1

GUIÓ DE PRÀCTIQUES DE BIOLOGIA CEL·LULAR. Microscopía òptica (fotònica). El poder de resolució és la capacitat de distingir dos punts diferents quan aquests es troben molt junts en el mateix pla. En general, l’ull humà pot distingir dos punts com a diferents fins a una distància de 0,1 mm, que és el mateix que dir 100 µm. El límit del poder de resolució (d) és la distància mínima a partir de la qual podem identificar dos punts com a diferents. El límit del poder de resolució del microscopi òptic és de 0,2 µm, per tant podem observar estructures com són el nucli, els cromosomes, els cloroplasts, mitocondris i bacteris. Per altra banda amb la microscopía electrònica de transmissió podem observar membranes, ribosomes, microtúbuls, etc. ja que el seu límit de resolució es troba a 0,4 – 1 nm. La formula que relaciona el poder de resolució amb el límit del poder de

resolució és: d

R1

=

Per tant quan més petita és el límit de resolució més poder de resolució tenim.

El límit de resolució ve determinat per la formula d’Abbe: θ

λλ

sin.

.61,0.61,0

nONd ==

On lambda (λ) és la longitud d’ona de la radiació utilitzada, que sol ser la radiació de la llum visible que va de 500 a 550 nm, també hi ha alguns microscopis amb lents de quars, fluorita o carbonat de liti usen llum ultraviolada 400 nm (260nm). En la formula trobem també ON que és la obertura numèrica de la lent del objectiu i dels condensadors del sistema òptic, és a dir el número de raigs de fotons que procedents de l’objecte entren a la lent objectiu per formar una imatge. Per tant com més gran sigui aquest nombre major serà la definició. Aquest nombre ve donat, tal i com es veu en el desenvolupament de la formula, per l’índex de refracció del medi (n) i pel sinus de l’angle d’obertura (sin θ). L’índex de refracció del medi pot ser el de l’aire que és 1 o bé si fem servir objectius d’immersió podem emprar olis d’immersió que tenen un índex de refracció de 1,4 a 1,5, que és molt similar al del vidre i per tant els raigs no canvien tant de direcció al canviar de medi. L’angle d’obertura és la meitat de l’amplada de l’angle que es forma quan la llum entra. L’angle màxim d’entrada és de 180º, per tant el màxim angle d’obertura és de 90º; en conseqüència el sinus serà igual o inferior a 1. Cal tenir en compte que quan treballem amb olis d’immersió les distàncies de treball i la profunditat de camp són molt curtes. La distància de treball és la distància que hi ha entre la lent frontal de l’objectiu fins a la preparació quan la imatge està enfocada, per tant quan treballem amb olis d’immersió aquesta ha de ser i és molt curta per tal que la gota d’oli uneixi la preparació amb la lent objectiu sense deixar espai per l’aire.

2

La profunditat de camp és la propietat que té un objectiu de presentar perfectament detallats els diferents plans d’una mostra sense haver de variar l’enfocament, en els objectius d’immersió com que treballem al màxim d’augments, estem enfocant plans molt concrets deixant els altres desenfocats. En conclusió a partir de la formula d’Abbe podem dir que per tenir un poder de resolució màxim hem de tenir un límit de resolució mínim que s’aconsegueix amb una longitud d’ona mínima i una obertura numèrica màxima, que s’aconsegueix aproximant al màxim l’angle d’obertura a 90º i amb un índex de refracció màxim. Una altra característica és el camp del microscopi que és el diàmetre del cercle visual il·luminat dins del qual observem la imatge de l’objectiu a través del microscopi. A majors augments aquest camp es veu disminuït. En un microscopi és més important la resolució que no pas els augments. Els augments (X) són la relació que hi ha entre la mida real i la mida que ens facilita l’objectiu. Si no s’especifica res en concret ens referim al total que s’obté de multiplicar els augments de la lent ocular pels de la lent objectiva. En un microscopi és més important els augments de la lent objectiva ja que és aquesta la que ens defineix la resolució de la imatge que a partir de l’augment per part de la lent ocular que obtenim la imatge ja que directament de l’objectiu seria massa petita. En general els microscopis òptics donen un augment màxim de 1.000 a 1500 X. Els microscopis són un sistema de lents que produeixen una imatge augmentada d’un objecte petit. Els primers microscopis ven ser inventats pels volts de l’any 1700. En un microscopi òptic compost tenim tres sistemes de lents, dos lents de formació de la imatge que són l’objectiu i l’ocular i una per a la correcta il·luminació que és el condensador.

L’estructura dels microscopis es divideix en tres parts: Peu o suport aguanta de la manera més estable tot el microscopi, pesant.

Columna o braç suporta la part òptica, els comandaments d’enfoc i la platina. Cargol macromètric és comandament d’enfoc que permet fer grans moviments de

apropament i allunyament de la preparació i la part òptica, movent la platina i permetent un moviment inicial i groller d’enfocament i apropament.

Cargol micromètric és comandament d’enfoc que permet fer moviments de precisió i de curt recorregut de apropament i allunyament de la preparació i la part òptica

Tub és un cilindre que serveix de suport a l’ocular i l’objectiu. Té una longitud de 160 a 250 mm. Pot incorporar lents intermitges que modifiquen una mica l’augment, i en

el capçal incorpora lents per difractar. Platina és el suport de la preparació amb una perforació que permet el pas de la llum. Poden tenir formes rectangulars o circulars per l’observació de cultius. Poden

incorpora unes pinces mòbils per subjectar la preparació i un sistema de coordenades per buscar zones determinades en observacions successives.

Subplatina aguanta el condensador i el diafragma. Diafragma és un disc foradat pel centre o bé amb bandes tancades que s’interposen al pas de la llum per deixar passar una determinada quantitat de llum. El mecanisme

per regular la quantitat de llum que entra a la mostra pot ser un iris format de làmines que se superposen o bé un disc giratori amb varis forats.

Mecànica o estatiu que suporta els components òptics de manera

adequada i en facilita la

manipulació.

Revòlver d’objectius és un dispositiu giratori o rotatori on hi ha cargolats els objectius que permet de manera parafocal, és a dir sense tenir que tornar a enfocar.

3

Objectiu és el component més important ja que la imatge no pot ser millorada. Presenta lents convergents que formen una imatge real, invertida i més gran. Es

troben a la part inferior del tub sobre la preparació. N’hi ha dos tipus: els apocromàtics que milloren la imatge mitjançant moltes lents que corregeixen

totalment les aberracions cromàtiques per tota la gamma de llum visible; per altra banda els acromàtics només tenen corregides part de les aberracions cromàtiques. Ocular és una lent o conjunt de lents que augmenten la imatge a la part superior del

tub. Hi ham microscopis monoculars i binoculars (2 oculars).

Òptica és la part més important i

fràgil.

Condensador recull i condensa la llum a cadascuna de les parts de la mostra per tal que aquesta estigui il·luminada amb una llum incandescent, potent i homogènia.

Il·luminació episcòpica: per reflexió prové de sobre la mostra. Il·luminació

Il·luminació diascòpica: per transmissió passa a través de la mostra.

Diferents tipus de microscopis òptics * Aquests aprofiten al màxim les propietats d’interferència i refracció de la llum i permeten veure

cèl·lules vives sense la necessitat d’haver de tenyir ni matar-les. Camp clar És el convencional que es veu la imatge fosca sobre un fons clar.

Camp fosc * Té un condensador que permet veure la imatge clara sobre un camp fosc. Contrast de

fases * La imatge es veu amb una aura brillant al voltant.

Contrast interdiferencial de Nowarski *

És una variació de tots els anteriors, on un feix de llum que se separa en dos després de travessar la mostra s’uneixen i forma una imatge amb relleu.

Fluorescència Va acompanyat de llum UV. Hi ha molta resolució i és útil a nivell molecular. Necessiten lents i filtres especials fets de quars, fluorita o carbonat de liti.

Polarització Converteix la llum natural en polaritzada, molt útil per veure estructures amb

una orientació molt marcada com és el cas de proteïnes i cristalls. Diferents tipus de microscopis electrònics

Transmissió Dóna una imatge 2D de la ultraestructura i té la màxima resolució i augments.

Rastreig També anomenat de escaning. Dóna una imatge 3D que permet veure

superfícies també amb molts augments i resolució. Microscopía de raigs X on la longitud d’ona és molt curta i permet estudiar estructures

cristal·lines o cristal·litzables com és el cas de les proteïnes.

4

Tinció amb Hematoxicilina i Eosina (HE). Amb aquesta el que pretenem és distingir i contrastar dues zones diferents com són el nucli i el citoplasma. Aquesta tècnica es basa en la coloració per càrregues oposades, utilitzant uns colorants amb càrrega positiva que s’enganxin a les estructures amb càrrega negativa i un colorant amb càrrega negativa que s’enganxi a estructures amb càrrega positiva. La càrrega de les estructures depèn dels aminoàcids de les proteïnes que el formen. Per exemple l’aminoàcid més simple que és la glicina (Gly) NH2-CH2-COOH, té un grup amino, el del nitrogen; i un grup carboxil, el de l’oxigen. Pot tenir càrrega positiva i negativa en funció del pH:

Aquestes formes varien segons el pH del medi de la manera següent: −−++ −− →←−− →←−−

++

COOCHNHCOOHCHNHCOOHCHNH HH

222223

−+ −−⇐−−⇒−− COOCHNHCOOHCHNHCOOHCHNH 222223

5

La Sang. La sang és un teixit connectiu circulant, està constituït per entre 5 i 8 litres en adults, i representa un 7 - 8% del pes del cos. Els components que la formen són el plasma sanguini i l’hematocrit. El plasma sanguini és la substància intracel·lular líquida (55%) que està composta en un 90% d’aigua, hidrocarburs (dissolvent gasos), ions com el clor o el sodi, un 0.1% de glúcids, un 0.1 de lípids que juntament amb un 7% de proteïnes formen les hormones que hi ha a la sang. Entre les proteïnes que hi ha hi trobem l’albúmina que és la responsable de mantenir la pressió osmòtica, evitant la pèrdua de sang pels capil·lars sanguinis; les γ i β globulines que intervenen en les accions immunitàries de l’organisme i unir-se a altres elements com lipoproteïnes per transportar-los millor respectivament; també hi trobem fibrògen i protrombina que intervenen en els processos de coagulació de la sang. En l’hematocrit hi trobem els glòbuls vermells anomenats també eritròcits, hematies o sèrie vermella i els glòbuls blancs anomenats leucòcits o sèrie blanca, i les plaquetes o trombòcits. L’estudi d’aquests serveix per indicar l’estat clínic d’un individu ja que, el nombre, la mida, la morfologia... poden indicar problemes en l’individu. En un hemograma (anàlisi de sang) es determinen els valors que composen la sèrie blanca i la sèrie vermella. La sang porta a les diferents cèl·lules totes les substàncies que són necessàries com són nutrients, metabolits, hormones i gasos i recullen productes residuals del metabolisme cel·lular com és el diòxid de carboni. La major part de les cèl·lules sanguínies tenen la seva funció en altres teixits. Els eritròcits s’encarreguen de l’intercanvi entre l’oxigen i el diòxid de carboni als pulmons i a totes les cèl·lules del cos ja que aquestes necessiten l’oxigen per fer les reaccions d’oxidació. El diòxid de carboni és captat pels eritròcits i es transportat cap els pulmons. Aquesta funció la fa específicament la hemoglobina. Un eritròcit fa aquesta funció 60 vegades més ràpid que no pas si aquest transport es fes lliures per la sang. Una reducció d’eritròcits o poca hemoglobina provoca anèmia.

Els leucòcits són atrets cap a les ferides per defensar l’organisme contra invasors. Els trobem en un elevat contingut en la sang, però quan hi ha infeccions o processos inflamatoris encara s’incrementa més. Hi ha un augment amb neutròfils quan hi ha un

procés infecciós bacterià amb resposta favorable ja que són la primera línia de defensa en fagocitar els invasors i en digerir-los amb enzims bacterians. Els eosinòfils augmenten en els processos al·lèrgics. Els basòfils prevenen la coagulació intravascular i augmenten en la fase de guariment. Aquests contenen hepanina que és un factor anticoagulant que evita que hi hagi una coagulació excessiva que impedeixi l’arribada d’oxigen o nutrients. També contenen histamina que és vasodilatador i serotonina que és vasoconstrictor. També hi ha factors quimiotàctils que són atrets quan hi ha una infecció i permeten l’entrada de neutròfils així com

6

també ho fa l’histamina. Els monòcits esdevenen macrofags quan entren en un teixit conjuntiu perquè hi ha una infecció. En aquest procés augmenten de mida, tenen més lisosomes i complexes de Golgi més desenvolupats. Aquests fagociten cèl·lules envellides, cossos estranys i microorganismes. Tenen més capacitat per englobar més bacteris que els neutròfils. Es diferencien pel fet que els macrofags actuen contra infeccions cròniques mentre que els neutròfils ho fan contra infeccions agudes. Els limfòcits B fabriquen anticossos específics contra determinats antígens mentre que els limfòcits T eliminen cèl·lules atacades per virus i alguns ataquen a cèl·lules tumorals. Les plaquetes intervenen en la formació de coàguls evitant així la desangració. En cas contrari hi ha una malaltia que és l’hemofilia.

7

El microscopi electrònic. El microscopi òptic funciona amb la longitud d’ona dels fotons. Però els físics, en concret De Broglie, en l’any 1924 va descobrir que els electrons es podien comportar com els fotons. L’emissió d’un feix de partícules es podia fer sobre una mostra o bé en fotons en el microscopi òptic que utilitza lents de vidre o amb electrons en el microscopi electrònic utilitzant lents o bobines electromagnètiques segons la hipòtesi de De Broglie.

Α==↑↑

=↓↓

↑

↓↓=↓↓

↓↓=↑↑

−

04,0)000.100..(.

).10.626,6(..tan(

.61,0

'.

1

34

eVdepotencialvm

sJPlanckdetch

ONd

AbbedF

dR

λλ

λ

S’aconsegueix disminuir molt la longitud d’ona que emeten els electrons a gran velocitat. En el 1931 Ruska i col·laboradors a Alemanya van fer el primer prototipus de microscopi electrònic de transició que permetia fer estudis ultraestructurals pel que fa a l’àmbit de la biologia i la física. En el 1979 Siemens el va fer de manera comercial. En el 1938 Von Ardenne va fer el primer prototipus de microscopi electrònic d’escandellatge que no es va comercialitzar fins el 1965 per Cambridge Instruments. Característiques generals del microscopi electrònic. - Permet obtenir imatges amb molta resolució quan fem impactar en les mostres un feix d’electrons. - Ofereix molts més augments que no pas el de fotons. - L’equivalent de la font de llum és una font emissora d’electrons, un filament de tungstè que s’escalfa a temperatures molt elevades 2.000º C deixant anar electrons, es troba a la part superior del microscopi. - A dins el tub hi ha d’haver el buit per tal que els àtoms de l’aire no desviïn els electrons per tant el material ha de ser biològicament mort. - El medi de contrast són metalls pesants com l’or o el pal·ladi o sals de metalls com el citrat de plom, l’acetat d’uracil o el tetraòxid d’osmi que també fixa. Les sals són extremadament tòxiques i per tant s’ha de treballar amb campanes extractores de flux laminar. Aquests medis de contrast són opacs als electrons i es dipositen en major o menor quantitat segons quina estructura cel·lular sigui. - Hi ha zones més electrodenses que es veuen més fosques pel fet que hi ha dipositat més metall i zones menys electrodenses que es veuen més clares perquè hi ha menys metall. Per tant, les imatges sempre són en blanc i negre.

8

Característiques específiques. - El microscopi electrònic de transició té un feix d’electrons de superfície amplia i fixa amb la finalitat que es travessi la mostra i es projecti en una pantalla fluorescent. - Els electrons per la seva poca massa tenen poca capacitat de penetració en les mostres biològiques, per tant aquestes han de ser modificades (no poden tenir més de 100 nm de gruix) per tant el procés de preparació és complexa. - La imatge que s’obté és fruit dels electrons que han travessat la mostra. - La imatge és bidimensional en una pantalla fluorescent. - El límit de resolució màxim és de 0.4 a 1 nm però en biologia és a partir de 2 nm, també té un nombre màxim d’augments de fins a 100.000 X. - El microscopi electrònic d’escandellatge el feix d’electrons és mòbil i puntual, per formar la imatge del feix d’electrons que surt del tungstè que és el feix d’electrons primari. - No fa falta travessar la mostra ja que la imatge es forma pels electrons que reboten sobre la recoberta d’or i paladi (50 nm). - Els electrons utilitzats per formar la imatge són els secundaris que són dispersats quan el feix d’electrons primaris impacta sobre la mostra, els secundaris es recullen en uns aparells que la transformen en una pantalla de raigs catòdics. - La imatge és en tres dimensions ja que es veu el relleu de la superfície. La resolució és menor que en el de transmissió (10-20 nm). Els augments directes són una mica menys 20.000 X. Requereix que es recobreixi amb un metalitzador que la recobreix d’or i paladi. El microscopi electrònic d’escandellatge ens proporciona informació sobre superfícies de teixits, orgànuls i cèl·lules mentre que el de transmissió ens proporciona informació sobre l’estructura amb molt de detall de cèl·lules o orgànuls.