ºC, excepto cuando contengan medios de cultivo para lo cual se debe usar el autoclave.


Actividad


Teórico – Práctico:

▐Esterilización

Definimos esterilización como la destrucción o eliminación de cualquier forma de vida. Comprende a aquellos tratamientos que dejan al objeto tratado libre de todo organismo vivo.

▐ Métodos de Esterilización

A.- Calor B.- Filtración 1.- Calor seco a.- Radiaciones2.- Calor húmedo d.- Agentes químicos3.- Calor directo

▐ A.- Calor

Los objetos pueden ser esterilizados por calor seco en horno o por calor húmedo que proporciona el vapor caliente.La esterilización por calor seco requiere más tiempo e intensidad por dos razones: - la conducción es menos rápida en el aire que en el vapor. - las bacterias pueden sobrevivir en estado de desecación y así la resistencia al calor casi se asemeja al de una endospora.

1.- Calor seco: Se usa para esterilizar vidrios y otros materiales sólidos estables al calor. Los objetos envueltos en papel son expuestos en un horno o estufa a una temperatura de 170ºC durante 90 minutos. Se observa que el envoltorio de papel adquiere un color ligeramente tostado.

2.- Calor Húmedo: Se utiliza para esterilizar soluciones acuosas como medios de cultivo o soluciones nutritivas. a) El tratamiento se lleva a cabo en un autoclave, que puede llenarse de vapor a una presión mayor a la atmosférica.Debido a que la temperatura de ebullición del agua aumenta con la presión podemos lograr mayores temperaturas dentro del autoclave.


Actividad


Presion Temperatura Tiempo 1 atm. 121ºC 15 min. 3/4 atm. 115ºC 20 min.

Estas temperaturas sólo se logran en un ambiente saturado en vapor por lo que al iniciarse la operación todo el aire debe ser expelido y reemplazado por vapor. Si queda algo de aire, la presión parcial de vapor será inferior a la que marca el manómetro y por lo tanto la temperatura lograda será inferior. Por eso conviene tener medidor de vapor y temperatura independientes.

Funcionamiento del autoclave:

Se coloca agua hasta el falso fondo (a) que se encuentra en su interior. Se coloca el material a esterilizar convenientemente preparado, se cierra la tapa (b) ajustando en cruz los tornillos (c) y se deja la espita (d) abierta. Se encienden los mecheros y se calienta el autoclave hasta desprendimiento de vapor. Esto indica que todo el aire que contenía el autoclave ha sido eliminado, es decir que se ha purgado el aparato. Se cierra la espita (d). Se observa en el manómetro el aumento de presión.

A partir del momento en que llega a la presión escogida, se controla el tiempo de esterilización. Luego se cierra la fuente de calor y se deja enfriar (el manómetro vuelve a cero). Recién ahora se puede abrir la espita y luego la tapa.

b) Tindalización: La esterilización por autoclave no puede ser aplicada a soluciones que contengan sustancias que son afectadas por el calor (termolábiles). Por ejemplo la leche, cuyo azúcar la lactosa, se carameliza a 100ºC, a la vez que las proteínas se desnaturalizan.En este caso conviene el calentamiento discontinuo o tindalización. Se utiliza el autoclave a vapor fluente, es decir con la espita abierta, para que la presión sea igual a la atmosférica y la temperatura no supere los 100ºC. Esto se realiza durante 30 min. y en 3 días consecutivos. Estos lapsos de 24 h. permiten a las esporas germinar y luego estas células son destruídas en el siguiente calentamiento.

Manómetro

a

bc

d


Actividad


3.- Calor Directo: Esta forma de esterilización consiste en exponer directamente el objeto a la acción de la llama como por ejemplo: esterilización de anzas (calentamiento al rojo), bocas de tubos (flameado) esterilización de morteros (alcohol encendido).

▐ B.- Filtración

Se usa para aquellas sustancias que son alteradas en sus condiciones físicas o químicas por acción del calor. Por ejemplo: sueros, soluciones de enzimas, toxinas bacterianas, etc. Este método es muy usado en la industria farmacológica.Los filtros pueden ser de porcelana, yeso, vidrio incrustado, siendo los más comunes los de membrana formado por una película de celulosa. Los filtros se ubican en un portafiltros y se realiza la filtración por succión y succión más presión. Las bacterias son eliminadas de las soluciones debido al efecto de colador que ejercen los poros y por la adsorción a las paredes de los poros por las diferencias de cargas eléctricas entre microorganismos y poros.


Actividad


Teórico – Práctico:

▐Medios de cultivo

▐ Introducción

Se llama medio de cultivo al conjunto de sustancias nutritivas que permiten el crecimiento y multiplicación de los microorganismos.Los constituyentes de los medios de cultivo son:

Fuente de Carbono: Este elemento aporta a los microorganismos esqueletos carbonados, y de su catabolismo le brindan energía para su crecimiento y multiplicación.Puede ser suministrado a través de diferentes fuentes, como hidratos de carbono (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, dextrosa, xilosa, manita, almidón, etc.).

Fuente de Nitrógeno: Se pueden suministrar en forma de NO3K, (NH4)2SO4.Muchos medios de cultivo presentan en un solo compuesto las fuentes de nitrógeno y carbono; como aquellos que combinan peptonas, aminoácidos, algunas proteínas como la caseína, etc. El más utilizado en microbiología es el extracto de levadura.

Sales minerales: Estas son fuente de macroelementos (K, Na, S, P, Ca, Fe) y de microelementos ( Mn, Zn, Co, Cu, Ni).

Factores de crecimiento: Son aquellos elementos esenciales para el desarrollo de los microorganismos, ya que estos no lo pueden sintetizar a partir de compuestos más simples. Ej.: vitaminas, coenzimas, aminoácidos.Para hacer selectivo un medio de cultivo se puede proceder de la siguiente manera:a. Aportando los compuestos nutritivos que un determinado microorganismo necesita y no lo que otros necesitan.b. Inhibiendo el desarrollo de algunos microorganismos no deseados, a través del pH, que limite su desarrollo, o incorporando sustancias inhibidoras, como por ejemplo colorantes (eosina, azul de metileno), metales pesados (bismuto), agentes antimicrobianos (pimaricina, gentamicina, cloranfenicol), sustancias químicas (sales en concentraciones que inhiben el desarrollo).


Actividad


Indicadores de pH: Cumplen la función de visualizar fácilmente si en un medio hay o no crecimiento o si acidifica o basifica el medio. Ej: azul de bromotimol, rojo neutro, rojo de fenol, púrpura de bromocresol, etc.

■ Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:

1. Por su composición:

- Naturales: -de origen animal: leche, carne.-de origen vegetal: mosto de malta, agua de levadura, papa, zanahoria, interiores de frutos.

- Artificiales: -químicamente definido: cuando se conoce exactamente la composición de cada uno de los elementos que lo constituyen.-mixtos: constituidos por sustancias químicamente definidas y sustancias naturales, como por ejemplo levadura glucosada, agar papa glucosado, caldo extracto de carne, caldo nutritivo, etc.

2. Por su función:

- Generales: son aquellos en cuales hay desarrollo de la flora microbiana mas variada. Ej.: agar nutritivo standard (ANS), agar papa glucosado (APG), caldo nutritivo.

- Diferenciales: son aquellos que debido a su composición química le dan características especiales a los diferentes géneros bacterianos por el aspecto de sus colonias. Ej.: agar levadura glucosado con Creta.

- Selectivos: son complejos, y sirven no solo para diferenciar entre géneros, sino que además tienen acción selectiva sobre otros microorganismos. Ej.: caldo nutritivo con ClNa 10%, agar nutritivo tamponado a pH 5.

■ Los microorganismos tienen distintos requerimientos de pH para su crecimiento y desarrollo, y de acuerdo a su pH óptimo se clasifican en:

- Acidófilos: Dentro del pH 3.5 a 5.5 se encuentra la gran mayoría de los microorganismos. Ej.: hongos y levaduras, bacterias lácticas y acéticas.


Actividad


- Neutrófilos: Desarrollan dentro del rango de pH 6.5 a 7.5. Ej.: Bacillus, Azotobacter.

- Basófilos: El pH óptimo de crecimiento y desarrollo es mayor a 7.5. Ej.: nitritadores, Micrococcus ureae, Bacillus pasteurii, Sarcina urea.

Ajuste de pHCuando se construye un medio de cultivo, se debe llevar el pH al óptimo para el desarrollo del microorganismo que nos interesa. Para ello el pH se corrige adicionando soluciones ácidas o básicas de acuerdo al punto al que deseemos llegar.

El solidificante más utilizado en la microbiología es el agar – agar, es un poligalactósido extraído de algas marinas, fluidifica a 85 ºC. No modifica sensiblemente el pH de los medios y no es atacado por la mayoría de los microorganismos.

Distribución en tubos

- Tubos en estría o pico de flauta: llevan de 7 a 8 ml de medio solidificable. Luego de ser esterilizados se los deja enfriar inclinados. Uso: para mantenimiento de cepas.

- Tubos en punción: llevan de 10 a 15 ml de medio solidificable. Se dejan enfriar en forma vertical. Uso: para preparar cajas de petri, siembra en profundidad para microorganismos anaerobios facultativos.


Actividad


Trabajo Práctico:

▐Preparación de medios de cultivo

▐ Objetivos

.Comprender el rol de los medios de cultivo en el estudio de los microorganismos..Identificar los constituyentes de los medios de cultivo..Diferenciar los solidificantes usados en microbiología.

▐ Actividades

1. Preparación de medios de cultivo preformulados.2. Preparación de medios de cultivo a partir de sus constituyentes. Ajuste de pH. 3. Esterilización de los medios de cultivo.4. Análisis de la constitución de los medios de cultivo. Evaluación de las características de cada uno de los medios de cultivo empleados en Microbiología Enológica


Actividad


Teórico - Práctico

▐Microscopia

Objetivos-Describir el microscopio óptico y conocer su manejo.-Adquirir habilidad para entender y aplicar las técnicas de coloración y realizar observaciones al microscopio.

IntroducciónEl microscopio es de gran importancia en el desarrollo de la Microbiología como Ciencia, siendo una herramienta básica en la investigación de rutina.El microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el objetivo, situado cerca del objeto que se observa, y el ocular por donde se observa.La imagen aumentada que forma el objetivo es transmitida al ocular que realiza el aumento final, de manera que el aumento total del microscopio compuesto es el producto del de su objetivo por el de su ocular.

Microscopio compuesto:Esquema


Actividad


Descripción de las partes ■ Se distinguen:

a. Parte mecánica:Consta del estativo, el revolver portaobjetivos, el cabezal mono o binocular y un sistema de enfoque macro y micrométrico. b. Sistema de iluminación:Formado por:

- Condensador: es un sistema de lentes que cumple la función de concentrar el haz de luz formando un cono de luz con ángulo suficiente para llenar la abertura del objetivo. Posee un diafragma iris que controla el díametro del círculo de luz que incide en el condensador. Al usar el objetivos a seco (10x a 40x) el diafragma solo se usa parcialmente abierto, puesto que la definición y detalles son mas claros con mediana iluminación. Con el objetivo de inmersión (100x) se debe abrir el diafragma.

- Fuente de luz: puede ser una lámpara incorporada al microscopio o provenir de una fuente externa que se enfoca hacia la platina (previo paso por el condensador) a traves de un espejo plano.

c. Sistema óptico: Formado por:

- Prisma: es un elemento que en los microscopios binoculares divide el haz de luz que proviene del objetivo haciendo que lleguen dos a los respectivos oculares. El prisma tiene un aumento que debe ser multiplicado por el aumento total del microscopio.

- Oculares: pueden tener aumentos de 5x, 10x o 15x.

- Objetivos: en ellos vienen indicados el aumento propio del objetivo, la apertura numerica, la distancia del objetivo al ocular en mm y en algunos casos el espesor del cubreobjetos a utilizar.Si es un objetivo especial de contraste de fase tambien viene indicado.Clases de objetivos:

- A seco: son los de menor aumento, pueden ser 4x, 10x, o 40x. Se llaman así porque entre el objetivo y el preparado que se observa hay aire.

- De inmersión: entre el objetivo y lo observado debe haber un líquido de índice de refracción mayor que el del aire (puede ser aceite de cedro o aceite sintetico). Estos objetivos tienen aumentos de 90x o 100x.


Actividad


Aumento del microscopioEs el producto entre el aumento del ocular y el del objetivo.Por ejm.: ocular 10x y objetivo 100x. El aumento total es 1000.Si el microscopio es binocular hay que considerar el aumento del prisma, inscripto en el cabezal.

En la instancia presencial haremos la descripción del microscopio óptico y sus partes, como así también lo utilizaremos para observar diferentes microorganismos.


Actividad


Teórico - Práctico

▐Coloración de Microorganismos

IntroducciónLa morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras: observando los microorganismos vivos sin teñir o bien observando las células muertas teñidas con colorantes. Debido al índice de refracción de los microorganismos, cercano al del agua, y a la falta de color de la mayoría de ellos, se hace conveniente colorearlos.Las coloraciones tienen como objeto visualizar además de la morfología, las estructuras internas como vacuolas, cuerpos nucleares, etc.Aunque las bacterias no parecen muy distintas del medio que las rodean, difieren mucho químicamente. Esta diferencia es la que permite distinguir las bacterias por tinción, pues generalmente el colorante reacciona con la célula bacteriana y no con el medio externo.Los colorantes son compuestos orgánicos capaces de combinarse con el protoplasma o determinadas estructuras celulares cediéndoles color.Los preparados que se usan en bacteriología son soluciones acuosas. En muchos casos se disuelve primero el colorante en alcohol y luego se diluye en agua. En cambio el mordiente puede definirse como una sustancia que forma un compuesto insoluble con el colorante fijándolo a la estructura coloreada. Ej.: lugol.

- Coloración simple, en donde se utiliza un solo colorante. Ej.: coloración con fucsina fenicada, azul de metileno, cristal violeta, etc.

- Coloración compuesta, que utiliza más de un colorante. Ej.: coloración de esporas y coloración de Gram (esta coloración es también diferencial, ya que permite diferenciar dos grupos de microorganismos).

- Coloraciones especiales, son las coloraciones de pared celular, flagelos, etc. Estas pueden ser simples o compuestas.

- Coloración negativa, en donde se aplica un colorante que rodea la célula pero no la tiñe. Para ello se usa una sustancia opaca que no tiene afinidad por los constituyentes celulares (tinta china, nigrosina).


Actividad


Trabajo Práctico

▐Coloraciones de Microorganismos

▐ Objetivos

-Comprender la importancia de las coloraciones en las prácticas microbiológicas.-Desarrollar habilidad en la preparación de frotis y coloraciones.

▐ Actividades

Antes de aplicar las distintas técnicas de coloración es necesario hacer el frotis del cultivo que se quiere observar.

A.Preparación del frotis Consiste en fijar el material que se va observar, es decir “pegar el material al portaobjetos”. El objetivo es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherirla al portaobjeto para evitar que se lave el preparado durante el proceso de tinción.1. Desengrasar el portaobjetos con alcohol o acetona.2. Preparar en un tubo de ensayo una suspensión lechosa del cultivo a observar.3. Flamear el ansa, tomar una gota de la suspensión y transferirla al centro del portaobjetos. 4. Distribuir esta gota en una superficie de 1 a 2 cm.5. Secar la preparación en columna de aire caliente.6. Fijar el extendido pasándolo tres veces por la llama. De esta manera por la acción del calor la pared celular se adhiere al vidrio del portaobjetos.

B.Coloración

B1.Coloración Simple1. Poner en contacto el colorante (fucsina fenicada, cristal violeta, azul de metileno, etc.) con el frotis, aproximadamente 1 min.2. Lavar con agua para quitar el exceso de colorante.3. Dejar secar. Puede acelerarse el secado en la columna de aire caliente del mechero.4. Observar el preparado con objetivo de inmersión.


Actividad


B2.Coloración de Gram1. Colorear el frotis por 1 min. con cristal violeta y lavar con agua.2. Tratar con solución de lugol por 1 min. y luego lavar y escurrir bien.3. Decolorar por 15 segundos con alcohol 95º y lavar.4. Colorear con safranina durante 1 min. y lavar con agua.5. Dejar secar.6. Observar el preparado con objetivo de inmersión.

B3.Coloración negativa

Para esta coloración no se prepara frotis previo, sino que se procede así:1. Depositar una gota de tinta china para bacteriología en el centro del portaobjetos.2. Mezclar con ella otra gota procedente de un cultivo líquido o de una dilución hecha con un cultivo de medio sólido y agua estéril.3. Extender sobre el portaobjetos y dejar secar al aire. Observar el preparado con objetivo de inmersión.


Actividad


Teórico – Práctico

▐Cultivo de microorganismos

▐ Introducción

El trabajo en microbiología se basa en el estudio de poblaciones microbianas; debido a la dificultad en la manipulación y la limitación en la información que se puede obtener a partir del examen de los individuos.Una ciencia que colabora en este estudio es la TAXONOMÍA. La misma se ocupa de las leyes de clasificación de los microorganismos basándose en el conocimiento de todos sus caracteres.La unidad taxonómica o de clasificación que comúnmente se utiliza es la ESPECIE. Esta categoría del sistema jerárquico se define como el conjunto de poblaciones clonales de elevada similitud fenotípica que a su vez difieren de otras poblaciones clonales. Se entiende por clon a una población de células bacterianas derivadas del crecimiento de una sola célula parental convenientemente aislada.También cabe aclarar que se entiende por fenotipo al conjunto de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que toda la información contenida en el genoma de los individuos, que no necesariamente se expresa, de una determinada especie constituye el genotipo.Como en un corto período de tiempo ocurren aumentos de las poblaciones microbianas, los cambios genéticos pueden establecerse y adquirir continuidad muy rápidamente, lo que hace problemático diferenciar especies bacterianas sobre la base de un pequeño número de caracteres.Lo ideal sería una descripción completa de su fenotipo (expresión de los caracteres) o mejor aún por su genotipo (información genética). Como metodología habitual se utilizan criterios de fácil determinación como los morfológicos, por su practicidad, algunos de los cuales son: forma y tamaño, movilidad, reproducción, tinción a colorantes especiales como la tinción de gram, presencia o ausencia de estructuras como esporas, cápsulas y flagelos, características de estructuras como paredes celulares y capas mucosas, crecimiento en medios gelificados donde se puede observar forma, tamaño, color y aspecto de las colonias producidas por el desarrollo de los microorganismos, y en medios líquidos donde se puede observar la turbidez, etc.Sin embargo este criterio ofrece elementos de juicio insuficientes para la caracterización definitiva y por lo tanto se tienen en cuenta otros criterios como son los mecanismos fisiológicos y bioquímicos,


Actividad


entre los cuales se incluyen información sobre crecimiento, muerte y supervivencia en diferentes condiciones de cultivo (temperatura de crecimiento, pH, humedad relativa, etc.), ausencia o presencia de determinadas enzimas (catalasa), como toman, utilizan y/o almacenan la energía.Estos criterios de identificación son utilizados para separar microorganismos a nivel de especie, pero existe otro que es utilizado para identificar diferentes cepas de una misma especie, (como ocurre con las bacterias y virus fitopatógenos y en rizobiología), y es el serológico, que se fundamenta en la interacción específica entre un antígeno y su respectivo anticuerpo, para lo cual se utilizan técnicas como son las placas de inmunodifusión y los test ELISA.

Todos estos son los criterios tenidos en cuenta en el proceso analítico y que son utilizados en el proceso de síntesis para catalogar a los microorganismos.Existen dos maneras diferentes de agrupar estos criterios analíticos, que dan lugar a la taxonomía clásica y la taxonomía numérica.

■ La taxonomía clásica utiliza criterios analíticos que ordena en forma subjetiva empleando un sistema de prioridades en el uso de los mismos: las características morfológicas y estructurales son más importantes que las características fisiológicas y bioquímicas (unos criterios tienen mas valor que los otros).

■ La taxonomía numérica preconiza la caracterización de los organismos por la observación de un gran número de caracteres independientes entre sí (arriba de 200 o 300), otorgándoles a cada uno de ellos el mismo peso o valor. Los datos se procesan con ayuda de una computadora y la afinidad entre dos poblaciones queda determinada por un coeficiente de similitud o uno de comparación.

En la práctica habitual de laboratorio no hace una clasificación taxonómica de los microorganismos sino que se realiza la IDENTIFICACIÓN. Este es el mecanismo que se sigue para determinar la identidad de un microorganismo. Hasta donde es posible, se dilucidan sus características por observación y ensayos adecuados. El microorganismo se identifica adecuadamente cuando se encuentra que la descripción de una especie es idéntica con las características observadas.

La esencia de la identificación la integran dos clases de operaciones: el aislamiento, que es la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas (cultivo con mas de una clase de microorganismo) que existen en la naturaleza, y el cultivo, que es el crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes


Actividad


artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son las mismas independientemente de la clase de microorganismo con el que se trabaje.

Para comenzar la identificación se parte un cultivo puro (cultivo que contiene una sola clase de microorganismo). Esto implica no solo el aislamiento de un determinado microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta (por ej. leche, suelo), sino también el mantenimiento del individuo aislado y de su descendencia, en un ambiente artificial que impide el acceso de otros microorganismos. Este ambiente se puede crear en un tubo de ensayo o caja de petri. Para obtener un cultivo puro se utilizan técnicas como: el enriquecimiento selectivo y la siembra en placas.El aislamiento de cultivos puros por métodos de siembra en placa implica la separación e inmovilización de los organismo individuales sobre un medio nutritivo solidificado con agar. Cada organismo viable da origen, al crecer, a una colonia cuya transferencia puede hacerse fácilmente. La manipulación del inoculo (material microbiano utilizado para sembrar) se realiza con hilo de metal o ansa que se esteriliza en llama antes de utilizarse.En este punto es necesario hacer notar la necesidad de evitar contaminación externa, observando que el material inicial debe estar estéril y que después de la inoculación debe estar protegido. En el lugar de trabajo se deben evitar las corrientes de aire.La siembra en estría para la purificación de cultivos es el método mas empleado. El inoculo es tomado con el ansa y se va diluyendo progresivamente con cada sucesiva estría, de manera tal que si las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente a lo largo de la últimas estrías se van desarrollando colonias bien aisladas.Al aislar a partir de una población natural mixta es posible obtener desarrollo de colonias bien separadas unas de otras. Si entonces se toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio apropiado a esto no se le puede llamar cultivo puro, ya que por cada colonia visible en la primera placa puede haber células de otros microorganismos que quedaron depositados en el agar y no lograron dar un crecimiento macroscópico a pesar de que son viables. Por lo tanto nunca se debe tomar la colonia de la primera placa para preparar un cultivo puro. Sino que se debe sembrar por estría en una segunda placa. Si todas las colonias de esta segunda placa resultan idénticas, una colonia bien aislada puede utilizarse para establecer un cultivo puro.La incorporación al medio de cultivo de sustancias inhibidoras selectivas son útiles para este fin (por ej. antibióticos).


Actividad


Método de la siembra por estría para obtener cultivos puros. a) Se toma del tubo un asa llena de inóculo, luego se hacen estrías sobre una placa estéril de agar esparciendo los organismos. Finalmente en la caja estriada después de la incubación, se observa la presencia de colonias aisladas. De estas colonias bien aisladas de donde usualmente se pueden obtener cultivos puros.

Crecimiento confluente al inicio de la estría

Colonias aisladas al final de la estría


Actividad


Trabajo Práctico

▐Aislamiento de microorganismos aerobios

▐ Objetivos:

- Comprender los pasos de una marcha bacteriológica para la identificación de microorganismos.- Desarrollar habilidades en el cultivo y aislamiento de microorga-nismos

▐ Procedimiento:

Antes de realizar la identificación es necesario obtener el cultivo puro para lo cual se procede de la siguiente manera.1. A partir de una suspensión que contiene diferentes tipos de microorganismos se realiza, con ayuda de un anza, una siembra en estría en placa con agar nutritivo, con el objetivo de obtener colonias aisladas. Se lleva a estufa durante 24 hs a una temperatura de 25 ºC.2. Describir el tipo de colonias que se obtienen, señalando la forma, tamaño, coloración, irregularidades que presente, consistencia, aspecto, etc.3. A partir de una colonia bien aislada se hace otra siembra en estrías en otra placa de petri que contenga agar nutritivo. Llevar a estufa por 24 hs a 25 ºC.4. Es importante que entre cada rotación de caja, cuando se haga la siembra, se esterilice el anza a la llama antes de tomar el inoculo.5. De aquella colonia bien aislada se siembra en tubo con agar nutritivo pico de flauta para lograr la multiplicación del mismo.

Practicas de laboratorio-_primera_parte_2011-05-26-431

Travel

Transcript of Practicas de laboratorio-_primera_parte_2011-05-26-431